Antivírusová liečba s použitím adenozínového nukleozidového analógu GS-441524 u mačiek s klinicky diagnostikovanou neurologickou mačacou infekčnou peritonitídou.

Original article: Antiviral treatment using the adenosine nucleoside analogue GS‐441524 in cats with clinically diagnosed neurological feline infectious peritonitis; 22.5.2020

Peter J. Dickinson, Michael Bannasch, Sara M. Thomasy, Vishal D. Murthy, Karen M. Vernau, Molly Liepnieks, Elizabeth Montgomery, Kelly E. Knickelbein, Brian Murphy, Niels C. Pedersen

Abstrakt

Infekčná peritonitída mačiek (FIP) je spôsobená mutantným biotypom mačacieho enterického koronavírusu. Výsledný vírus FIP (FIPV) v prípade neefúznej formy bežne spôsobuje patológie centrálneho nervového systému (CNS) a očí. Viac ako 95% mačiek s FIP podľahne chorobe niekoľko dní až mesiacov po diagnostikovaní napriek rôznym historicky používaným liečbam. Nedávno vyvinuté antivírusové lieky sa ukázali nádejné pri liečbe neneurologických FIP, ale údaje o liečbe neurologických prípadov FIP sú obmedzené. Štyri prípady prirodzene sa vyskytujúcej FIP s postihnutím CNS boli liečené antivírusovým nukleozidovým analógom GS-441524 (5-10 mg/kg) najmenej 12 týždňov. Mačky boli priebežne monitorované pomocou fyzikálnych, neurologických a oftalmologických vyšetrení. Jedna mačka absolvovala magnetickú rezonanciu (MRI), analýzu cerebrospinálneho moku (CSF) vrátane titra FCoV, RT-PCR, a oftalmologické vyšetrenie pomocou Fourierovej optickej koherenčnej tomografie a in vivo konfokálnu mikroskopiu (IVCM). Všetky mačky reagovali na liečbu pozitívne. Tri mačky sú stále nažive (528, 516 a 354 dní po začiatku liečby) s normálymi výsledkami fyzikálnych a neurologických vyšetrení. Jedna mačka bola eutanizovaná 216 dní od začiatku liečby po relapsoch po primárnej a sekundárnej liečbe. V 1 prípade bolo vyliečenie ochorenia určené na základe normalizácie nálezov MRI a CSF a vyšetrenia ochorenia kraniálneho a kaudálneho segmentu pomocou očných zobrazovacích metód. Liečba pomocou GS-441524 ukazuje jeho klinickú účinnosť a môže viesť ku klírensu a dlhodobému ústupu neurologickej FIP. Dávky potrebné pre ochorenie CNS môžu byť vyššie ako dávky používané pre neneurologické FIP.

Kľúčové slová: antivírusový, mačka, koronavíru, oftalmológia

Skratky

1. Úvod

Experimentálne liečby boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat a Výborom pre hodnotenie klinických skúšok Komisie pre klinické skúšky veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice na Kalifornskej univerzite v Davise. GS-441524 poskytla spoločnosť Gilead Sciences Inc. (Foster City, Kalifornia), ako už bolo opísané. 1, 2 Klinická diagnóza FIP bola založená na kombinácii charakteristických informácií, anamnézy, príznakov ochorenia, výsledkov laboratórnych testov vrátane hyperglobulinémie, zníženého pomeru albumín:globulín (AG) a titrov protilátok FCoV (nepriamy imunofluorescenčný test [IFA]), Fuller Laboratories , Fullerton, Kalifornia) 3 a reakcia na vírusovo špecifickú liečbu. Status vírusu mačacej leukémie (FeLV) a vírusu mačacej imunodeficiencie (FIV) sa stanovil pre antigén FeLV a protilátku FIV pomocou ELISA (IDEXX, Westbrook, Maine). V jednom prípade sa vykonalo opakované pokročilé diagnostické testovanie vrátane MRI, analýzy CSF, CSF FCoV RT‐PCR (Real-time PCR Research and Diagnostics Core Facility, UC Davis, Davis, Kalifornia) a sérológie, FD‐OCT a IVCM.

2. Prípad 1

Kastrovaný samec domácej 8-mesačnej modrej siamskej mačky získaný ako mačiatko zo záchrannej skupiny. Anamnéza niekoľkomesačnej letargie a zníženej chuti do jedla a mesačná progresívna ataxia panvových končatín potvrdená neurologickým vyšetrením. Mačka vážila 3,0 kg, čo bolo o 1 kg menej ako samica súrodenca. Abnormality biochémie v sére zahŕňali zvýšenú celkovú koncentráciu proteínov (8,9 g/dl; referenčný interval 6,3-8,8 g/dl) s pomerom AG 0,53 (albumín, 3,1 g/dl; referenčný interval 2,6-3,9 g/dl; globulín), 5,8 g/dl; referenčný interval, 3,0-5,9 g/dl). Testy na titre protilátok FeLV a FIV a Toxoplasma gondii IgM a IgG (Protatek, Mesa, Arizona) boli negatívne a titer protilátok FCoV bol pozitívny s hodnotou 1:12 800. Očné vyšetrenie identifikovalo chorioretinálne jazvy v tapetálnom funduse v oboch očiach (oculus uterque, OU). Ultrazvukové vyšetrenie brucha ukázalo obvodové hyperechoické čiary na obličkových kortikomedulárnych spojoch, lineárne hyperechoické čiary paralelné s luminálnym povrchom jejuna a ilea a zväčšené kolické a mezenterické lymfatické uzliny. Mačka bola liečená 5 mg/kg GS-441524 SC raz denne počas 14 týždňov. Chuť do jedla a aktivita vrátane skákania na vyvýšené povrchy sa zlepšili do 4 dní. Celková koncentrácia proteínu v sére po ukončení liečby bola 7,8 g/dl s pomerom AG 0,77. Neurologické vyšetrenie bolo normálne a telesná hmotnosť bola 5,1 kg. Mačka zostáva v čase písania článku 528 dní po začiatku liečby klinicky normálna.

3. Prípad 2

Ročný kastrovaný kocúr domácej krátkosrstej mačky narodený zachránenej divokej mačke mal 3 mesačnú históriu prednej uveitídy a týždňovú históriu letargie, zmeneného správania, šklbania chvosta, generalizovaných záchvatov, zníženej chuti do jedla a dysfágie a ataxie panvových končatín. Mačka vážila 3,7 kg. Na neurologickom vyšetrení bola mačka otupená generalizovanou ataxiou, zníženými posturálnymi reakciami v ľavých hrudných a pravých panvových končatinách, zníženým fyziologickým nystagmom OU a zníženým nazálnym vnemom na pravej strane. Reakcia na priblíženie bola znížená u obidvoch očí, bola prítomná anizokória (mydriáza v ľavom oku [oculus sinister, OS]) so zníženým priamym a konsenzuálnym pupilárnym svetelným reflexom (PLR) s osvetlením OS. Očné vyšetrenie odhalilo prednú uveitídu OU s odlúčením sietnice OS a retinálnu vaskulitídu OU. Mačka vážila 3,7 kg a abnormality biochémie séra zahŕňali zvýšenú celkovú koncentráciu proteínu (8,6 g/dl; referenčný interval, 6,6-8,4 g / dl) s pomerom AG 0,48 (albumín, 2,8 g/dl; referenčný interval, 2,2-4,6) g/dl; globulín, 5,8g/dl; referenčný interval, 2,8-5,4 g/dl), zvýšená koncentrácia celkového bilirubínu (1,8 mg/dl; referenčný interval, 0,0-0,2 mg/dl) a zvýšená aktivita AST (128 IU/dl L; referenčný interval, 17-58 IU/L). Test na vírus mačacej leukémie, FIV a antigén srdcových červov (SNAP Feline Triple Test, IDEXX, Westbrook, Minnesota) bol negatívny. Palpácia brucha ukázala zväčšené mezenterické lymfatické uzliny. Mačka bola liečená 5 mg/kg GS-441524 SC, raz denne počas 14 týždňov. Telesná hmotnosť pri ukončení liečby bola 5,9 kg. Úroveň mentácie a aktivita sa výrazne zlepšili 48 hodín po začiatku liečby. Po 3 týždňoch liečby boli neurologické a oftalmologické príznaky nepozorovateľné okrem miernej intermitentnej anizokórie a chorioetinálnych jaziev OU. Predtým zaznamenané abnormality sérovej biochémie ustúpili s celkovou koncentráciou sérového proteínu 8,1 g/dl a pomerom AG 0,77. Tri týždne po ukončení liečby mačka vážila 6,4 kg, fyzikálne a neurologické vyšetrenia boli bez nálezu a celková koncentrácia proteínu v sére bola 7,0 mg/dl s pomerom AG 0,84. Mačka zostáva v čase písania článku 516 dní po začiatku liečby klinicky normálna.

4. Prípad 3

18-mesačná kastrovaná domáca krátkosrstá mačka získaná z útulku mala 3-mesačnú anamnézu očného ochorenia, 3-týždňovú progresívnu anamnézu letargie a nechutenstva a niekoľkodňovú anamnézu progresívnej parézy končatín. Mačka bola liečená prednizolón-acetátovými 1% očnými kvapkami OU, každých 6 hodín po dobu 5 dní pred prezentáciou. Na neurologickom vyšetrení mačka vykazovala neprimerané správanie a precitlivenosť na kraniálnu palpáciu. Mačka bola neambulanticky paraparetická so zníženými reflexmi panvových končatín. Žmurkací reflex chýbal OU s anizokóriou (zrenica stredného rozsahu v pravom oku [oculus dexter, OD], mydriáza OS). Pupilárny svetelný reflex chýbali OD kvôli zadným synechiám a absentovali OS s priamym alebo nepriamym osvetlením. Boli prítomné reflexy na oslnenie a videnie OU a mačka vykazovala znížené videnie za fotopických podmienok. Očné vyšetrenie ukázalo uveitídu a syndróm hyperviskozity OU. Mačka vážila 2,6 kg. Abnormality biochémie v sére zahŕňali zvýšenú koncentráciu celkového proteínu (11,7 g/dl; referenčný interval 6,3-8,8 g/dl) s pomerom AG 0,2 (albumín, 2,0 g/dl; referenčný interval 2,6-3,9 g/dl; globulín) , 9,7 g/dl; referenčný interval, 3,0-5,9 g/dl). Testy na FeLV a FIV boli negatívne a titer protilátok FCoV bol pozitívny s hodnotou 1: 6400. Ultrazvukové vyšetrenie brucha ukázalo hepatosplenomegáliu, malé obličky s nevýraznými kortikomedulárnymi spojmi a zväčšené mezenterické lymfatické uzliny. Mačka bola liečená 5 mg/kg GS-441524 SC, raz denne počas 15 týždňov. Po 1 mesiaci liečby sa uveitída zlepšila, ale stále je prítomná a mačka bola ambulantne paraparetická s normálnymi segmentovými reflexmi. Mačka vážila 3,3 kg a pomer AG bol 0,55. Po 2 mesiacoch liečby boli prítomné jemné príznaky aktívnej prednej uveitídy OD, ale došlo iba k miernemu zlepšeniu ambulantnej paraparézy. Telesná hmotnosť sa zvýšila na 3,7 kg a pomer AG bol 0,67. Po 15 týždňoch liečby boli iba minimálne známky uveitídy OD a zlepšenla sa ambulantnej paraparéza, ktoré bola statická počas predchádzajúcich 4 týždňov. Mačka vážila 4,0 kg a pomer AG bol 0,76. Po ukončení liečby sa letargia, nechutenstvo a anizokória vrátili do 36 hodín. Liečba bola obnovená dávkou 5 mg/kg GS-441524 SC jedenkrát denne a príznaky ustúpili do 24 hodín. Známky zostali statické počas 12 týždňov druhého kola liečby, ale znížená aktivita sa po ukončení liečby znova objavila. Mačka bola eutanizovaná čiastočne z dôvodu zvýšenej odolnosti voči podávaniu lieku. Histopatologické hodnotenie po pitve preukázalo multifokálnu chronickú nefunkčnú meningitídu, encefalomyelitídu a ventrikulitídu, lymfocytovú, histiocytovú uveitídu a choroiditídu OU a intersticiálnu nefritídu. Pozitívna koronavírusová imunohistochemická imunoreaktivita (protilátka FIP ‐ V3‐70, Custom Monoclonals International, Sacramento, Kalifornia) bola identifikovaná v rámci histiocytov spojených s léziami v mozgu, obličkách a oku.

5. Prípad 4

Sedemmesačná sterilizovaná samica domácej krátkosrstej mačky adoptovaná z útulku mala trojtýždňovú históriu letargie a nechutenstva a dvojtýždňovú históriu ataxie a prikrčenej chôdze. Na neurologickom vyšetrení mala mačka ataxickú chôdzu, ktorá bola horšia v panvových končatinách. Posturálne reakcie boli znížené v panvových končatinách. Anizokória (OD stredného pásma, miotický OS) bola prítomná s neúplnými PLR OU. Žmurkacie reflexy, oslňujúce reflexy a videnie boli prítomné OU. Mačka vážila 2,7 kg. Magnetická rezonancia mozgu preukázala multifokálne T2-váženej hyperintenzity v celom parenchýme, najťažšie v strednom mozgu a talame. Postkontrastné T1-vážené snímky ukázali difúzne zhrubnutie a zosilnenie mozgových blán mozgu a mozgového kmeňa s výraznou ventrikulomegáliou (obrázok 1). Cerebrospinálny mok odobratý z cerebellomedulárnej cisterny bol xantochromický s celkovým počtom nukleovaných buniek (TNCC) 888/μL (referenčný interval, <3 bunky/μL) a celkovou koncentráciou bielkovín v CSF 1790 mg/dl (referenčný interval, <25 mg/dl). Titre séra a CSF FCoV protilátok boli pozitívne pri > 1:20 480 a real-time TaqMan RT‐PCR pre FCoV v CSF bola pozitívna s hodnotou prahového cyklu (Ct) 18,87. Testy na FeLV a FIV boli negatívne. Sérová biochémia a abnormality CBC zahŕňali celkovú koncentráciu proteínu 8,5 g/dl (referenčný interval, 6,6-8,4 g/dl), pomer AG 0,37 (albumín 2,3 g/dl; referenčný interval 2,2-4,6 g/dl; globulín 6,2 g/dl; referenčný interval 2,8-5,4 g/dl), celková koncentrácia bilirubínu 0,5 mg/dl (referenčný interval 0,0-0,2 mg/dl), anémia (hematokrit, 25,8%; referenčný interval, 30 -50%) a lymfopénia (835/μL; referenčný interval, 1000‐7000/μL). Ultrazvukové vyšetrenie brucha ukázalo hyperechoické obličky a retroperitoneálny tuk, niekoľko zväčšených lymfatických uzlín a mierny peritoneálny výpotok. Pri oftalmologickom vyšetrení FD‐OCT a IVCM bola zistená predná uveitída s keratickými zrazeninami prítomnými v OU v zadnej časti; očná hypertenzia (25 mmHg OD, 11 mmHg OS) a chorioretinitída boli tiež identifikované OD (obrázok2). Mačka bola liečená 5 mg/kg GS-441524 SC, raz denne počas 4 týždňov a prednisolónacetátovými 1% očnými kvapkami OU q8h a dorzolamid 2% očnými kvapkami OD q8h počas prvých 3 týždňov liečby GS ‐ 441524. Aktivita a mentácia sa zlepšili do 24 hodín po začiatku liečby. Po 4 týždňoch sa oftalmologické ochorenie výrazne zlepšilo (obrázok 2), ale stále bola prítomná ataxia a mačka stratila 0,2 kg telesnej hmotnosti (obrázok 3). Koncentrácia celkového proteínu v sére bola stále zvýšená (8,6 g/dl) so zlepšeným pomerom AG 0,72; lymfopénia a anémia ustúpili. Z dôvodu nedostatku prírastku hmotnosti a pretrvávajúcich neurologických deficitov sa dávka GS-441524 zvýšila na 8 mg/kg SC, jedenkrát denne počas ďalších 10 týždňov (spolu 14 týždňov). Mačka tiež dostala dvojtýždňovú kúru prednizolónu 1 mg/kg PO každých 24 hodín. Zvýšená aktivita a ochota skákať na vyvýšené povrchy sa pozorovali do 24 hodín a 1 týždeň po ukončení liečby GS-441524 bolo neurologické vyšetrenie ngatívne a nezistilo sa žiadne aktívne oftalmologické ochorenie. Telesná hmotnosť sa zvýšila na 3 kg a celková koncentrácia proteínu v sére bola normálna (7,6 g/dl) s pomerom AG 0,8. Opakovaná magnetická rezonancia (obrázok 1) vykázala minimálne zvýšenie kontrastu meningey, ale ventrikulomegália sa zvýšila. Opakovaná CSF RT‐PCR pre FCoV RNA bola negatívna a TNF v CSF sa znížil oproti predchádzajúcemu počtu, ale stále vysoký pri 224/μL. Vzhľadom na dôkazy z analýzy mozgovomiechového moku, že infekcia bola stále aktívna, sa dávka GS-441524 ďalej zvyšovala na 10 mg/kg SC, jedenkrát denne počas ďalších 5 týždňov (spolu 19 týždňov). Mačka zostala v tomto období klinicky normálna so zvýšenou aktivitou a telesná hmotnosť sa zvýšila na 4,7 kg (obrázok 3). Ihneď po ukončení liečby zostali neurologické a oftalmologické vyšetrenia nezmenené a opakovaná MRI bola okrem perzistentnej ventrikulomegálie bez nálezu. Opakovaná analýza CSF preukázala pokračujúci pokles TNCC (8 buniek/μL) a celkovej koncentrácie proteínov (85 mg/dl), negatívnu RT‐PCR pre FCoV RNA a znížený titer protilátok FCoV o 1:128. Približne 8 mesiacov po začiatku liečby a 3 mesiace po ukončení liečby sa MRI nezmenila oproti predchádzajúcemu zobrazeniu, okrem menej závažnej ventrikulomegálie. Analýza mozgovomiechového moku preukázala TNCC 6 buniek/μL, celkovú koncentráciu proteínu 52 mg/dl, negatívnu RT‐PCR pre FCoV RNA a statický titer protilátok FCoV 1: 128. Koncentrácia celkového proteínu v sére bola 7,1 g/dl s pomerom AG 0,97. Pri oftalmologickom vyšetrení neboli pozorované žiadne príznaky aktívneho zápalu, hoci boli identifikované ohniskové oblasti zriedenia sietnice. Mačka zostáva v čase písania článku 354 dní po začiatku liečby klinicky normálna.

6. Diskusia

Infekčná peritonitída mačiek je hlavnou príčinou úmrtnosti mladých mačiek a častou príčinou neurologických ochorení. Niekoľko experimentálnych liečebných postupov nepreukázalo konzistentnú účinnosť proti FIP a mačky sú eutanizované alebo uhynú niekoľko dní až mesiacov po rozvoji klinického ochorenia, najmä keď FIP ovplyvňuje CNS. Našťastie lieky zamerané na replikáciu RNA vírusov pri dôležitých ľudských chorobách, ako je vírus ľudskej imunitnej nedostatočnosti (HIV), hepatitída C a ebola, poskytli model liečby vírusových chorôb u iných druhov, ako je práve FIP. GS-441524 je 1′-cyano-substituovaný adenín C-nukleozidový ribózový analóg, ktorý inhibuje syntézu vírusovej RNA. GS-441524 a 3C-Like inhibítor vírusovej proteázy preukázali účinnosť proti FIPV pri experimentálne indukovanej a prirodzene získanej FIP. Predbežné štúdie však naznačujú, že liečba očných a CNS foriem FIP môže byť zložitejšia z dôvodu obmedzeného priestupu lieku cez hematookulárnu a hematoencefalickú bariéru. Pri liečbe založenej na inhibítoroch proteáz bola pozorovaná vysoká miera relapsu choroby FIP s postihnutím CNS, zatiaľ čo pri liečbe očnej a neurologickej FIP sa nádejnejším stal GS-441524. Počiatočná klinická štúdia s GS-441524 na prirodzene získanej, neneurologickej FIP používala dávky 2 mg/kg, ktoré sa javili ako nedostatočné pre mačky, u ktorých sa v priebehu liečby vyvinuli neurologické príznaky. Zdá sa však, že 2 mačky, u ktorých sa pri tejto dávke vyskytlo neurologické ochorenie, reagovali na 4 mg/kg. 4 prípady neurologickej FIP z našej štúdie boli liečené dávkou 5 mg/kg, s trvaním liečby a následným zvyšovaním dávky na základe klinických reakcií. Dávka 5 mg/kg, SC, jedenkrát denne po dobu 12 až 14 týždňov bola dostatočná na liečbu 2 menej závažných neurologických prípadov FIP (prípady 1, 2), ale opakované cykly s dávkou 5 mg/kg u najvážnejšie klinicky postihnutej mačky (prípad 3) mali za následok iba zlepšenie klinických príznakov s rýchlou klinickou regresiou po ukončení liečby. Toto terapeutické zlyhanie viedlo v prípade 4 k postupnému zvyšovaniu dávky z 5 na 10 mg/kg. In vitro 50% účinná koncentrácia (EC50) pre GS-441524 na prevenciu vírusových cytopatických účinkov bola reportovaná pri 0,8 μM s úplnou inhibíciou vírusovej replikácie pri 10 μM a čiastočnou inhibícia pri 1 μM. 1 Obmedzené farmakokinetické štúdie u mačiek z tej istej štúdie ukázali, že koncentrácie GS-441524 v CSF boli približne 20% v plazme a dávka 10 mg/kg viedla ku koncentráciám v CSF 0,8 až 2,7 μM. Tieto údaje zodpovedajú obmedzenej účinnosti spojenej s dávkami 5 mg/kg v prípadoch 3 a 4 a zjavnej účinnosti spojenej so zvyšovaním dávky na 8 až 10 mg/kg v prípade 4. Pre ďalšie definovanie optimálnej dávky GS-441524 u mačiek s neurologickou FIP budú nevyhnutné rozšírené farmakokinetické štúdie u zdravých a postihnutých mačiek s intaktnou a narušenou funkciou hematoencefalickou bariérou. Podobne ako v predchádzajúcich správach boli spozorované obmedzené nežiaduce reakcie spojené s dlhodobým používaním GS-441524. Lokálne kožné reakcie a nepríjemné pocity po SC injekcii boli jedinými klinicky relevantnými nežiaducimi reakciami, ale to bol hlavný faktor ovplyvňujúci rozhodnutie o eutanázii prípad č. 3. Aj keď boli reakcie na liečbu merateľné pomocou MRI, analýzy CSF a zobrazenia očí, rovnako užitočné boli aj klinické reakcie na liečbu pri použití vhodnej dávky, s rýchlym zlepšením mentácie, chuti do jedla a aktivity, ktoré sa všeobecne pozorovali do 24 až 36 hodín. Zvýšená telesná hmotnosť a schopnosť skákať na vyvýšené objekty a povrchy sa tiež považovali za konzistentné ukazovatele účinnej liečby. GS-441524 nie je k dispozícii na bežné klinické použitie, ale hlásené prípady naznačujú, že FIP ovplyvňujúca CNS môže byť liečiteľná pomocou vhodných antivírusových liekov. Vývoj podobných antivírusových liekov na klinické použitie by sa mal považovať za prioritu tohto historicky smrteľného ochorenia.

Referencie

1. Murphy BG, Perron M, Murakami E, a kol. The nucleoside analog GS‐441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol. 2018;219:226‐233. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
2. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, a kol. Efficacy and safety of the nucleoside analog GS‐441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2019;21:271‐281. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
3. Pedersen NC. An update on feline infectious peritonitis: diagnostics and therapeutics. Vet J. 2014;201:133‐141. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
4. Pedersen NC. A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963‐2008. J Feline Med Surg. 2009;11:225‐258. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
5. Pedersen NC, Kim Y, Liu H, a kol. Efficacy of a 3C‐like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2018;20:378‐392. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
6. Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC, a kol. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad‐Spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog. 2016;12:e1005531. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]