Myokarditída u domácich zvierat prirodzene infikovaných britským variantom COVID-19

Luca Ferasin, DVM, Ph.D, Matthieu Fritz, Ph.D, Heidi Ferasin, DVM, Pierre Becquart, Ph.D, Vincent Legros, DVM, Ph.D and Eric M. Leroy
Pôvodný článok: Myocarditis in naturally infected pets with the British variant of COVID-19; 18.3.2021; Preklad 1.4.2021

Abstrakt

Domáce zvieratá sa môžu infikovať SARS-CoV-2, ale na základe zatiaľ dostupných obmedzených informácií nie je známe, či nový britský variant B.1.1.7 môže ľahšie infikovať určité druhy zvierat alebo zvýšiť možnosť prenosu z človeka na zviera. V tejto štúdii uvádzame prvé prípady infekcie domácich mačiek a psov britským variantom B.1.1.7 SARS-CoV-2 diagnostikovaným v špecializovanej veterinárnej nemocnici v juhovýchodnom Anglicku. Ďalej sme zistili, že u mnohých majiteľov a opatrovateľov týchto domácich miláčikov sa vyvinuli respiračné príznaky Covid-19 3-6 týždňov pred tým, ako ich domáce zvieratá ochoreli, a tiež mali pozitívny test PCR na Covid-19. Je zaujímavé, že u všetkých týchto domácich zvierat infikovaných B.1.1.7 sa vyvinuli atypické klinické prejavy vrátane závažných srdcových abnormalít súvisiacich s myokarditídou a závažného zhoršenia celkového zdravotného stavu pacienta, ale bez akýchkoľvek primárnych respiračných príznakov. Naše objavy demonštrujú prvýkrát schopnosť spoločenských zvierat byť infikované variantom B.1.1.7 SARS-CoV-2 a vyvolávajú otázky týkajúce sa jeho patogenity u týchto zvierat. Okrem toho, vzhľadom na zvýšenú infekčnosť a prenosnosť variantu B.1.1.7 pre človeka, tieto zistenia tiež viac ako kedykoľvek predtým zdôrazňujú riziko, že spoločenské zvieratá môžu potenciálne hrať dôležitejšiu úlohu v dynamike vypuknutia SARS-CoV-2, ako sa doteraz myslelo.

Úvod

Pandémia COVID-19 v dôsledku ťažkého akútneho respiračného syndrómu spôsobeného koronavírusom 2. typu (SARS-CoV-2) vyznačujúca sa zmenou aminokyseliny spike proteínu (S) D614G (označovaná ako variant B. 1) postihla niekoľko miliónov prípadov na celom svete. Táto globálna situácia uprednostnila výskyt mnohých genómových mutácií, z ktorých niektoré vytvorili varianty so selektívnymi výhodami ¹. Na konci jesene 2020 sa v niekoľkých krajinách objavili tri pozoruhodné varianty, ktoré sa potom rýchlo rozšírili do celého sveta, vrátane B.1.1.7 (tiež označovaného ako 20I/N501Y.V1), ktorý bol prvýkrát zistený v Anglicku ², B.1.351 (20J/N501Y.V2) prvýkrát detekovaný v Južnej Afrike a nedávno identifikovaný „brazílisky“ variant P.1 (20I/N501Y.V3). Tieto tri varianty nesú konšteláciu genetických mutácií, vrátane tých na úrovni domény viažucej receptor proteínu S (RDB), ktorá je nevyhnutná pre väzbu na receptor ACE-2 hostiteľskej bunky na uľahčenie vstupu vírusu.

Odhaduje sa, že variant B.1.1.7, označovaný tiež ako obávaný variant (VOC) 202012/01 alebo 20I/501Y.V1, sa objavil v septembri 2020 v Kente, grófstve v juhovýchodnom Anglicku, a rýchlo prekonal ostatné v Anglicku už existujúce varianty v dôsledku zvýšenej prenosnosti a infekčnosti ². Viaceré dôkazy naznačujú, že jeho zvýšenú prenosnosť riadi mutácia N501Y a delécia aminokyseliny Δ69/70 v RDB ³. Následne došlo k zvýšeniu výskytu B.1.1.7 počas celoštátneho lockdownu zavedeného vládou Spojeného kráľovstva od 5. novembra do 2. decembra 2020, a to aj napriek prísnym obmedzeniam, čo spôsobilo mimoriadny nárast prípadov COVID-19, ktoré sa osobitne dotkli oblasti Veľkého Londýna. K 7. februáru 2021 predstavoval VOC 202012/01 zhruba 95% nových infekcií SARS-CoV-2 vo Veľkej Británii a v súčasnosti bol identifikovaný v najmenej 86 krajinách.

Celosvetovo bolo zaznamenaných už niekoľko prípadov infekcie SARS-CoV-2 u domácich miláčikov (najmä mačiek a psov), a predpokladá sa, že tieto zvieratá boli infikované ich majiteľmi alebo opatrovateľmi. Infekcie domácich miláčikov väčšinou viedli k nebadateľným až miernym zažívacím a respiračným príznakom, ako sú kašeľ, nádcha, kýchanie a zápal spojiviek ^4–6. Je zaujímavé, že napriek nekontrolovanému nárastu prípadov COVID-19, ku ktorému vo Veľkej Británii došlo od novembra 2020, neboli u spoločenských zvierat zatiaľ hlásené žiadne infekcie vírusom SARS-CoV-2. Prekvapivejšie je, že podľa najlepších vedomostí autorov doteraz nikdy nebola zdokumentovaná prirodzená infekcia žiadneho zvieraťa variantom B.1.1.7, a to ani v Anglicku, ani nikde inde.

Výsledky

Hlásime náhle zvýšenie počtu domácich psov a mačiek s myokarditídou na kardiologickom oddelení The Ralph Veterinary Referral Center (RVRC) na okraji Londýna (UK), medzi decembrom 2020 a februárom 2021, s neočakávaným nárastom incidencie z 1,4% na 12,8% (8,5% u mačiek a 4,3% u psov). Zdá sa, že tento náhly nárast prípadov kopíroval krivku a časovú líniu ľudskej pandémie COVID-19 vo Veľkej Británii v dôsledku variantu B.1.1.7, ktorá sa začala v polovici decembra 2020 a vyvrcholila koncom januára 2021 pred návratom na historickú úroveň v polovici februára 2021.

Žiadny z týchto pacientov s myokarditídou nemal v anamnéze srdcové choroby a ich klinický obraz bol podobný a charakterizovaný akútnym nástupom letargie, nechutenstvom, tachypnoe/dyspnoe (sekundárne v dôsledku výskytu kongestívneho zlyhania srdca) a v niektorých prípadoch synkopálnymi udalosťami. Diagnostické vyšetrenia odhalili prítomnosť zvýšeného srdcového troponínu-I (medián 6,8; rozsah 0,68 až 61,1 ng/ml [normálny referenčný rozsah 0,0-0,2 ng/ml]) sprevádzanú echokardiografickým dôkazom remodelácie myokardu a/alebo známkami pleurálneho výpotku a/alebo pľúcneho edému, často potvrdenými na hrudných rádiografoch a/alebo závažné komorové arytmie na elektrokardiografii (pozri doplnkový obrázok S1). Všetky postihnuté zvieratá dosiahli pozoruhodné zlepšenie po odpočinku v klietke, kyslíkovej terapii, akútnej diuréze a v niektorých prípadoch antiarytmickej liečbe doplnkom sotalolu a rybieho oleja predtým, ako boli po niekoľkých dňoch intenzívnej starostlivosti prepustené na perorálnu liečbu. Je pozoruhodné, že u väčšiny majiteľov a opatrovateľev týchto domácich miláčikov s myokarditídou sa vyvinuli respiračné príznaky Covid-19 v priebehu 3-6 týždňov pred tým, ako ochoreli ich domáce zvieratá, a mnoho z týchto majiteľov malo pozitívny PCR test na Covid-19. Vzhľadom na túto náhodu a zaujímavý simultánny vývoj myokarditídy u týchto domácich miláčikov a prepuknutie choroby B1.1.7 COVID-19 vo Veľkej Británii sme sa rozhodli preskúmať infekciu SARS-CoV-2 u týchto zvierat. Na tento účel sa odobrali vzorky séra, ako aj oro/nazofaryngeálne a rektálne výtery od siedmich zvierat (šesť mačiek a jeden pes) pri počiatočnej prezentácii na RVRC medzi 22. januárom a 10. februárom 2021 (tabuľka 1). V rovnakom období sme odobrali vzorky krvi od štyroch ďalších domácich miláčikov (dvoch mačiek a dvoch psov) počas ich zotavovania, 2-6 týždňov po tom, čo sa u nich objavili príznaky myokarditídy. U žiadneho z 11 zvierat s myokarditídou sa nevyvinuli žiadne príznaky podobné chrípke a všetky sa klinicky zlepšili v priebehu niekoľkých dní intenzívnej starostlivosti, hoci jedna mačka (LL) mala jeden týždeň po prepustení relaps jej klinických príznakov charakterizovaných výraznou letargiou a nekontrolovanou komorovou tachykardiou, čo podnietilo jej majiteľov, aby sa rozhodli pre eutanáziu. Všetky mačky a psy boli kastrovaní a vo veku od jedného do 12 rokov. Po odbere boli všetky vzorky skladované pri -20 ° C až do transportu v ľade do laboratória MIVEGEC vo Montpellier vo Francúzsku na sérologické a virologické vyšetrenia.

Oro/nazofaryngeálne a rektálne výtery boli testované pomocou kvapôčkovej digitálnej RT-PCR (ddPCR) zameranej na jednu oblasť špecifickú pre SARS-CoV-2 N gén a dve oblasti Spike proteínu špecifické pre tri súčasné prevládajúce SARS-CoV-2 varianty, menovite 20I/N501Y.V1, 20J/N501Y.V2 a 20I/N501Y.V3. Jedna cieľová oblasť obsahujúca mutáciu N501Y je spoločná pre tri varianty a druhá cieľová oblasť obsahujúca deléciu Δ69-70 je špecifická pre variant B.1.1.7. Séra sa testovali na IgG špecifický pre SARS-CoV-2 pomocou troch mikrosférových imunotestov (MIA), ktoré detegovali väzbu IgG na N proteín, S1-RBD-proteín alebo S trimerický proteín, ako aj testom na báze retrovírusov na detekciu SARS-CoV-2 neutralizujúce protilátky (pozri Materiály a metódy).

U všetkých oro/nazofaryngeálnych výterov sa zistilo, že SARS-CoV-2 ddPCR sú negatívne. Pozitívne signály ddPCR sa však získali pre tri oblasti z rektálnych výterov od troch zo siedmich zvierat (dve mačky a jeden pes), čo naznačuje infekciu britským variantom B.1.1.7. Koncentrácia RNA bola v rozmedzí od 12 do 33 kópií/μL vzorky, čo naznačuje nízku vírusovú nálož (tabuľka 1). Okrem toho sa zistilo, že vzorky od jedného zvieraťa odobraté počas akútnej fázy choroby, ktoré vykazovalo negatívny výsledok ddPCR, ako aj u dvoch zo štyroch zvierat odobratých počas obdobia zotavenia, obsahovali protilátky SARS-CoV-2. Celkovo sa teda u šiestich z našich 11 skúmaných zvierat ukázalo, že sú SARS-CoV-2 pozitívne, a to buď ddPCR, alebo sérologicky. Zaujímavejšie je, že keď vezmeme do úvahy iba päť zvierat, u ktorých majiteľov alebo opatrovateľov bola laboratórne potvrdená pozitivita na Covid-19, štyri sa ukázali SARS-CoV-2 pozitívne (tabuľka 1).

Diskusia

Pokiaľ je nám známe, toto je prvá správa o infekcii mačiek aj psov britským variantom SARS-CoV-2 B.1.1.7. Vzhľadom na zvýšenú infekčnosť a prenosnosť variantu B.1.1.7 pre človeka, objav mačiek a psov infikovaných B.1.1.7 viac ako kedykoľvek predtým zdôrazňuje riziko, že spoločenské zvieratá môžu potenciálne hrať významnú úlohu pri dynamike prepuknutia choroby SARS-CoV-2, ako sa doteraz myslelo. Naliehavo sú preto potrebné ďalšie štúdie na preskúmanie pravdepodobnosti prenosu variantu B.1.1.7 typu zviera-zviera, ako aj zviera-človek, a na preukázanie, či mutácia N501Y a delécia Δ69-70 spôsobujú, že vírus je pre tieto zvieratá infekčnejší.

Ďalším pozoruhodným a neočakávaným zistením našej štúdie je vývoj neobvyklých klinických prejavov u mačiek a psov infikovaných B.1.1.7, vrátane závažných srdcových abnormalít sekundárnych po myokarditíde a závažného zhoršenia celkového zdravotného stavu pacienta, ale bez akýchkoľvek primárnych respiračných príznakov. S výnimkou jedinej mačky zo Španielska, u ktorej sa vyskytlo kardiorespiračné zlyhanie vedúce k závažnej respiračnej tiesni ⁷, boli doteraz hlásené ako prirodzené, tak aj experimentálne infekcie SARS-CoV-2 u mačiek a psov buď asymptomatické alebo s miernym ochorením horných dýchacích ciest . Aj keď sa zdá, že infekcia B.1.1.7 u ľudí súvisí s vyššou úmrtnosťou na COVID-19 alebo klinickou závažnosťou, je potrebné uznať a riešiť súvislosť medzi myokarditídou a infekciou B.1.1.7 u domácich domácich miláčikov. ⁸ V tejto súvislosti je dôležité zdôrazniť skutočnosť, že myokarditída spojená s multisystémovým zápalovým syndrómom je tiež dobre známou komplikáciou COVID-19 u ľudí (dospelých aj detí) pravdepodobne kvôli prehnanej imunitnej odpovedi hostiteľa ^9,10.

Naše objavy dokazujú schopnosť spoločenských zvierat infikovať sa variantom SARS-CoV-2 B.1.1.7 a vyvolávajú otázky týkajúce sa jeho patogenity u týchto zvierat. Preto je naliehavo potrebné výrazne urýchliť a posilniť vyšetrovanie a dohľad nad infekciami zvierat vysoko prenosnými variantmi, ako sú britský B.1.1.7, juhoafrický B1.351 a brazílsky P.1 ako súčasť globálneho reakcie na prebiehajúcu pandémiu viacerých druhov COVID-19.

Materiály a metódy

Extrakcia RNA

Rektálne a oro/naso-faryngeálne výtery boli resuspendované vortexovaním v 300 μL PBS. Celková RNA sa extrahovala z 200 μL supernatantu z rektálneho výteru a z 200 μL vírusového transportného média z nosohltanových výterov. Extrakcia sa uskutočňovala na extrakčnom systéme IndiMag 48 (Indical Bioscience) pomocou technológie magnetických guľôčok so súpravou IndiMag Pathogen podľa pokynov výrobcu. Elučný objem bol 100 μL.

Jednokroková dRT-PCR

Procedúra RT-dPCR sa uskutočňovala podľa pokynov výrobcu s použitím QIAcuity 8, 5-plexu (Qiagen, Nemecko), súpravy QIAcuity One-Step Viral RT-PCR (kat. Č. 1123145, Qiagen, Nemecko) a 24-jamkovej 26K nanodosky (kat. Č. 250001, Qiagen, Nemecko). Technika ddRT-PCR preukázala pre diagnostiku COVID-19 vyššiu senzitivitu a špecificitu v porovnaní s RT-qPCR. ¹¹

Stručne povedané, reakčná zmes RT-dPCR bola zostavená nasledovne: 4x jednokrokový vírusový RT-PCR Master Mix 10 μl, 100x multiplexná reverzná transkripčná zmes 0,4 μl, 20x sada primérov a sond 0149, 0130, 0150 (ref IAGE) 2 μl x3 (6 μL), voda bez RNázy 22,6 μl a templát RNA 1 μl, v konečnom objeme 40 μl. Cieľ 0130 cieľ 2019-nCoV_N2 NC_045512v2 fluorofor HEX, dĺžka amplikónu 67 bp. Cieľová oblasť 0149: delécia mutácie 69-70, línia B1.1 a B1.258, fluorofor HEX, dĺžka amplikónu 100 bp. Cieľová oblasť 0150 S: mutácia N501Y, línia B1.1.7, fluorofor Cy5, dĺžka amplikónu 133 bp. Sekvencie sú dôverné a sú uložené pod číslom EP20306715.2. Zmes bola pripravená na predbežnej doštičke a potom prenesená do 24-jamkovej 26K nanodosky. Potom bola zavedená do prístroja QIAcuity 8, čo je plne automatizovaný systém. Pracovný postup zahŕňal i) krok primovania a valcovania za účelom generovania a izolácie komorových oddielov, ii) krok amplifikácie podľa nasledujúceho cyklického protokolu: 50°C počas 40 minút pre reverznú transkripciu, 95°C počas 2 minút pre aktiváciu enzýmu, 95°C po dobu 5s pre denaturáciu a 60°C po dobu 30s pre žíhanie/predĺženie po dobu 40 cyklov a iii) krok zobrazovania sa uskutočnil načítaním v nasledujúcich kanáloch FAM, HEX a CY5. Celý čas pracovného toku bol v prípade týchto troch krokov približne 2 hodiny. Pokusy sa uskutočňovali s použitím negatívnej kontroly (bez kontroly templátu, NTC) a pozitívnej kontroly (vzorka pacienta bola pomocou nášho rutinného diagnostického testovania potvrdená ako pozitívna pomocou RT-PCR). Všetky reakcie mali najmenej 25 400 oddielov. Dáta sa analyzovali pomocou softvéru QIAcuity Suite Software V1.1.3 (Qiagen, Nemecko) a vyjadrili sa ako kópie/μl.

Mikrosférový imunotest

Vzorky séra mačiek a psov sa testovali pomocou multiplexného mikroskopického imunotestu (MIA). Na zachytenie špecifických sérových protilátok sa použilo 10 μg troch rekombinantných antigénov SARS-CoV-2: nukleoproteín (N), doména viažuca receptor (RBD) a trimérny spike (tri-S). Separátne súpravy mikrosfér MagPlex (Luminex Corp) sa príslušne spojili s vírusovými antigénmi pomocou amínovej spojovacej súpravy (Bio-Rad Laboratories) podľa pokynov výrobcu, zatiaľ čo súprava mikrosfér spojená s rekombinantným ľudským proteínom (O6-metylguanínová DNA metyltransferáza) sa použila ako kontrola v teste. Procedúra MIA sa uskutočňovala tak, ako je opísané v ¹². Stručne povedané, zmesi mikrosfér sa postupne inkubovali chránené pred svetlom na orbitálnej trepačke so vzorkami séra (1: 400), biotinylovaným proteínom A a biotinylovaným proteínom G (každý 4 μg / ml) (Thermo Fisher Scientific) a Streptavidín-R-fykoerytrín (4 μg / ml) (Life technologies). Merania sa uskutočňovali pomocou prístroja Magpix (Luminex). Relatívne fluorescenčné intenzity (RFI) sa vypočítali pre každú vzorku vydelením signálu MFI nameraného pre sady mikrosfér potiahnutých antigénom signálom MFI získaným pre sadu kontrolných mikrosfér, aby sa zohľadnila nešpecifická väzba protilátok na guľôčky. Hraničné hodnoty špecifickej séropozitivity pre každý antigén boli stanovené na tri štandardné odchýlky nad priemernú hodnotu RFI vzoriek séra 29 psov a 30 mačiek odobratých pred rokom 2019. Na základe predpandemickej populácie bola MIA špecificita pre N proteín stanovená na 96,6%. pre psy a mačky, 96,6% pre RBD pre mačky a 100% pre psy a 100% pre tri-S pre mačky a 96,6% pre psy.

Meranie neutralizačnej aktivity

Na meranie neutralizačnej aktivity v sérach mačiek a psov sa použila pseudo častica na báze MLV nesúca reportér GFP pseudotypizovaný špičkou SARS-CoV2 (SARS-CoV-2pp). Každá pozitívna vzorka SARS-CoV2 detegovaná pomocou MIA bola spracovaná neutralizačným postupom, ako bol opísaný v ¹³. Úroveň infekčnosti bola vyjadrená ako % GFP pozitívnych buniek a porovnaná s bunkami infikovanými SARS-CoV-2pp inkubovanými bez séra. Pre-pandemické séra z Francúzska sa použili ako negatívne kontroly a anti-SARS-CoV-2 RBD protilátka sa použila ako pozitívna kontrola.

Prehlásenie o konflikte záujmov

Žiadny z autorov nemá v tejto štúdii žiadny konflikt záujmov (finančný ani osobný).

Financovanie

Štúdia bola financovaná Francúzskou národnou agentúrou pre výskum (ANR-RA-COVID-19; Geografická a časová sérologická štúdia infekcie spoločenských zvierat vírusom SARS-CoV-2 počas druhej vlny COVID-19 vo Francúzsku, CoVet) a projekt IDEXLYON z Université de Lyon ako súčasť „Programu Investissements d’Avenir“ (ANR-16-IDEX-0005) a Institut de Recherche pour le Développement (IRD).

Poďakovanie

Sme vďační majiteľom domácich miláčikov, že nám dali súhlas na odber vzoriek od svojich zvierat. Ďakujeme tiež Dr. Laurentovi Locquetovi a Dr. Altinovi Cala za to, že prispeli ku klinickému manažmentu týchto pacientov. Ďakujeme tiež Franzovi Durandetovi (IAGE – Ingénierie et Analyze en Génétique Environnementale, Grabels, Francúzsko), Alix de Mont-Marin (Innovative Diagnostics, Francúzsko) a Afif M. Abdel Nour (Qiagen, Francúzsko) za pomoc v molekulárnej biológii. Ďalej ďakujeme Françoisovi Loïcovi Cossetovi, Solène Denollyovej, Bertrandovi Bosonovi z CIRI – Centre International de Recherche en Infectiologie, Team EVIR, Univ Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Inserm, U111, UMR5308, ENS Lyon, za vývoj techniky seroneutralizácie. Na záver ďakujeme doktorovi Thierrymu Buronfosseovi za láskavý dar predpandemických sér.

Referencie

1. Rambaut, A., et al. A dynamic nomenclature proposal for SARS-CoV-2 lineages to assist genomic epidemiology. Nature microbiology 5, 1403–1407 (2020).Google Scholar
2. (PHE), P.H.E. Investigation of novel SARS-CoV-2 variant: Variant of concern 202012/01: Technical briefing 6. London: PHE. 13 Feb 2021. Available from: www.gov.uk/government/publications/investigation-of-novel-sars-cov-2-variant-variant-of-concern-20201201 (2021).Google Scholar
3. Leung, K., Shum, M.H., Leung, G.M., Lam, T.T. & Wu, J.T. Early transmissibility assessment of the N501Y mutant strains of SARS-CoV-2 in the United Kingdom, October to November 2020. Euro surveillance: bulletin Europeen sur les maladies transmissibles = European communicable disease bulletin 26 (2021).Google Scholar
4. Barrs, V., et al. SARS-CoV-2 in Quarantined Domestic Cats from COVID-19 Households or Close Contacts, Hong Kong, China. Emerging Infectious Disease journal 26, 3071 (2020).Google Scholar
5. Hosie, M.J., et al. Respiratory disease in cats associated with human-to-cat transmission of SARS-CoV-2 in the UK. bioRxiv, 2020.2009.2023.309948 (2020).Google Scholar
6. Sit, T.H.C., et al. Infection of dogs with SARS-CoV-2. Nature 586, 776–778 (2020).Google Scholar
7. Segalés, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 in a cat owned by a COVID-19-affected patient in Spain. Proceedings of the National Academy of Sciences 117, 24790–24793 (2020).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
8. Challen, R., et al. Risk of mortality in patients infected with SARS-CoV-2 variant of concern 202012/1: matched cohort study. BMJ 372, n579 (2021).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
9. Morris, S.B., et al. Case Series of Multisystem Inflammatory Syndrome in Adults Associated with SARS-CoV-2 Infection – United Kingdom and United States, March-August 2020. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 69, 1450–1456 (2020).CrossRefPubMedGoogle Scholar
10. Valverde, I., et al. Acute Cardiovascular Manifestations in 286 Children With Multisystem Inflammatory Syndrome Associated With COVID-19 Infection in Europe. Circulation 143, 21–32 (2021).Google Scholar
11. Falzone, L., et al. Sensitivity assessment of droplet digital PCR for SARS-CoV-2 detection. Int J Mol Med 46, 957–964 (2020).CrossRefGoogle Scholar
12. Fritz, M., et al. High prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in pets from COVID-19+ households. One Health 11, 100192 (2021).Google Scholar
13. Legros, V., et al. A longitudinal study of SARS-CoV-2-infected patients reveals a high correlation between neutralizing antibodies and COVID-19 severity. Cellular & Molecular Immunology 18, 318–327 (2021).Google Scholar