Dlhá história Beta-d-N4-hydroxycytidínu a jeho moderná aplikácia na liečbu Covid-19 u ľudí a FIP u mačiek.

Niels C. Pedersen DVM, PhD
Originálny článok: The long history of Beta-d-N4-hydroxycytidine and its modern application to treatment of Covid-19 in people and FIP in cats.

Beta-d-N4-hydroxycytidín je malá molekula (nukleozid), ktorá bola študovaná koncom 70. rokov v bývalom Sovietskom zväze ako súčasť výskumu biologických zbraní [2]. Weaponizácia chorôb, ako sú kiahne, bola celosvetovým postrachom, ale nebezpečenstvo použitia vírusu kiahní na tento účel bolo príliš veľké. Pravé kiahne boli zo sveta vykorenené, prakticky všetky zásoby zničené a ďalší výskum zakázaný. To viedlo USA a Sovietsky zväz k výskumu ďalších RNA vírusov ako biologických zbraní a antivirotík na obranu proti nim. Vírus venezuelskej konskej encefalomyelitídy (VEEV) bol jedným z prvých vírusov, u ktorého sa seriózne zvažovalo jeho využitie ako biologickej zbrane [3]. VEEV sa na ľudí prenáša uštipnutím komárom a spôsobuje vysokú horúčku, bolesti hlavy a encefalitídu s opuchmi, ktoré môžu byť smrteľné. Zistilo sa, že beta-d-N4-hydroxycytidín nielenže inhibuje replikáciu VEEV, ale aj širokú škálu alfavírusov vrátane eboly, chikungunya, chrípkového vírusu, norovírusu, vírusu bovinnej diarey, vírusu hepatitídy C a respiračného syncyciálneho vírusu. [3-8]. Prvé správy o inhibičnom účinku beta-d-N4-hydroxycytidínu na ľudský koronavírus NL63 pochádzajú z roku 2006 [9]. Nedávne štúdie potvrdili jeho inhibičný účinok na široké spektrum ľudských a zvieracích koronavírusov [8].

Dôležitá časť novšej histórie beta-d-N4-hydroxycytidínu je spojená s Emory Institute for Drug Development (EIDD) [1], kde dostal experimentálne označenie EIDD-1931. Významnú finančnú podporu na štúdium antivirotík proti alfavírusom v inštitúciách, ako je Emory, poskytovala americká vláda už od roku 2004 [10]. Agentúra na zníženie obranných hrozieb poskytla v roku 2014 inštitucionálnu podporu s cieľom nájsť antivírusovú zlúčeninu proti VEEV a iným alfakoronavírusom. „N4-Hydroxycytidín a jeho deriváty a antivírusové použitia“ boli zahrnuté v patentovej prihláške USA 2016/106050 A1 z roku 2016 [11]. Ďalšie financovanie v roku 2019 poskytol Národný ústav pre alergie a infekcie na partnerský výskum esterifikovaného prekurzora beta-d-N4-hydroxycytidínu (EIDD-2801) na liečbu chrípky [10]. Uvedeným zámerom chemických zmien EIDD-2801 bolo zvýšenie jeho orálnej biologickej dostupnosti, čo by v konečnom dôsledku umožnilo podávať beta-d-N4-hydroxycytidín ako pilulky a nie ako injekcie. V roku 2019/2020 došlo k zmene zamerania výskumu z chrípky na SARS-CoV-2 [2]. Komercializáciou EIDD-2801 bola poverená pobočka Emory s názvom Ridgeway Biotherapeutics, ktorá následne spolupracovala so spoločnosťou Merck na zdĺhavom a nákladnom procese schvaľovania FDA. Aktuálna verzia EIDD-2081 na testovanie v teréne dostala názov Molnupiravir.

Beta-d-N4-hydroxycytidín, účinná látka Molnupiraviru, existuje v dvoch formách ako tautoméry. V jednej forme sa chová ako cytidín s jednoduchou väzbou medzi uhlíkom a skupinou N-OH. Vo svojej ďalšej forme, ktorá napodobňuje uridín, má oxim s dvojitou väzbou medzi uhlíkom a skupinou N-OH. Za prítomnosti beta-d-N4-hydroxycytidínu ho vírusová RNA-dependentná RNA polymeráza číta ako uridín namiesto cytidínu a namiesto guanozínu vkladá adenozín. Prepínanie medzi formami spôsobuje nezhody počas transkripcie, čo má za následok početné mutácie vírusového genómu a zastavenie replikácie vírusu [8].

Snaha spoločnosti Merck o podmienečné a úplné schválenie Molnupariviru FDA pokračuje. Spoločnosť Merck vo svojom vyhlásení uviedla: [12]„V očakávaní výsledkov z programu MOVe-OUT spoločnosť Merck vyrába Molnupiravir na vlastné riziko. Spoločnosť Merck očakáva, že do konca roku 2021 vyrobí 10 miliónov liečebných dávok, pričom v roku 2022 sa očakáva výroba ďalších dávok. Spoločnosť Merck sa zaväzuje poskytovať včasný prístup k lieku Molnupiravir na celom svete, ak bude autorizovaný alebo schválený, a plánuje zaviesť prístup k viacúrovňovým cenám na základe kritérií príjmu krajín Svetovej banky, ktoré budú odrážať relatívnu schopnosť krajín financovať svoju zdravotnú reakciu na pandémiu. V rámci svojho záväzku rozšíriť globálny prístup spoločnosť Merck už skôr oznámila, že uzavrela nevýhradné dobrovoľné licenčné zmluvy na Molnupiravir so zavedenými generickými výrobcami na urýchlenie dostupnosti Molnupiraviru vo viac ako 100 krajinách s nízkymi a strednými príjmami (LMIC) po schválení alebo núdzovom povolení miestnymi regulačnými agentúrami. “ Je nepravdepodobné, že by sa táto „veľkorysosť“ vzťahovala aj na použitie u zvierat.

Lieky na inhibíciu pôvodcu súčasnej pandémie Covid-19 boli v posledných dvoch rokoch predmetom urýchlených terénnych testov a jeden z nich, Remdesivir, bol schválený v rekordnom čase pre použitie u hospitalizovaných pacientov. V minulom roku bol Molnupiravir postúpený k podmienečnému schváleniu ako perorálny liek na domácu liečbu infekcie v počiatočnom štádiu [12]. Účinné zlúčeniny proti koronavírusu však boli vyvíjané už skôr pre inú bežnú a vážnu chorobu mačiek, mačaciu infekčnú peritonitídu (FIP). Tieto lieky zahŕňajú inhibítor proteázy (GC376) [13] a inhibítor RNA dependentnej RNA polymerázy (GS-441524), ktorý je aktívnou zložkou Remdesiviru [14]. Úspech antivírusových liekov pri liečbe FIP podnietil nedávnu štúdiu EIDD-1931 a EIDD-2801 pre ich schopnosti inhibovať FIPV v tkanivových kultúrach [15]. Účinná koncentrácia EC50 pre EIDD-1931 proti FIPV je 0,09 μM, EIDD-2801 0,4 μM a GS441524 0,66 μM [15]. Percento cytotoxicity pri 100 μM je 2.8, 3.8, respektíve 0. Preto sú EIDD-1931 a EIDD-2801 o niečo účinnejšie pri inhibícii vírusov, ale tiež cytotoxickejšie ako GS-441524. Tieto laboratórne štúdie naznačujú, že EIDD-1931 a EIDD-2801 sú vynikajúcimi kandidátmi na liečbu FIP.

Napriek tomu, že EIDD-1931 a EIDD-2801 sú veľkým prísľubom pre liečbu FIP, existuje niekoľko prekážok, kvôli ktorým v blízkej budúcnosti nebude legálne používanie týchto zlúčenín veľmi pravdepodobné. GS-441524, aktívna forma Remdesiviru a patentovaná spoločnosťou Gilead Sciences, bol skúmaný na použitie u mačiek s FIP krátko pred pandémiou Covid-19. Výskum FIP [14] preto podnietil potenciálne použitie Remdesiviru proti vírusu Ebola, a nie koronavírusom podobným SARS [14]. Aj keď boli tieto štúdie realizované v spolupráci s vedcami z Gilead Sciences, spoločnosť odmietla udeliť práva na GS-441524 na liečbu u zvierat, akonáhle bolo zrejmé, že existuje oveľa väčší trh s Covid-19 u ľudí [16]. Podobne moje pokusy za posledné 2-3 roky u Emory, Ridgeback Biotherapeutics a veterinárnej divízie spoločnosti Merck skúmať EIDD-1931 a EIDD2801 pre liečbu FIP u mačiek buď zostali bez odpovede, alebo boli zamietnuté, nepochybne z podobných dôvodov, prečo Gilead odmietol udeliť práva pre GS-441524. Veľká celosvetová potreba liečby FIP však rýchlo podporila neschválený trh s GS-441524 z Číny. Tá istá potreba liečiť FIP nedávno vyvolala záujem o Molnupiravir, tiež z Číny.

Situácia s EIDD-1931 vs. EIDD-2801/Molnupiravir a GS-441524 vs. Remdesivir vyvoláva otázku, prečo sa niektoré lieky pre účely marketingu prevádzajú na proliečivá [17]. Remdesivir bol údajne esterifikovaný, aby sa zvýšila antivírusová aktivita, aj keď štúdie na mačkách ukázali, že GS-441524 a Remdesivir mali podobnú vírusovú inhibičnú aktivitu v tkanivovej kultúre [18]. Zistilo sa však, že Remdesivir sa zle absorbuje orálnou cestou, a preto bol podmienenčne schválený iba pre injekčné použitie. EIDD-2801 bol vytvorený pre zvýšenie orálnej absorpcie EIDD-1931, aj keď predchádzajúci výskum ukázal, že EIDD-1931 je dobre absorbovaný orálne aj bez esterifikácie [6]. Motívy komercializácie Remdesiviru namiesto GS-441524 na humánne použitie boli vedecky spochybnené, pretože tento sa zdá byť v niekoľkých smeroch lepší bez ďalších úprav [17]. Prečo bol pre komercializáciu vybraný EIDD-2801, keď EIDD-1931 by bol lacnejší, 4-násobne účinnejší proti vírusom a o jednu tretinu menej toxický ako EIDD-2801 [15]? Sila patentových práv a dlhá životnosť patentov môžu v týchto rozhodnutiach predstavovať dôležitejšie faktory. [16,17,19].

Jedným z problémov pri liečbe FIP u mačiek sú hematookulárne a hematoencefalické bariéry, ktoré nadobúdajú veľký význam, keď choroba postihne oči a/alebo mozog [13, 14, 20]. Tento problém bol z veľkej časti prekonaný pri liečbe očných a neurologických foriem FIP pomocou GS-441524 postupným zvyšovaním dávkovania na zvýšenie hladín v krvi a tým aj koncentrácie liečiva v komorovom moku a/alebo v mozgu [20]. GC376, jedno z najúčinnejších antivirotík proti vírusu FIP v kultúre [17], nie je účinný proti okulárnej a neurologickej FIP kvôli neschopnosti dostať do týchto miest dostatok liečiva, aj keď sa dávka niekoľkonásobne zvyšuje[14]. Našťastie sa zdá, že EIDD-1931 môže dosiahnuť účinné hladiny v mozgu, ako to naznačujú štúdie na koňoch s infekciou VEEV [3]. Rezistencia na liečivá je ďalším problémom, ktorý sa teraz prejavuje u niektorých mačiek liečených GS-441524, najmä u jedincov s neurologickou formou FIP. Dlhé liečebné procedúry a ťažkosti s transportom dostatočného množstva liečiva do mozgu podporujú rozvoj liekovej rezistencie.

Zásadný význam má krátkodobý a dlhodobý toxický účinok kandidátskeho lieku na testovaného človeka alebo zviera. V bunkových kultúrach vykázal GS-441524 nižšiu toxicitu ako GC376, EIDD-1931 a EIDD-2801 [15]. Najdôležitejšia je však toxicita, ktorá sa prejavuje in vivo. GC376 patrí medzi lieky s najvyšším inhibičným účinkom na koronavírus [15], ale pri podávaní mladým mačiatkam spomaľuje vývoj dospelého chrupu [13]. Počas takmer troch rokov používania GS-441524 v teréne nebola pozorovaná žiadna vážna toxicita, čo odzrkadľuje úplnú absenciu cytotoxických účinkov in vitro pri koncentráciách až 400 µM [18]. EIDD-1931 a EIDD-2801 však vykazujú významnú cytoxicitu pri 100 µM [15]. Preto schopnosť EIDD-1931 vytvárať fatálne mutácie v RNA vyvoláva už nejaký čas množtvo otázok [8, 21, 22]. To bol hlavný dôvod, prečo sa aplikácia na liečbu chorôb stále odkladala. Súčasná odporúčaná doba liečby Covid-19 Molnupiravirom je však v počiatočnom štádiu liečby iba 5 dní [10]. Odporúčaná doba liečby FIP s GS-441524 je ale 12 týždňov [14], čo predstavuje oveľa dlhší čas pre manifestáciu toxicity. Preto bude dôležité dôkladné pozorovanie mačiek pri liečbe EIDD-1931 alebo EIDD-2801, či už ide o krátkodobé alebo dlhodobé účinky.

Všetky doterajšie antivírusové lieky viedli k rozvoju liekovej rezistencie prostredníctvom mutácií vo vírusovom genóme. Aj keď sa Remdesivir javí menej náchylný voči takýmto mutáciám v porovnaní s liekmi používaných pri vírusových ochoreniach, ako je HIV/AIDS, rezistencia je dobre zdokumentovaná [23–25]. Rezistencia voči GS-441524 u mačiek liečených na FIP bola pozorovaná s vyššou frekvenciou, najmä u mačiek s neurologickou FIP, kde je ťažšie dopraviť do mozgu dostatočné množstvo liečiva [13, 14, 20]. Rezistencia voči GS-441524 u mačiek bude tiež pravdepodobne väčším problémom, pretože mačky s FIP sa často liečia 12 týždňov alebo dlhšie, zatiaľ čo Remdesivir (a Molnupiravir) sa odporúčajú užívať iba päť dní počas počiatočného viremického štádia Covid-19 [16]. Problém rezistencie na liečivá je v liečbe HIV/AIDS efektívne zvládnutý použitím kokteilu rôznych liekov súčasne s rôznymi profilmi rezistencie. Mutanty rezistentné na jedno liečivo budú ostatné lieky okamžite inhibovať, čím sa zabráni ich pozitívnej selekcii pri liečbe. Inhibícia rezistencie je obzvlášť silná, ak tieto dva lieky útočia na rôzne proteíny zahrnuté v replikácii vírusu. Napríklad GC376 je inhibítor proteázy [13], zatiaľ čo GS-441524 pôsobí na RNA dependentnú RNA polymerázu [18]. GC376 však nie je tak dobre absorbovaný cez hematoencefalickú bariéru. Aj keď ešte neprebehol potrebný výskum, zdá sa, že medzi GS-441524 a Molnupiravirom nebude existovať žiadna skrížená rezistencia, a pri prechode hematoencefalickou bariérou je rovnako účinný ako GS-441524 [3]. To z Molnupiraviru (alebo 5-hyroxycytidínu) robí dôležitý príspevok pre budúcu liečbu FIP.

Ako sa dalo čakať, Molnupiravir bol nedávno testovaný na mačkách s FIP najmenej jedným čínskym predajcom GS-441524 a predbežné výsledky sú uvedené na webovej stránke FIP Warriors CZ/SK [26]. Terénne testy zahŕňali 286 mačiek s rôznymi formami prirodzene sa vyskytujúcej FIP pozorovaných na klinikách pre domáce zvieratá v USA, Veľkej Británii, Taliansku, Nemecku, Francúzsku, Japonsku, Rumunsku, Turecku a Číne. 286 mačiek, ktoré sa zúčastnili štúdie, vrátane siedmich mačiek s okulárnou (n=2) a neurologickou (n=5) FIP, nedošlo k žiadnemu úhynu. Dvadsať osem z týchto mačiek bolo vyliečených po 4-6 týždňoch liečby a 258 po 8 týždňoch. Všetky liečené mačky boli zdravé aj po 3-5 mesiacoch, čo je obdobie, počas ktorého by sa u neúspešne liečených mačiek očakávali relapsy. Tieto údaje poskytujú presvedčivé dôkazy o bezpečnosti a účinnosti Molnupiraviru pre mačky s rôznymi formami FIP. Dúfame však, že táto terénna štúdia bude napísaná v rukopisnej forme, predložená k recenznému konaniu a uverejnená. Tak či tak, Molnupiravir sa už teraz predáva majiteľom mačiek s FIP. Minimálne jeden ďalší veľký predajca GS-441524 má tiež záujem používať Molnupiravir na FIP, čo naznačuje dopyt po ďalších antivírusových liečivách pre mačky s FIP.

Bezpečné a účinné dávkovanie pre Molnupiravir u mačiek s FIP nebolo publikované. Minimálne jeden predajca z Číny však poskytol iste farmakokinetické dáta a dáta z terénnych testov Molnupariviru u mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou FIP v reklamnom letáku na výrobok s názvom Hero-2081 [26]. Tieto informácie však jasne neuvádzajú množstvo Molnupiraviru v jednej z ich „50 mg tabliet“ a skutočný dávkovací interval (q12h alebo q24h?). Našťastie odhadovanú počiatočnú dávku molnupiraviru pre mačky s FIP je možné získať z publikovaných štúdií o EIDD-1931 a EIDD-2801 in vitro na bunkových kultúrach [15] a laboratórnych a terénnych štúdií GS-441524 [14,18]. Molnupiravir (EIDD-2801) má EC50 0,4 uM/ul proti FIPV v bunkovej kultúre, zatiaľ čo EC50 GS-441524 je asi 1,0 uM/ul [18]. Oba majú podobnú perorálnu absorpciu okolo 40 – 50 %, takže účinná subkutánna (SC) dávka pre Molnupiravir by bola približne polovica odporúčanej 4 mg/kg SC každých 24 hodín začiatočnej dávky pre GS441524 [14] alebo 2 mg/kg SC q24h. Dávka per-os (PO) by sa zdvojnásobila, aby sa zohľadnila menej účinná perorálna absorpcia na dávku 4 mg/kg PO každých 24 hodín. Odhadovanú počiatočnú perorálnu dávku molnupiraviru pre mačky s FIP je možné tiež vypočítať z dostupných údajov o liečbe Covid-19. Pacientom liečeným na Covid-19 sa podáva 200 mg molnupiraviru PO q12h počas 5 dní. Táto dávka bola evidentne vypočítaná z farmakokinetickej štúdie vykonanej na ľuďoch a ak priemerný človek váži 60-80 kg (70 kg), účinná inhibičná dávka je ~ 3,0 mg/kg PO q12h. Mačka má bazálny metabolický pomer 1,5 -krát vyšší ako človek a za predpokladu rovnakej orálnej absorpcie u ľudí aj mačiek by minimálna dávka pre mačky podľa tohto výpočtu bola 4,5 mg/kg PO každých 12 hodín. Za predpokladu, že molnupiravir prechádza cez hematookulárnu bariéru a hematoencefalickú bariéru rovnako efektívne ako GS-441524 [3,18], dávka by sa zvýšila ~1,5 a ~2,0-krát, aby sa umožnila adekvátna penetrácia do komorovej vody a mozgovomiechový mok pre mačky s okulárnou (~ 8 mg/kg PO, q12 h) alebo neurologickou FIP (~ 10 mg/kg PO, q12h). Liečba bude trvať 10-12 týždňov a monitorovanie odpovede na liečbu bude identické s GS-441524 [14, 20]. Tieto odporúčania sú založené na predpokladoch zo zverejnených informácií a budú potrebné ďalšie skúsenosti s Molnupiravirom v tejto oblasti. Nie je pravdepodobné, že Molnupiravir bude na liečbu FIP bezpečnejší a účinnejší ako GS-441524, ale tretie antivírusové liečivo môže byť mimoriadne užitočné pri prevencii rezistencie voči GS-441524 (ako kokteil antivirotík s rôznymi profilmi rezistencie) alebo pri liečbe mačiek, ktoré už nereagujú dobre na GS-441524. Veľkou neznámou je, či bude Molnupiravir bez dlhodobých toxických účinkov, pretože účinná látka N4-hydroxycytidín je mimoriadne účinný mutagén [21] a doba liečby FIP je oveľa dlhšia ako pri Covid-19 a existuje pravdepodobnosť väčších vedľajších účinkov.

Je škoda, že EIDD-1931 (N4-hydroxycytidín), účinnej látke Molnupiraviru, nebola pri liečbe mačiek FIP venovaná väčšia pozornosť ako Molnupiraviru. EIDD-1931 má 4-krát väčší inhibičný účinok proti vírusu ako Molnupiravir (EC50 0,09 oproti 0,4 μM) a percento cytotoxicity je o niečo nižšie (2,3% vs. 3,8% pri 100 μM) [15]. N4-hydroxycytidín je tiež účinne absorbovaný orálnou cestou [3], čo bolo pri vývoji EIDD-2801 (Molnupiravir) bagatelizované. Tento scenár je identický so scenárom GS-441524 vs. Remdesivir, pričom pre komercializáciu bol vybraný druhý z nich – Remdesivir, aj keď súčasný výskum naznačuje, že najlepším kandidátom by bol GS-441524[17].

Referencie

  1. Painter GR, Natchus MG, Cohen O, Holman W, Painter WP. Developing a direct acting, orally available antiviral agent in a pandemic: the evolution of molnupiravir as a potential treatment for COVID-19 [published online ahead of print, 2021 Jun 18]. Curr Opin Virol. 2021;50:17-22. doi:10.1016/j.coviro.2021.06.003
  2. Halford B. An emerging antiviral takes aim at COVID-19. c&en topics. 2020. https://cen.acs.org/pharmaceuticals/drug-development/emerging-antiviral-takes-aim-COVID19/98/web/2020/05.
  3. Painter GR, Richard A. Bowend RA, Bluemling GR et al. The prophylactic and therapeutic activity of a broadly active ribonucleoside analog in a murine model of intranasal Venezuelan equine encephalitis virus infection. Antiviral Res. 2019, 171:104597
  4. Costantini, V.P., Whitaker, T., Barclay, L., Lee, D., McBrayer, T.R., Schinazi, R.F., Vinje,J., 2012. Antiviral activity of nucleoside analogues against norovirus. Antivir. Ther.17 (6), 981–991. https://doi.org/10.3851/imp2229.
  5. Ehteshami, M., Tao, S., Zandi, K., Hsiao, H.M., Jiang, Y., Hammond, E., Amblard, F., Russell, O.O., Merits, A., Schinazi, R.F., 2017. Characterization of beta-d-N(4)-hydroxycytidine as a novel inhibitor of chikungunya virus. Antimicrob. Agents Chemother. 61 (4) e02395-02316. https://doi.org/10.1128/aac.02395-16.
  6. Stuyver, L.J., Whitaker, T., McBrayer, T.R., Hernandez-Santiago, B.I., Lostia, S., Tharnish, P.M., Ramesh, M., Chu, C.K., Jordan, R., Shi, J., Rachakonda, S., Watanabe, K.A., Otto, M.J., Schinazi, R.F., 2003. Ribonucleoside analogue that blocks replication of bovine viral diarrhea and hepatitis C viruses in culture. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 244–254.
  7. Yoon J., Toots M, Lee S, Lee ME, et al., 2018. Orally efficacious broad-spectrum ribonucleoside analog inhibitor of influenza and respiratory syncytial viruses. Antimicrob. Agents Chemother. 2018, 62(8): https://doi.org/10.1128/aac.00766-18
  8. Urakova N, Kuznetsova V, Crossman DK, Sokratian A, Guthrie DB, Kolykhalov AA, et al. β-d-N4Hydroxycytidine is a potent anti-alphavirus compound that induces a high level of mutations in the viral genome. J Virol. 2018, 92:e01965–e01917. doi: 10.1128/JVI.01965-17.
  9. Pyrc, K., Bosch, B.J., Berkhout, B., Jebbink, M.F., Dijkman, R., Rottier, P., van der Hoek,L., 2006. Inhibition of human coronavirus NL63 infection at early stages of the replication cycle. Antimicrob. Agents Chemother. 2006, 50(6):2000–2008. https://doi.org/10.1128/aac.01598-05.
  10. Whitfill T. A likely new treatment for Covid-19 was made possible by government-funded innovation. STAT+. https://www.statnews.com/2021/10/05/government-funding-backed-molnupiravir-possible-newcovid-19-treatment/.
  11. Painter, G.R., Guthrie, D.B., Bluemling, G., Natchus, M.G. N4-Hydroxycytidine and Derivatives and Antiviral Uses Related Thereto. US Patent Application, 2016, 2016/106050 A1.
  12. Merck news release, October 1, 2021. https://www.merck.com/news/merck-and-ridgebacksinvestigational-oral-antiviral-molnupiravir-reduced-the-risk-of-hospitalization-or-death-by-approximately-50percent-compared-to-placebo-for-patients-with-mild-or-moderat/.
  13. Pedersen NC, Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC, Eckstrand C, Groutas WC, Bannasch M, Meadows JM, Chang KO. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2018, 20(4):378-392.
  14. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, Montgomery E, Murakami E, Liepnieks M, Liu H. efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2019, 21(4):271-281.
  15. Cook SE, Vogel H and D. Castillo D. A rational approach to identifying effective combined anticoronaviral therapies against feline coronavirus. 2021. bioRxiv 2020.07.09.195016; doi: https://doi.org/10.1101/2020.07.09.195016
  16. Zhang S. A Much-Hyped COVID-19 Drug Is Almost Identical to a Black-Market Cat Cure. May 8, 2020 Shutterstock / The Atlantic, https://www.theatlantic.com/science/archive/2020/05/remdesivir-cats/611341/.
  17. Yan VC, Muller FL. Advantages of the Parent Nucleoside GS-441524 over Remdesivir for Covid-19 Treatment. ACS Medicinal Chemistry Letters. 2020, 11 (7):1361-1366 DOI: 10.1021/acsmedchemlett.0c00316
  18. Murphy BG, Perron M, Murakami E, Bauer K, Park Y, Eckstrand C, Liepnieks M, Pedersen NC. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies.Vet Microbiol. 2018, 219:226-233.
  19. Common Dreams. Public citizen. Press release, August 4, 2020, https://www.commondreams.org/newswire/2020/08/04/public-citizen-scientists-gilead-and-federalscientists-have-neglected
  20. Dickinson PJ. Coronavirus Infection of the Central Nervous System: Animal Models in the Time of Covid-Front. Vet. Sci. 2020, 23: https://doi.org/10.3389/fvets.2020.584673
  21. Zhou S, Hill CS, Sarkar S, et al., β-d-N4-hydroxycytidine Inhibits SARS-CoV-2 through lethal mutagenesis but Is also mutagenic to mammalian cells. J Infect Dis. 2021, 224:415–419, https://doi.org/10.1093/infdis/jiab247.
  22. Cohen J, Piller C. Emails offer look into whistleblower charges of cronyism behind potential COVID-19 drug. ScienceInsider-Health. 2020, https://www.science.org/news/2020/05/emails-offer-look-whistleblowercharges-cronyism-behind-potential-covid-19-drug.
  23. Agostini ML, Andres EL, Sims AC, et al. Coronavirus susceptibility to the antiviral remdesivir (GS-5734) is mediated by the viral polymerase and the proofreading exoribonuclease. MBio 2018; 9. DOI:
    10.1128/mBio.00221-18.
  24. Szemiel AM, Merits A, Orton RJ, In vitro selection of Remdesivir resistance suggests evolutionary predictability of SARS-CoV-2. Plos Path, 2021,https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009929 .
  25. Martinot M, Jary A, Fafi-Kremer S, et al., Emerging RNA-Dependent RNA Polymerase Mutation in a Remdesivir-Treated B-cell Immunodeficient Patient With Protracted Coronavirus Disease 2019, Clinical Infectious Diseases, 2020;, ciaa1474, https://doi.org/10.1093/cid/ciaa1474
  26. FIP Warriors CZ/SK – EIDD-2801 (Molnupiravir) https://www.fipwarriors.eu/en/eidd-2801-molnupiravir/
Prečítať “Dlhá história Beta-d-N4-hydroxycytidínu a jeho moderná aplikácia na liečbu Covid-19 u ľudí a FIP u mačiek.”

ZHRNUTIE LIEČBY FIP POMOCOU GS-441524 (Dr. Pedersen)

Pôvodný článok: SUMMARY OF GS-441524 TREATMENT FOR FIP
Niels C. Pedersen, DVM PhD, emeritný profesor,
Stredisko pre zdravie spoločenských zvierat, škola veterinárneho lekárstva, UC Davis

Na monitorovanie liečby používame rovnaké kritériá, aké sú opísané v klinickej štúdii publikovanej v JFMS (Journal of Feline Medicine and Surgery). Majitelia by mali v denných alebo týždenných intervaloch sledovať teplotu, váhu, aktivitu, chuť do jedla a klinické príznaky pôvodného ochorenia. Krvné testy – hematológia a biochémia (vrátane hodnôt sérových bielkovín – celkový proteín, albumín, globulín, pomer A:G) na začiatku liečby a potom každé 4 týždne. Je vždy užitočné, keď sa tieto hodnoty spolu s hmotnosťou aktualizujú vo forme grafu. Cieľom je mať zdravú, čulú a aktívnu mačku na konci 12 týždňov liečby a s normálnymi hodnotami krvných testov, najmä pokiaľ ide o pomery hematokritu, celkového proteínu, globulínu, albumínu a A: G. Výrazné zvýšenie hmotnosti je tiež dobrým znamením, a niektoré mladé alebo obzvlášť vychudnuté mačky môžu počas liečby viac ako zdvojnásobiť svoju váhu. Jedná sa samozrejme o idealizovanú liečbu, a treba počítať s tým, že bude pravdepodobne potrebné upraviť dávkovanie smerom nahor, ak je odpoveď pomalá, alebo ak sa počas liečby prejavia komplikácie, ako napríklad okulárne alebo neurologické postihnutie.

Pre stabilizáciu mačiek, ktoré sú kriticky choré v čase diagnózy, alebo počas prvých dní liečby GS-441524 (GS), môže byť potrebná podporná (symptomatická) starostlivosť. Abdominálny výpotok by sa nemal odsávať, pokiaľ neutláča hrudník a nezasahuje do dýchania, pretože sa rýchlo nahradí na úkor zvyšku tela. Hrudné výpotky sú však zvyčajne spojené s rôznym stupňom dyspnoe a mali by sa odstrániť. Hrudné výpotky sa vracajú oveľa pomalšie. Symptomatická starostlivosť tiež často zahŕňa tekutiny a elektrolyty na potlačenie dehydratácie, antibiotiká pri podozrení na sekundárnu bakteriálnu infekciu a protizápalové lieky (zvyčajne systémové kortikosteroidy) a zriedkavo krvnú transfúziu. U niektorých mačiek s postihnutím oka môžu byť potrebné aj lokálne lieky na potlačenie závažného zápalu a zvýšeného vnútroočného tlaku (glaukóm).

Kortikosteroidy, ako je prednizolón, by sa mali používať len počas prvých dní liečby GS a mali by sa vysadiť, keď dôjde k rýchlemu zlepšeniu zdravotného stavu. Dlhodobé používanie kortikosteroidov s GS sa dôrazne neodporúča, pretože môže maskovať príznaky zlepšenia spôsobené GS, najmä u mačiek s neurologickou FIP, nemá žiadnu liečebnú moc a môže interferovať s vývojom ochrannej imunitnej odpovede na vírus FIP. Je možné, že táto imunitná odpoveď hrá hlavnú úlohu v konečnom vyliečení. Ak sú mačky na chronickej liečbe steroidmi, nie je potrebné znižovať dávku, pretože neexistuje dôkaz, že by sa u mačiek vyskytla závažná atrofia nadobličiek, ku ktorej dochádza u ľudí pri dlhodobej liečbe steroidmi. Mnohí majitelia, poradcovia pre liečbu GS a veterinári budú používať rôzne propagované doplnky na zlepšenie zdravia pečene, obličiek alebo imunitného systému, ako aj vitamíny ako B12. Tieto látky nemajú preukázanú účinnosť a považujem ich za vyhodené peniaze.

Liečba injekčnou formou GS, ktorá je najbežnejšia, sa môže tiež skomplikovať vredmi/léziami v mieste vpichu. Liečba je ťažká pre majiteľov aj pre mačky, pretože injekcie môžu byť bolestivé. U niektorých mačiek, najmä u tých s neurologickým postihnutím, nastáva problém s vývojom čiastočnej liekovej rezistencie, ktorá si vyžaduje zvyšovanie dávky. Reakcia na liečbu je zvyčajne do 24-72 hodín a väčšina mačiek sa vráti do normálu, alebo sa blíži k normálu v priebehu 2-4 týždňov, čo je dobré znamenie. Predpokladáme, že miera úspešnosti liečby FIP s GS-441424 je viac ako 80%, s ohľadom na zlyhanie liečby v dôsledku nesprávnej diagnózy FIP, neprimerané dávkovanie, komplikácie zdravotného stavu a rezistenciu na lieky. Mladé mačky sa liečia ľahšie a majú vyššiu mieru vyliečenia, ako mačky staršie 7 rokov. Mačky s vlhkou alebo suchou FIP, s nekomplikovanými neurologickými alebo očnými symptómami sa liečia ľahšie, ako mačky s neurologickou FIP.

Počiatočná dávka pre mačky s vlhkou alebo suchou FIP bez známok očného alebo neurologického ochorenia, je 4-6 mg/kg denne počas 12 týždňov, pričom u mladších mačiek a vlhkej FIP je tendencia smerovať k dolnej hranici a suché prípady k hornej hranici. Mačky s očnými léziami a bez neurologických príznakov začínajú s dávkou 8 mg/kg denne počas 12 týždňov. Mačky s neurologickými príznakmi začínajú na dennej dávke 10 mg/kg po dobu 12 týždňov. Ak sa u mačiek s vlhkou alebo suchou FIP na začiatku objavia očné alebo neurologické príznaky, prechádzajú na príslušné očné alebo neurologické dávky. Existuje orálna forma GS dostupná najmenej z dvoch zdrojov z Číny (Spark, Mutian), ale nepoužívam ju, takže nepoznám porovnateľné dávkovanie. Neodporúčam to však, pokiaľ injekčná dávka stúpne nad 10 mg/kg denne, pretože účinnosť orálnej absorpcie pri týchto vysokých dávkach klesá.

Odporúčam dávkovanie upraviť týždennou kontrolou hmotnosti. Prírastok hmotnosti môže byť u mnohých z týchto mačiek obrovský, a to buď preto, že sú na začiatku tak vychudnuté, alebo rastú, prípadne oboje. Ak dôjde k úbytku hmotnosti na začiatku liečby, zostávam na pôvodnom dávkovaní a neznižujem ho. Neschopnosť naberať váhu počas liečby sa považuje za zlé znamenie. Nezvyšujeme dávku, pokiaľ na to nie sú závažné dôvody, ako napríklad zhoršenie stavu, alebo sa nezlepšujú výsledky krvných testov, pomalé zlepšenie, slabá úroveň aktivity, obnovenie pôvodných klinických príznakov, alebo zmena formy ochorenia zahrňujúca aj očné alebo neurologické príznaky. Tu prichádza na rad zdravý úsudok, pretože sa nechcete zaseknúť na jednej hodnote krvi, ktorá nie je celkom bežná, ale nemá vplyv na celkový zdravotný stav mačky. Napríklad globulín môže byť stále trochu vysoký, ale ďalšie dôležité hodnoty krvných testov a zdravotný stav sú veľmi dobré. Ak existuje dobrý dôvod na zvýšenie dávky, malo by to byť vždy od +2 do +5 mg/kg denne a minimálne po dobu 4 týždňov. Ak tieto 4 týždne spôsobia predĺženie 12-týždňového trvania liečby, je to kvôli tejto úprave dávky. Dá sa očakávať pozitívna reakcia na akékoľvek zvýšenie dávky, a pokiaľ nevidíte zlepšenie, znamená to, že dávka stále nie je dostatočne vysoká, objavuje sa rezistencia na lieky, máte zlú značku GS, mačka nemá FIP , alebo existujú iné choroby, ktoré liečbu ovplyvňujú.

Jedným z najťažších rozhodnutí je určiť, kedy ukončiť liečbu. Hoci niektoré mačky, často mladšie s vlhkou FIP, môžu byť vyliečené už za 8 týždňov, a možno aj skôr, zvyčajná doba trvania liečby je 12 týždňov. Niektoré mačky môžu dokonca vyžadovať úpravu dávkovania a dlhšie obdobia liečby. Kritické krvné hodnoty, ako je hematokrit, hladina celkového proteínu, albumínu a globulínu a celkový počet bielych krviniek a absolútny počet lymfocytov sa zvyčajne u liečených mačiek normalizujú po 8-10 týždňoch, kedy často dochádza k neočakávanému zvýšeniu úrovne aktivity. Predpokladá sa, ale nie sú na to ešte dôkazy, že po 8-10 týždňov sa u mačky objaví vlastná imunita voči infekcii. Toto je situácia, ktorá sa vyskytuje pri liečbe hepatitídy C u ľudí, čo je tiež chronická infekcia spôsobená RNA vírusom, ktorá si často vyžaduje až 12 alebo viac týždňov antivírusovej liečby.

Nanešťastie neexistuje jednoduchý test, ktorý by určil, kedy došlo k vyliečeniu, a strach z relapsu často vedie majiteľov, liečebných poradcov a veterinárov k predĺženiu liečby nad hranicu 84 dní. Strach z relapsov tiež spôsobí, že ľudia zapojení do rozhodovacieho procesu budú príliš opatrní, pokiaľ ide o jednu hodnotu krvi, ktorá je trochu abnormálna (napr. mierne vysoký globulín alebo mierne nízky pomer A:G), alebo výsledky konečného ultrazvuku naznačujúce podozrivo zväčšené lymfatické uzliny, malé množstvo tekutiny v brušnej dutine, alebo nejasné nepravidelnosti v orgánoch, ako sú obličky, slezina, pankreas alebo črevá. Je potrebné pamätať na to, že do normálneho rozsahu krvných hodnôt síce spadá väčšina zvierat, ale inak sú to krivky v tvare zvona, a že sa nájde pár výnimočných pacientov, ktorí budú mať hodnoty na okraji týchto kriviek. Diagnóza podľa ultrazvuku musí vziať do úvahy stupeň patológie, ktorá sa môže vyskytnúť v brušnej dutine postihnutou FIP, ako napríklad jazvy alebo niektoré následky vo forme zmien orgánov u úspešne liečených mačiek. V situáciách, keď také otázky vyvstávajú, je lepšie pozrieť sa podrobnejšie na celkový obraz, a nielen na jednu malú časť. Najdôležitejším výsledkom liečby je návrat k normálnemu zdraviu, ktorý má dve zložky – vonkajšie príznaky zdravia a vnútorné príznaky zdravia. Medzi vonkajšie príznaky zdravia patrí návrat k normálnej úrovni aktivity, chuť k jedlu, primerané zvýšenie hmotnosti alebo rast a kvalita srsti. Posledne menované sú pre mačku často jednými z najlepších meradiel zdravia. Vnútorné príznaky zdravia sa prejavujú návratom určitých kritických hodnôt k normálu na základe periodického sledovania úplného krvného obrazu a biochémie. Najdôležitejšie hodnoty v krvnom obraze sú hematokrit a relatívny a absolútny celkový počet bielych krviniek, neutrofilov a lymfocytov. Najdôležitejšie hodnoty v biochémii (alebo sérovej elektroforéze) sú hladiny celkového proteínu, globulínu, albumínu a pomer A: G. Bilirubín je u mačiek často zvýšený pri efúznej FIP a môže byť užitočný pri monitorovaní závažnosti a trvania zápalu. V hematologických a biochemických paneloch existuje veľa ďalších hodnôt a nie je nič neobvyklé, že niektoré z nich sú o niečo vyššie alebo nižšie ako normálne, a je lepšie tieto hodnoty ignorovať, pokiaľ nie sú výrazne zvýšené a nie sú spojené s klinickými príznakmi – napríklad vysoká urea a kreatinín, ktoré sú tiež spojené so zvýšenou spotrebou vody, nadmerným močením a abnormalitami v analýze moči. Počet krvných doštičiek strojovo je u mačiek notoricky nízky v dôsledku traumy z odberu krvi a zhlukovania krvných doštičiek, a mal by sa vždy overiť manuálnym vyšetrením krvných náterov. Konečné rozhodnutie o ukončení alebo predĺžení liečby, keď sa stretnete s nejasnými pochybnosťami o rôznych testovacích postupoch, by malo vždy vychádzať z vonkajších prejavov zdravia viac, ako z ktoréhokoľvek jednotlivého výsledku testu.

Rôzne FIP skupiny prišli s rôznymi modifikáciami liečby FIP. Niektoré skupiny budú od začiatku liečiť mimoriadne vysokou dávkou GS namiesto toho, aby dávku zvyšovali iba vtedy, keď je to indikované, alebo v posledných dvoch týždňov navýšia dávkovanie GS, alebo o ďalšie dva týždne pretiahnu liečbu s vyššou dávkou GS v nádeji, že môžu skrátiť dobu trvania liečby, či znížiť pravdepodobnosť relapsu. Niektorí obhajujú použitie interferónu omega alebo nešpecifických imunostimulantov na ďalšiu stimuláciu imunitného systému, a niektorí používajú rôzne ďalšie modifikácie. Neexistuje žiadny dôkaz, že modifikácia liečby extra vysokou dávkou zlepší rýchlosť vyliečenia. Podobne interferón omega a nešpecifické imunostimulanty nemajú žiadne preukázané priaznivé účinky pri FIP, keď sa podávajú ako jediná liečba alebo ako doplnky ku GS. Objavuje sa aj prax pridávania ďalšieho antivírusového lieku, inhibítora vírusovej proteázy GC376, k liečbe GS u mačiek, u ktorých sa vyvíja rezistencia na GS, ale táto možnosť ešte vyžaduje výskum. Nakoniec je bežné, že majitelia, liečebné skupiny a veterinárni lekári pridávajú mnohé doplnky, toniká alebo injekcie (napr. B12) na zvýšenie hladín v krvi alebo na prevenciu ochorenia pečene alebo obličiek. Takéto doplnky sú zriedka potrebné u mačiek s čistou chorobou FIP.

Relapsy FIP počas 12-týždňového pozorovacieho obdobia po liečbe sa vyskytujú, a neexistuje jednoduchý krvný test na predpoveď, či došlo k vyliečeniu, alebo je možný relaps. Relapsy zvyčajne zahŕňajú infekcie, ktoré prenikli do centrálneho nervového systému (mozog, chrbtica, oči) počas liečby vlhkej alebo suchej FIP, ktorá nebola sprevádzaná neurologickými alebo okulárnymi príznakmi. Dávka GS-441524 používaná na liečbu týchto foriem FIP je často nedostatočná na účinné prekonanie hematoencefalickej alebo hematookulárnej beriéry. Hematoencefalická bariéra je nepriestupnejšia ako hematookulárna bariéra, čo vysvetľuje, prečo sa lézie očí dajú liečiť ľahšie ako infekcie mozgu alebo chrbtice. Relapsy, ktoré sa vyskytnú v období po liečbe, a ktoré zahŕňajú oči, mozog alebo chrbticu sa zvyčajne liečia najmenej 8 týždňov pri začiatočnej dennej dávke najmenej o 5 mg / kg vyššej, ako je dávka použitá počas primárnej liečby (napr. 10, 12, 15 mg/kg denne). Odporúča sa nepoužívať perorálne formy GS, ak dávka presahuje 10 mg/kg injekčnej formy denne, pretože pri vysokých perorálnych koncentráciách je znížená účinnosť absorpcie v čreve. U mačiek, ktoré sa nedajú vyliečiť z infekcie pri dávkach až 15 mg/kg denne, sa pravdepodobne vyvinula rôzna miera rezistenice voči GS-441524. Čiastočná rezistencia môže umožniť udržanie príznakov ochorenia pod kontrolou, ale nie vyliečenie, zatiaľ čo celková rezistencia sa prejavuje rôznou závažnosťou klinických príznakov počas liečby.

V čase diagnostiky môže existovať rezistencia na GS-441524, čo je však neobvyklé. Skôr sa objavuje počas liečby, a na začiatku je často čiastočná a vedie k potrebe vyššieho dávkovania. U niektorých mačiek sa môže stať úplnou. Rezistencia je najväčším problémom u mačiek s neurologickým ochorením, najmä u tých, ktoré majú neurologické príznaky, alebo sa u nich vyvine mozgová infekcia počas liečby, alebo počas relapsu po tom, čo sa liečba javila ako úspešná. Mnoho mačiek s čiastočnou rezistenciou na lieky môže byť liečené na príznaky choroby, ale relaps sa objaví hneď po ukončení liečby. Mačky sa „liečili“ na FIP už viac ako rok bez vyliečenia, ale nakoniec sa rezistencia zhoršuje, alebo majiteľovi dôjdu peniaze.

Liečba GS-441524 vykazuje žiadne, alebo len minimálne systémové vedľajšie účinky. Môže spôsobiť mierne poškodenie obličiek u niektorých mačiek, ale nemala by viesť k zlyhaniu obličiek. Systémové liekové reakcie typu vaskulitídy sa pozorovali u niekoľkých mačiek a možno ich zameniť s reakciami v mieste vpichu. Tieto liekové reakcie sú však v miestach, kde sa nepodávajú injekcie, a často sa stratia samé, alebo dobre reagujú na krátkodobú nízku dávku steroidov. Hlavným vedľajším účinkom liečby GS je bolesť v miestach vpichu, ktorá sa líši od mačky k mačke a podľa schopností osoby, ktorá injekcie aplikuje (zvyčajne majiteľ). Vredy/lézie v mieste vpichu sú u niektorých mačiek problém, a zvyčajne k nim dôjde, keď sa miesto vpichu nestrieda (nezdržujte sa medzi ramenami) a nepodáva sa do svalových a nervových vrstiev pod podkožím. Odporúčam zvoliť miesta začínajúce jeden palec za lopatkami, dole od chrbta po 1 až 2 palce pred chvostovou časťou a jednu tretinu až polovicu cesty dole k hrudníku a bruchu. Mnoho ľudí používa gabapentín pred injekciami na zmiernenie bolesti. Vredy v mieste vpichu sa zbavia okolitých chlpov a jemne sa čistia 4 alebo viackrát denne sterilnými vatovými tyčinkami namočenými v zriedenom roztoku peroxidu vodíka pre domácnosť v pomere 1:5. Zvyčajne nevyžadujú žiadne zložitejšie ošetrenie a vyliečia sa asi za 2 týždne.

Dúfame, že čoskoro bude k dispozícii legálna forma GS-441524. Liečivo s názvom Remdesivir je najväčšou súčasnou nádejou, pretože Remdesivir sa pri intravenóznom podaní ľuďom, myšiam, primátom a mačkám okamžite rozkladá na GS. Remdesivir dostal plné schválenie americkej FDA, a podobné schválenie bude pravdepodobne nasledovať aj v ďalších krajinách. Ak to tak bude, môže ho predpisovať akýkoľvek humánny lekár s licenciou a veterinári. Použitie Remdesiviru v USA sa však stále obmedzuje na konkrétnu podskupinu pacientov s Covid-19 a len za kontrolovaných podmienok a s pokračujúcim zberom údajov. Kým nebudú zrušené všetky obmedzenia, nebude ľahko dostupný ani pre ľudské použitie. Nemám skúsenosti s liečbou mačiek Remdesivirom namiesto GS-441524. Skupiny v Austrálii a niektorých ázijských krajinách však začínajú Remdesivir používať a hlásia rovnaké výsledky ako s GS-441524. Dávkovanie Remdesiviru na molárnom základe je teoreticky rovnaké ako GS-441524. Voľná ​​báza GS-441524 má molekulovú hmotnosť 291,3 g/M, zatiaľ čo Remdesivir má 602,6 g/M. Preto na získanie 1 mg GS-441524 by bolo potrebné dvakrát viac Remdesiviru (602,6/291,3=2,07). Rozpúšťadlo pre Remdesivir sa výrazne líši od rozpúšťadla používaného pre GS-441524 a je určené na IV použitie u ľudí. Nie je známe, ako sa bude zriedený Remdesivir správať pri subkutánnej aplikácii počas 12 alebo viac týždňov dlhej liečbe. U ľudí sa pri Remdesivire pozorovali mierne príznaky hepatotoxicity a nefrotoxicity. GS-441524 spôsobuje miernu a neprogresívnu renálnu toxicitu u mačiek, ale bez zjavnej pečeňovej toxicity. Nie je isté, či renálna toxicita pozorovaná u ľudí, ktorým bol podávaný Remdesivir, je spôsobená jeho aktívnou zložkou (t.j. GS-441524) alebo chemickými prísadami určenými na zvýšenie antivírusovej aktivity. O schválenie GC376 pre mačky (a ľudí) sa snaží spoločnosť Anivive, ale bude to trvať ešte dva alebo viac rokov. GC376 je inhibítor vírusovej proteázy a pôsobí odlišne ako GS-441524, ktorý inhibuje rané štádium replikácie vírusovej RNA. Preto je nepravdepodobné, že bude mať významný synergický vírusový inhibičný účinok, bude ale oveľa dôležitejší pri inhibícii liekovej rezistencie, keď sa použije v kombinovanej terapii (ako napríklad kombinovaná antivírusová terapia pre HIV/AIDS).

Prečítať “ZHRNUTIE LIEČBY FIP POMOCOU GS-441524 (Dr. Pedersen)”

Mačacia infekčná peritonitída (FIP): Nádej pre mačky na obzore

Sam Taylor, BVetMed (Hons), CertSAM, MANZCVS, DipECVIM-CA, FRCVS a Emi Barker BSc (Hons), BVSc (Hons), PhD, DipECVIM-CA, MRCVS sumarizujú myšlienky o prejavoch a diagnostike tejto choroby a predstavujú novú éru liečby.

Emi BarkerSamantha Taylor, VetTimes Volume 51, Issue 32, Pages 16-19 | August 31, 2021
Pôvodný článok: Feline infectious peritonitis: hope on the horizon for cats

Obrázok 1. „Klasická“ Mačka s “klasickou” FIP s objemným brušným výpotkom. Obrázok: Feline Center, Langford Vets, University of Bristol

FIP je spôsobený virulentnými mutáciami mačacieho koronavírusu (FCoV), ktoré ho transformujú z miernej a enterickej infekcie na závažné systémové ochorenie.

Rovnako ako ostatné koronavírusy, FCoV je veľký obalený RNA vírus – to je dôležité, keď vezmeme do úvahy vyhýbanie sa imunitnému systému, prežitie v prostredí, detekciu, liečbu a prevenciu. FIP má vysokú úmrtnosť a až donedávna boli liečebné postupy relatívne neúčinné.

Tento článok sumarizuje súčasné názory o prejavoch a diagnostike tejto choroby. Predstavuje tiež novú éru liečby FIP v súvislosti s nedávnou dostupnosťou legálnych liekov vo Veľkej Británii.

Čo spôsobuje FIP?

FCoV je alfakoronavírus, ktorý infikuje domáce mačky a iné mačky. Je z rovnakého rodu ako psí enterický koronavírus a vírus gastroenteritídy ošípaných. FCoV nemôže infikovať ľudí a je iba vzdialene príbuzný so SARS-CoV-2, betacoronavírusom a pôvodcom ochorenia COVID-19.

FCoV, ako biotyp mačacieho enterického koronavírusu (FECV), sa bežne deteguje vo výkaloch – najmä u mačiek žijúcich v domácnostiach s viacerými mačkami. Infekcia sa typicky šíri fekálno-orálnou cestou, keď sú mačiatka alebo mladé mačky v kontakte s mačkami vylučujúcimi. Šance na prežitie tohto obaleného vírusu v prostredí sú vo všeobecnosti zlé, pokiaľ nie je vírus uzavretý vo výkaloch, a je citlivý na väčšinu dezinfekčných prostriedkov.

U niektorých mačiek a v určitom okamihu po počiatočnej infekcii -medzi replikáciou vírusu v enterocytoch a účinnou replikáciou v makrofágoch a monocytoch – menej virulentný FECV mutuje do virulentnej formy spojenej s FIP – to znamená biotyp vírusu FIP (FIPV). V géne hrotového proteínu boli nájdené určité mutácie súvisiace s týmto prechodom, hoci žiadna z nich ešte nie je patognomonická pre FIP.

Vysoká frekvencia genomických mutácií – znak RNA vírusov – môže tiež uľahčiť vyhýbanie sa imunitnej odpovedi hostiteľa a poháňať tkanivový tropizmus, čo vedie k rôznym prejavom choroby. Prirodzený priamy prenos FIPV medzi mačkami sa považuje za zriedkavý, pričom sa všeobecne verí, že FIPV – a následne FIP – vzniká v dôsledku novej mutácie u FCoV individuálne infikovanej mačky.

Obrázok 2. Mierna žltačka a bledosť u mačky s FIP.

Jednou z mnohých komplexností FCoV a FIP je, že infekcia sa prejavuje mnohými rôznymi spôsobmi v závislosti od vírusových faktorov, ako sú kmeň a dávka, ale aj od imunitnej reakcie mačky a genetických faktorov.

Zdá sa, že silná bunkovo sprostredkovaná imunitná (CMI) reakcia na FCoV poskytuje ochranu pred FIP. Naproti tomu mačky s prevažne protilátkovo sprostredkovanou odpoveďou so slabou reakciou CMI typicky podľahnú efuzívnej „vlhkej“ forme choroby v dôsledku imunitne sprostredkovanej vaskulitídy, zatiaľ čo u mačiek so strednou CMI sa vyvinú tkanivové granulómy typické pre neefuzívnu „suchú“ formu FIP.

Je dôležité mať na pamäti, že efuzívna a neefuzívna forma FIP sa môžu výrazne prekrývať, čo vedie k širokému spektru symptómov; krátke epizódy efuzívnej formy FIP môžu nastať skôr, ako prevládne neefuzívna forma a naopak, v terminálnych štádiách neefuzívnej formy FIP sa môžu vytvárať výpotky. Mnoho mačiek s výpotkom má navyše tkanivové granulómy.

Klinické príznaky

Klasická prezentácia mladej mačky s ascitom bohatým na proteíny (obrázok 1) môže ponúknuť jednoduchšiu diagnostiku; ostatné mačky však môžu byť skôr diagnostickou výzvou. Medzi bežné nešpecifické príznaky patria letargia, anorexia a chudnutie.

Postihnuté mačky môžu byť febrilné so strednou horúčkou, typicky nižšou ako 40°C, ktorá často kolíše a zle reaguje na NSAID (nesteroidné antiflogistiká alebo nesteroidné protizápalové látky) alebo antimikrobiálne látky, a ikterus, ak je prítomný, je zvyčajne mierny (obrázok 2).

Obrázok 3. Hyféma, uveitída a hypopyón u mačky s okulárnou FIP.

Viskózne výpotky s vysokými hladinami bielkovín sa tvoria u približne 80% mačiek s FIP – väčšina (približne 85%) zahŕňa brušnú dutinu, kým menej prípadov vykazuje výpotok v hrudnej dutine (približne 20%).

Občas sa pozorujú perikardiálne výpotky, aj keď len zriedka spôsobujúce tamponádu, a veľmi zriedkavo sa vyskytujú skrotálne výpotky u nekastrovaných mačiek.

Pyogranulomatózne lézie sa môžu vyskytnúť v akomkoľvek tkanive, a zatiaľ čo bežne zahŕňajú brušné orgány (napríklad mezenterické lymfatické uzliny a obličky), ochorenie môže byť obmedzené na iné orgány, ako sú oči, mozog alebo miecha.

Očné príznaky zahŕňajú uveitídu, keratické zrazeniny, hypopyón, hyfému (obrázok 3) a retinitídu. Neurologické príznaky zahŕňajú ataxiu, záchvaty, nystagmus, hyperestéziu a zmeny správania/mentácie.

Diagnostika

Napriek tomu, že jedna abnormalita sama osebe neurčuje diagnózu FIP, ani ich absencia diagnózu nevylučuje, veterinár môže podozrenie na FIP postaviť na nasledujúcich zisteniach, pričom má na pamäti signalizáciu, klinický obraz, klinickú patológiu a výsledky zobrazovacích metód, ak nie je prítomná alternatívna diagnóza, pravdepodobnejšie vysvetlenie:

Obrázok 4. MRI sken mačky s FIP ukazujúci obštrukčný hydrocefalus a zvýšenie kontrastu mozgových blán.
  • Klinické vyšetrenie – môže odhaliť horúčku, ikterus, abdominálnu distenziu (ascites; organomegáliu), chorioretinitídu, ataxiu, deficity hlavových nervov.
  • Analýza krvi – lymfopénia, neregeneratívna anémia, mikrocytóza, neutrofília, hyperglobulinémia, nízky pomer albumín/globulín (A:G; klasicky menej ako 0,4), hyperbilirubinémia, vysoký α-1 kyslý glykoproteín (často výrazne zvýšený, viac ako 1,5 mg/ml).
  • Diagnostické zobrazovanie – výpotky, lézie v brušných orgánoch, abnormality CNS konzistentné so zosilnením meningeálnej oblasti a/alebo obštrukčný hydrocefalus (obrázok 4).
  • Analýza efúzie – neseptický pyogranulomatózny zápal s relatívne nízkym počtom buniek (celkový počet jadrových buniek vyšší ako 5 × 109/l; hlavne neutrofily a makrofágy) s vysokou koncentráciou bielkovín (často vyššou ako 35g/l) a nízkym A:G (obrázok 5).
  • Molekulárna diagnostika – pozitívne výsledky FCoV RNA RT-PCR v tekutinách (napríklad výpotky, komorová voda, CSF; Poznámka: falošne pozitívne a negatívne výsledky sú možné u plnej krvi) alebo aspirátoch tenkou ihlou (FNA) postihnutého orgánu (napríklad obličky, pečeň, mezenterické lymfatické uzliny); čím vyššia je vírusová záťaž, tým viac to svedčí o FIP. Poznámka: RT-PCR nemôže potvrdiť diagnózu FIP.

Vysoké hladiny protilátok FCoV naznačujú iba predchádzajúcu infekciu FCoV a neznamenajú diagnózu FIP

Definitívna diagnóza FIP je potvrdená pozitívnym imunohistochemickým farbením na antigén koronavírusu v makrofágoch spojených s patologickými zmenami FIP vo vzorkách tkaniva fixovaných formalínom. Odber vzoriek na histopatológiu a imunohistochemické farbenie však vyžaduje invazívne postupy, ktoré môžu byť u chorej mačky kontraindikované.

Obrázok 5. Analýza výpotku je užitočná pri diagnostike FIP; kde je to možné, odoberte vzorku tekutiny.

Alternatívne prítomnosť antigén-pozitívnych buniek koronavírusu v cytologických vzorkách (výpotok, komorová voda, cytospínové CSF preparáty alebo FNA z akýchkoľvek abnormálnych orgánov – napríklad mezenterickej lymfatickej uzliny) vykazujúcich pyogranulomatózne zmeny sú veľmi nápomocné pri diagnostike a umožnujú menej invazívne získanie vzoriek.

Niektorí vedci použili bunkové pelety pripravené z centrifugovaných vzoriek efúzie na zlepšenie citlivosti imunohistochemického farbenia (Tasker a kol, 2021).

Je však dôležité čo najspoľahlivejšie diagnostikovať FIP pred liečbou, pretože na uvedené klinické príznaky existuje mnoho ďalších diferenciálnych diagnóz – vrátane neoplázie (najmä lymfómu), iných infekčných chorôb (pyotorax, toxoplazmóza, mykobakterióza, plesňové infekcie) ) a primárne imunitne sprostredkované ochorenie (idiopatická encefalitída, uveitída, lymfocytová cholangitída). Na obrázku 6 je graf naznačujúci možné diagnostické cesty.

Minimálne invazívny odber vzoriek môže zahŕňať odber brušných alebo hrudných výpotkov a FNA abnormálnych orgánov.

Podrobnejšie diagnostické vývojové diagramy pri diagnóze FIP sú dostupné na webovej stránke Európskeho poradného výboru pre choroby mačiek (www.abcdcatsvets.org/feline-infectious-peritonitis).

Obrázok 6. Prístup k diagnostike FIP

Liečba FIP pomocou antivírusových liekov

V posledných rokoch sa publikácie zameriavali na antivírusové lieky (GS-441524, nukleozidový analóg, ktorý inhibuje vírusovú RNA polymerázu, a GC376, inhibítor vírusovej proteázy) s potenciálom vyliečiť mačky experimentálne vyvolanou (Kim et al, 2016; Murphy et al, 2018) a prirodzene získanou (Pedersen et al, 2018; 2019; Dickinson et al, 2020) FIP.

Nanešťastie, až donedávna (pozri ďalej), legálne formulácie týchto liekov neboli komerčne dostupné, aj keď niektorí majitelia získavali a podávali nezákonné formulácie svojim mačkám neznámeho pôvodu a za veľké náklady.

Remdesivir, proliečivo GS-441524, je antivírusový liek so širokým spektrom účinku proti RNA vírusom. Pôvodne bol vyvinutý na liečbu vírusu hepatitídy C a vírusu Ebola u ľudí. Jeho vývoj bol potom výrazne urýchlený kvôli celosvetovej liečbe SARS-CoV-2.

V Austrálii je remdesivir legálne dostupný veterinárnym lekárom niekoľko mesiacov ako „špeciálna“ formulácia, ktorá umožňuje veterinárom získať skúsenosti s týmto liekom pri liečbe mačiek a mačiatok s FIP, kde preukázal sľubné výsledky. Na rozdiel od GS-441524 má remdesivir nízku orálnu biologickú dostupnosť a u ľudských pacientov sa podáva vo forme intravenóznej infúzie.

Vo Veľkej Británii je remdesivir legálne dostupný prostredníctvom spoločnosti Gilead Sciences, ktorá je držiteľom patentu a vyrába liek na humánne použitie. Aktuálne dostupnou formuláciou je Veklury, prášok na rekonštitúciu s vodou pre injekčné roztoky na konečnú koncentráciu remdesiviru 5 mg/ml. Po rekonštitúcii by mal byť vychladený a spotrebovaný do 24 hodín.

Obrázok 7. Vialky s preformulovaným remdesivirom budú k dispozícii na liečbu FIP, legálne, vo Veľkej Británii od augusta 2021.

U mačiek sa neoficiálne spravidla podáva SC, aj keď niektorým mačkám môže prospieť počiatočné IV podanie. Od augusta 2021 bude remdesivir k dispozícii aj u výrobcu špeciálnych liekov ako veterinárny „špeciál“ (obrázok 7) vo Veľkej Británii. Reformulovaný remdesivir bude dodávaný v injekčných liekovkách obsahujúcich 100 mg remdesiviru, v koncentrácii 10 mg/ml, čo umožňuje menšie injekčné objemy, s dobou použiteľnosti pri vhodnom skladovaní najmenej tri mesiace.

Skúsenosti našich kolegov z Austrálie (Malik, osobná komunikácia) nám umožňujú navrhovať dávky podľa uvedeného plánu. Autori zdôrazňujú potrebu diagnostiky FIP pred použitím tohto lieku, aby sa zaistilo jeho správne použitie, pričom pripúšťajú, že diagnóza FIP môže byť predpokladaná z dôvodu klinických alebo finančných diagnostických obmedzení.

Náklady, predĺžený charakter liečebného cyklu (odporúča sa minimálne 12 týždňov), potenciálne nepohodlie pri SC injekciách a riziko relapsu je potrebné pred začatím terapie prediskutovať s majiteľmi mačiek.

Majitelia môžu byť naučení podávať každodenné injekcie svojej mačke, ale musia byť dôkladne vyškolení, aby sa vyhli neúmyselnej samoaplikácii, nesprávnej technike, ktorá môže mačke ublížiť, a aby minimalizovali riziko nežiaducej reakcie mačky na injekcie vedúcej k poraneniu uhryznutím alebo poškriabaním. Tento liečebný proces vyžaduje angažovaných majiteľov a je emocionálnym aj významným finančným záväzkom.

V závislosti od klinického stavu mačky je stále potrebná podporná terapia (napríklad IV alebo SC tekutiny, antiemetická stimulácia a chuť do jedla, analgézia, nutričná podpora prostredníctvom sondy, antimikrobiálne látky na sepsu). Mačky s uveitídou môžu vyžadovať topickú liečbu kortikosteroidmi a mačky s neurologickými príznakmi môžu potrebovať lieky proti záchvatom.

Obrázok 8. Bengálske mačiatko s okulárnou a neurologickou FIP pred (vľavo) a po (vpravo) liečbe remdesivirom.

Napriek tomu, že systémové používanie kortikosteroidov sa spravidla neodporúča súbežne s používaním antivirotík, u mačiek so silným podozrením na sekundárne imunitne sprostredkované ochorenie v dôsledku FIP (napríklad imunitne sprostredkovaná hemolytická anémia) je možné zvážiť krátkodobé podávanie kortikosteroidov.

Miera úspečnosti liečby je vysoká – 80% až 95% (Malik, osobná komunikácia; obrázok 8) – a preto máme dôvod byť optimistickí pri diskusii o liečbe s klientmi, aj keď si uvedomujeme záväzok a súvisiace náklady a potenciál relapsu.

Zvýšenie úspešnosti liečby

Liečba je dlhá a remdesivir môže byť pri aplikácii injekcie bolestivý. Liek sa po otvorení skladuje v chladničke a pred injekciou sa má zohriať na izbovú teplotu. Veľkosť ihly môže ovplyvniť nepohodlie; pre niektorých pacientov môže byť výhodnejšie rýchlejšie injekčné podanie „zelenej“ ihly (21G) s väčším priemerom, zatiaľ čo iným prospeje „oranžová“ (25G) ihla s menším priemerom. Na každú injekciu sa má použiť nová ihla.

Niektoré mačky budú musieť denne chodiť na aplikáciu injekcie na kliniku každý deň. Gabapentín alebo trazodón (oba v dávke 50 mg až 100 mg orálne na mačku), podávané dve hodiny pred termínom na zníženie úzkosti a bolesti, môžu niektorým mačkám prospieť. Iné mačky môžu potrebovať dávku buprenorfínu (0,02 mg/kg až 0,03 mg/kg transmukozálne alebo IM na klinike pred liečbou).

Na zníženie nepohodlia je možné miesto vpichu ostrihať a 45 až 60 minút pred injekciou aplikovať lokálny anestetický krém EMLA. Zdá sa, že tolerancia injekcie sa medzi jednotlivými mačkami líši.

Remdesivir pri liečbe FIP


Dávkovanie

  • FIP s výpotkami (tj ascites a/alebo pleurálny výpotok), ale bez akéhokoľvek očného alebo neurologického postihnutia: 7 mg/kg8mg/kg jedenkrát denne.
  • FIP s okulárnymi príznakmi (to znamená uveitídu alebo iné postihnutie oka, ale bez neurologického postihnutia): 10 mg/kg jedenkrát denne.
  • FIP s neurologickými príznakmi: 12 mg/kg15mg/kg jedenkrát denne.

Spôsob podávania

  • Väčšina prípadov: SC injekcia do voľnej kože medzilopatkovej oblasti.
  • Veľmi ťažké prípady: 10mg/kg sa môže spočiatku podávať intravenóznou infúziou (tj. zriediť v 10 ml fyziologického roztoku a podávať pomaly počas 10 až 20 minút), aby sa dosiahol rýchly antivírusový účinok; to môže byť prevedené po troch až štyroch dňoch na SC injekciu, akonáhle mačka začne jesť a zlepšuje sa jej zdravotný stav. Poznámka: po intravenóznej aplikácii sa u niektorých mačiek na niekoľko hodín môže dostavť depresia.

Dĺžka liečby

  • Treba počítať s liečbou v trvaní minimálne 84 dní (tj. 12 týždňov). Táto doba je založená na klinickej štúdii s GS-441524 a neoficiálnom použití remdesiviru na minimalizáciu pravdepodobnosti relapsu FIP.
  • Po 84 dňoch sa má liečba ukončiť iba vtedy, ak je pacient klinicky v poriadku a abnormálne laboratórne parametre sa vrátili do normálu.
  • Ak je reakcia na liečbu len čiastočná alebo neuspokojivá, môže byť potrebné predĺženie liečby.

Monitorovanie

  • V prvých dňoch pozorne sledujte klinické príznaky:
    – Zlepšenie by malo byť rýchle, v priebehu niekoľkých dní, s nárastom hmotnosti a zlepšením klinických príznakov.
    – Zvážte verifiikáciu diagnózy, ak nie je zaznamenané žiadne zlepšenie (s ohľadom na nasledujúce symptómy):
    Efúzie (obzvlášť pleurálne) sa môžu na jeden až dva dni zhoršiť na začiatku liečby a môžu vyžadovať terapeutickú torakocentézu alebo abdominocentézu. Zdá sa, že k tomu dochádza najčastejšie po IV liečbe. Zvážte monitorovanie raz alebo dvakrát denne pomocou ultrazvuku.
    Neurologické príznaky sa môžu spočiatku objaviť alebo zhoršiť v prvých dňoch liečby. To môže zahŕňať rozvoj záchvatov, ktoré môžu vyžadovať lekársku starostlivosť (napríklad levetiracetam 20 mg/kg až 30 mg/kg každých osem hodín).
  • Váha by mala byť pravidelne kontrolovaná a dávky podľa toho upravované.
  • Monitorujte PCV, celkové proteíny (albumín a globulín), bilirubín a ďalšie abnormálne parametre, kým sa vrátia do normálu. Frekvencia monitorovania sa medzi veterinármi líši; spravidla sa vykonáva mesačné hodnotenie biochémie a hematológie, ale malo by sa prispôsobiť financiám klienta a reakcii a správaniu mačky.
  • Sérové ​​globulíny sa môžu spočiatku zvyšovať, ale každá hyperglobulinémia zvyčajne ustúpi do 12. týždňa.
  • Uvádza sa, že remdesivir spôsobuje u ľudí reno/hepatotoxicitu, ale tie boli pozorované iba pri vyšších dávkach našimi austrálskymi kolegami, ktoré ustúpili, keď bola dávka znížená. *V závislosti od reakcie môžu byť potrebné vyššie dávky. Použitie nižších dávok na zníženie nákladov môže zvýšiť pravdepodobnosť zlyhania liečby. Upozorňujeme, že tieto odporúčania pre dávkovanie sa môžu meniť v závislosti od rastúceho množstva údajov a klinických skúseností veterinárov používajúcich tento liek. Odporúča sa konzultácia s odborníkom na mačky alebo internú medicínu, aby sa prediskutoval individuálny prípad a vhodné dávkovanie.

Ďalšia liečba

Vedci skúmajú priaznivé účinky imunostimulantov a/alebo iných antivírusových liekov, ako sú interferóny alebo meflochín, akonáhle je liečba remdesivirom ukončená, alebo ak sa injekcie považujú za príliš bolestivé. Väčšina doposiaľ publikovaných štúdií sa zamerala na použitie samotných antivirotík.

Poďakovania

Autori chcú poďakovať austrálskym kolegom Davidovi Hughesovi, Rebecce Bradyovej a Richardovi Malikovi za zdieľanie svojich skúseností s liečbou remdesivirom u mačiek s FIP. Ďakujeme aj Séverine Tasker a profesorke Gunn-Moore za pripomieky k článku.

Potrebujete poradiť s liečbou FIP?

Stephanie Sorrell a Danièlle Gunn-Moore z University of Edinburgh budú robiť nábor prípadov s cieľom sledovať reakciu mačiek vo Veľkej Británii na remdesivir, ďalšie informácie budú čoskoro nasledovať.

Ak je medzitým potrebná rada ohľadom diagnostiky a liečby suspektného prípadu FIP, pošlite e-mail na adresu fipadvice@gmail.com

Referencie

  • Dickinson PJ, Bannasch M, Thomasy SM, Murthy VD, Vernau KM, Liepnieks M, Montgomery E, Knickelbein KE, Murphy B and Pedersen NC (2020). Antiviral treatment using the adenosine nucleoside analogue GS-441524 in cats with clinically diagnosed neurological feline infectious peritonitis, Journal of Veterinary Internal Medicine 34(4): 1,587-1,593.
  • Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC, Sahani Weerasekara S, Hua DH, Groutas WC, Chang K and Pedersen NC (2016). Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor, PLOS Pathogens 12(3): e1005531.
  • Murphy BG, Perron M, Murakami E, Bauer K , Park Y, Eckstrand C, Liepnieks M and Pedersen NC (2018). The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies, Veterinary Microbiology 219: 226-233.
  • Pedersen NC, Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC, Eckstrand C, Groutas WC, Bannasch M, Meadows JM and Chang K-O (2018). Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis, Journal of Feline Medicine and Surgery 20(4): 378-392.
  • Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, Montgomery E, Murakami E, Liepnieks M and Liu H (2019). Efficacy, and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis, Journal of Feline Medicine and Surgery 21(4): 271-281.
  • Tasker S and members of the European Advisory Board for Cat Diseases (2021). Feline infectious peritonitis guidelines, www.abcdcatsvets.org/feline-infectious-peritonitis
Prečítať “Mačacia infekčná peritonitída (FIP): Nádej pre mačky na obzore”

Vývoj NK buniek exprimujúcich chimérický antigénny receptor (CAR-NK) proti spike proteínu mačacieho koronavírusu

Vedúci projektu: Cynthia Leifer
Sponzor: Program výskumných grantov Cornell Feline Health Center
Originálny Názov: Development of Feline Chimeric Antigen Receptor-Expressing Natural Killer Cells (CAR-NK) Against a Feline Coronavirus Spike Protein
Suma projektu: 55 200 dolárov
Obdobie projektu: júl 2021 až jún 2022


POPIS (poskytnutý žiadateľom):

Mačací koronavírus (FCoV) spôsobuje subklinickú infekciu, z ktorej sa môže vyvinúť smrteľná infekčná peritonitída mačiek FIP. Spôsobuje ju vírus infekčnej peritonitídy mačiek (FIPV), ktorý vznikne vtedy, keď v spike (hrotovom) vírusovom proteíne vírusu FCoV dôjde k vzniku mutácie. Napriek viac ako troch desaťročiam výskumu vírusu stále neexistuje žiadna schválená liečba FIP. Je to čiastočne spôsobené skutočnosťou, že FIPV typu I síce spôsobuje väčšinu klinických infekcií, ale v kultúrach sa mu veľmi nedarí a je k dispozícii málo reagencií na jeho štúdium, zatiaľ čo typ II dobre rastie, má k dispozícii viac reagencií, ale spravidla nespôsobuje klinické ochorenie. Vývoj nových imunoterapií vyžaduje významné predklinické štúdium a validáciu, a kvôli obmedzeniam pri štúdiu FIPV typu I neboli vyvinuté žiadne imunoterapie pre klinickú FIP. Chceme sa pokúsiť o novú imunoterapiu s pomocou in vitro výskumu FIPV typu II, ktorý by mohol viesť k terapii mačiek FIP spôsobených FIPV typu I. Imunoterapia, ktorá si v poslednom získala pozornosť pri liečbe ľudských rakovín, sú imunitné bunky upravené pomocou chimérneho antigénneho receptora (CAR). Tento prístup ešte nebol vyvinutý pre akútne vírusové infekcie, ako je FIPV, ani sa doteraz u mačiek nepoužíval. CAR tvoria dve hlavné zložky: jednoreťazcový fragment protilátky (ScFv) a signálna doména z imunitného kostimulačného receptora. Navrhujeme použiť ScFv špecifický pre FIPV spike proteín exprimovaný v mačacích imunitných bunkách, ktoré by bolo možné podať mačke za účelom vyhľadania a zničenia buniek infikovaných FIPV. Súčasné humánne terapie CAR vyžadujú použitie autológnych T buniek, pretože alogénne T bunky zabíjajú hostiteľské bunky a vedú k reakcii štepu proti hostiteľovi (graft-versus-host disease).
NK bunky (natural killers) sú predmetom stále väščieho záujmu, pretože NK bunky neindukujú reakciu štepu proti hostiteľovi, a môžu sa teda použiť v „bežných“ terapiách. O mačacích NK bunkách sa však vie len málo. Predpokladáme, že geneticky modifikované mačacie NK bunky exprimujúce CAR zamerané na spike proteín vírusu mačacej infekčnej peritonitídy typu II rozpoznajú a usmrtia cieľové bunky infikované FIPV in vitro.

Aby sme dosiahli naše ciele:

  1. určíme cytotoxickú aktivitu podskupiny NK buniek v porovnaní s NKT a T bunkami na validáciu mačacích NK buniek ako potenciálnych nosičov CAR,
  2. na klonovanie a sekvenovanie použijeme v súčasnej dobe dostupné hybridomové spike protilátky anti-FIPV typu II pre zostavenie CAR zameraného proti spike proteínu typu II a
  3. in vitro validujeme test NK buniek a dáta demonštrujúce efekt CAR-NK buniek usmrcujúcich bunky infikované FIPV typu II.

Dokončenie tejto štúdie poskytne údaje dôležité pre vývoj CAR-NK terapie pre FIPV typu I, teda úplne novej liečby tejto devastujúcej choroby.
Prečítať “Vývoj NK buniek exprimujúcich chimérický antigénny receptor (CAR-NK) proti spike proteínu mačacieho koronavírusu”

Nelicencovaná GS-441524 antivírusová terapia môže byť účinná pri domácej liečbe infekčnej peritonitídy mačiek

Sarah Jones 1, Wendy Novicoff 2, Julie Nadeau 3 a Samantha Evans 1,*

1 Katedra veterinárnych biologických vied, Vysoká škola veterinárnej medicíny, Štátna univerzita v Ohiu, Columbus, OH 43210, USA
2 Oddelenia ortopedickej chirurgie a vied o verejnom zdraví, Lekárska fakulta, University of Virginia, Charlottesville, VA 22903, USA
3 Veterinárna pohotovostná klinika Hamilton Region, Hamilton, ON L8P 4W3, Kanada
* Autor, ktorému by mala byť adresovaná korešpondencia.

Akademický redaktor: Clive J. C. Phillips
Animals 2021, 11 (8), 2257; https://doi.org/10.3390/ani11082257
Doručené: 22. apríla 2021 / Revidované: 29. mája 2021 / Akceptované: 27. júla 2021 / Zverejnené: 30. júla 2021

Pôvodný článok: Unlicensed GS-441524-Like Antiviral Therapy Can Be Effective for at-Home Treatment of Feline Infectious Peritonitis

Stručné zhrnutie

Infekčná peritonitída mačiek (FIP) je smrteľné ochorenie mačiek spôsobené mačacím koronavírusom. Cieľom tejto štúdie bolo formálne vyhodnotiť podávanie nelicencovanej antivírusovej terapie GS-441524 zo skupinových zdrojov pre mačky s podozrením na infekčnú peritonitídu mačiek (FIP). Členovia podporných skupín na sociálnych sieťach a skupín distribútorov liekov na báze GS-441524 boli dotazovaní prostredníctvom internetu. Z 393 analyzovaných prieskumov, ktoré spĺňali kritériá zaradenia, bolo 73,7% vlastníkov využívajúcich túto terapiu zo Spojených štátov. Iba 8,7% majiteľov uviedlo, že pri liečbe svojej mačky sa im dostalo výraznej pomoci od ich veterinárneho lekára. Priemerné náklady na liečbu boli 4920 USD. Väčšina majiteľov (88,2%) hlásila znateľné zlepšenie klinických príznakov do jedného týždňa od začiatku terapie. V čase prieskumu žilo 96,7% (380 mačiek), pričom 54,0% z nich bolo považovaných za vyliečené a ďalších 43,3% bolo monitorovaných v 12-týždňovom období pozorovania. Celkovo u 12,7% mačiek došlo k relapsu klinických príznakov FIP a 3,3% mačiek uhynulo napriek terapii GS-441524. Hlásené komplikácie väčšinou súviseli s podávaním subkutánnych injekcií kyslého roztoku GS-441524 majiteľom, ako je vokalizácia, bolesť, zápasenie a rany v mieste vpichu. Obmedzenia tejto štúdie zahŕňajú retrospektívny dizajn, zaujatosť pri výbere prípadov, spoliehanie sa na údaje oznámené vlastníkom a neschopnosť potvrdiť obsah nelicencovaných liečiv; zo skúseností týchto majiteľov sa však dá vyvodiť dôležité ponaučenie. Aj keď je to nekonvenčné a určite nie bez zdravotných a právnych rizík, nelicencovaná, domáca terapia podobná GS-441524, podľa informácií od majiteľov, môže očividne priniesť výhody pri liečbe mačiek so suspektnou diagnózou FIP.

Abstrakt

Cieľom tejto štúdie bolo formálne vyhodnotiť podávanie nelicencovanej antivírusovej terapie podobnej GS-441524 zo skupinových zdrojov pre mačky s podozrením na infekčnú peritonitídu mačiek (FIP), donedávna smrteľné ochorenie. Členovia podporných FIP skupín na sociálnych sieťach a skupín distribútorov liekov s GS-441524 boli dotazovaní prostredníctvom internetu. Prieskum bol zameraný na majiteľov, ktorí liečili svoje mačky najmenej 12 týždňov nelicencovanými liekmi s GS-441524. Z 393 analyzovaných ankiet, ktoré spĺňali kritériá pre zaradenie, bolo 73,7% vlastníkov využívajúcich túto terapiu zo Spojených štátov. Len 8,7% majiteľov uviedlo, že im pri poskytovaní liečby ich mačke pomáhal veterinár. Priemerné náklady na liečbu boli 4920 USD. Väčšina majiteľov (88,2%) hlásila znateľné zlepšenie klinických príznakov do jedného týždňa od začiatku terapie. V čase prieskumu žilo 96,7% (380 mačiek), pričom 54,0% z nich bolo považovaných za vyliečených a ďalších 43,3% bolo monitorovaných v 12-týždňovom období pozorovania. Celkovo u 12,7% mačiek došlo k relapsu klinických príznakov FIP a 3,3% mačiek uhynulo napriek terapii GS-441524. Hlásené komplikácie väčšinou súviseli s podávaním subkutánnych injekcií kyslého roztoku GS-441525 majiteľom, ako je vokalizácia, bolesť, ťažkosti a rany v mieste vpichu. Obmedzenia tejto štúdie zahŕňajú retrospektívny dizajn, zaujatosť pri výbere prípadov, spoliehanie sa na údaje oznámené vlastníkom a neschopnosť potvrdiť obsah nelicencovaných liečiv; zo skúseností týchto majiteľov sa však dá vyvodiť dôležité ponaučenie. Aj keď sa jedná o nekonvenčnú a určite nie bez zdravotných a právnych rizík, nelicencovanú, domácu terapiu s GS-441524, podľa správ majiteľov, môže očividne priniesť výhody pri liečbe mačiek s podozrením na FIP.

Kľúčové slová: FIP; GS-441524; COVID-19; čierny trh; koronavírus; mačka; remdesivir

Úvod

Od marca 2020 sa šírenie koronavírusu známeho ako SARS-CoV2 vyvinulo do globálnej pandémie COVID-19. Podobný, ale pre mačky špecifický vírus známy ako mačací koronavírus (FCoV) je pôvodcom smrteľného ochorenia mačiek známeho ako infekčná peritonitída mačiek (FIP). Antivírusové lieky, ktoré inhibujú replikáciu vírusovej RNA, ponúkajú potenciálne terapeutické a preventívne výhody pre COVID-19, vrátane proliečiva adenozínového nukleozidového monofosfátu GS-5734, bežnejšie známeho ako remdesivir (na trhu Gilead Sciences, Inc. (Foster City, CA, USA) ) [1]. Štúdia z roku 2018 publikovaná Murphyom a kol. preukázala, že GS-441524, menej chemicky komplexný rodičovský nukleozid (tiež patentovaný spoločnosťou Gilead), bol vysoko účinný proti experimentálne vyvolanej FIP v dávke 4,0 mg/kg subkutánne každých 24 hodín počas 12 týždňov (84 dní) u 10 laboratórnych mačiek [2]. Neskôr v roku 2019 rovnaká skupina uskutočnila klinickú štúdiu s použitím GS-441524 pre liečbu 31 mačiek vo vlastníctve klientov s FIP a výsledky naznačili, že toto kedysi smrteľné ochorenie je pomocou tohto nukleozidového analógu klinicky reverzibilné [3]. Názov zlúčeniny GS-441524 je (2R, 3R, 4S, 5R) -2- (4-aminopyrrolo [2,1-f] [1,2,4] triazin-7-yl) -3,4-dihydroxy -5- (hydroxymetyl) tetrahydrofuran-2-karbonitril, ktorý je známy mnohými ďalšími synonymami [4]. Pre stručnosť tejto správy uvádzame viacero nelicencovaných liekových formulácií, ktoré tvrdia, že obsahujú túto zlúčeninu ako „podobné GS-441524“, aj keď ich nevyrába spoločnosť Gilead Sciences.

FCoV (mačací koronavírus) je extrémne bežný vírus, ktorý je celosvetovo považovaný za všadeprítomný [5], pričom séroprevalencia je medzi 26 až 87% (v závislosti od štúdie a regiónu sveta) u mačiek pochádzajúcich z prostredia s vysokou koncentráciou mačiek (chovateľské stanice alebo chovatelia a útulky pre zvieratá) [6]. Aktívne infekcie FCoV spôsobujú u väčšiny pacientov mierne až subklinické prechodné GI infekcie [7,8]. Zatiaľ čo 70% týchto mačiek je prechodne infikovaných FCoV, 13% zostáva trvalo infikovaných a chronicky vylučuje vírus do svojich výkalov [9]. FIP vzniká z mutovanej formy FCoV u približne 5% týchto mačiek [8] a odhaduje sa, že každoročne zabije 0,3 až 1,4% mačiek na celom svete [3]. Dve hlavné klinické formy FIP zahrnujú efuzívnu („vlhkú“) formu, pri ktorej sa u pacienta objavujú výpotky v telesných dutinách, a neefuzívnu („suchú“) formu. Až donedávna bol vývoj FIP u mačiek jednotne smrteľný a často bolo náročné dôjsť k presnej diagnóze antemortem (pred smrťou) [10].

Pravdepodobne kvôli ambícii pokračovať vo výskume ľudských RNA vírusov, ktoré by mohli byť inhibované GS-441524, Gilead zastavil ďalší vývoj terapie GS-441524 u mačiek. To vyvolalo dopyt po GS-441524 u majiteľov mačiek, ktorých mačkám diagnostikovali FIP, a čelili tak istej smrti. Výsledkom je, že viacerí výrobcovia nelicencovaných liekov (niekedy tiež označovaní ako „čierny trh“) začali predávať túto zlúčeninu majiteľom mačiek cez internet, čo v súčasnosti nie je podľa amerického patentu povolené spoločnosťou Gilead Sciences [4]. Evolúcia pokračovala do rozsiahlej online siete na liečbu a podporu FIP, založenej na crowd-sourcingu, vo veterinárnej medicíne v doteraz nevídanom rozsahu. V súčasnosti na sociálnych sieťach existuje niekoľko veľkých skupín, ktoré pomáhajú majiteľom mačiek získavať lieky s GS-441524, plánovať protokol a liečiť svoje mačky s podozrením na FIP. Pretože GS-441524 zostáva nelicencovanou terapiou v USA aj inde vo svete, väčšina tohto lieku sa vyrába, nakupuje, podáva a monitoruje bez veľkého, ak vôbec nejakého, veterinárneho dohľadu.

Cieľom tejto štúdie bolo formálne vyhodnotiť podávanie tejto nelicencovanej terapie pre FIP z rôznych zdrojov a určiť, ktoré faktory môžu viesť k úspechu liečby. Za týmto účelom sme uskutočnili prieskum u členov najväčšej z vyššie uvedených skupín na sociálnych sieťach a skupín distribúcie liekov s GS-441524. To, čo sme objavili, bolo skutočne ohromujúce; Nielenže sa laici sa u svojich mačiek rutinne pokúšajú o túto terapiu, ale podľa údajov uvádzaných vlastníkmi je účinná a vedie k vyliečeniu. V tejto správe sú analyzované ďalšie charakteristiky pacientov, liečby a výsledkov.

Materiály a metódy

Dotazník bol vytvorený prostredníctvom Google Forms (docs.google.com/forms). Dotazník bol rozosielaný na prominentnej stránke skupiny na sociálnej sieti („FIP Warriors“) venovanej liečbe a distribúcii GS-441524. Bol inzerovaný a zameraný na majiteľov mačiek s podozrením na FIP (na základe variabilných kritérií používaných ich jednotlivými veterinárnymi lekármi) a boli absolvovali aspoň určitú liečbu GS-441524. Niektorí z týchto pacientov absolvovali celých 84 dní liečby, zatiaľ čo iní začali s liečebným protokolom a následne zomreli na chorobu alebo boli kvôli komplikáciám eutanizovaní. Kritériami pre zaradenie boli odpovede týkajúce sa akejkoľvek mačky, ktorá podstúpila liečbu GS-441524 s podozrením na FIP, a ktorá absolvovala najmenej 84 dní liečby (bez ohľadu na výsledok), alebo ktorá začala liečbu a následne uhynula. Vylučovacími kritériami boli odpovede týkajúce sa pacientov, ktorí absolvovali <84 dní terapie (kvôli existencii polovičného protokolu trvania liečby), alebo ktorí nezodpovedali väčšinu otázok ankety.

Vyplnenie dotazníka trvalo majiteľom mačiek zhruba tridsať minút a otázky pozostávali z formátu s možnosťou výberu z viacerých odpovedí a formátu krátkych odpovedí. Niektoré otázky sa objavili na základe predchádzajúcich odpovedí v hierarchickom usporiadaní. Povolenie zdieľať a šíriť anketu bolo získané od správcov sociálnej skupiny, a bolo často zdieľané a uverejňované na všetkých spriaznených stránkach. Údaje z prieskumov boli zozbierané od 31. júla 2020 do 25. októbra 2020. Štúdiu schválil inštitucionálny kontrolný výbor Ohio State University (protokol č. 2021E0162).

Všetky údaje boli analyzované v Minitab verzie 19 (State College, PA, USA). Boli vypočítané deskriptívy a frekvencie pre všetky kategorické premenné. Základná popisná štatistika bola vypočítaná pre všetky spojité premenné. Na porovnanie rozdielov medzi skupinami sa použili dvojvzorkové t-testy alebo jednosmerné ANOVA s alfa nastaveným na 0,05 a 80% výkonu.

Výsledky

Charakteristiky vlastníka/pacienta

Počas obdobia štúdie bolo zozbieraných 411 ankiet, pričom 393 prípadov spĺňalo kritériá pre zaradenie a bol známy stav (živý vs. mŕtvy). Zostávajúcich 18 ankiet bolo neúplných pre získanie dostatočného množstva informácií. Z týchto 393 prípadov bolo 64,9% samcov (52,3% kastrovaných samcov a 12,6% intaktných samcov) a 35,1% samíc (25,9% sterilizovaných samíc a 9,2% intaktných samíc).

Väčšina majiteľov bola z USA (73,7%), ďalší najvyšší počet pochádzal z Kanady (6,6%) (tabuľka 1). Priemerný vek pri diagnostikovaní bol 1,65 roka (približne 1 rok a 8 mesiacov) so štandardnou odchýlkou ​​2,28 roka a rozsahom od 2 mesiacov do 18 rokov. Viac ako dve tretiny mačiek (67,2%) boli krížené plemená, dlhosrstých domácich alebo krátkosrstých domácich. Zostávajúcich 32,8% tvorila široká škála čistokrvných plemien, pričom najbežnejšie plemeno bolo hlásené ako siamské (5,6% všetkých mačiek) (tabuľka 2). To podporuje šestnásťročnú retrospektívnu štúdiu z roku 2006, ktorú uskutočnili Pesteanu-Somogyi a kol., ktorý zistil, že čistokrvné mačky majú významne väčšiu pravdepodobnosť diagnózy FIP [11]. Takmer jedna štvrtina majiteľov uviedla, že im veterinárny lekár priamo (14,5%) alebo nepriamo (12,0%) povedal o nelicencovanom GS-441524, zatiaľ čo 30,36% vlastníkov uviedlo, že informácie našli pri vlastnom online prieskume, a 23,21% uviedlo, že sa dozvedeli o terapii GS-441524 na webových stránkach skupín sociálnych sietí pre majiteľov mačiek s FIP (tabuľka 3).

Tabuľka 1: Krajina pôvodu respondentov prieskumu.

KrajinaPočet odpovedí%
USA28973.72
Kanada266.63
Veľká Británia153.83
Taliansko133.32
Bulharsko82.04
Chorvátsko41.02
Holandsko41.02
Rumunsko41.02
Austrália30.77
Írsko30.77
Čína20.51
Nemecko20.51
Hong Kong20.51
Mexico20.51
Nový Zéland20.51
Poľsko20.51
Portugalsko20.51
Česká republika10.26
Maďarsko10.26
Malajzia10.26
Peru10.26
Srbsko10.26
Singapur10.26
Švédsko10.26
Švajčiarsko10.26
Turecko10.26
Celkom392100%
Neuvedené1

Tabuľka 2. Plemená mačiek liečených GS-441524.

PlemenoPočet odpovedí%
Zmiešané26467.18
Siamská mačka225.6
Mainská mývalia123.05
Bengálska mačka112.8
Britská krátkosrstá102.54
Sibírska mačka92.29
Ragdoll82.04
Devon Rex71.78
Perzská71.78
Ruská modrá71.78
Škótska klapouchá51.27
Sphynx51.27
Birma41.02
Exotická krátkosrstá30.76
Himalájska mačka20.51
Nórska lesná mačka20.51
Snowshoe20.51
Abesínska mačka10.25
Balinézska mačka10.25
Bombajská mačka10.25
Barmská mačka10.25
Lykoi10.25
Mandalay (Bombay)10.25
Munchkin10.25
Ocicat10.25
Orientálna krátkosrstá10.25
Ragamuffin10.25
Selkirk Rex10.25
Singapura10.25
Skookum10.25
Celkom393100.0

Tabuľka3. Ako sa majitelia mačiek prvýkrát dozvedeli o existencii terapie GS-441524 pre FIP. Majitelia mohli uviesť viac ako jeden zdroj, takže celkový počet odpovedí je vyšší ako celkový počet respondentov.

SpôsobPočet odpovedí%
Internet, nie Facebook11930.36
Facebook9123.21
Veterinár (priamo)5714.54
Priateľ5614.29
Veterinár (nepriamo)4711.99
Záchranná stanica123.06
Chovateľ82.04
Konferencia20.51

Zatiaľ čo väčšina majiteľov (291 odpovedí, 74,3%) uviedla, že mali aspoň nejakú pomoc od veterinára (zvyčajne išlo o pomoc s diagnostickým monitorovaním), iba 34 (8,7%) uviedlo, že sa im dostalo významej pomoci pri podávaní terapie od svojich veterinárnych lekárov, ako je pomoc. s injekciami liečiva alebo s perorálnym podaním zlúčeniny. Je nutné poznamenať, že 101 (25,7%) vlastníkov uviedlo, že okrem počiatočnej diagnostiky sa im nedostalo inej veterinárnej pomoci. Títo majitelia liečili mačku úplne sami, čo vyvoláva obavy o dobré životné podmienky zvierat, ak sú majitelia netrénovaní alebo neskúsení v oblasti injekčného podávania alebo zvládania rán po injekcii. Priemerné hlásené náklady u rôznych značiek na liečbu terapiou GS-441524 boli 4920 USD, so štandardnou odchýlkou 3115 USD a mediánom 4000 USD. Uvedené náklady sa pohybovali od najnižších 500 USD po najvyššie 21 000 USD.

Charakteristiky ochorenia

Väčšina majiteľov (224 odpovedí, 57,0%) uviedlo, že ich mačka mala známky efuzívnej („vlhkej“) FIP, často so zjavne viditeľnými výpotkami, spozorovanými majiteľmi. Veľký kontingent (169 odpovedí, 43,2%) majiteľov uvádzal príznaky neurologického a/alebo očného ochorenia. Najčastejšími klinickými príznakmi boli letargia/apatia (347 odpovedí, 88,3%), znížená chuť do jedla (308 odpovedí, 78,4%) a horúčka (258 odpovedí, 65,7%) (tabuľka 4).

Tabuľka 4. Klinické príznaky hlásené u mačiek liečených GS-441524. Majitelia mohli uviesť viac ako jednu odpoveď, takže celkový počet odpovedí je vyšší ako celkový počet respondentov.

Klinické príznakyPočet odpovedí%
Letargia/Malátnosť34788.3%
Nechutenstvo30878.4%
Strata hmotnosti28271.8%
Horúčka25865.7%
Odmietanie jedla (anorexia)18847.8%
Zvaäčšené brucho16742.5%
Skrývanie/Vyhýbanie14737.4%
Výpotok11629.5%
Obťažná chôdza10326.3%
Neurologické príznaky10326.3%
Dýchacie ťažkosti/kašeľ9524.2%
Žltačka5313.5%

Najčastejšími znakmi reakcie na terapiu boli zvýšená chuť do jedla (287 odpovedí, 73,8%), zlepšený pohyb/chôdza/skákanie (205 odpovedí, 52,7%), zlepšená energia (153 reakcií, 39,3%) a ústup horúčky (104 reakcií 26,7%).
Medzi 50 mačkami, u ktorých došlo k relapsu (12,7%), sa u viac ako polovice (69,0%) vyvinuli zhoršujúce sa príznaky súvisiace s apetítom, letargiou, slabosťou a horúčkou. Ďalších 14,3% majiteľov pozorovalo neurologické alebo očné príznaky.

Charakteristiky liečby

Bolo hlásených mnoho rôznych nelicencovaných značiek liekov s obsahom GS-441524. Krajina pôvodu týchto zlúčenín nie je ľahko zistiteľná. Najčastejšie bol hlásený Mutian (19,4%), za ním nasledovali majitelia, ktorí počas liečby používali viacero rôznych značiek (18,1%), a to hlavne preto, že pôvodná značka už nebola k dispozícii, keď potrebovali znova objednať (tabuľka 5). Možno kvôli zmätku medzi respondentmi prieskumu ohľadne rozdielu v „dávkovaní“ (mg/kg) oproti „dávke“ (mg celkom) iba 203 majiteľov presne uvádzalo počiatočné a konečné dávkovanie pre ich mačky. Priemerné počiatočné dávkovanie bolo 6,7 ​​mg/kg (rozsah 2 mg/kg až 16 mg/kg) so štandardnou odchýlkou ​​2,24 a mediánom 5 mg/kg a priemerné konečné dávkovanie bolo 8,5 mg/kg (rozsah 3 mg /kg až 25 mg/kg) so štandardnou odchýlkou ​​3,34 a mediánom 8 mg/kg. Počiatočné dávkovanie bolo voľne založené na predchádzajúcej štúdii z UC Davis [3] a majitelia hľadali pomoc u správcov webových stránok skupín na sociálnych sieťach pri individuálnych zmenách na základe reakcie pacienta a nedávnych laboratórnych nálezov. Je potrebné poznamenať, že počas liečebného obdobia nebolo údajne znížené žiadne dávkovanie. Pri použití párového t-testu bol rozdiel medzi počiatočným a konečným dávkovaním veľmi významný (p <0,001). Uvedené dávkovanie sa líši od štúdie z roku 2018, ktorá zistila, že optimálna dávka je 4,0 mg/kg subkutánne každých 24 hodín po dobu minimálne 12 týždňov [3]. Počiatočné a konečné dávkovania boli významne odlišné pre mačky s neurologickými alebo očnými príznakmi hlásenými vlastníkmi v porovnaní s mačkami, ktoré nemali neurologické alebo očné postihnutie (priemerné dávkovanie 8,01 mg/kg oproti 5,44 mg/kg na začiatku liečby; priemerné dávkovanie 10,47 mg/kg oproti 6,62 mg/kg na konci liečby).

Tabuľka 5. Hlásená značka GS-441524. Mnoho respondentov používalo počas liečby viac ako jednu značku.

Značka GS (Koncentrácia)Počet odpovedí%
Mutian (rôzne dávkovanie a formulácie)7619.13
Viac značiek *7118.11
Shire (15 mg/mL)6215.82
Capella (15 mg/mL)389.69
Hero-Biely (17 mg/mL)389.69
Iné *369.18
Oscar (15 mg/mL)328.16
Hero-Modrý (15 mg/mL)205.1
Pine (15 mg/mL)194.85
Celkom392100.00
Neuvedené1

Z 393 pacientov bolo 348 (88,5%) liečených 12 týždňov (84 dní), pričom 45 pacientov (11,4%) absolvovalo predĺženú liečbu (v priemere 4 týždne liečby navyše). Predĺženie liečby bolo založené na základe toho, či došlo k úplnému ústupu príznakov na konci štandardných 12 týždňov terapie a nezahŕňa mačky, ktoré relapsovali počas alebo po fáze pozorovania. Väčšina pacientov (71,7%) bola liečená injekčným GS-441524, 8,2% dostalo perorálne formulácie a 20,1% dostalo kombináciu perorálnych a injekčných formulácií. Vrámci prieskumu bola zaznamenaná aj liečba inými liekmi a podporné terapie (tabuľka 6). Medzi najbežnejšie doplnkové terapie patril vitamín B1 alebo B12 (41,8%) a používanie steroidov (37,9%). Iba 8,2% majiteľov uviedlo, že používali gabapentín.

Tabuľka 6. Podporné terapie hlásené pre mačky liečené GS-441524. Majitelia mohli uviesť viac ako jednu odpoveď, takže celkový počet odpovedí je vyšší ako celkový počet respondentov.

Podporná terapiaPočet odpovedí%
Vitamín B1 alebo B1213841.8%
Steroidy12537.9%
Iné vitamíny a doplnky10331.3%
Tekutiny (SQ or IV, nešpecifikované)9027.4%
Antibiotiká7422.4%
Svetelná terapia3911.9%
Prostriedky proti zvracaniu3611.1%
Stimulátory apetítu3410.3%
Gabapentín278.2%

Majitelia väčšiny pacientov, ktorí dostávali injekcie, hlásili vokalizáciu v čase injekcie (309 odpovedí, 82,0%) a/alebo bolesť v mieste vpichu (287 odpovedí, 76,1%). Viac ako polovica (203 odpovedí, 51,7%) hlásila zjazvenie a chrasty v mieste (miestach) injekcie (tabuľka 7).

Tabuľka 7. Komplikácie a nežiaduce udalosti hlásené u mačiek liečených GS-441524. Majitelia mohli uviesť viac ako jednu odpoveď, takže celkový počet odpovedí je vyšší ako celkový počet respondentov.

KomplikáciaPočet odpovedí%
Vokalizácia pri injekcii30982.0%
Bolesť v mieste injekcie28776.1%
Mačka bojovala počas aplikácie23662.6%
Chrasty/jazvy20351.7%
Lézie/rany v mieste aplikácie15742.2%
Krvácanie v mieste aplikácie14739.4%
Zvíšená aktivita13335.5%
Opuch v mieste aplikácie9625.7%
Zvýšený apetít5414.3%

Výsledky

V prípade mačiek, ktoré v čase prieskumu spĺňali kritériá zaradenia, žilo 380 (96,7%) a 13 (3,3%) zomrelo. Pokiaľ ide o aktuálnu fázu liečby, 54,0% bolo hlásených ako „vyliečených“, 43,3% bolo v období pozorovania (prežilo najmenej 12 týždňov liečby) a 2,7% bolo opäť liečených na relaps príznakov FIP. Medzi 224 mačkami so známkami efuzívnej („vlhkej“) FIP zomrelo osem mačiek (3,6% mačiek v tejto skupine) do času, keď vlastník vyplnil dotazník. Spomedzi 169 mačiek s neefúznou (suchou) FIP päť (2,96%) uhynulo do času vypĺňania dotazníka. Zo 169 mačiek, u ktorých boli hlásené neurologické alebo očné príznaky, zomrelo osem (4,7% mačiek v tejto skupine). Štyri z týchto mačiek, ktoré uhynuli, mali neurologické/očné, ako aj príznaky efuzívnej (vlhkej) FIP a štyri mačky, ktoré uhynuli, mali neurologické/očné, ako aj príznaky neefuzívnej (suchej) FIP. Rozdiel v úmrtnosti medzi týmito skupinami nebol štatisticky významný.

Väčšina majiteľov (88,2%) hlásila znateľné zlepšenie do jedného týždňa od začiatku liečby GS-441524 a priemerný čas „návratu k normálnemu správaniu“ bol 3,85 týždňa (rozsah 1 až 16 týždňov). Majitelia mačiek s neurologickými alebo očnými príznakmi uviedli, že 66% z nich reagovalo na liečbu do jedného týždňa a 16,3% týchto mačiek vykázalo výrazné zlepšenie do jedného dňa. Recidíva podozrenia na FIP (definovaná ako recidíva príznakov po skončení 12-týždňového obdobia liečby) bola hlásená v 50/393 prípadoch (12,7%), pričom 48 z týchto 50 majiteľov mačiek (96%) uviedlo iba jeden relaps. Päť mačiek (10%) s hláseným relapsom uhynulo alebo boli eutanizované, všetky po jednom relapse. Zo 45 mačiek (90%) s relapsom FIP, ktoré boli v čase prieskumu nažive, bolo v súčasnosti liečených 9, 17 bolo v 12-týždňovom období pozorovania a 19 bolo považovaných za vyliečené. Štyri (8%) z päťdesiatich mačiek s hláseným relapsom vykazovali v čase diagnostiky neurologické alebo očné príznaky; to nebol štatisticky významný rozdiel od počtu mačiek bez neurologických alebo očných znakov v čase diagnostiky.

Diskusia

Uvádzame prvú vedeckú správu o nelicencovanej antivírusovej terapii používanej na úspešnú domácu liečbu mačacej infekčnej peritonitídy (FIP) majiteľmi mačiek. Pokiaľ je autorom známe, je to prvé rozšírené použitie nelicencovaného liečiva skupinového pôvodu pre liečbu veterinárnej choroby. Neobhajujeme neoprávnené použitie tohto lieku; Našim cieľom bolo predložiť tieto informácie s cieľom lepšie informovať majiteľov mačiek a veterinárnych lekárov, ktorí stoja pred rozhodnutiami o liečbe suspektných prípadov FIP.

Samci boli v našej štúdii zastúpení nadpriemerne (64,9%), podobne ako predchádzajúce zistenia Riemera a kol. ktoré ukázali, že mužské pohlavie významne korelovalo s FIP [12]. Takmer tri štvrtiny (72,7%) vlastníkov, ktorí sa zúčastnili prieskumu, mali sídlo v USA. Čiastočne to môže byť spôsobené tým, že prieskum je napísaný v angličtine, a hoci je tu zameraná sociálna sieť medzinárodnou platformou, zdá sa, že členovia majú sídlo väčšinou v USA. Priemerný vek mačiek v našej štúdii bol jeden rok a osem mesiacov, čo zodpovedá Riemerovi a kol. (2016), ktorí zistili, že FIP sa významne častejšie vyskytuje u mačiek mladších ako dva roky [12]. Viac ako dve tretiny (67,2%) uvádzaných mačiek boli zmiešané plemená alebo domáce mačky, čo je o niečo menej, ako uvádza Riemer a kol. u mačiek s FIP v roku 2016 (78,8%) [12]. Prieskum zistil, že 32,8%mačiek liečených liekmi s GS-441524 bolo čistokrvných, pričom siamské (5,6%), maine coon (3,05%), bengálske (2,8%) a britská krátkosrstá (2,54%) boli najčastejšie uvádzané plemená. Nadmerné zastúpenie čistokrvných mačiek uvedené v našej štúdii môže byť spôsobené zvýšenou prevalenciou FIP, ako už skôr uviedli Pesteanu-Somogyi a kol. (2006) [11]; z dôvodu umiestnenia v prostredí s vyššou početnosťou mačiek; alebo možno kvôli tomu, že majitelia čistokrvných mačiek sú v priemere majetnejší a investujú viac financií do svojich mačiek.

Je zaujímavé, že približne jedna štvrtina (26%) majiteľov uviedla, že po diagnostikovaní FIP liečili svoje mačky úplne sami, bez pomoci alebo vedomia svojich veterinárnych lekárov. Je dôležité si uvedomiť, že hoci väčšina respondentov nášho prieskumu nedostala od svojich veterinárnych lekárov pomoc s terapiou, máme podozrenie, že veľká väčšina z nich dostala predpokladanú diagnózu FIP prostredníctvom veterinárneho lekára v podobe klinických a laboratórnych údajov (napríklad kompletný krvný obraz, biochémia, analýza tekutín, atď.), keďže ich vyžadujú správcovia skupín sociálnych sietí pred začatím terapie. Títo majitelia dokázali nájsť podporu potrebnú na administráciu terapie GS-441524 doma vďaka online pomoci skupín na sociálnych sieťach, najmä od správcov skupín. Iba 8,7% uviedlo, že ich veterinár im významne pomohol pri liečbe ich mačky GS-441524 tým, že pomohol podať zlúčeninu namiesto toho, aby ponúkol iba rutinné vyšetrenia a opakované diagnostické vyšetrenie. Väčšina majiteľov (65,6%) napriek tomu pokračovala so svojim veterinárom v starostlivosti, ktorá zvyčajne spočívala v opakovaní krvných testov a ďalšej diagnostike. Z našich výsledkov nie je jasné, aká časť tých, ktorí navštevovali svojich veterinárnych lekárov, informovala veterinárny tím o domácej liečbe GS-441524. Je známe, že správcovia skupín sledujú pokroky jednotlivých mačiek prostredníctvom protokolu o liečbe v tabuľke. Monitorujú rôzne parametre ako hmotnosť, hematokrit, počet bielych krviniek, počet lymfocytov, počet neutrofilov, počet monocytov, albumín, globulín, pomer A:G v sére (pomer albumín/globulín), celkový bilirubín, BUN (dusík močoviny v krvi), kreatinín a ALT (alanín transamináza). Na základe pokroku v mesačných hodnotách krvného obrazu sa majitelia môžu poradiť so svojim prideleným správcom vždy, keď ošetrujúci veterinárny lekár nemôže pomôcť, a to buď z dôvodu obmedzených znalostí o liečbe, alebo z neochoty pomôcť zo strachu pred rizikom straty lekárskej licencie. Toto zistenie prináša dôležité otázky o tom, či by administrátori v úsilí pomôcť pacientom s FIP mohli byť obvinení z výkonu veterinárnej medicíny bez licencie a mohli by nevedomky spôsobovať ujmu, prípadne, akú úlohu by v tomto úsilí mohli a mali mať veterinári.

Počiatočné neoficiálne správy od majiteľoch získavajúcich tento liek z nelicencovaných zdrojov v zúfalstve, aby pomohli svojim chorým mačkám, prišli s fámami o cene 10 000 – 20 000 USD a niektorí z našich respondentov prieskumu uviedli, že tieto ceny zaplatili. Napriek tomu, že je to určite stále nákladná liečba, majitelia v našom prieskume uviedli priemerné náklady tesne pod 5 000 USD (4920 USD). Tento rozdiel môže byť čiastočne spôsobený nárastom spoločností vyrábajúcich tento nelicencovaný liek, čo znižuje náklady prostredníctvom konkurencie. Máme podozrenie, že náklady na liečbu sa z tohto dôvodu časom znížili, ale nemôžeme to definitívne určiť, pretože náš prieskum sa nedotazoval na kalendárny dátum terapie.

Mutian, medzinárodná značka a pravdepodobne najznámejšia dostupná formulácia GS-441524, neuvádza GS-441524 na svojom štítku a namiesto toho je uvádzaný ako „doplnok stravy“ na liečbu FIP [13]. Toto však bola značka GS-441524, ktorú najčastejšie uviedli majitelia, čo naznačuje, že majitelia aj správcovia webových stránok sa domnievajú, že táto značka obsahuje liek GS-441524. Majitelia, ktorí sa zúčastnili prieskumu, uviedli vyššie počiatočné dávky, ako boli uvedené v pôvodnej štúdii (4,0 mg/kg) [3], a ešte vyššie konečné dávky, pravdepodobne na základe reakcie ich mačky na liečbu. Priemerné počiatočné dávkovanie bolo 6,7 ​​mg/kg a priemerné konečné dávkovanie bolo 8,5 mg/kg; tento rozdiel bol štatisticky významný (p <0,001). Majitelia mačiek, ktoré vykazovali neurologické alebo očné príznaky FIP, boli správcami skupín inštruovaní, aby začali s vyššími dávkami (8 mg/kg). Nie je jasné, či je táto prax opodstatnená, na základe nedostatku publikovaných dôkazov o použití terapie GS-441524 pri neurologickej alebo okulárnej FIP, okrem jedinej kazuistiky očného ochorenia, ktoré bolo liečené 8 mg/kg Mutian a simultánne mačacím interferónom omega [14]. Mačkám, u ktorých bola pôvodne diagnostikovaná neneurologická/neokulárna FIP, a u ktorých sa neskôr objavili neurologické alebo očné príznaky, bolo tiež odporučené zvýšiť dávkovanie. Mnoho majiteľov tiež zvýšilo dávkovanie, ak sa ich mačka v časovom bode 4 alebo 8 týždňov nedosiahla výrazné zlepšenie, teda mala A:G 0,5 alebo nižší. Podľa našich zistení sa niektorí majitelia rozhodli začať najskôr na spodnom konci dávkovacieho rozmedzia, aby zistili, či to bude postačovať na liečbu klinických príznakov ich mačiek, najmä kvôli obavám z nákladov. Pôvodné štúdie na GS-441524 pre FIP uvádzali menší úspech pri liečbe FIP u mačiek začínajúcich na 2,0 mg/kg a určili optimálne dávkovanie 4,0 mg/kg podávanú subkutánne každých 24 hodín [3]. Rozdiel v účinnom dávkovaní medzi kontrolovanou štúdiou od UC Davis [3] a tým, ktoré uviedli majitelia v našej štúdii, ktorí získali nelicencovanú terapiu podobnú GS-441524, môže byť spôsobený nedostatočnou kontrolou kvality od rôznych čiernych výrobcov. Je možné, že nelicencované formulácie obsahujú menej čistú zlúčeninu alebo sú inak menej účinné ako zlúčenina farmaceutickej kvality. Preto je náročné porovnať tieto dávkovania priamo.

Na základe pôvodného liečebného protokolu použitého v štúdii UC Davis je odporúčaná dĺžka liečby 84 dní (12 týždňov) [3]. Z našich pozorovaní na stránkach skupín je rozhodnutie ukončiť liečbu a začať 84-dňové (12-týždňové) obdobie pozorovania založené nielen na úplnom ústupe klinických príznakov hlásených majiteľom (s výnimkami pri minoritných zvyškových okulárnych alebo neurologických príznakov), ale aj v 12. týždni krvných testov preukazujúcich normalizáciu hladín sérových bielkovín. Dobrovoľný veterinárny lekár na stránke sociálnych sietí často preskúma krvné testy týchto majiteľov a schváli ukončenie terapie GS-441524. Aj keď sa zdá, že niektoré mačky dosahujú klinickú remisiu oveľa skôr, ako o 12-týždňov, majitelia a správcovia webových stránok sa zdráhajú prerušiť liečbu skôr ako za 12 týždňov zo strachu, že mačka relapsuje. Liečebné kúry kratšie ako 12 týždňov ešte neboli formálne vyhodnotené. Žiadny respondent prieskumu v našej štúdii neuviedol predčasné (<12 týždňov) ukončenie terapie, okrem prípadov, keď mačka zomrela alebo bola eutanizovaná.

Protokol vytvorený správcami sociálnych skupín odporúča všetkým majiteľom, aby začali s liečbou injekčnou formou lieku s obsahom GS-441524. Považuje sa to za lepšie kvôli obavám z enterálnej absorpcie liekov u mačiek s gastrointestinálnymi príznakmi (vracanie, hnačka) alebo anorexiou. Po dvoch až štyroch týždňoch injekčnej liečby sa mačky prehodnocujú prípad od prípadu, aby sa zistilo, či môžu prejsť na perorálnu formuláciu. Pri oboch formách lieku existujú problémy s kompatibilitou pacienta. Koncentrácia zlúčeniny v orálnom prípravku je nízka, čo vyžaduje podanie viacerých kapsúl naraz, čo môže byť pre majiteľov náročné. Aj keď je jednoduchšie zaistiť, aby pacient dostal celú dávku v injekčnej forme, pH 1,5 požadované na udržanie lieku v stabilnom stave [3] je veľmi kyslé, čo pravdepodobne vedie k bolesti a vokalizácii po injekcii. Väčšina majiteľov v našom prieskume (71,7%) uviedla, že používa iba injekčnú formu GS-441524, zatiaľ čo iba 8,2% uviedlo, že používa iba perorálnu formuláciu. Pravdepodobne kvôli kyslej povahe injekčnej formy väčšina pacientov (89% z tých, ktorí dostávali injekcie) vokalizovala po injekcii, a pre väčšinu (83% z tých, ktorí dostávali injekcie) bola aplikácia bolestivá v mieste (miestach) injekcie. Bolesť a chorobnosť spojená s miestom vpichu predstavovali väčšinu hlásených nežiaducich účinkov lieku. U mnohých mačiek (46% z tých, ktorí dostávali injekcie) sa vyvinuli vredy alebo rany v predchádzajúcich miestach vpichu a u 43% mačiek (z tých, ktoré dostávali injekcie) bolo hlásené krvácanie v mieste vpichu.

Injekčné a perorálne formy vitamínu B1 alebo vitamínu B12 boli najčastejšie uvádzanou podpornou terapiou používanou vlastníkmi. Išlo pravdepodobne o pomoc mačkám, ktoré boli anemické, mali gastrointestinálne príznaky a/alebo mali anorexiu [15]. Okrem hematologických účinkov vitamín B12 ovplyvňuje ďalšie telesné systémy, ako sú neurologické a kardiovaskulárne systémy, a môže pomôcť pri prevencii chorôb u ľudí [16], ktoré by u mačiek s podozrením na FIP bolo možné použiť terapeuticky alebo profylakticky. Nie je prekvapením, že druhou najčastejšou doplnkovou terapiou bolo podávanie steroidov (pravdepodobne glukokortikoid; v prieskume sa neuvádza), ktoré sú tradične súčasťou štandardnej starostlivosti o FIP [17]. Boli hlásené rôzne nutraceutiká a ako podporná starostlivosť sa bežne používala buď subkutánna alebo intravenózna tekutinová terapia (27,4%, náš výskum nerozlišuje). Časté používanie antibiotík (predpokladá sa v dôsledku rán/abscesov v mieste vpichu, profylaktické použitie v dôsledku neutropénie alebo na iné empirické použitie) vyvoláva vážne obavy z toho, ako sa tieto lieky získavali a či sa dodržiavala primeraná antimikrobiálna manipulácia. Je zaujímavé, že „svetelnú terapiu“ (známu aj ako fotobiomodulácia) používalo 11,9% vlastníkov. Táto terapia sa príležitostne používa vo veterinárnej medicíne ako alternatívna metóda na liečbu zápalových stavov, poskytovanie analgézie a na urýchlenie hojenia rán [18,19]. Existuje podozrenie, že svetelná terapia sa používala väčšinou na liečbu rán, ktoré sa vyvinuli v dôsledku injekčnej formy liečby. Kontrola bolesti nebola hlásená tak často, ako sa očakávalo. NSAID (nesteroidné protizápalové lieky) boli spomenuté zriedkavo, pravdepodobne kvôli súbežnému užívaniu steroidov. Gabapentín uviedlo iba 8,2% majiteľov a tento liek mohol byť použitý buď na sedáciu/chemické obmedzenie pacienta, alebo na analgéziu.

Z predložených údajov sme považovali za najpozoruhodnejší počet mačiek, ktoré údajne dobre reagovali na liečbu a v čase prieskumu ich majitelia uviedli, že sú v úplnej klinickej remisii (bez klinických príznakov, ktoré boli predtým spojené s diagnózou FIP). Len malé percento pokračovalo v liečbe kvôli relapsu (2,7%), ktorý je definovaný ako recidíva klinických príznakov, ktoré vedú k diagnóze FIP alebo vzniku nových klinických príznakov FIP. To platilo pre rôzne klinické prejavy FIP, vrátane efuzívnej, neefuzívnej, okulárnej a neurologickej FIP. Takmer všetky (96,7%) mačky boli nažive v čase, keď ich majitelia odoslali dotazník. Predtým sa verilo, že zatiaľ čo GS-441524 sa ukazuje ako účinná liečba efuzívnych a neefuzívnych foriem FIP, okulárne a neurologické formy sú oveľa ťažšie liečiteľné kvôli neschopnosti GS441524 prejsť hematookulárnou alebo hematoencefalickou bariérou [2]. Okrem toho predchádzajúce merania GS-441524 vo vzorkách komorovej vody a mozgovomiechovej tekutiny (CSF) ukázali podstatne nižšie koncentrácie ako vzorky séra po subkutánnych injekciách GS-441524 [2]. V našej štúdii 42,3% majiteľov uviedlo, že ich mačka má neurologické alebo očné príznaky a iba 4,7% týchto mačiek údajne neprežilo. Aj keď je v tejto oblasti potrebný ďalší výskum, naša štúdia poskytuje dôkaz, že terapia GS-441524 je možnosťou aj pre týchto pacientov. Dôvodom môže byť to, že počiatočné aj konečné dávkovania mačiek v tejto skupine liečených doma ich majiteľmi boli podstatne vyššie ako pôvodne publikované dávkovania [3].

Vzhľadom na množstvo rôznych nelicencovaných značiek antivírusových liekov s GS-441524 a množstvo vlastníkov, ktorí počas liečby používali viacero značiek, naša štúdia nebola schopná zistiť, či je jedna značka účinnejšia ako druhá. To bolo umocnené skutočnosťou, že väčšina mačiek v štúdii bola v čase písania textu nažive, čo naznačuje veľmi vysokú účinnosť väčšiny, ak nie všetkých, nelicencovaných značkiek GS-441524. Aj keď uznávame inherentnú zaujatosť v tejto štúdii, napriek nedostatku dohľadu nad výrobou liekov s GS-441524 sa zdá, že je veľmi úspešný pri liečbe FIP podľa údajov uvádzaných vlastníkmi. Napriek tomu je rozumné sa domnievať, že tieto rôzne formulácie sa môžu líšiť v koncentrácii, čistote, pH, účinnosti, absorpčnom vzore, vedľajších účinkoch a ďalších charakteristikách, čo z nich robí cenný základ ďalšej štúdie. Upozorňujeme, že nemôžeme priamo potvrdiť, že ktorákoľvek z tu uvedených značiek obsahuje akúkoľvek zlúčeninu podobnú GS-441524; toto je dôležitá oblasť aktívneho vyšetrovania našej skupiny a ďalších. Je stále možné, že niektoré z týchto značiek obsahujú iné antivirotiká na báze nukleozidových analógov, proteázový inhibítor GC376 [20] alebo niečo úplne iné.

Jedno zrejmé obmedzenie našej štúdie je, že neexistuje žiadny konečný antemortem diagnostický test na infekčnú peritonitídu mačiek (mimo invazívnej chirurgie a biopsie, ktorá sa vykonáva veľmi zriedka), a respondenti nášho prieskumu sa sami vybrali tak, aby sa pripojili k sociálnym skupinám FIP a reagovali na náš prieskum. Preto, hoci bolo hlásených 380 z 393 mačiek, ktorých majitelia sa zúčastnili prieskumu, nažive, neexistuje spôsob, ako potvrdiť diagnózu FIP u týchto mačiek alebo u 13 uhynutých mačiek, pretože neboli hlásené žiadne pitvy. Nepochybne niektorí z týchto pacientov mohli byť nesprávne diagnostikovaní a ich majitelia nesprávne nasmerovaní na liečbu GS-441524. Pozitívna odpoveď na terapiu teda mohla byť u niektorých pacientov iba zhodou okolností. Podobne prípady, u ktorých bolo hlásené, že nereagujú dobre na terapiu podobnú GS-441524 (t.j. 13 mačiek, ktoré zomreli v tejto štúdii), mohli byť preto, že pacient skutočne trpel inou chorobou. Vzhľadom na náklady na túto liečbu a veľké ťažkosti spojené s jej získaním je však opodstatnené predpokladať, že u mnohých pacientov už bola väčšina ostatných spôsobov diagnostiky a terapie vykonaná a vyčerpaná, a že FIP bola skutočne najpravdepodobnejšou diferenciálnou diagnózou. Je potrebné poznamenať, že zatiaľ čo v súčasnosti neexistuje jediný, minimálne invazívny, definitívny diagnostický test na FIP, reakcia na liečbu GS-441524 by sa dala považovať za podpornú alebo dokonca diagnostickú metódu FIP. Väčšina majiteľov (88,2%) uviedla dramatické zlepšenie klinických príznakov do jedného týždňa od začiatku liečby s priemerným časom „návratu k normálnemu správaniu“ 3,85 týždňa. Preto by v budúcnosti mačky s podozrením na FIP mohli začať s liečbou GS-441524 a rýchla reakcia na lieky by mohla byť užitočná diagnosticky aj terapeuticky. Je však dôležité zaistiť kontinuálne hodnotenie renálnych a hepatálnych funkcií, pretože nukleozidové analógy môžu byť nefrotoxické aj hepatotoxické [21].

V súvislosti s vyššie uvedeným obmedzením pravdepodobne výberová odchýlka zohrala veľkú úlohu v zjavnom úspechu terapie v našej štúdii. Prieskum bol rozoslaný na hlavnej stránke podpornej FIP skupiny, ako aj na stránkach pre mačky, ktoré boli považované buď za „vyliečené“, s relapsom a predĺženou liečbou, trpiace neurologickou a očnou FIP, alebo trpiace efuzívnou (vlhkou) FIP. Odpovede na prieskum boli vyžiadané od majiteľov, ktorých mačky absolvovali najmenej 12 týždňov liečby. Aj keď sa tým splnil náš cieľ získať informácie od používateľov internetu o nelicencovaných liekoch GS-441524, výsledky vykazujú nepochybne určitú zaujatosť oproti majiteľom, ktorých mačky začali s liečbou GS-441524, ale následne zomreli na FIP, pretože možno opustili skupiny alebo sa rozhodli nevyplniť prieskum z dôvodu negatívnych emočných stavov vrátane nedostatku nadšenia z neúspešnej liečby. Je rozumné predpokladať, že títo majitelia sa s väčšou pravdepodobnosťou odídu zo skupiny, potom ako svoju mačku stratili kvôli chorobe, alebo že algoritmus webových stránok skupín im tieto príspevky nemusí zobrazovať tak často. Tento efekt ešte zhoršuje skutočnosť, že pôvodná webová stránka FIP skupiny bola prevádzovateľom sociálnej siete odstránená v auguste 2020. Zostávajúcich členov skupiny pravdepodobne postihne „zaujatie nadšením“, pričom iba tí najnadšenejší a najpozitívnejší členovia skupiny zostávajú. Tieto faktory veľmi pravdepodobne zvýšili úspešnosť tu uvádzanú; Nedávna štúdia v Číne však zistila podobné, veľmi vysoké prežitie u mačiek liečených GS-441524 a GC376 (29/30 mačiek klinicky vyliečených) [22]. Tieto údaje o výsledkoch hlásených vlastníkmi by sa preto mali považovať za predbežné a je naliehavo potrebný ďalší výskum skutočnej účinnosti terapie GS-441524 v poľných podmienkach.

K ďalším obmedzeniam štúdie patrí, že dokončenie ankety trvalo asi 30 minút, pričom v tomto bode mohli byť majitelia unavení z odpovedí na otázky. V otázkach, ktoré poskytovali dlhé zoznamy možných odpovedí, mohla zohrať významnú úlohu aj zaujatosť [23]. Okrem toho spoliehanie sa na to, že si majitelia (s neznámym lekárskym vzdelaním) budú pamätať na udalosti stresujúceho obdobia pri starostlivosti o chorú mačku, môže viesť k nepresnostiam pri spomínaní. Čiastočne kvôli týmto problémom naša skupina pokračuje v prebiehajúcej prospektívnej analýze nelicencovanej terapie podobnej GS-441524 pre FIP. Napriek tomu tu poskytnuté údaje poukazujú na bezprecedentnú udalosť vo veterinárnej medicíne a zo skúseností týchto majiteľov sa možno zmysluplne poučiť.

Je dôležité, že hoci je GS-441524 štrukturálne veľmi podobný remdesiviru a existuje dobrý dôvod domnievať sa, že môže byť účinný proti iným koronavírusom, žiadny respondent prieskumu neuviedol používanie nelicencovaných prípravkov GS-441524 určených pre mačky pri liečbe ľudí so SARS-CoV-2. To bolo mierne prekvapujúce vzhľadom na to, že rovnaké zúfalstvo z liečby FIP u mačiek, ktoré viedlo k rozvoju čierneho terapeutického trhu s GS-441524, je možné nájsť u miliónov rodín na celom svete s milovanou osobou trpiacou na COVID- 19 počas obdobia trvania prieskumu. Nemáme však žiadne informácie o takom použití, ani z našich údajov z prieskumov, ani z neoficiálneho monitorovania týchto FIP skupín. Z regulačného hľadiska by neoprávnené používanie liekov s GS-441524 u ľudí pravdepodobne znamenalo vyššiu úroveň právneho záujmu.

Závery

Aj keď ide o nekonvenčnú a určite nie bez zdravotných a právnych rizík, nelicencovanú, domácu terapiu s GS-441524, podľa majiteľov účinne rieši klinické príznaky u mačiek s podozrením na FIP. Podľa údajov uvádzaných vlastníkmi je táto nelicencovaná liečba očividne účinná pri rôznych klinických prejavoch ochorenia (efuzívna, neefuzívna, neurologická a očná forma FIP). Budúcnosť tohto konkrétneho lieku na liečbu FIP je nejasná, pretože stav výroby, distribúcie a patentových práv GS-441524 sa neustále vyvíja. Táto liečba však predstavuje testovací prípad sociálnych médií a entít pochádzajúcich z davu, ktoré povstávajú, aby vyplnili prázdnotu, ktorú zanechalo korporačné odmietnutie „zázračného lieku“ na predtým 100% smrteľnú chorobu. Jedna sa o prvý takto rozsiahly prípad vo veterinárnej medicíne, ale v dnešnej dobe vysoko prepojeného internetu takmer určite nebude posledný.

Referencie

  1. Frediansyah, A.; Nainu, F.; Dhama, K.; Mudatsir, M.; Harapan, H. Remdesivir and its antiviral activity against COVID-19: A systematic review. Clin. Epidemiol. Glob. Health 20219, 123–127. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  2. Murphy, B.G.; Perron, M.; Murakami, E.; Bauer, K.; Park, Y.; Eckstrand, C.; Liepnieks, M.; Pedersen, N.C. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet. Microbiol. 2018219, 226–233. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  3. Pedersen, N.C.; Perron, M.; Bannasch, M.; Montgomery, E.; Murakami, E.; Liepnieks, M.; Liu, H. Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 201921, 271–281. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  4. Pubchem. PubChem Compound Summary for CID 44468216 [Internet]. National Center for Biotechnology Information. 2021. Available online: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/gs-441524 (accessed on 28 May 2021).
  5. Pedersen, N.C. An update on feline infectious peritonitis: Virology and immunopathogenesis. Vet. J. 2014201, 123–132. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  6. Drechsler, Y.; Alcaraz, A.; Bossong, F.J.; Collisson, E.W.; Diniz, P.P.V. Feline coronavirus in multicat environments. Vet. Clin. N. Am. Small Anim. Pract. 201141, 1133–1169. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  7. Ettinger, S.J.; Feldman, E.C.; Cote, E. Textbook of Veterinary Internal Medicine—eBook; Elsevier Health Sciences: Amsterdam, The Netherlands, 2017. [Google Scholar]
  8. Lewis, C.S.; Porter, E.; Matthews, D.; Kipar, A.; Tasker, S.; Helps, C.R.; Siddell, S.G. Genotyping coronaviruses associated with feline infectious peritonitis. J. Gen. Virol. 201596, 1358–1368. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  9. Addie, D.D.; Jarrett, O. Use of a reverse-transcriptase polymerase chain reaction for monitoring the shedding of feline coronavirus by healthy cats. Vet. Rec. 2001148, 649–653. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  10. Pedersen, N.C. An update on feline infectious peritonitis: Diagnostics and therapeutics. Vet. J. 2014201, 133–141. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  11. Pesteanu-Somogyi, L.D.; Radzai, C.; Pressler, B.M. Prevalence of feline infectious peritonitis in specific cat breeds. J. Feline Med. Surg. 20068, 1–5. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  12. Riemer, F.; Kuehner, K.A.; Ritz, S.; Sauter-Louis, C.; Hartmann, K. Clinical and laboratory features of cats with feline infectious peritonitis—A retrospective study of 231 confirmed cases (2000–2010). J. Feline Med. Surg. 201618, 348–356. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  13. MUTIAN. Cat FIP Symptoms & Treatment: Free Online Support. Available online: https:/www.mutian.us/ (accessed on 1 March 2021).
  14. Addie, D.D.; Covell-Ritchie, J.; Jarrett, O.; Fosbery, M. Rapid Resolution of Non-Effusive Feline Infectious Peritonitis Uveitis with an Oral Adenosine Nucleoside Analogue and Feline Interferon Omega. Viruses 202012, 1216. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  15. Maunder, C.L.; Day, M.J.; Hibbert, A.; Steiner, J.M.; Suchodolski, J.S.; Hall, E.J. Serum cobalamin concentrations in cats with gastrointestinal signs: Correlation with histopathological findings and duration of clinical signs. J. Feline Med. Surg. 201214, 686–693. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  16. O’Leary, F.; Samman, S. Vitamin B12 in health and disease. Nutrients 20102, 299–316. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  17. Hartmann, K.; Ritz, S. Treatment of cats with feline infectious peritonitis. Vet. Immunol. Immunopathol. 2008123, 172–175. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  18. Hamblin, M.R.; Demidova, T.N. Mechanisms of low level light therapy. Mechanisms for Low-Light Therapy. Int. Soc. Opt. Photonics 20066140, 614001. [Google Scholar]
  19. Venter, M. Light therapy in veterinary practice. Vet. Nurs. J. 201328, 320–323. [Google Scholar]
  20. Pedersen, N.C.; Kim, Y.; Liu, H.; Galasiti Kankanamalage, A.C.; Eckstrand, C.; Groutas, W.C.; Bannasch, M.; Meadows, J.M.; Chang, K.-O. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 201820, 378–392. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  21. Fan, Q.; Zhang, B.; Ma, J.; Zhang, S. Safety profile of the antiviral drug remdesivir: An update. Biomed. Pharmacother. 2020130, 110532. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  22. Yin, Y.; Li, T.; Wang, C.; Liu, X.; Ouyang, H.; Ji, W.; Liu, J.; Liao, X.; Li, J.; Hu, C. A retrospective study of clinical and laboratory features and treatment on cats highly suspected of feline infectious peritonitis in Wuhan, China. Sci. Rep. 202111, 5208. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]
  23. Koppell, J.G.; Steen, J.A. The Effects of Ballot Position on Election Outcomes. J. Politics 200466, 267–281. [Google Scholar] [CrossRef]
Prečítať “Nelicencovaná GS-441524 antivírusová terapia môže byť účinná pri domácej liečbe infekčnej peritonitídy mačiek”

Virucidné a antivírusové účinky esenciálneho oleja Tymiánu obyčajného na mačací koronavírus

22.4.2021
Cristiana Catella, Michele Camero, Maria Stella Lucente, Giuseppe Fracchiolla, Sabina Sblano, Maria Tempesta, Vito Martella, Canio Buonavoglia, Gianvito Lanave
Pôvodný článok: Virucidal and antiviral effects of Thymus vulgaris essential oil on feline coronavirus

Základné fakty

  • EO fungujú ako antibakteriálne, antivírusové, protiplesňové a insekticídne látky.
  • TEO preukázal účinnosť proti niekoľkým RNA vírusom vrátane CoV.
  • Protiinfekčná aktivita TEO proti FCoV sa hodnotila v bunkách CRFK.
  • Ukázalo sa, že TEO inhibuje replikáciu FCoV in vitro.
  • TEO vykazoval virucidnú aktivitu proti FCoV až 92,86%.

Abstrakt

Mačací infekčný zápal pobrušnice (FIP) je smrteľné systémové ochorenie mačiek spôsobené koronavírusom (CoV) (FIPV). Napriek klinickému významu a vplyvu na zdravie mačiek sú v súčasnosti terapeutické možnosti liečby FIP u mačiek obmedzené. Výskyt pandemického koronavírusu ťažkého respiračného syndrómu typu 2 (SARS-CoV-2), etiologického agens koronavírusovej choroby z roku 2019 (COVID-19), schopného infikovať široké spektrum druhov zvierat vrátane mačiek, vyvolali záujem o vývoj nových molekúl s antivírusovou aktivitou na liečbu infekcií CoV u ľudí a zvierat.

Esenciálne oleje (EO) vzbudili významnú pozornosť svojimi antivírusovým vlastnosťami, ktoré integrujú a v niektorých prípadoch nahrádzajú bežné lieky. Je známe, že Thymus vulgaris EO (TEO) je účinný proti niekoľkým RNA vírusom vrátane CoV. V predloženej štúdii sa antivírusová účinnosť TEO proti FIPV hodnotila in vitro.

TEO v koncentrácii 27μg/ml bol schopný inhibovať replikáciu vírusu s významným znížením o 2 log10 TCID50/50 μl. Okrem toho bola virucidná aktivita testovaná pomocou TEO pri koncentrácii 27 a 270 μg/ml, nad cytotoxickým prahom, na stanovenie zníženia vírusového titra až na 3,25 log10 TCID50/50 μl do 1 hodiny časového kontaktu. Tieto výsledky otvárajú niekoľko perspektív z hľadiska budúcich aplikácií a terapeutických možností pre koronavírusy, keďže FIPV infekcia u mačiek by mohla byť potenciálnym modelom pre štúdium antivirotík proti CoV.

Kľúčové slová

Tymianový éterický olej, Mačací koronavírus, Thymus vulgaris, Tymián obecný, Dúška tymianová, Materina dúška, Tymián obyčajný, FIP

Výsledky

Pandémia koronavírusovej choroby z roku 2019 (COVID-19) spôsobená koronavírusom ťažkého repiračného syndrómu (SARS-CoV-2) (WHO, 2020) podnietila výskum liečby a imunitnej profylaxie s využitím predošlých poznatky zhromaždených o SARS-CoV-1 a živočíšnych CoV (Decaro a kol., 2020). Doteraz nebol schválený žiadny konkrétny liek na liečbu pacientov s COVID-19. Remdesivir, inhibítor RNA-dependentnej RNA polymerázy (RdRp), však preukázal sľubné výsledky (Kabir a kol., 2020). Okrem toho v súčasnosti prebiehajú štúdie na vyhodnotenie účinnosti teikoplanínu a monoklonálnych a polyklonálnych protilátok proti SARS-CoV-2 (Kabir a kol., 2020).

Lieky skúmané u mačiek na liečbu mačacej infekčnej peritonitídy (FIP) boli tiež testované proti COVID-19 u ľudských pacientov (Pedersen a kol., 2018, Pedersen a kol., 2019).

Koronavírusy sú dlho známe práve kvôli existencii FIP, smrteľného systémové ochorenia mačiek. Vírus FIP (FIPV) je virulentný patotyp mačacieho enterického koronavírusu (FCoV) (Kummrow a kol., 2005). Napriek jeho vplyvu na zdravie mačiek sú terapeutické možnosti liečby FIP u mačiek obmedzené a účinné vakcíny nie sú k dispozícii. Okrem toho boli hlásené nepriaznivé účinky vakcín (Tizard, 2020). Vývoj nových molekúl s antivírusovou aktivitou na liečbu infekcií CoV je v súčasnosti vnímaný ako priorita v humánnej aj v živočíšnej medicíne. Infekcia FIPV u mačiek sa považuje za potenciálny model pre štúdium antivirotík proti CoV (Amirian a Levy, 2020).

Rastlinné lieky podnietili záujem spotrebiteľov i vedcov (Hosseinzadeh a kol., 2015) a éterické oleje (EO) extrahované z aromatických a liečivých rastlín zvýšili osobitnú pozornosť pre ich prospešné vlastnosti (de Sousa Barros a kol., 2015). Uvádza sa, že EO vykazujú významné antiseptické, antibakteriálne, antivírusové, antioxidačné, antiparazitárne, protiplesňové a insekticídne účinky (Chouhan a kol., 2017; Ma a Yao, 2020). Nedávno u sumcov experimentálne intoxikovaných Thiamethoxamom (TMX) podávanie EO Thymus vulgaris (TEO) čiastočne znížilo toxické účinky TMX (El Euony a kol., 2020). EO sú tiež potenciálnym rezervoárom inovatívnych terapeutických riešení, ktoré integrujú a v niektorých prípadoch nahrádzajú konvenčné lieky (Reichling a kol., 2009). Napríklad EO Laurus nobilis (Vavrín pravý – Vavřín vznešený) inhiboval SARS CoV typu 1 (SARS-CoV-1) (Loizzo a kol., 2008) a zmes EO bola účinná proti vírusu vtáčej koronavírusovej infekčnej bronchitídy (IBV) (Jackwood et al., 2010). ). Nedávno sa tiež ukázalo, že EO vykazujú antivírusovú aktivitu proti SARS-CoV-2 (Asif a kol., 2020). Ukázalo sa, že TEO je účinný proti niekoľkým RNA vírusom vrátane CoV (Lelešius a kol., 2019; Nadi a kol., 2020).

Zloženie TEO (Specchiasol Bussolengo, Verona – Taliansko) sa stanovilo v troch nezávislých experimentoch pomocou plynovej chromatografie technikou hmotnostnej spektrometrie (GC-MS) (Rosato a kol., 2020). Podrobnosti o príprave vzoriek, prístrojoch a metódach analýzy GC-MS už boli publikované (Salvagno a kol., 2020; Rosato a kol., 2018). Dáta z GC/MS analýz boli vyjadrené ako % plochy ± Modelovanie štruktúrnych rovníc (SEM). Vo všetkých prípadoch bol SEM nižší ako 10%. Štatistická analýza pre SEM bola vykonaná pomocou programu Microsoft Excel Office 2010 (Windows 7 Home Premium, Microsoft Corporation, USA). Celkovo bolo vo vzorke TEO identifikovaných 26 zložiek, čo zodpovedá 98,7% celej zmesi. Podrobné chemické zloženie TEO je uvedené v doplnkovej tabuľke 1.

TEO v koncentrácii 928 mg/ml sa najskôr zriedil v dimetylsulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) a následne v Dulbecco-MEM (D-MEM).

Mačacie obličkove bunky Crandell Reese (CRFK) sa kultivovali v DMEM a kmeni FCoV-II 25/92 (Buonavoglia a kol., 1995) s titrom 105.25 TCID50/50 μl.

Cytotoxicita TEO sa hodnotila pomocou testu XTT (Denizot a Lang, 1986) s použitím súpravy In Vitro Toxicology Assay Kit (Sigma – Aldrich Srl, Miláno, Taliansko) po vystavení buniek rôznym koncentráciám zlúčenín (7.25, 14.5, 29, 58, 116, 232, 464, 928, 1856 μg/ml) počas 72 hodín. Cytotoxicita sa vyhodnocovala spektrofotometrickým meraním absorpčného signálu (optická hustota, OD). Vo všetkých experimentoch boli neošetrené bunky použité ako negatívna kontrola pri 0% cytotoxicite. Ako kontrola vehikula sa použili bunky ošetrené ekvivalentnými riedeniami DMSO. Po logaritmickej konverzii koncentrácií TEO sa údaje získané v testoch cytotoxicity analyzovali pomocou postupu nelineárnej úpravy krivky. Správnosť zhody sa testovala nelineárnou regresnou analýzou krivky dávka-odozva. Maximálna necytotoxická koncentrácia sa považovala za koncentráciu zlúčeniny, pri ktorej životaschopnosť ošetrených buniek CRFK poklesla o nie viac ako 20% (CC20) vzhľadom na negatívnu kontrolu.

Hodnota CC20 TEO bola vyhodnocovaná pri 27μg/ml a vypočítaná na základe priemeru ± štandardná odchýlka (SD) z troch experimentov. Vo všetkých experimentoch DMSO nepreukázal žiadny účinok na bunky.

Na základe výsledkov testu cytotoxicity sa antivírusová aktivita TEO proti kmeňu FCoV-II 25/92 vyhodnocovala pri 27μg/ml a tiež pod cytotoxickým prahom (13,5 μg/ml). Použitie látky pod cytotoxickým prahom nám umožňuje znížiť toxicitu a dosiahnuť efektívne výsledky pri nižších nákladoch. Konfluentné monovrstvy CRFK buniek 24h na 24-jamkových platniach boli infikované 100µl FCoV-II obsahujúceho 10000 TCID50 s multiplicitou infekcie (MOI) 0,14. Po adsorpcii vírusu počas 1 hodiny pri 37°C sa očkovacie látky odstránili, bunkové monovrstvy sa raz premyli a pridal sa TEO. V neošetrených infikovaných bunkách sa použil D-MEM na nahradenie inokula a použil sa ako vírusová kontrola. Po 72 hodinách sa odobrali alikvóty supernatantov na vírusovú titráciu (Lanave a kol., 2019) a kvantifikáciu RNA (Gut a kol., 1999).

Virucidná aktivita TEO proti FCoV-II sa hodnotila predbežnou liečbou vírusu (10000 TCID50) pomocou TEO v koncentrácii 27μg/ml a nad cytotoxickým prahom (270μg/ml), pretože ak sa použije ako virucid, molekula nie je v priamom kontakte s bunkami. Konkrétne bolo 100µl FCoV-II ošetrených TEO (1 ml) pri izbovej teplote. Na experimenty sa použila vírusová kontrola. Po 10 minútach, 30 minútach a 1 hodine sa alikvotné podiely každej zmesi vírusu-TEO a vírusovej kontroly podrobili vírusovej titrácii (Lanave et al., 2019).

Údaje z testov antivírusovej a virucidnej aktivity boli vyjadrené ako priemer ± SD a analyzované analýzou odchýlky (ANOVA) pomocou Tukeyho testu ako post hoc testu (štatistická významnosť stanovená na 0,05).

Štatistické analýzy sa uskutočňovali pomocou softvéru GraphPad Prism v.8.0.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Vírusové titre infikovaných buniek CRFK ošetrených TEO a neošetrených infikovaných buniek (vírusová kontrola) sa vyjadrili ako log10 TCID50/50 ul a vyniesli sa proti koncentráciám liečiva. Porovnaním vírusového titra neošetrených infikovaných buniek (4,25 log10 TCID50/50 μl) s infikovanými bunkami ošetrenými TEO v koncentrácii 13,5 a 27μg/ml došlo k poklesu o 0,25 (p> 0,05) a 2,25 log10 TCID50/50 μl (p < 0,0001), v danom poradí (obr. 1A). To naznačuje, že TEO v koncentrácii 27μg/ml je schopný významne inhibovať replikáciu vírusu. Antivírusová aktivita TEO proti FIPV korešponduje s výsledkami získanými s hydrosolmi Thymus vulgaris in vitro proti vírusu reprodukčného a respiračného syndrómu ošípaných (PRRSV) (Kaewprom a kol., 2017).

Obrázok 1. Vírusové titre supernatantov odobratých 72 hodín po infekcii z neošetrených CRFK buniek infikovaných FCoV (10 TCID50) a ošetrených éterickým olejom Thymus vulgaris (TEO) v rôznych koncentráciách (13,5 a 27μg/ml). 0=Neošetrené CRFK bunky infikovanée FCoV, NA=Nukleová kyselina

Vírusové titre sa hodnotili metódou zriedenia endpointu, vyjadrili sa ako log10 TCID50/50 μl a vyniesli sa proti TEO pri rôznych koncentráciách (A). Vírusové nukleové kyseliny boli kvantifikované pomocou qPCR, vyjadrené ako log10 vírusových NA/10ul a vynesené proti TEO pri rôznych koncentráciách (B). Pruhy na obrázkoch označujú priemery. Chybové pruhy označujú štandardnú odchýlku.

Vírusové nukleové kyseliny (NA) sa vyjadrili ako log10 vírusových NA/10μl infikovaných buniek ošetrených TEO a vírusovou kontrolou a vyniesli sa proti necytotoxickým koncentráciám liečia. Porovnaním vírusovej nálože neošetrených infikovaných buniek (6,53 log10 vírusových NA/10μl) s infikovanými bunkami ošetrenými TEO pri 13,5 a 27 μg/ml bol zaznamenaný pokles o 0,61 (p = 0,0005) a 1,34 (p <0,0001) log10 NAs /10 μl, v danom poradí (obrázok 1B).

Virucidná aktivita TEO bola vyhodnocovaná pri rôznych koncentráciách a pre rôzne doby kontaktu s FCoV-II (obr. 2). Po 10 minútach TEO pri 27 a 270μg/ml sa zistilo zníženie o 1,5 (p = 0,0008) a 2,5 (p <0,0001) log10 TCID50/50μl v porovnaní s vírusovou kontrolou (4,25 log10 TCID50/50 μl) (Obr. 2A). Po 30 minútach TEO pri 27 a 270 μg/ml indukoval pokles o 1,25 (p = 0,0007) a 3,375 (p <0,0001) log10 TCID50/50 μl v porovnaní s vírusovou kontrolou (3,75 log10 TCID50/50 μl) (Obr. 2B). Po 1 hodine TEO pri 27 a 270μg/ml došlo k poklesu o 1,25 (p = 0,0007) a 3,25 (p <0,0001) log10 TCID50/50μl v porovnaní s vírusovou kontrolou (3,50 log10 TCID50/50μl). K vírusovej inaktivácii došlo v závislosti na dávke a čase, počínajúc od 33,33% a dosahujúcou 92,86%, keď sa TEO použil v najvyššej koncentrácii (270 μg/ml), po 1 hodine (obr. 2C). Virucidnú aktivitu TEO možno vysvetliť schopnosťou poškodiť vírusový obal, čím sa zabráni adsorpcii a penetrácii do hostiteľských buniek (Reichling a akol., 2009), ako ukázala elektrónová mikroskopia u obalu herpesvírusu po predbežnej liečbe EO (Shogan a kol., 2006). TEO by preto mohol byť cenným prostriedkom na dezinfekciu povrchov a mohol by byť prísadou pri príprave potravinových výrobkov.

Obrázok 2. Virucidný účinok TEO pri rôznych koncentráciách (27 a 270 μg/ml) proti FCoV (10000 TCID50). Vírus bol inkubovaný s TEO počas 10 minút (A), 30 minút (B) a 60 minút (C) pri izbovej teplote a následne titrovaný v CRFK bunkách. Vírusové titre FCoV boli vyjadrené ako log10 TCID50/50 μl a vynesené proti TEO pri rôznych koncentráciách. Pruhy na obrázkoch označujú priemery. Chybové pruhy označujú štandardnú odchýlku.

Thymus vulgaris je aromatická rastlina stredomorského pôvodu, ktorá obsahuje EO a lipofilné látky (Nabavi a kol., 2015) a jej extrakty sú bohaté na tymol, karvakrol, p-cymén a γ-terpinén (Kowalczyk a kol., 2020).

Thymus vulgaris preukázal antivírusovú aktivitu proti herpes simplex vírusu (HSV) (Nolkemper a kol., 2006), chrípkovému vírusu (Vimalanathan a Hudson, 2014), vírusu Newcastleskej choroy (Rezatofighi a kol., 2014), PRRSV (Kaewprom a kol., 2017) a IBV (Lelešius a kol., 2019), aj keď antivírusový mechanizmus ešte treba objasniť. Naopak, bola už objasnená inhibícia replikácie vírusu ľudskej imunodeficiencie in vitro pomocou TEO (Feriotto a kol., 2018).

Chemické zloženie TEO odhalilo prítomnosť 26 molekúl, z ktorých hlavnými frakciami boli tymol, p-cymén, γ-terpinén, β-linalool, karyofylén. Aby sa znížila cytotoxicita TEO, bolo by zaujímavé identifikovať aktívne molekuly a testovať ich jednotlivo. Ako sa dalo očakávať, hlavnú zložku TEO použitú v tejto štúdii predstavoval tymol. Dokázalo sa, že tymolová frakcia má účinnosť proti HSV (Sharifi-Rad a kol., 2017) a chrípkovým vírusom (Alburn a kol., 1972). Mali by sa testovať ďalšie menej zastúpené frakcie TEO, aby sa vyhodnotila ich antivírusová aktivita.

Demonštrovali sme in vitro antivírusový a virucidný účinok TEO proti FCoV v bunkách CRFK. Tieto štúdie otvárajú niekoľko perspektív z hľadiska budúcich aplikácií a terapeutických možností pre ľudské a zvieracie koronavírusy.

Prehlásenie o konflikte záujmov

Autori prehlasujú, že nedošlo ku konfliktu záujmov.

Dodatok A. Doplňujúce údaje

Tabuľka 1: Chemické zloženie éterického oleja Thymus vulgaris

ČísloZložkaArea%+SEMSI/MSLRIAI
1propanoic acid, ethyl ester0.10+0.0986714714
2α-tricyclene0.13+0.1094915919
3α-thujene1.21+0.9897925926
4α-pinene1.81+0.1195930931
5camphene1.89+0.7096949952
61-octen-3-ol0.37+0.0183974975
7sabinene0.71+0.3293977977
8β-pinene0.56+0.0394978978
9β-myrcene1.42+0.2586985991
10α-phellandrene0.15+0.019110011003
11p-cymene19.64+2.509510241024
12limonene0.6+0.019110331027
13eucalyptol0.89+0.079910231031
14cis-β-terpineol0.13+0.019011451147
15γ-terpinene8.83+0.879410631059
16α-terpinolene0.12+0.018110851089
17β-linalool4.07+1.559710971098
18camphor1.69+0.779811451146
19borneol1.85+0.989711661167
20terpinen-4-ol1.83+0.899611721174
21α-terpineol0.12+0.018611891190
22methyl thymol, ether0.39+0.229012351235
23isothymol methyl ether0.42+0.0294NA1244
24thymol47.01+1.599412901290
25caryophyllene2.18+0.999914171418
26caryophyllene oxide0.58+0.139115811592
 Celkom charakterizované98.7   
 Ostatné 1.3   
Legenda
SEM= Structural Equation Modeling (Modelovanie štrukturálnych rovníc)
SI/MS= Similarity Index/Mass Spectrum (Index podobnosti / hmotnostné spektrum)
LRI=Linear retention index (Lineárny retenčný index)
AI= Arithmetic Index (Aritmetický index)
NA=not assessed (neposudzované)

Referencie

Prečítať “Virucidné a antivírusové účinky esenciálneho oleja Tymiánu obyčajného na mačací koronavírus”

Racionálny prístup k identifikácii účinných kombinovaných antikoronavírusových terapií proti mačaciemu koronavírusu

9.7.2020
S.E. Cook, H. Vogel, D. Castillo, M. Olsen, N. Pedersen, B. G. Murphy
Pôvodný článok: A rational approach to identifying effective combined anticoronaviral therapies against feline coronavirus

Abstrakt

Mačací infekčný zápal pobrušnice (FIP), spôsobený genetickým mutantom mačacieho enterického koronavírusu známym ako FIPV, je smrteľným ochorením mačiek, pre ktoré v súčasnosti nie je k dispozícii žiadna vakcína alebo liečba schválená FDA. Šírenie FIPV u postihnutých mačiek vedie k radu klinických príznakov vrátane kavitárnych výpotkov, anorexie, horúčky a lézií pyogranulomatóznej vaskulitídy a perivaskulitídy s alebo bez postihnutia centrálneho nervového systému a/alebo oka. Vznikla kritická potreba účinných a schválených antivírusových terapií proti koronavírusom vrátane FIPV a zoonotických koronavírusov, ako je SARS-CoV-2, pôvodcu COVID-19. Pokiaľ ide o SARS-CoV-2, predbežné dôkazy naznačujú, že môžu existovať potenciálne klinické a patologické spoločné znaky s mačacím koronavírusovým ochorením, vrátane enterického a neurologického postihnutia. Skúmali sme 89 vytipovaných antivírusových zlúčenín a identifikovali sme 25 zlúčenín s antivírusovou aktivitou proti FIPV, ktoré predstavujú rôzne triedy liekov a mechanizmov antivírusového pôsobenia. Na základe úspešných stratégií kombinovanej liečby u ľudských pacientov s infekciou HIV alebo vírusom hepatitídy C sme identifikovali kombinácie liekov zameraných na rôzne fázy životného cyklu FIPV, ktoré vedú k synergickému antivírusovému účinku. Podobne navrhujeme, aby sa kombinovaná antikoravírusová terapia (cACT) s viacerými mechanizmami účinku a penetrácie do všetkých potenciálnych anatomických miest vírusovej infekcie aplikovala na liečbu ďalších koronavírusov, ako je SARS-CoV-2.

Zhrnutie autora

In vitro sme testovali antivírusovú aktivitu proti FIPV u 89 zlúčenín. Antivírusová aktivita týchto zlúčenín spočivala buď v priamom účinku na vírusové proteíny zapojených do replikácie vírusu, alebo v nepriamom inhibičnom účinku na normálne bunkové procesy uzurpované FIPV na podporu replikácie vírusu. Dvadsaťpäť z týchto zlúčenín vykázalo významnú antivírusovú aktivitu. Zistili sme aj to, že určité kombinácie týchto zlúčenín sú účinnejšie ako samotná monoterapia.

Slovník

SkratkaAnglický výrazSlovenský preklad
PIprotease inhibitorinhibítor proteázy
NPInucleoside polymerase inhibitornukleozidový inhibítor polymerázy
NNPInon-nucleoside polymerase inhibitornenukleozidový inhibítor polymerázy
CPEcytopathic effect cytopatický efekt
cACTcombined anti-coronaviral therapykombinovaná antikoronavírusová terapia
cARTcombined anti-retroviral therapykombinovaná antiretrovírusová terapia
CRFK cellsCrandell-Rees Feline Kidney cellsCrandell-Rees mačacie obličkové bunky

Úvod

Mačacia infekčná peritonotída (FIP) je vysoko smrteľné ochorenie bez účinnej vakcíny alebo liečby schválenej FDA. Aj keď patogenéza nie je úplne objasnená, všeobecne sa predpokladá, že FIP je výsledkom špecifických mutácií vo vírusovom genóme minimálne patogénneho a všadeprítomného mačacieho enterického koronavírusu (FECV), ktoré vedú k vzniku virulentného vírusu FIP (FIPV) [1–3]. Tieto mutácie FECV vedú k zmene tropizmu vírusom napadnutej hostiteľskej bunky z intestinálnych enterocytov na makrofágy peritoneálneho typu. Produktívna infekcia makrofágov vírusom FIPV, cielená rozsiahla anatomická diseminácia a imunitne sprostredkovaná perivaskulitída vedú k vysoko smrteľnému systémovému zápalovému ochoreniu FIP [4]. V dôsledku vírusovej diseminácie sa FIP môže prejavovať klinickými príznakmi odrážajúcimi zápal na rôznych anatomických miestach, ktoré môžu potenciálne zahŕňať brušnú dutinu a vnútornosti, hrudnú dutinu, centrálny nervový systém a/alebo oči [5–8]. Kvôli vysokej úmrtnosti FIP zostáva devastujúcim vírusovým ochorením mačiek a výzvou pri stanovení presnej etiologickej diagnózy za súčasného nedostatku dostupných a efektívnych možností liečby [7, 9]. Vývoj účinnej vakcíny proti FIP bol komplikovaný úlohou na protilátkách závislého zosilnenia (ADE) v patogenéze choroby FIP, kde sa ukázalo, že prítomnosť neneutralizujúcich antikoronavírusových protilátok zhoršuje ochorenie FIP [10–12] .

Koronavírusy u cicavcov infikujú a spravidla spôsobujú ochorenie črevného traktu alebo dýchacieho systému infikovaných hostiteľov [13]. FIP sa však často prejavuje ako syndróm multisystémového zápalového ochorenia v dôsledku rozsiahleho šírenia makrofágov infikovaných FIPV. Nedávny pandemický výskyt SARS-CoV-2 má u infikovaných ľudských pacientov za následok rôzne syndrómy choroby, súhrnne označovanej ako COVID-19. Aj keď má SARS-CoV-2 zjavný tropizmus pre respiračný epitel, ktorý vedie k intersticiálnej pneumónii, nedávne dôkazy naznačujú, že COVID-19 sa môže prejavovať aj ako zažívacie ochorenie a klinicky sa prejavovať ako hnačka [14, 15]. Tropizmus pre tieto tkanivá odráža membránovú expresiu proteínu ACE2, bunkového cieľa SARS-CoV-2 [16]. Ďalej sa ukazuje, že SARS-CoV-2 je schopný infikovať a spôsobiť zápalové ochorenie v tkanivách mimo črevného traktu a dýchacích ciest, vrátane mozgu, očí, reprodukčných orgánov a srdcového myokardu [17–21]. Neuroinvazia mozgového kmeňa a následná encefalitída spôsobená SARS CoV-2 môžu prispieť k respiračnému zlyhaniu u pacientov s COVID-19 [20,22]. Experimentálne je SARS CoV-2 schopný vytvoriť produktívnu infekciu u mačiek [23]. Infekcia FIPV mačiek a infekcia SARS CoV-2 u ľudských pacientov sa preto podobajú viac, ako sa pôvodne zdalo.

Vznikla okamžitá a kritická potreba dostupných a účinných antivírusových terapií na liečenie týchto koronavírusových chorôb. Mačky infikované FIPV by mohli slúžiť ako translačný model a poskytnúť užitočné poznatky použiteľné pre pacientov infikovaných SARS-CoV-2 s COVID-19. Posledné antivírusové klinické štúdie u mačiek experimentálne aj prirodzene infikovaných FIPV priniesli nádej pre liečbu a vyliečenie FIP pomocou GS-441524, nukleozidového analógu a metabolitu proliečiva Remdesivir (Gilead Sciences) alebo GC-376, 3C-like inhibítora proteázy FIPV (Anivive) [24–26]. Remdesivir, prodrug GS-441524, sa nedávno ukázal byť sľubným pri liečbe ľudských pacientov infikovaných SARS-CoV-2 [27,28]. Napriek týmto nedávnym klinickým úspechom musia byť tieto antivírusové zlúčeniny ešte schválené a v súčasnosti nie sú k dispozícii na klinické veterinárne použitie u mačiek s FIP.

Identifikácia a vývoj účinných antivírusových terapií môžu byť nákladné aj časovo náročné. Cielený skríning a opakované použitie liekov už schválených FDA alebo schválených na výskumné použitie, môžu hrať efektívnu úlohu pri objavovaní liekov. Použitím predpokladaných antivírusových zlúčenín vybraných na základe ich preukázanej účinnosti pri liečbe iných RNA-vírusov sme identifikovali podskupinu zlúčenín so silnou anti-FIPV aktivitou a charakterizovali ich profily bezpečnosti a účinnosti in vitro. Na základe veľkého úspechu kombinovanej antiretrovírusovej terapie (cART) proti HIV-1 a kombinovanej liečby vírusu hepatitídy C [29] sme vyvinuli metódy na identifikáciu účinných kombinačných terapií proti FIPV. Počiatočné monoterapie proti HIV-1, ako je azidotymidín (AZT), často viedli k vírusovým únikovým mutáciám. Zdá sa, že súčasné použitie viacerých antivírusových zlúčenín blokuje tento adaptívny vírusový evolučný mechanizmus, pretože vývoj HIV-1 je modernými cART účinne zastavený [30]. Úspešnosť cART je výsledkom farmakologického zamerania na viac stupňov životného cyklu vírusu súčasne, pričom sa spoločne dosahuje synergický antivírusový účinok [31].

Vzhľadom na pôsobivý úspech cART by sa mohlo javiť, že súčasné zacielenie na FIPV v rôznych fázach životného cyklu vírusu kombinovanou antikoronavírusovou terapiou (cACT) môže ponúknuť vyššiu úroveň trvalého a úplnejšieho úspechu, v porovaní s monoterapiami samotnými. Zahrnutie antivírusového agenta do cACT schopného preniknúť hematoencefalickou (BBB) ​​a hematookulárnou bariérou, a dosiahnuť farmakologicky relevantné tkanivové koncentrácie môže uľahčiť eradikáciu FIPV v celom systéme. Popisujeme tu súbor in vitro testov uľahčujúcich rýchly skríning a identifikáciu účinných antikoronavírusových zlúčenín. Účinné antivírusové látky s rôznymi mechanizmami účinku a predpokladanou distribúciou v tele boli kombinované do cACT a testované na synergiu zlúčenín. Predpokladali sme, že kombinované použitie dvoch alebo viacerých účinných antivírusových monoterapií s rôznymi mechanizmami účinku uľahčí identifikáciu synergických kombinácií poskytujúcich vynikajúcu antikoronavírusovú účinnosť v porovnaní s ich samostatným použitím. Identifikácia úspešnej cACT môže tiež poskytnúť vodítka k liečbe ďalších objavujúcich sa vírusových ochorení, ako je SARS-CoV-2.

Výsledky

Testovanie zlúčenín

Na identifikáciu zlúčenín s anti-FIPV aktivitou bola in vitro testovaná skupina 89 zlúčenín (doplnková tabuľka 1) z rôznych tried liečiv a s rôznymi predpokladanými mechanizmami účinku. Testované zlúčeniny zahŕňali inhibítory nukleozidovej polymerázy (NPI), nenukleozidové polymerázové inhibítory (NNPI), inhibítory proteázy (PI), NS5A inhibítory, súbor nových anti-helikázových chemických „fragmentov“ a súbor zlúčenín s neurčenými mechanizmami účinku . Z tejto skupiny 89 zlúčenín sa ukázalo, že celkovo 25 rôznych zlúčenín vykazuje antivírusovú aktivitu proti FIPV vrátane NPI, PI, inhibítorov NS5A a dvoch zlúčenín s neurčenými mechanizmami účinku (označovaných ako „iné“, obr. 1). Medzi tieto úspešné antivírusové látky patrili toremiféncitrát, daklatasvir, elbasvir, lopinavir, ritonavir, nelfinavirmesilát, K777 / K11777, grazoprevir, amodiaquín, EIDD 1931, EIDD 2801 a GS-441524 pochádzajúce od troch rôznych čínskych výrobcov (tabuľka 1, obr. 2). Testovali sme niekoľko nukleozidových analógových zlúčenín poskytnutých spoločnosťou Gilead Sciences štrukturálne príbuzných nukleozidovým analógom GS-441524 a Remdesivir na ich antivírusové vlastnosti a našli sme niekoľko s potenciálom (obsiahnutých vo vyššie uvedených 25 identifikovaných zlúčeninách), ale tieto látky sme ďalej nesledovali. Pre ďalšie analýzy bolo vybraných 13 antivírusových látok. Tento celkový počet zahrňuje už pretým identifikovaný 3-C inhibítor proteázy, GC-376 (Anivive).

Názov zlúčeninyKategória liekuEC50 (µM)
GC376PI0.04
EIDD 1931NPI0.09
ElbasvirNS5A Inhibitor0.16
EIDD 2801NPI0.4
GS-441524+NPI0.66
K777/K11777PI0.67
Toremifene citrateIné*5
AmodiaquineIné**6.5
LopinavirPI8.08
RitonavirPI8.7
GrazoprevirPI12.13
Nelfinavir mesylatePI13.47
Tabuľka 1.
EC50 zlúčenín s anti-FIPV aktivitou.
PI = Inhibítor proteázy; NPI = Nukleozidový inhibítor polymerázy
+ MedChem Express, HY-103586
* Selektívny modulátor estrogénových receptorov
** 4-Aminoquinoline
Obrázok 1
Testované zlúčeniny podľa mechanizmu účinku
(A) Všetky testované zlúčeniny
(B) Zlúčeniny, u ktorých bola pri testoch in vitro zistená anti-FIPV aktivita
Obrázok 2
Príklad testovacej matrice využívajúcej farbenie kryštálovou violeťou na identifikáciu anti-FIPV aktivity pri 10μM.
Horný ľavý riadok sú kontrolné jamky iba s CRFK bunkami a bez liečiva alebo FIPV. Pravý horný riadok je pozitívna kontrola využívajúca GS-441524 so známou úplnou ochranou CRFK buniek pred FIPV-indukovanou bunkovou smrťou. Celý spodný rad jamiek predstavuje CRFK bunky infikované FIPV a bez liečby. Zvyšné riadky sú testovacie jamky, pričom ľavá polovica hodnotí cytotoxicitu pri 10μM (bez infekcie FIPV) a pravá polovica hodnotí anti-FIPV aktivitu pri 10μM pre ktorúkoľvek danú zlúčeninu. Strata zafarbenia naznačuje stratu buniek. Daklatasvir a velpatasvir demonštrovali anti-FIPV aktivitu, o čom svedčí zvýšené farbenie kryštálovou violeťou (relatívne intaktné bunkové monovrstvy) v porovnaní s kontrolnými jamkami obsahujúcimi iba FIPV (spodný rad doštičky). Lieky 32, 33 a 34 vykazovali neprítomný až minimálny antivírusový účinok, zatiaľ čo liečivo 34 (Ravidasvir) tiež vykazovalo cytotoxicitu pri koncentrácii 10μM na základe dramatického vyčistenia jamiek pozorovaného v ľavej polovici matrice bez FIPV.

Stanovenie antivírusovej účinnosti

Antivírusová účinnosť (EC50) sa stanovila pre 10 antivírusových zlúčenín. Pre tieto zlúčeniny bola EC50 v rozmedzí od 0,04μM do 13,47μM (tabuľka 1, obr. 3). Jedna z antivírusových látok, Daclatasvir, preukázal neprijateľnú cytotoxicitu pri 20μM a bol vyradený z ďalšieho testovania. Ukázalo sa, že GS-441524 pochádzajúci z Číny (MedChemExpress, HY-103586) má porovnateľnú EC50 v porovnaní s predtým publikovanými hodnotami pre GS-441524 pochádzajúci z Gilead Sciences [25].

Obrázok 3
Reprezentatívne príklady nelineárnych regresných analýz EC50 pre zlúčeniny s anti-FIPV aktivitou.

Na identifikáciu polovičnej maximálnej efektívnej koncentrácie (EC50) sa uskutočnili sériové riedenia každej zlúčeniny s anti-FIPV aktivitou. Tu uvedené výsledky GS-441524 predstavujú zlúčeninu pochádzajúcu z MedChemExpress.

Bezpečnostné profily cytotoxicity

Profily bezpečnosti na cytotoxicitu (CSP) sa stanovili pre desať rôznych antivírusových zlúčenín v bunkách CRFK. Pri 5μM sedem testovaných zlúčenín nevykazovalo v podstate žiadnu cytotoxicitu, zatiaľ čo dve z antivirotík, amodiaquine a toremifene, mali 11, respektíve 12% cytotoxicitu (obr. 4; tabuľka 2). 50% cytotoxická koncentrácia (CC50) pre GC376 sa uvádza ako >150μM [32]. Je zaujímavé, že na základe testu Promega CellTox ™ Green Cytotoxicity bola cytotoxicita obidvoch EIDD zlúčenín v podstate nedetegovateľná až do 100μM. Vizuálna kontrola jamiek s EIDD tesne pred aplikáciou fluorescenčného farbiva a odčítaním z matrice však odhalila rozdiely v morfológii buniek (cytopatický účinok) medzi neliečenými CRFK bunkami a liečenými bunkami. Neliečené CRFK bunky sa vyznačovali adherentnou vretenovou morfológiou v jednej monovrstve, zatiaľ čo jamky s EIDD preukázali zreteľný pokles konfluencie v porovnaní s variabilnou morfológiou buniek vrátane zaokrúhľovania buniek (cytopatický účinok). Rozpor medzi subjektívnym vizuálnym hodnotením jamiek s EIDD a fluorescenčným testom je záhadou. Je možné, že celkové zníženie počtu buniek v jamkách s EIDD viedlo k strate a degradácii nukleovej kyseliny nevyhnutnej na fluorescenčné viazanie a detekciu v teste CellTox.

ZlúčeninaKategória lieku5μM10μM25μM50μM100μM
ElbasvirNS5A Inhibítor0.670.461.424.9
K777/K11777PI0.610.292.3916
Toremifene citrateIná*1222233539
AmodiaquineIná**1112192326
LopinavirPI0.6715131618
RitonavirPI0.490.8423326
GrazoprevirPI0.5500.813.919
EIDD1931NPI1.20.940.60.782.8
EIDD2801NPI00.950.631.70.8
GS-441524+NPI0.210000
Tabuľka 2
Percento cytotoxicity podľa zlúčeniny a koncentrácie.
PI = Inhibítor proteázy; NPI = Nukleozidový inhibítor polymerázy
* Selektívny modulátor estrogénových receptorov
** 4-Aminoquinoline
+ NMPharmTech
Obrázok 4
Reprezentatívne profily cytotoxicity.
Stĺpcové grafy percenta cytotoxicity +/- štandardná odchýlka (SD) pre štyri zlúčeniny s anti-FIPV aktivitou. Percentuálne hodnoty cytotoxicity sa stanovili normalizáciou cytotoxicity pre kontrolné jamky s pozitívnou toxicitou (nastavená na 100% cytotoxicitu) a neliečené bunky CRFK (nastavené na 0% východiskovej cytotoxicity).

Kvantifikácia inhibície produkcie vírusovej RNA pri monoterapii

Na meranie schopnosti každej antivírusovej látky inhibovať koronavírusovú replikáciu pri monoterapii (Vírusový RNA knock-down test) sa použil test RT PCR v reálnom čase. Zlúčeninami demonštrujúcimi najväčšiu inhibíciu produkcie FIPV RNA boli GC376, 3C-like inhibítor koronavírusovej proteázy, GS-441524, EIDD-1931 a EIDD-2801, pričom posledné tri boli nukleozidové analógy (obr. 5, tabuľka 3). Medzi látky s najmenším inhibičným účinkom na produkciu vírusovej RNA patria elbasvir, nelfinavir a ritonavir. Ritonavir, inhibítor proteázy, sa používa v kombinácii s lopinavirom na liečbu infekcie HIV-1 (Kaletra, AbbVie). Monoterapia lopinavirom má u ľudí neuspokojivú orálnu biologickú dostupnosť, avšak pri použití v kombinácii sa ukázalo, že ritonavir výrazne zlepšuje plazmatickú koncentráciu lopinaviru [33]. Preto aj napriek relatívne minimálnej inhibícii FIPV identifikovanej s ritonavirom ako monoterapiou, bola táto zlúčenina predmetom ďalšieho testovania vrátane kombinovaného antikoravírusového hodnotenia.

ZlúčeninaNásobok redukcie titra vírusu
GC376 (20μM)25000
GC3767300
GS-441524 (NMPharmTech)5280
EIDD-19313700
GS-441524 (MedChemExpress)3500
EIDD-28012110
Lopinavir309
Toremifene10
K7777
Grazoprevir5
Amodiaquine4
Elbasvir2
Nelfinavirmesylate1
Ritonavir1
Tabuľka 3
Násobné zníženie počtu kópií vírusovej RNA pre anti-FIPV zlúčeniny pri monoterapii
*Pokiaľ nie je uvedené inak, všetky zlúčeniny sa použili pri 10 μM.
Obrázok 5
Násobné zníženie počtu kópií FIPV RNA s použitím antivírusových zlúčenín pri monoterapii.

FIPV-infikované CRFK bunky sa inkubovali 24 hodín so zlúčeninami so zistenou anti-FIPV aktivitou. Počet vírusových kópií sa následne stanovil pomocou RT-qPCR a normalizoval sa na počet mačacích GAPDH kópií, aby sa určil účinok násobného zníženia pre každú zlúčeninu. Všetky zlúčeniny sa testovali pri 10μM, pokiaľ nie je uvedené inak. Všetky experimentálne ošetrenia sa uskutočňovali v triplikátových jamkách a násobný pokles sa vypočítal vydelením priemerného experimentálneho normalizovaného počtu kópií FIPV priemerným normalizovaným počtom kópií FIPV stanoveným pre neošetrené jamky infikované FIPV.
1GS-441524 – NMPharmTech (Čína).
2GS-441524 – MedChemExpress (Čína).

Kvantifikácia inhibície produkcie vírusovej RNA pri cACT

Na identifikáciu kombinácií liekov so synergickým antivírusovým účinkom oproti monoterapii sa vybrali kombinácie dvoch alebo viacerých zlúčenín na základe (i) zavedených kombinácií používaných pri iných vírusových infekciách, ako je HIV-1 a HCV, (ii) liekov s rôznymi mechanizmami účinku , (iii) potenciálnych zmien v systémovej distribúcii zlúčeniny (napr. schopnosti preniknúť cez hematoencefalickú alebo hematookulárnu bariéru podľa chemickej klasifikácie) a (iv) minimálnej cytotoxicity (na základe CSP). Pre každú cACT bolo akékoľvek výsledné zníženie počtu kópií FIPV prevyšujúce vypočítaný aditívny účinok pre každé liečivo použité v režime monoterapie považované za synergické (tabuľka 4). Najväčší synergický účinok s najvyšším celkovým násobným znížením vírusovej RNA, dosiahla kombinácia GC376 a amodiaquinu so 76-násobným znížením vírusovej RNA v porovnaní s aditívnym účinkom (obr. 6). Táto konkrétna synergická kombinácia bola jedným z prekvapujúcich výsledkov vzhľadom na to, že samotný amodiaquín preukázal iba obmedzenú inhibíciu kópií vírusovej RNA FIPV stanovenú pomocou qRT-PCR.

Zlúčenina 1Zlúčenina 2Zlúčenina 3Redukcia titra vírusuAddcACT/add
GC376 (20 uM)Amodiaquine18970002500476
GC376 (20 uM)AmodiaquineToremifene2560002501410
GC376 (20 uM)K7772480002500710
GC376 (20 uM)Toremifene128000250105.1
GC376 (20 uM)Nelfinavir mesylate91100250013.6
Elbasvir (5 uM)Lopinavir1400031145
Elbasvir (5 uM)GC376 (20 uM)12600250020.50
GC376 (10 uM)Amodiaquine1170073041.6
GC376 (10 uM)Grazoprevir829073051.1
GC376 (20 uM)GS-441524 (NMPharmTech)8260302800.27
GC376 (10 uM)AmodiaquineElbasvir (5 uM)757073061.0
GC376 (10 uM)GS-441524 (MedChem)6910108000.64
GC376 (20 uM)Ritonavir6560250010.26
K777Lopinavir553031618
GC376 (10 uM)GS-441524 (NMPharmTech)4340125800.34
GC376 (20 uM)Lopinavir3400253090.13
LopinavirRitonavir313031010
LopinavirRitonavirToremifene17403205.4
GC376 (10 uM)EIDD-280125594100.03
K777Toremifene25171.5
Tabuľka 4
Násobné zníženie počtu kópií FIPV vírusovej RNA pri kombinovanej terapii (cACT).
Očakávaný aditívny účinok reflektuje súčet násobného zníženia vírusovej RNA každej zlúčeniny použitej pri monoterapii (Tabuľka 3)
* Pokiaľ nie je uvedené inak, všetky zlúčeniny boli použité pri 10μM.
cACT/add – pomer redukcie titra FIPV pri kombinovanej terapii oproti súčtu násobkov redukcie titra pri monoterapii
Add – súčet násobkov redukcie titra pri monoterapii
Obrázok 6
Vybrané príklady násobného zníženia počtu kópií FIPV RNA pomocou kombinovanej terapie (cACT).
Stĺpce predstavujú priemerný násobný pokles troch jamiek liečených buniek CRFK v porovnaní so stredným násobným poklesom troch neliečených jamiek infikovaných FIPV. Všetky zlúčeniny boli testované pri 10μM, pokiaľ nie je uvedené inak.

Vzhľadom na výraznú anti-FIPV aktivitu GC-376, ako aj na jeho potenciálnu dostupnosť pre pokrok vo farmakokinetických štúdiách in vivo, klinických testoch a nádejnom použití v aplikácii cACT bola táto zlúčenina vybraná na sériu “vírusových RNA knock-down” testov pri mono a kombinovanej terapii (obr. 7). Celkovo GC376 preukázal vynikajúcu anti-FIPV aktivitu pri 20μM tak pri monoterapii, ako aj pri kombinovanej terapii in vitro. K najvýraznejšiemu zníženiu FIPV RNA došlo v kombinácii GC376 pri 20μM s amodiaquinom pri 10μM. Pokus kombinujúci GC376 s amodiaquinom sa opakoval a oba výsledky sú uvedené pre porovnanie na obr. 7C.

Obrázok 7
GC376 antivírusová aktivita pri monoterapii a v kombinovanej terapii pri 10 a 20 μM

(A) Redukcia FIPV RNA kvantifikovaná pomocou RT-qPCR s použitím GC376 ako monoterapii pri 10 a 20 μM. Medzi týmito dvoma koncentráciami je významný rozdiel, pričom 20μM je lepšia ako 10μM. (nepárový t-test; p <0,0001).
(B) Kombinovaná in vitro terapia s použitím GC376 pri 10 μM.
(C) Kombinovaná in vitro terapia proti FIPV s použitím GC376 pri 20 μM.

Diskusia

Pretože v súčasnosti neexistuje účinná vakcína proti FIP, existuje silná klinická a celosvetová potreba účinných možností antivírusovej liečby pre mačky infikované FIPV. Testovali sme 89 zlúčenín, ktorých výsledkom je identifikácia 25 antivírusových látok s antivírusovou účinnosťou a silnými bezpečnostnými profilmi proti mačaciemu koronavírusu, FIPV. Identifikovali sme tiež kombinácie antivírusových látok (cACT), ktoré viedli k vyššej účinnosti alebo synergizmu oproti samotnej monoterapii. Obzvlášť zaujímavé bolo zistenie týkajúce sa použitia elbasviru, ktorý opakovane demonštroval vynikajúcu ochranu CRFK pred FIPV vyvolanom CPE pri koncentrácii nižšej ako 1 μM na základe viacerých testov (EC50 0,16 μM). V zásade sa však nezistil žiadny rozdiel v počte kópií vírusovej RNA medzi infikovanými bunkami liečenými elbasvirom alebo bez neho. Ďalšia vizuálna analýza buniek CRFK infikovaných FIPV, ktoré boli liečené elbasvirom, odhalila atypickú morfológiu buniek vo vzťahu k neinfikovaným bunkám, ktorá sa vyznačovala premenlivým zväčšením, zaoblením buniek a čiastočným odlúčením buniek (cytopatický účinok). Tieto „atypické bunky“ sa zriedka oddelili od kultivačnej doštičky a vo výsledku boli hodnoty absorbancie porovnateľné s neinfikovanými kontrolnými jamkami. Tento dichotomický výsledok medzi analýzou doštičky a vírusovým RNA knock-down testom naznačuje, že k antivírusovému účinku elbasviru dochádza po vírusovej replikácii a vo výsledku nemusí elbasvir chrániť bunky pred akumuláciou vírusovej RNA. Elbasvir sa používa na liečbu pacientov infikovaných vírusom hepatitídy C (HCV) a predpokladá sa, že je cielený na HCV NS5A proteín zabraňujúci replikácii a tiež na kompletizáciu viriónov [34]. Aj keď nie je pre FIPV identifikovaný homológ NS5A, je možné, že elbasvir vykazuje podobný antivírusový účinok tým, že zabraňuje kompletizácii viriónov FIPV bez blokovania syntézy vírusovej RNA v CRFK bunkách. Dodatočné vyhodnotenie liečených buniek CRFK infikovaných FIPV pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie môže objasniť účinok elbasviru na ochranu CRFK pred poškodením a smrťou spojenou s FIPV.

Ukázalo sa, že súčasné podávanie ritonaviru s lopinavirom významne zvyšuje plazmatické koncentrácie lopinaviru u potkanov, psov a ľudí [33]. Ritonavir je silný inhibítor CYP3A, ktorý je primárnym enzýmom zodpovedným za metabolizmus inhibítorov proteázy, a preto jeho súbežné podávanie s inými inhibítormi proteázy vedie k zvýšeným systémovým koncentráciám súčasne podávaného inhibítora proteázy, ako je lopinavir [38, 39]. Zvýšenie antivírusového účinku lopinaviru spojené s ritonavirom bolo v testoch eliminácie vírusovej RNA relatívne minimálne s iba 10-násobnou inhibíciou FIPV oproti aditívnemu účinku. Môže to byť výsledkom in vitro artefaktu testovania na mačacej obličkovej bunkovej línii (tj. CRFK bunkách), v ktorej chýba enzým CYP3, čo je enzým, ktorý sa typicky vyskytuje v miestach s vysokým metabolizmom inhibítora proteázy pri efekte prvého priechodu (tj. v enterocytoch a hepatocytoch) [39]. Tieto výsledky naznačujú, že samotné testy in vitro nemusia úplne predpovedať účinok antivírusových látok u mačiek infikovaných FIPV in vivo.

Grazoprevir, inhibítor serínovej proteázy NS3/4, sa používal v kombinácii s elbasvirom, inhibítorom NS5A, na liečbu pacientov infikovaných HCV (Zepatier, Merck) [40]. Tu sme preukázali, že grazoprevir má anti-FIPV aktivitu, keď sa používa ako monoterapia. Inhibítor cysteínovej proteázy K777/K11777 bol skúmaný kvôli svojej schopnosti blokovať vstup koronavírusu (MERS-CoV a SARS-CoV-1) a ebolavírusu a bolo zistené, že úplne inhibuje koronavírusovú infekciu, ale iba v cieľových bunkových líniách bez vírus aktivujúcich serínových proteáz. [41]. V prípade iných bunkových línií K777 inhiboval vstup koronavírusových buniek v kombinácii s inhibítorom serínovej proteázy [41]. Je možné, že obmedzená inhibícia produkcie FIPV RNA K777 by sa mohla zvýšiť, ak by sa kombinovala s inhibítorom serínovej proteázy.

Amodiaquine je antimalarické liečivo a patrí do triedy 4-aminochinolínových liečiv. Amodiaquine spolu s príbuznými 4-aminochinolínmi, ako sú chlorochin a hydroxychlorochin, bol pôvodne vyvinuý pre liečbu malárie [42], a podobne ako chlorochín a hydroxychlorochín oplýva rozsiahlym anatomickým distribučným objemom vrátane očí a mozgu [43–49]. Prenikanie antivírusových látok do CNS a/alebo očných kompartmentov je obzvlášť dôležité v prípade mačiek infikovaných FIPV s neurologickým a/alebo očným postihnutím. Zatiaľ čo niekoľko výskumov definovalo antivírusové vlastnosti chlorochínu a hydroxychlorochínu [28, 50, 51], antivírusová aktivita amodiaquinu sa skúmala aj s identifikáciou antivírusovej aktivity proti vírusu dengue, vírusu Ebola a ťažkej horúčke s vírusovým trombocytopénnym syndrómom (SFTS) [52–55]. Mechanizmus účinku amodiaquinu môže zahŕňať zvýšenie cytoplazmatického lyzozomálneho a/alebo endozomálneho pH, ktoré zabráni uvoľneniu životaschopných viriónov do cytoplazmy [56]. Vzhľadom na svoj jedinečný status triedy liečív a predpokladanú schopnosť prekonať hematoencefalickú bariéru [57] je amodiaquine sľubným kandidátom pre kombinovanú liečbu neurologických a/alebo okulárnych foriem FIP.

Toremiféncitrát, selektívny modulátor estrogénových receptorov (SERM), sa používa na liečbu metastatického karcinómu prsníka u ľudských pacientov. V poslednej dobe bol toremifén hodnotený z hľadiska jeho antivírusových vlastností a preukázal antikoravírusovú aktivitu proti zoonotickým koronavírusom, koronavírusom blízkovýchodného respiračného syndrómu (MERS-CoV) a SARS-CoV-1 [58]. Toremifén tiež preukázal aktivitu proti vírusu Ebola (EBOV) [59, 60]. Aj keď presný mechanizmus antivírusového pôsobenia nie je definovaný, zdá sa, že antivírusový účinok toremifénu proti EBOV spočíva v destabilizácii glykoproteínu EBOV [59].

Je zaujímavé, že GC376 preukázal pri kombinovanej terapii mätúce rozdiely medzi dávkovaním 10 μM a 20 μM . Pri kombinovanom použití pri 10 μM s inými zlúčeninami absentoval synergizmus a v niektorých prípadoch pokles antivírusového účinku v porovnaní s adititívnymi hodnotami v rozmedzí od 0,03 do 1,6 (tabuľka 4). Ak sa použil pri 20 μM, stále existovali prípady, keď kombinácia s inou zlúčeninou viedla k zníženému antivírusovému účinku v porovnaní s GC376 použitým ako monoterapia pri 20 μM. Oveľa viac variácií však pri kombináciách pri 20 μM vykazovalo násobok účinku oproti aditívnym hodnotám v rozmedzí od 0,13 do 76 (tabuľka 4). Konkrétnym príkladom je kontrast medzi GC376 pri 20 μM v porovnaní s GC376 pri 10 μM kombinovanom s amodiaquinom pri 10 μM. Prvý spôsobil najväčšiu inhibíciu vírusovej RNA, ako aj najväčší násobok aditívneho (synergického) účinku, zatiaľ čo druhý spôsobil takmer stratu synergizmu s hodnotou násobku aditívnej hodnoty 1,6.

Identifikácia účinných antivírusových stratégií pre liečbu mačiek infikovaných FIPV má translačné dôsledky pre prebiehajúcu pandémiu SARS-CoV-2. Infekcia FIPV u mačiek pripomína infekciu koronavírusmi u fretiek [61, 62] a porovnáva sa s patogenézou iných chronických chorôb závislých od makrofágov, ako je tuberkulóza [63]. Pretože sa klinické a patogénne podrobnosti infekcie SARS-CoV-2 u ľudí stále objavujú, zdá sa, že existuje určité prekrytie s FIPV v anatomickej distribúcii, klinických prejavoch a pravdepodobnej reakcii na určité antivírusové terapie. U mačiek je mačací enterický koronavírusový biotyp (FECV) obmedzený na zažívací trakt v dôsledku tropizmu enterocytov. Klinické príznaky u mačiek infikovaných FECV siahajú od mierneho gastrointestinálneho ochorenia (hnačka) až po absenciu príznakov. Mutovaný mačací biotyp koronavírusu FIPV získava makrofágový tropizmus a prednostne sa zameriava na serózne povrchy brušnej a hrudnej dutiny s podskupinou mačiek, ktoré demonštrujú postihnutie CNS alebo očí [7]. Podobne u pacientov s COVID-19 existujú správy o hnačkách a podskupine pacientov s postihnutím CNS [14]. Aj keď bol bunkový receptor pre SARS-CoV-2 identifikovaný ako ACE2 [64], bunkový receptor pre FIPV sérotypu I sa ešte musí určiť. Bunkový receptor pre menej klinicky relevantný FIPV sérotypu II bol identifikovaný ako mačacia aminopeptidázová peptidáza (fAPN) [4]. Štúdia využívajúca RNAseq na hodnotenie profilov génovej expresie buniek ascitu získaných z mačiek s FIP neidentifikovala expresiu ACE2, čo naznačuje, že ACE2 pravdepodobne nebude receptorom FIPV sérotypu I [63]. Je potrebné podrobnejšie preskúmanie identity receptora FIPV sérotypu I.

Doterajšie klinické úspechy s použitím GS-441524 alebo GC-376 u mačiek s experimentálnymi a prirodzene sa vyskytujúcimi FIP ukazujú, že je možné účinne liečiť FIP, avšak liečba suchých (granulomatóznych), neurologických a okulárnych FIP stále predstavuje výzvu. Inhibítor proteázy 3C-like proteázy, GC-376, sa javí ako relatívne účinný pri liečbe efúznej infekcie FIPV obmedzenej na telesné dutiny, ale môže byť menej účinný pri liečbe neurologických alebo okulárnych foriem ochorenia [24]. Tieto odlišné výsledky môžu byť výsledkom neúčinnej penetrácie hematoencefalickej a hematookulárnej bariéry, čo robí z GC-376 nádejného kandidáta na kombinovanú terapiu s antivírusovým liekom prenikajúcim do CNS.

Materiály a metódy

Inokulácia FIPV pre in vitro experimenty

Mačacie obličkové bunky Crandell-Reese (CRFK, ATCC) sa kultivovali v bankách T150 (Corning), naočkovali sa FIPV sérotypu II (WSU-79-1146, GenBank DQ010921) a množili sa v 50 ml Dulbeccovho modifikovaného Eagle média (DMEM) s 4,5 g/l glukózy (Corning) a 10% fetálneho hovädzieho séra (Gemini Biotec). Po 72 hodinách inkubácie pri 37°C bol zaznamenaný rozsiahly cytopatický účinok (CPE) a veľké plochy clearingu/oddeľovania buniek. Banky sa následne bleskovo zmrazili na -70°C počas 8 minút, krátko sa rozmrazili pri izbovej teplote a bunky a supernatant sa potom centrifugovali pri 1500 g počas 5 minút, po ktorých nasledoval druhý krok centrifugácie pri 4000 g počas 5 minút, aby sa izolovali bezbunkové vírusové objemy. Supernatant obsahujúci vírusový základ sa rozdelil na 0,5 a 1,0 ml alikvotné časti v 1,5 ml kryotubusoch (Nalgene) a archivoval sa pri -70°C. Po zmrazení sa jedna skúmavka nechala rozmrznúť a titer vírusu sa stanovil pomocou biologických testov (TCID50) a RT PCR metód v reálnom čase (nižšie).

Infekčná dávka dose-50 pre tkanivovú kultúru (TCID50) sa stanovila pomocou vírusového plaque testu. CRFK bunky sa pestovali na 96-jamkovej doštičke pre tkanivové kultúry (Genesee Scientific), kým bunky CRFK nedosahovali približne 75-85% konfluenciu. Sériové 10-násobné riedenia sa pripravili z FIPV zásobného roztoku a 200 μl vzoriek z každého riedenia sa pridalo do 10-jamkových replikátov. 72 hodín po infekcii sa bunky fixovali metanolom a zafarbili sa kryštálovou violeťou (Sigma-Aldrich). Jednotlivé jamky sa vizuálne hodnotili na vírusom indukovaný CPE, hodnotili sa ako CPE pozitívne alebo negatívne a TCID50 sa stanovila na základe rovnice log10TCID50 = [celkový počet # jamiek CPE pozitívny / # replikátov] + 0.5, aby reflektovali infekčné virióny na mililiter supernatantu [68].

Kvantifikácia FIPV pomocou qRT-PCR

Bezbunková vírusová RNA bola izolovaná z východiskového vírusu pomocou QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) podľa pokynov výrobcu. Izolovaná RNA bola ošetrená DNázou (Turbo DNáza, Invitrogen) a následne reverzne transkribovaná pomocou súpravy High-Capacity RNA-to-CDNA (Applied Biosystems) podľa protokolov výrobcov. Počet kópií FIPV a mačacej GAPDH cDNA sa stanovil s použitím Real-Time PCR systému Applied Biosystems ‘QuantStudio 3 a PowerUp SYBR Green Master Mix podľa protokolu výrobcu pre 10 μL reakciu. Každá PCR reakcia sa uskutočňovala trikrát s vodným templátom ako negatívnou kontrolou a plazmidovou DNA ako pozitívnou kontrolou. Kontrolná reakcia vylučujúca reverznú transkriptázu bola zahrnutá do každej sady testov PCR v reálnom čase. Templáty cDNA sa amplifikovali pomocou FIPV forward primeru, 5’-GGAAGTTTAGATTTGATTTGGCAATGCTAG a FIP reverzného primeru, 5’-AACAATCACTAGATCCAGACGTTAGCT (terminálna časť génu FIPV 7b) [25]. PCR v reálnom čase pre mačací domáci gén GAPDH sa uskutočňovala súčasne s použitím primérov, 5 GAPDH, 5’-AAATTCCACGGCACAGTCAAG a 3 GAPDH, 5’-TGATGGGCTTTCCATTGATGA. Podmienky cyklovania pre FIPV aj GAPDH amplikóny boli nasledujúce: 50°C počas 2 minút, 95°C počas 2 minút, potom nasledovalo 40 cyklov pri teplote 95°C počas 15s, 58°C počas 30s, 72°C počas 1 minúty. Posledný krok obsahoval disociačnú krivku na vyhodnotenie špecifičnosti väzby priméru. Počet kópií FIPV a GAPDH bol vypočítaný na základe štandardných kriviek generovaných v našom laboratóriu. Kópie cIPNA FIPV stanovené pomocou RT PCR v reálnom čase sa normalizovali na 106 kópií mačacej GAPDH cDNA.

Vývoj anti-helikázových chemických fragmentov

Lieky skúmané a opísané v tejto štúdii boli už známe antivírusové látky. Naproti tomu bol helikázový enzým FIPV klonovaný, exprimovaný a použitý ako cieľ pre koronavírus a enzýmovo špecifickým vírusovým objavom. Cieľová sekvencia DNA AviTag-FIP Helicase-HisTag bola optimalizovaná a syntetizovaná. Syntetizovaná sekvencia bola klonovaná (Adeyemi Adedeji) do vektora pET30a s tagom Avi-His na expresiu proteínu v E. coli. Kmeň E. coli BL21 (DE3) sa transformoval rekombinantným plazmidom. Jedna kolónia sa naočkovala do 1 litra auto-indukovaného média obsahujúceho antibiotikum a kultúra sa inkubovala pri 37°C pri 200 ot./min.

Keď OD600 dosiahol asi 3, teplota bunkovej kultúry bola na 16 hodín zmenená na 15°C. Bunky sa zozbierali centrifugáciou. Bunkové pelety sa resuspendovali v lyzačnom pufri s následnou sonifikáciou. Zrazenina po centrifugácii sa rozpustila pomocou denaturačného činidla. Cieľový proteín sa získal jednostupňovým čistením na Ni kolóne. Cieľový proteín sa sterilizoval 0,22 um filtrom. Výťažok bol 7,2 mg pri 0,90 mg/ml a bol uložený v PBS, 10% glycerole, 0,5 mM L-arginíne, pH 7,4. Koncentrácia bola stanovená Bradfordovým proteínovým testom s BSA ako štandardom. Čistota proteínu a molekulová hmotnosť sa stanovili pomocou SDS-PAGE s potvrdením Western blot.

Skríning fragmentov povrchovej plazmónovej rezonancie (SPR) sa uskutočňoval na platforme ForteBio Pioneer FE SPR. Použil sa senzorový čip HisCap, ktorý obsahuje povrchovú matricu NTA. Kanály 1 a 3 boli naplnené 100uM NiCI2, nasledovalo injekčné podanie 50ug/ml FIP proteínu. Kanál 2 bol ponechaný bez bielkovín, rovnako ako NiCl2, ako referencia. Kanál 1 bol imobilizovaný na hustotu ~8000 RU, zatiaľ čo kanál 3 obsahoval približne 12000 RU. Bol použitý kanál 1. Pufrom použitým na imobilizáciu bol 10 mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCI a 0,1% Tween-20. Pre tento test sa pridal DMSO do konečnej koncentrácie 4%. Proprietárna knižnica zlúčenín sa zriedila v rovnakom tlmivom roztoku bez DMSO na konečnú koncentráciu DMSO 4% DMSO. Zlúčeniny z knižnice sa testovali pri koncentrácii 100 uM s použitím gradientovej injekčnej metódy OneStep. Nálezy boli vybrané na základe RU a kinetiky a použité pre bunkový skríning.

Vírusový plaque (doštičkový) test

Na skríning antivírusovej aktivity zlúčenín boli infikované bunky CRFK ošetrené zlúčeninami v šiestich jamkových replikátoch a porovnávané s jamkami pozitívnej kontroly (infikované bunky), negatívnymi kontrolami (neinfikované bunky) a kontrolami liečby (infikované bunky ošetrené známou účinnou antivírusovou zlúčeninou) súčasne na každej platni pre tkanivové kultúry. CRFK bunky sa pestovali na 96-jamkových platniach pre tkanivové kultúry (Genesee Scientific) obsahujúcich 200 ul kultivačného média. Pri ~75-85% konfluencii buniek bolo médium v ​​neinfikovaných kontrolných jamkách odsaté a nahradené 200 ul čerstvého média. Médium v ​​infikovaných jamkách bolo odsaté a nahradené médiom inokulovaným FIPV pri multiplicite infekcie (MOI) 0,004 infekčného viriónu na bunku. Doštička pre tkanivovú kultúru sa inkubovala 1 hodinu s periodickým jemným miešaním (manipulácie typu „číslo osem“) uskutočňovaným každých 15 minút, aby sa uľahčila interakcia vírus-bunka. Po 1 hodine po infekcii sa každá predpokladaná antivírusová zlúčenina pridala do šiestich jamiek infikovaných FIPV (na stanovenie antivírusovej účinnosti zlúčeniny) a šiestich neinfikovaných kontrolných jamiek (na skríning cytotoxicity zlúčeniny v bunkách CRFK). Všetky zlúčeniny boli pôvodne skrínované pri 10 μM, s výnimkou zlúčenín „chemického fragmentu“ dodávaných M. Olsenom (Midwestern University), ktoré boli hodnotené pri 50 μM. Doštičky s tkanivovými kultúrami sa inkubovali 72 hodín pri 37°C a potom sa zafixovali metanolom a zafarbili sa kryštálovou fialovou farbou. Doštičky sa skenovali na absorbanciu pri 620 nm pomocou čítačky doštičiek ELISA (FilterMax F3, Molecular Devices; Softmax Pro, Molecular Devices). Pre každú liečebnú podmienku sa zaznamenali jednotlivé hodnoty absorbancie jamky spolu s priemernou hodnotou absorbancie a strednou chybou priemeru pre 6 jamkové experimentálne replikáty.

Pre látky, ktoré preukázali antivírusovú účinnosť pri počiatočnom skríningu pri 10 alebo 50μM (chránené pred vírusom asociovaným CPE), sa EC50 stanovila vykonaním série progresívnych 2-násobných riedení zlúčenín vo vírusovom plaque teste. Na stanovenie EC50 sa bunky CRFK pestovali na 96-jamkových doštičkách pre tkanivové kultúry podobne ako v prípade antivírusového skríningového testu. Okrem neinfikovaných kontrolných jamiek boli všetky zostávajúce jamky infikované FIPV, ako je opísané vyššie. Séria dvojnásobného riedenia sa pohybovala od 20μM do 0μM a každá koncentrácia sa uskutočňovala v šiestich jamkových replikátoch. Počet krokov riedenia bol v rozmedzí od 6 do 14 a bol závislé od zlúčeniny. Šesť jamkových replikátov neinfikovaných buniek CRFK slúžilo ako kontrola pre normálne bunky CRFK; šesť replikátov CRFK buniek infikovaných FIPV slúžilo ako neošetrené kontrolné jamky infikované FIPV; a šesť jamkových replikátov FIPV infikovaných CRFK buniek ošetrených GS-441524 slúžilo ako kontrolné jamky na ochranu pred vírusom indukovanou bunkovou smrťou na základe publikovaných údajov týkajúcich sa účinnosti použitia GS-441524 in vitro v CRFK bunkách [26].

Platne s tkanivovými kultúrami sa inkubovali 72 hodín a potom sa zafixovali metanolom, zafarbili sa kryštálovou violeťou a pomocou čítačky doštičiek ELISA sa skenovala absorbancia pri 620 nm. Jednotlivé hodnoty absorbancie spolu s priemernou hodnotou absorbancie a štandardnou odchýlkou pre 6 jamkové experimentálne replikáty boli zaznamenané pre každú podmienku liečby. EC50 bola vypočítaná vynesením nelineárnej regresnej rovnice (krivka dávka-odpoveď) pomocou programu Prism 8 (GraphPad).

Vírusový RNA knock-down test

Na kvantifikáciu inhibície produkcie vírusovej RNA zlúčeninou sa použili testy v reálnom čase RT-PCR. CRFK bunky sa kultivovali na 6-jamkovej doštičke pre tkanivové kultúry (Genesee Biotek). Pri približne 75-85% splývaní buniek bolo kultivačné médium nahradené čerstvým médiom a bunky boli infikované FIPV sérotypu II pri MOI 0,2 (MOI na základe TCID50 biotestu/pfu). Doštičky sa inkubovali jednu hodinu s periodickým jemným trepaním každých 15 minút. Jamky infikované FIPV boli ošetrené jednou (monoterapia), dvoma alebo tromi (kombinovaná antikoravírusová terapia) antivírusovými zlúčeninami; každé experimentálne ošetrenie sa uskutočňovalo trikrát. Dávka zlúčeniny bola založená na EC50 zlúčenín a pohybovala sa od 0,001 do 20 μM. Pre každú experimentálnu sadu slúžili tri kultivačné jamky s FIPV-infikovanými a neošetrenými CRFK bunkami ako vírusom infikované kontroly. Infikované bunkové kultúry boli následne inkubované po dobu 24 hodín a celková RNA spojená s bunkami bola izolovaná pomocou mini súpravy PureLink ™ RNA (Invitrogen). RNA bola ošetrená DNAsou (TurboDNAse, Ambion), reverzne transkribovaná na cDNA pomocou súpravy High-Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems) a cIPNA FIPV a mačacie GAPDH cDNA boli merané pomocou qRT-PCR v reálnom čase, ako je opísané vyššie . Násobné zníženie vírusového titra sa stanovilo delením normalizovaného priemerného počtu kópií FIPV RNA pre neošetrené bunky CRFK infikované FIPV na normalizovaný priemerný počet kópií FIPV RNA pre liečené bunky CRFK požadovanou zlúčeninou (zlúčeninami). Očakávaný aditívny účinok sa stanovil pridaním násobnej redukcie pre každú monoterapiu použitú v kombinácii. Zložený aditívny účinok sa určil vydelením predikovaného aditívneho účinku na hodnotu kombinovanej redukcie násobku pre konkrétnu kombinovanú liečbu.

Stanovenie bezpečnostných profilov cytotoxicity (CSP).

Cytotoxicita zlúčeniny v mačacích bunkách sa hodnotila pomocou komerčne dostupnej súpravy (CellTox Green Cytotoxicity Assay, Promega) podľa pokynov výrobcu. Neošetrené bunky CRFK sa použili ako negatívne kontroly a bunky sa ošetrili cytotoxickým roztokom poskytnutým výrobcom ako pozitívne kontroly toxicity. Stručne, okrem kontrolných jamiek boli bunky CRFK nanesené na 96-jamkové doštičky pre tkanivové kultúry (Genesee Scientific) v štyroch jamkových replikátoch s 5, 10, 25, 50 alebo 100 μM koncentráciami požadovanej zlúčeniny a boli inkubované po dobu 72 hodín. Po 72 hodinách sa na všetky jamky nanieslo farbivo viažuce sa na súpravu DNA, inkubované pri 37°C chránené pred svetlom po dobu 15 minút a intenzite fluorescencie pri 485-500 nm Ex/520-530 nm EM bola následne stanovená pomocou čítačky doštičiek (FilterMax F3, Molekulárne zariadenia; Softmax Pro, Molekulárne zariadenia). Predpokladalo sa, že cytotoxicita zlúčeniny v konkrétnej koncentrácii je úmerná intenzite fluorescencie na základe selektívnej penetrácie a väzby farbiva na DNA degenerovaných, apoptotických alebo nekrotických buniek. Rozsah cytotoxicity sa stanovil nastavením hodnoty fluorescencie pre bunky ošetrené reagentom pre pozitívnu kontrolu na 100% a neošetrené mačacie bunky ako 0% cytotoxicity. Priemerná hodnota fluorescencie pre štyri jamky obsahujúce každú koncentráciu zlúčeniny sa potom interpolovala ako percento (percento cytotoxicity) v rozmedzí od 0 do 100%.

Konflikt záujmov

Autori prehlasujú, že nedošlo k žiadnemu konfliktu záujmov.

Oceňujeme financovanie poskytované Winn Feline Foundation (MTW 17-020; MTW 19-026) a Kalifornskou univerzitou v Davise, Centre for Companion Animal Health (CCAH; 2018-92-F; 2018-94-FE) prostredníctvom darov určených pre výskum FIP viacerými individuálnymi darcami a organizáciami (SOCK FIP, Davis, CA) a nadáciami (fond Philip Raskin, Kansas City, KS).

Doplnkové informácie

Kompletný zoznam zlúčenín testovaných in vitro na aktivitu proti FIPV

Inhibítory nukleozidovej polymerázy

12x GS Nuc AnalogsNucleoside analogNPI
GS-441524 (China-sourced)Nucleoside analog AdenosineNPI
3-Deazaneplanocin A HydrochlorideNucleoside analog AdenosineNPI
AdefovirNucleoside analog AdenosineNPI
GalidesivirNucleoside analog AdenosineNPI
GS-441524 (Manufactured in China)Nucleoside analog AdenosineNPI
MK-0608Nucleoside analog AdenosineNPI
NITD008Nucleoside analog AdenosineNPI
DidanosineNucleoside analog AdenosineNPI
Tenofovir alafenamideNucleoside analog AdenosineNPI
Tenofovir disoproxil fumarateNucleoside analog AdenosineNPI
EIDD 1931Nucleoside analog Cytidine 
EIDD 2801Nucleoside analog Cytidine 
2′-C-methylcytidineNucleoside analog CytidineNPI
Gemcitabine HydrochlorideNucleoside analog CytidineNPI
2-C-methylguanosineNucleoside analog GuanosineNPI
7-methylguanosineNucleoside analog GuanosineNPI
EntecavirNucleoside analog GuanosineNPI
MizoribineNucleoside analog GuanosineNPI
RibavirinNucleoside analog GuanosineNPI
PSI-6206Nucleoside analog UridineNPI
6-AzauridineNucleoside analog UridineNPI
BalapiravirNucleoside analog CytidineNPI
SofosbuvirNucleoside analog UridineNPI
FavipiravirNucleoside analog PurineNPI
Celkom 36

Inhibítory proteázy

GrazoprevirNS3/4A protease inhibitorPI
RupintrivirRhinoviral 3CP inhibPI
LopinavirAntiretroviral PIPI
RitonavirAntiretroviral PIPI
NelfinavirAntiretroviral PIPI
Disulfiram (tetraethyliuram disulfide)Papain-like protease inhibPI
K777/K11777Cysteine protease inhibitorPI
TelaprevirNS3/4A protease inhibitorPI
Camostat mesylateSerine protease inhibitorPI
ParitaprevirSerine protease inhibitorPI
GC376Coronavirus protease inhibitorPI
Celkom 11

NS5A inhibítory

VelpatasvirNS5A InhibitorNS5A Inhibitor
Ravidasvir/PPI-668NS5A InhibitorNS5A Inhibitor
LedipasvirNS5A InhibitorNS5A Inhibitor
OmbitasvirNS5A InhibitorNS5A Inhibitor
PibrentasvirNS5A InhibitorNS5A Inhibitor
DaclatasvirNS5A InhibitorNS5A Inhibitor
ElbasvirNS5A InhibitorNS5A Inhibitor
Celkom 7

NNPI

DasabuvirNon-nucleoside polymerase inhibitorNNPI
Celkom 1

Iné

MonensinIonophoreIné
Phenazopyridine hydrochlorideCrystalline solidIné
Pyrvinium pamoate hydrateAndrogen receptor inhibitorIné
Toremifene citrateSelective estrogen receptor modulator Iné
AM580Retinobenzoic derivativeIné
HomoharringtonineTranslation elongation inhibIné
Amodiaquine4-aminoquinoloneIné
Celkom 7

Midwestern Chemical Fragments

F0472-0017Midwestern
F6190-0257Midwestern
F6279-0675Midwestern
F2167-1080Midwestern
F6190-0740Midwestern
F6438-2155Midwestern
F3411-5663Midwestern
F6233-0011Midwestern
F9995-2543Midwestern
F2124-0890Midwestern
F2711-2577Midwestern
F2130-0055Midwestern
F2493-3358Midwestern
F2459-0974Midwestern
F2124-0465Midwestern
F1899-2269Midwestern
F2185-1982Midwestern
F2189-0717Midwestern
F2147-0158Midwestern
F1371-0192Midwestern
F2156-0057Midwestern
F9995-2431Midwestern
F3349-0218Midwestern
F2156-0059Midwestern
F2156-0070Midwestern
F5856-0194Midwestern
F2147-0975Midwestern
Celkom 27

Referencie

  1. Chang HW, de Groot RJ, Egberink HF, et al. Feline infectious peritonitis: Insights into feline coronavirus pathobiogenesis and epidemiology based on genetic analysis of the viral 3c gene. J Gen Virol 2010; 91: 415–420.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  2. Pedersen NC, Liu H, Dodd KA, et al. Significance of coronavirus mutants in feces and diseased tissues of cats suffering from feline infectious peritonitis. Viruses 2009; 1: 166–184.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  3. Vennema H, Poland A, Foley J, et al. Feline infectious peritonitis viruses arise by mutation from endemic feline enteric coronaviruses. Virology 1998; 243: 150–157.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  4. Rottier PJM, Nakamura K, Schellen P, et al. Acquisition of Macrophage Tropism during the Pathogenesis of Feline Infectious Peritonitis Is Determined by Mutations in the Feline Coronavirus Spike Protein. J Virol 2005; 79: 14122–14130.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  5. Diaz JV., Poma R. Diagnosis and clinical signs of feline infectious peritonitis in the central nervous system. Can Vet J 2009; 50: 1091–1093.PubMedGoogle Scholar
  6. Foley JE, Lapointe JM, Koblik P, et al. Diagnostic features of clinical neurologic feline infectious peritonitis. J Vet Intern Med 1998; 12: 415–423.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  7. Pedersen NC. An update on feline infectious peritonitis: Diagnostics and therapeutics. Vet J 2014; 201: 133–141.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  8. Stiles J. Ocular manifestations of feline viral diseases. Vet J 2014; 201: 166–173.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  9. Pedersen NC. A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963-2008. J Feline Med Surg 2009; 11: 225–258.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  10. Hohdatsu T, Yamada M, Tominaga R, et al. Antibody-Dependent Enhancement of Feline Infectious Peritonitis Virus Infection in Feline Alveolar Macrophages and Human Monocyte Cell Line U937 by Serum of Cats Experimentally or Naturally Infected with Feline Coronavirus. J Vet Med Sci 1998; 60: 49–55.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  11. Takano T, Yamada S, Doki T, et al. Pathogenesis of oral type I feline infectious peritonitis virus (FIPV) infection: Antibodydependent enhancement infection of cats with type I FIPV via the oral route. J Vet Med Sci 2019; 81: 911–915.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  12. Vennema H, de Groot RJ, Harbour DA, et al. Early death after feline infectious peritonitis virus challenge due to recombinant vaccinia virus immunization. J Virol 1990; 64: 1407–1409.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  13. Fenner’s Veterinary Virology. 2017. Epub ahead of print 2017. DOI: 10.1016/c2013-0-06921-6.CrossRefGoogle Scholar
  14. Wei X, Wang X, Peng W, et al. The Lancet Respiratory Medicine Clinical characteristics of SARS-CoV-2 infected pneumonia with diarrhea. 4.Google Scholar
  15. Hosoda T, Sakamoto M, Shimizu H, et al. SARS-CoV-2 enterocolitis with persisting to excrete the virus for about two weeks after recovering from diarrhea: A case report. Infect Control Hosp Epidemiol 2020; 1–4.Google Scholar
  16. Hamming I, Timens W, Bulthuis MLC, et al. Tissue distribution of ACE2 protein, the functional receptor for SARS coronavirus. A first step in understanding SARS pathogenesis. 2004; 631–637.Google Scholar
  17. Zhang J, Wu Y, Wang R, et al. Bioinformatic analysis of reproductive system Bioinformatic analysis reveals that the reproductive system is potentially at risk from SARS-CoV-2. 2020; 1–15.Google Scholar
  18. Zheng YY, Ma YT, Zhang JY, et al. COVID-19 and the cardiovascular system. Nat Rev Cardiol. Epub ahead of print 2020. DOI: 10.1038/s41569-020-0360-5.CrossRefGoogle Scholar
  19. Chen L, Deng C, Chen X, et al. Ocular manifestations and clinical characteristics of 534 cases of COVID-19 in China: A cross-sectional study. medRxiv 2020; 2020.03.12.20034678.Google Scholar
  20. Mao L, Wang M, Chen S, et al. Neurological Manifestations of Hospitalized Patients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective case series study. medRxiv 2020; 2020.02.22.20026500.Google Scholar
  21. Chen C, Zhou Y, Wang DW. SARS-CoV-2: a potential novel etiology of fulminant myocarditis. Herz 2020; 10–12.Google Scholar
  22. Li Y-C, Bai W-Z, Hashikawa T. The neuroinvasive potential of SARS-CoV2 may be at least partially responsible for the respiratory failure of COVID-19 patients. J Med Virol 2020; 24–27.Google Scholar
  23. Shi J, Wen Z, Zhong G, et al. Susceptibility of ferrets, cats, dogs, and other domesticated animals to SARS-coronavirus 2. Science. Epub ahead of print 2020. DOI: 10.1126/science.abb7015.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  24. Pedersen NC, Kim Y, Liu H, et al. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2018; 20: 378–392.CrossRefGoogle Scholar
  25. Murphy BG, Perron M, Murakami E, et al. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol 2018; 219: 226–233.Google Scholar
  26. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, et al. Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2019; 21: 271–281.Google Scholar
  27. Holshue ML, DeBolt C, Lindquist S, et al. First case of 2019 novel coronavirus in the United States. N Engl J Med 2020; 382: 929–936.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  28. Wang M, Cao R, Zhang L, et al. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro. Cell Res 2020; 30: 269–271.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  29. Nakagawa F, May M, Phillips A. Life expectancy living with HIV: Recent estimates and future implications. Curr Opin Infect Dis 2013; 26: 17–25.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  30. Simonetti FR, Kearney MF. Review: Influence of ART on HIV genetics. Current Opinion in HIV and AIDS. Epub ahead of print 2015. DOI: 10.1097/COH.0000000000000120.CrossRefGoogle Scholar
  31. Arts EJ, Hazuda DJ. HIV-1 antiretroviral drug therapy. Cold Spring Harb Perspect Med; 2. Epub ahead of print 2012. DOI: 10.1101/cshperspect.a007161.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  32. Kim Y, Liu H, Kankanamalage ACG. Reversal of the Progression of Fatal Coronavirus Infection in Cats by a Broad-Spectrum Coronavirus Protease Inhibitor. 2016; 1–18.Google Scholar
  33. Kumar GN, Jayanti VK, Johnson MK, et al. Metabolism and disposition of the HIV-1 protease inhibitor lopinavir (ABT-378) given in combination with ritonavir in rats, dogs, and humans. Pharm Res 2004; 21: 1622–1630.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  34. Sulejmani N, Jafri SM, Gordon SC. Pharmacodynamics and pharmacokinetics of elbasvir and grazoprevir in the treatment of hepatitis C. Expert Opin Drug Metab Toxicol 2016; 12: 353–361.Google Scholar
  35. Combination Antiretroviral Therapy for HIV Infection – American Family Physicianhttps://www.aafp.org/afp/1998/0601/p2789.html (accessed 6 April 2020).Google Scholar
  36. Julg B. Atripla™ – HIV therapy in one pill. 2008; 4: 573–577.Google Scholar
  37. Clay PG, Taylor TAH, Glaros AG, et al. “One pill, once daily”: what clinicians need to know about Atripla™. 2008; 4: 291–302.Google Scholar
  38. Hill A, Van Der Lugt J, Sawyer W, et al. How much ritonavir is needed to boost protease inhibitors? Systematic review of 17 dose-ranging pharmacokinetic trials. Aids 2009; 23: 2237–2245.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  39. A. H, G.R. G, R.J. B. Ritonavir: Clinical pharmacokinetics and interactions with other anti-HIV agents. Clin Pharmacokinet 1998; 35: 275–291.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  40. Kwo P, Gane EJ, Peng C, et al. Effectiveness of Elbasvir and Grazoprevir Combination, With or Without Ribavirin, for Treatment-Experienced Patients With Chronic Hepatitis C Infection. Gastroenterology 2017; 152: 164–175.e4.Google Scholar
  41. Zhou Y, Vedantham P, Lu K, et al. Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Res 2015; 116: 76–84.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  42. Alessandro SD, Scaccabarozzi D, Signorini L, et al. The Use of Antimalarial Drugs against Viral Infection. 2020; 1–26.Google Scholar
  43. Rynes RI, Bernstein HN. Ophthalmologic safety profile of antimalarial drugs. In: Lupus. 1993. Epub ahead of print 1993. DOI: 10.1177/0961203393002001051.CrossRefGoogle Scholar
  44. Briceño E, Reyes S, Sotelo J. Therapy of glioblastoma multiforme improved by the antimutagenic chloroquine. Neurosurg Focus. Epub ahead of print 2003. DOI: 10.3171/foc.2003.14.2.4.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  45. Ekong M, Igiri A, Ekanem T, et al. The effect of amodiaquine on some brain macromolecules of Wistar rats. Int J Biol Chem Sci. Epub ahead of print 2009. DOI: 10.4314/ijbcs.v2i4.39762.CrossRefGoogle Scholar
  46. Mackenzie AH. Pharmacologic actions of 4-aminoquinoline compounds. Am J Med. Epub ahead of print 1983. DOI: 10.1016/0002-9343(83)91264-0.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  47. Kuroda K. Detection and distribution of chloroquine metabolites in human tissues. J Pharmacol Exp Ther.Google Scholar
  48. Maguire A, Kolb H. THE EFFECT OF A SYNTHETIC ANTIMALARIAL (AMODIAQUINE) ON THE RETINA. Br J Dermatol. Epub ahead of print 1964. DOI: 10.1111/j.1365-2133.1964.tb15487.x.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  49. McAnally D, Siddiquee K, Gomaa A, et al. Repurposing antimalarial aminoquinolines and related compounds for treatment of retinal neovascularization. PLoS One. Epub ahead of print 2018. DOI: 10.1371/journal.pone.0202436.CrossRefGoogle Scholar
  50. Keyaerts E, Li S, Vijgen L, et al. Antiviral activity of chloroquine against human coronavirus OC43 infection in newborn mice. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53: 3416–3421.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  51. Savarino A, Boelaert JR, Cassone A, et al. Effects of chloroquine on viral infections: An old drug against today’s diseases? Lancet Infect Dis 2003; 3: 722–727.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  52. Azuma P, Massaquoi M, Job D, et al. Effect of Artesunate–Amodiaquine on Mortality Related to Ebola Virus Disease. 2016; 23–32.Google Scholar
  53. Boonyasuppayakorn S, Reichert ED, Manzano M, et al. HHS Public Access. 2015; 125–134.Google Scholar
  54. Baba M, Toyama M, Sakakibara N. Establishment of an antiviral assay system and identification of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus inhibitors. 2017; 25: 83–89.Google Scholar
  55. Savarino A, Lucia MB, Rastrelli E, et al. Anti-HIV Effects of Chloroquine. JAIDS J Acquir Immune Defic Syndr. Epub ahead of print 2004. DOI: 10.1097/00126334-200403010-00002.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  56. Al-bari AA. Targeting endosomal acidification by chloroquine analogs as a promising strategy for the treatment of emerging viral diseases. 2017; 5: 1–13.Google Scholar
  57. Terauchi M. Pharmacokinetics of selective estrogen receptor modulators(SERMs). Clin Calcium 2016; 26: 1571–1581.Google Scholar
  58. Agents A, Dyall J, Diseases I, et al. Repurposing of Clinically Developed Drugs for Treatment of Middle. Epub ahead of print 2014. DOI: 10.1128/AAC.03036-14.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  59. Zhao Y, Ren J, Harlos K, et al. virus glycoprotein. Nature 2016; 535: 169–172.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  60. Dyall J, Nelson EA, Dewald LE, et al. Identification of Combinations of Approved Drugs With Synergistic Activity Against Ebola Virus in Cell Cultures. 2018; 22908: 672–678.Google Scholar
  61. Michimae Y, Mikami S, Okimoto K, et al. The First Case of Feline Infectious Peritonitis-like Pyogranuloma in a Ferret Infected by Coronavirus in Japan. 2010; 99–101.Google Scholar
  62. Ramis A, Amarilla SP. Coronavirus Infection in Ferrets : Antigen Distribution and Inflammatory Response. 2016; 53: 1180–1186.Google Scholar
  63. Watanabe R, Eckstrand C, Liu H, et al. Characterization of peritoneal cells from cats with experimentally ‑ induced feline infectious peritonitis (FIP) using RNA ‑ seq. Vet Res 2018; 1–15.Google Scholar
  64. Inhibitor P, Hoffmann M, Kleine-weber H, et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Article SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. 2020; 1–10.Google Scholar
  65. Zhang B, Zhou X, Zhu C, et al. Immune phenotyping based on neutrophil-to-lymphocyte ratio and IgG predicts disease severity and outcome for patients with COVID-19. medRxiv. Epub ahead of print 2020. DOI: 10.1101/2020.03.12.20035048.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  66. Zhao J, Yuan Q, Wang H, et al. Antibody Responses to SARS-CoV-2 in Patients of Novel Coronavirus Disease 2019. SSRN Electron J. Epub ahead of print 2020. DOI: 10.2139/ssrn.3546052.CrossRefGoogle Scholar
  67. Cao X. COVID-19: immunopathology and its implications for therapy. Nat Rev Immunol; 2019. Epub ahead of print 2020. DOI: 10.1038/s41577-020-0308-3.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  68. Ramakrishnan MA. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World J Virol 2016; 5: 85.CrossRefPubMedGoogle Scholar
Prečítať “Racionálny prístup k identifikácii účinných kombinovaných antikoronavírusových terapií proti mačaciemu koronavírusu”

Neurologická forma mačacej infekčnej peritonitídy a liečba pomocou GS-441524

1.6.2021
Niels C. Pedersen, DVM PhD
Pôvodný článok: The Neurological Form of Feline Infectious Peritonitis and GS-441524 treatment

Úvod

Neurologické postihnutie sa vyskytuje asi u 5–10% prípadov FIP. To sa môže v jednotlivých regiónoch líšiť, pretože na základe skúseností autora sa zdá, že turecké pouličné mačky vykazujú väčšiu prevalenciu. Vek nástupu je podobný ako u iných foriem FIP, pričom väčšina prípadov sa vyskytuje do 3 rokov.

Neurologická FIP sa považuje za formu suchej FIP a typické lézie suchej FIP v oblasti brucha, hrudníka alebo očí sa vyskytujú približne v polovici neurologických prípadov FIP. Neurologické príznaky sú viditeľné iba u asi 5% mačiek s prejavmi vlhkej FIP.1 Každopádne u mačiek došlo k významnému zvýšeniu výskytu neurologickej FIP buď počas liečby s GS-441524, alebo vo forme relapsov v období pozorovania po liečbe u mačiek, ktoré boli pôvodne liečené na neneurologickú FIP.

Klinické príznaky

Neurologická FIP sa vyskytuje v dvoch formách, primárnej a sekundárnej. Abnormálne neurologické príznaky sú prítomné u mačiek s primárnym ochorením. Bežné sú však aj všeobecné príznaky zlého zdravotného stavu, ako napríklad neprospievanie, chudnutie, letargia a nechutenstvo. Horúčka môže byť zjavná alebo skrytá. Asi polovica mačiek s primárnou neurologickou FIP bude mať tiež identifikovateľné lézie mimo CNS a typickými výsledkami krvných testov. Avšak mačky bez zjavných znakov poškodenia CNS budú mať často na paneli CBC a v sére normálne, alebo normálu sa blížiace hladiny.

Skoré neurologické príznaky, rozpoznateľné prospektívne alebo retrospektívne, zahŕňajú lízanie podlahy alebo stien, sporadické zášklby svalov a neurčité správanie a kognitívne abnormality. Anizokória je ďalším skorým znamením. Podozrenie na neurologickú FIP rastie, keď sú klinické príznaky funkčnejšie. Najskorším znakom je zvyčajne postupná strata koordinácie a rovnováhy (ataxia). Nechuť skákať hore alebo dole z vysokých miest je jedným z prvých prejavov nekoordinácie. Inkoordinácia je spočiatku najnápadnejšia u zadných nôh, ale rýchlo sa stáva všeobecnou. V niektorých prípadoch sa môžu vyskytnúť aj záchvaty typu grand mal alebo psychomotorického typu. Záchvaty typu grand mal sa prejavujú krátkou stratou vedomia, silnými rytmickými svalovými kŕčmi postihujúcimi celé telo. Psychomotorická epilepsia je spojená s rôznym stupňom vedomia a nekontrolovanými alebo čiastočne kontrolovanými pohybmi tela.

Mačky so sekundárnou neurologickou FIP sa vyznačujú príznakmi extra-intestinálneho ochorenia a postihnutie CNS sa objaví v neskoršej fáze choroby. Vyskytuje sa často počas antivírusovej liečby iných foriem FIP a je častou príčinou relapsu u mačiek liečených na iné formy FIP. Tieto relapsy sa zvyčajne vyskytujú v priebehu prvých 1-4 týždňov po úspešnej liečbe.

Postihnutie miechy je pri neurologickej FIP často prehliadané, hoci viac ako 50% mačiek so zápalovým ochorením miechy má FIP.2 Postihnutie miechy vedie k fekálnej a/alebo močovej inkontinencii rôznej závažnosti. Paralýza chvosta alebo zadných končatín sú tiež príznakmi ochorenia miechy. Postihnutie miechy pravdepodobne vedie k trvalým neurologickým deficitom a potom k ochoreniu mozgu.

Diagnostika

Náhly výskyt neurologických abnormalít u mačiek mladších ako 5-7 rokov je silným dôkazom FIP už iba ​​na základe samotnej pravdepodobnosti, pretože len málo ďalších chorôb bude mať v tejto vekovej skupine podobné príznaky. Avšak medzi veterinármi existuje tendencia zaradiť systémovú toxoplazmózu na svoj diagnostický zoznam vyššie, najmä keď sa pozorujú očné príznaky alebo príznaky postihnutia CNS. Systémová toxoplazmóza u mačiek je v porovnaní s FIP zriedkavým ochorením a často sa vyskytuje u imunokompromitovaných hostiteľov, vrátane hostiteľov s FIP. 15-17 Je to pochopiteľné, pretože mačky sú v prírode definitívnym hostiteľom Toxoplasma gondii a vyvinul sa u nich stav fakultatívnej symbiózy. Okrem toho je hlavným klinickým prejavom systémovej toxoplazmózy charakteristická pneumónia, niekedy spojená s hepatitídou, nekrózou pankreasu, myozitídou, myokarditídou a dermatitídou.3-8 Uveitída podobná FIP sa vyskytuje u približne 10% mačiek so systémovou toxoplazmózou, 4 a encefalitída je ešte menej častá.7,17 Diagnostický test na systémovú toxoplazmózu je založený na porovnaní titrov protilátok IgG a IgM pomocou postupu nepriamej fluorescenčnej protilátky (IFA). 3 Vysoké titre IgG pri absencii protilátok IgM naznačujú predchádzajúcu expozíciu na toxoplazmu, ktorá môže v populácií divých mačiek dosahovať až 50% .4 Prítomnosť vysokých titrov protilátok IgM je indikáciou systémového rozšírenia organizmu z čreva do iných tkanív a je jednou z požiadaviek na diagnostiku systémového ochorenia. Mnoho mačiek s očnými a neurologickými známkami je však nevhodne liečených na systémovú toxoplazmózu iba na základe vysokých titrov IgG.

Diagnóza typických foriem FIP sa zvyčajne určí spojením informácií o veku a pôvode mačky, historických a fyzických znakov (napr. zlý zdravotný stav, horúčka, brušné alebo hrudné výpotky, hmatateľné hmoty v brušných orgánoch) s určitými laboratórnymi abnormalitami v kompletnom krvnom obraze (anémia; vysoký počet bielych krviniek, nízky počet lymfocytov a vysoký počet neutrofilov), sérovom biochemickom paneli (vysoká celková bielkovina, vysoký globulín, nízky albumín a nízky pomer A:G), vyšetrenia výpotkov, ak sú prítomné (exsudát alebo modifikovaný exsudát, žltý odtieň) a určením pravdepodobnosti, že tieto zistenia možno najlepšie vysvetliť FIP. Definitívnu diagnózu je možné získať identifikáciou koronavírusových proteínov alebo RNA vo výpotkoch alebo vzorkách tkanív pomocou PCR alebo imunohistochémie. Je ale možné, že u mačiek, u ktorých sa vyvinie neurologická FIP počas liečby alebo po liečbe neneurologickej formy, budú mnohé alebo všetky tieto klinické znaky chýbať.

Diagnostika neurologickej FIP, najmä v primárnej forme, sa zvyčajne robí tromi spôsobmi: 1) zvážte všetky historické, klinické a laboratórne nálezy a odhadnite pravdepodobnosť, že sa jedná o FIP, 2) vyšetrite mozog pre charakteristické znaky FIP pomocou magnetickej rezonancie (MRI) a/alebo analýzou mozgovomiechového moku (CSF), 8,9 a 3) liečte na základe predpokladu, že ide o neurologickú FIP, a dúfajte v pozitívnu reakciu na antivírusovú liečbu.

Pri diagnostike neurologickej FIP sa stále viac uplatňuje magnetická rezonancia s vylepšením kontrastu. Dilatácia (hydrocefalus) jednej alebo viacerých mozgových komôr je častou léziou v mozgu.8,9 Podobné rozšírenia vo forme syringomyélie sa dajú pozorovať aj v mieche. Dilatácie sú sekundárne pri zápale okolitého ependymu. Ependyma zabezpečuje vylučovanie, cirkuláciu a udržiavanie homeostázy CSF. Preto je závažnosť sekundárneho obštrukčného hydrocefalu FIP úmerná stupňu ependymálneho zápalu a súvisiaceho zvýšenia kontrastu. Diskrétne lézie parenchýmu nie sú identifikované. MRI výrazne zvyšuje náklady na diagnostiku, anestézia zvyšuje riziko úmrtia u ťažko chorých mačiek a odborné znalosti a vybavenie nie sú vždy k dispozícii. Preto konečná diagnóza často spadá do reakcie na špecifickú antivírusovú liečbu. Liekom voľby pre neurologické prípady FIP je GS-441524.9,12

Analýza CSF je alternatívnym spôsobom kvantifikácie povahy a závažnosti zápalu v ependyme a mozgových blanách. Hladiny proteínu v CSF a počet buniek sú u mačiek s FIP zvýšené a často je možné získať vhodné vzorky pre detekciu infikovaných makrofágov pomocou IHC alebo PCR.10,11 Analýza CSF je spojená s malým rizikom z anestézie a punkcie ihly do cisterny magna.

Liečba

Neurologická FIP sa dá vyliečiť, ak sa cez hematoencefalickú bariéru prejde dostatočné množstvo antivivirotika a vírus nezískal rezistenciu voči lieku.9,12 Terénne testy s inhibítorom vírusovej proteázy GS376 boli prvými, ktoré preukázali, že neurologické príznaky možno významne potlačiť, ale infekcia sa nedá vyliečiť. Za dôvod sa považovala neschopnosť dosiahnuť dostatočne vysoké hladiny GC376 v CNS. Väčší úspech pri liečbe mačiek s neurologickou FIP sa dosiahol pomocou nukleozidového analógu a inhibítora transkripcie vírusovej RNA GS-441524.9,12 Ukázalo sa, že GS-441524 vstupuje do cerebrospinálnej tekutiny (CSF) v koncentráciách od 7-21% krvi, v závislosti od testovanej mačky. 13 Tieto rozdiely hematoencefalickej bariéry medzi mačkami sú pravdepodobným vysvetlením variabilných dávok GS-441524 od 4 do 10 mg/kg denne potrebných pre liečbu prirodzene sa vyskytujúcich prípadov neurologickej FIP.9,12

Súčasné počiatočné dávkovanie pre GS-441524 bolo na základe nedávnych zistení7 stanovené na 10 mg/kg denne subkutánnou cestou. Aj keď je možné liečiť niektoré mačky pri nižšom dávkovaní, 9,12 neexistuje jednoduchý spôsob, ako zmerať silu hematoencefalickej bariéry, takže sa používa najnižšie dávkovanie, ktoré bude mať liečivý efekt pre väčšinu mačiek. Úspešnosť liečby sa meria tak zlepšením klinických príznakov, ako aj zlepšením kritických abnormálnych hodnôt krvných testov. Prírastok hmotnosti a kvalita srsti sú taktiež dôležité kvalitatívne znaky, ktoré je potrebné pozorovať. Sekvenčné analýzy MRI a CSF poskytnú priamejšie dôkazy o reakcii na liečbu,9 ale vo väčšine prípadov sú nepraktické.

Zlepšenie celkového zdravotného stavu a neurologických príznakov sa zvyčajne prejavia do 24-48 hodín a väčšina mačiek predurčených k úplnému zotaveniu sa vráti do normálneho stavu za 4-6 týždňov. Významná časť mačiek však bude reagovať pomalšie a vyžaduje si prehodnocovanie ich klinického stavu a stavu krvných testov každé 4 týždne. Spomalenie priebehu liečby, buď klinicky, alebo vo forme zvratu v počiatočných abnormalitách krvného testu, si bude vyžadovať zvýšenie dávky lieku od +2 do +5 mg/kg denne.9,12

Ukončenie liečby, ktoré je zvyčajne po 84 dňoch, nie je vždy ľahké potvrdiť. Typické abnormality v krvných testoch, ktoré sa používajú pri väčšine ostatných foriem FIP, sa buď nevyskytujú v čase diagnózy, alebo sa vrátia do normálu pred ukončením liečby. Trvalé neurologické abnormality môžu pretrvávať aj po vyliečení infekcie a sťažujú tak klinické vyhodnotenie. Bez analýzy pomocou magnetickej rezonancie a/alebo mozgovomiechového moku, ktoré by potvrdili, či choroba už pominula, zostáva jedinou možnosťou ukončiť liečbu a dúfať, že k relapsu nedôjde.

Komplikácie neurologickej FIP

Relapsy u mačiek liečených na neurologickú FIP sa zvyčajne vyskytujú v priebehu niekoľkých dní po ukončení liečby a sú spôsobené buď neprimeraným dávkovaním a/alebo získaním liekovej rezistencie. Výskyt relapsov sa javí o niečo vyšší ako po liečbe foriem FIP bez postihnutia CNS. Poddávkovanie môže byť výsledkom silnejšej hematoencefalickej bariéry u niektorých mačiek v porovnaní s inými, nekvalitného antivírusového lieku alebo nesprávneho výpočtu dávky. Je však bežné, že sa mačky pri opakovanej liečbe vyliečia, pokiaľ nedošlo k liekovej rezistencii.

Získanie liekovej rezistencie je dobre známe u antivírusových liekov používaných u ľudí na choroby ako HIV/AIDS. Bola zaznamenaná aj u GC37611,14 aj GS-441524 u mačiek.12 Rezistencia na liečivo sa môže vyskytnúť mutáciami buď v pôvodnom FECV, alebo v jeho mutantnom biotype FIP v prírode14, a prejavovať sa nedostatočnou počiatočnou reakciou na liečbu, ale nie je to bežný jav.12 Rezistencia sa pravdepodobnejšie vyskytne počas liečby a dochádza k nej jednak chronickým vystaveniu liečivu, jednak nižšími sub-inhibičnými hladinami liečiva. Rezistencia na liek je zvyčajne čiastočná a dá sa často prekonať zvýšením dávky. Lieková rezistencia sa môže časom časom zhoršiť, a ďalšie zvyšovanie dávkovania už neprinesie žiadny efekt.

Mačky s neurologickou FIP môžu po ukončení liečby vykazovať zvyškové poškodenie mozgu a/alebo miechy a trvalé následky. Medzi postihnutia patrí rôzny stupeň nekoordinácie, zmeny správania a demencia. Najproblematickejšie následky sú spojené s postihnutím miechy. Miecha je uzavretá v kostnej trubici, ktorá neumožňuje veľkú expanziu v prípade zápalu alebo nejakej formy syringomyélie. Postihnutie miechy pri FIP sa často prejavuje rôznymi stupňami fekálnej a/alebo močovej inkontinencie. Pozoruje sa tiež ochrnutie zadných končatín a chvosta, ale je to menej časté. Bohužiaľ, tieto klinické abnormality sú často trvalé, najmä ak sa neurologické ochorenie nelieči dlhší čas.

Jedným z najbežnejších negatívnych výsledkov antivírusovej liečby u mačiek s neurologickou FIP je nedosiahnutie vyliečenia, aj keď pokračovanie v liečbe vysokými dávkami stále umožňuje udržateľnú kvalitu života (t.j. riadenie príznakov ochorenia bez vyliečenia). Táto situácia naznačuje, že inhibícia replikácie vírusu antivírusovými liekmi nemusí byť dostatočná pre vyliečenie infekcie, a že je tiež potrebná účinná imunitná odpoveď. Tento fenomén „liečby bez vyliečenia“ viedol v mnohých prípadoch mnohých majiteľov k tomu, aby v liečbe za každú cenu pokračovali aj po dobu viac ako jedného roka. Tiež to viedlo k mnohým experimentom s ultravysokými dávkami GS441524 (>15 mg/kg denne), rozdelenými dávkami, prechodom z injekcií na perorálnu liečbu, súčasnou perorálnou a injekčnou liečbou, kombinovanou antivírusovou liečbou (napr. GS-441424 plus GC376) a podporou antivírusovej liečby vysokými dávkami kortikosteroidov a iných imunosupresív. Príležitostne sa vyžaduje liečba takýmito spôsobmi liečby, ale výsledok bol pre väčšinu týchto mačiek nepriaznivý.

Existujú nepriame dôkazy o tom, že imunita hostiteľa voči FIP je rozdelená medzi CNS a ostatné časti tela. Výskyt postihnutia CNS sa zdá byť zvýšený, keď vďaka GS-441524 dôjde k inhibícii infekcie mimo CNS. Zdá sa preto, že aktívne ochorenie mimo CNS má inhibičný účinok na ochorenie v CNS. Mačky s čistým neurologickým ochorením často nevykazujú abnormálne hodnoty krvných testov na paneli CBC ani v sére, a to ani pri významných zápalových zmenách v mozgovomiechovom moku.8 Mačky s neurologickou FIP majú v porovnaní s inými formami FIP často najvyššie sérum, teda najvyššie hodnoty titra protilátok v CSF.8 To všetko sú dôkazy o „kompartmentalizácii“ infekcie na jednej alebo druhej strane hematoencefalickej bariéry.

Referencie

  1. Pedersen NC. 2009. A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963-2008. J Feline Med Surg 11:225-58.
  2. Marioni-Henry K. Feline spinal cord diseases. Vet Clin No Am Small Anim Pract. 2010;40:1011–1028.
  3. Pedersen NC. Toxoplasmosis. In: Feline Infectious Diseases. American Veterinary Publications, Inc., Goleta, CA, USA, 1988, pp 372-380.
  4. Petrak M, Carpenter J. Feline toxoplasmosis. J Am Vet Assoc. 1965; 146:728734. 
  5. Jokelainen P, Simola O, Rantanen E, Nareaho A, Lohi H, Sukura A. Feline toxoplasmosis in Finland: Cross-sectional epidemiological study and case series study. J Vet Diagn Invest. 2012; 24:1115–1124.
  6. Henriksen P, Dietz HH, Henriksen SA. Fatal toxoplasmosis in five cats. Vet Parasitol. 1994;55:15-20.
  7. Holzworth J. Encephalitic toxoplasmosis in a cat. J Am Vet Assoc. 1954; 124:313-316.
  8. Foley JE, Lapointe JM, Koblik P, Poland A, Pedersen NC Diagnostic features of clinical neurologic feline infectious peritonitis. J Vet Intern Med. 1998;12:415-423.
  9. Dickinson PJ, Bannasch M, Thomasy SM, Murthy VD, Vernau KM, Liepnieks M, Montgomery E, Knickelbein KE, Murphy B, Pedersen NC. Antiviral treatment using the adenosine nucleoside analogue GS‐441524 in cats with clinically diagnosed neurological feline infectious peritonitis. J Vet Intern Med. 2020; 34:1587–1593.
  10. Ives EJ, Vanhaesebrouck AE, Cian F. 2013. Immunocytochemical demonstration of feline infectious peritonitis virus within cerebrospinal fluid macrophages. J Feline Med Surg. 2013;15:1149–1153. 
  11. Pedersen NC, Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC, Eckstrand C, Groutas WC, Bannasch M, Meadows JM, Chang KO. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2018;20:378-392.
  12. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, et al. Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2019;21:271-281. 
  13. Murphy BG, Perron M, Murakami E, et al. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol. 2018;219:226-233. 
  14. Perera KD, Rathnayake AD, Liu H, Pedersen NC, Groutas WC, Chang KO, Kim Y. Characterization of amino acid substitutions in feline coronavirus 3C-like protease from a cat with feline infectious peritonitis treated with a protease inhibitor. Vet Microbiol. 2019;237:108398. 
  15. Ward, B.C. and Pedersen, N.C.:  Infectious Peritonitis in Cats.  J Am Vet Med.  1969;154:26-35.  
  16. Toomey JM, Carlisle-Nowak MM, Barr SC, Lopez JW, French TW, Scott FW, Hoose W, Pizano S, Dubey JP. Concurrent toxoplasmosis and feline infectious peritonitis in a cat. J Am Anim Hosp Assoc. 1995;31:425-428.
  17. Zandonà L, Brunetta R, Zanardello C, Vascellari M, Persico L, Mazzolini E. Cerebral toxoplasmosis in a cat with feline leukemia and feline infectious peritonitis viral infections. Can Vet J. 2018;59:860-862
Prečítať “Neurologická forma mačacej infekčnej peritonitídy a liečba pomocou GS-441524”

Rýchla liečba ťažkej FIP pomocou prírodných produktov

5.4.2021
Yue Zhang, Yuanfeng Zhang, Lili Zhu, Fang Lu, Xin Du, Xin Zhao, Tao Lu
Pôvodný článok: Rapid Resolution of severe feline infectious peritonitis using natural products

Abstrakt

Toto je prvá správa o úspešnej liečbe závažného prípadu infekčnej peritonitídy mačiek (FIP) pomocou kapsuly Lianhuaqingwen (LH), čínskeho lieku na báze prírodných produktov, ktorá bola použitá i na liečbu Covid-19. Ročnej mačke diagnostikovali FIP – prítomné silné ascity, afágia, zápaly, ťažkosti s dýchaním a chudnutie. Po 22 dňoch liečby kapsulami LH sa všetky ukazovatele mačky vrátili do normálu a ascites postupne zmizli. Táto kazuistika je prvým popisom klinického zotavenia mačky so systémovou infekciou FCoV s použitím kapsúl LH.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ: koronavírus, zápal, mačacia infekčná peritonitída, FIP, prírodné produkty, TCM

Základné fakty

Mačací koronavírus (FCoV), RNA alfa koronavírus, je vysoko infekčný enterický vírus, ktorý je z epidemiologického hľadiska členom rodiny Coronaviridae z radu Nidovirales [1,2], a môže infikovať mačky všetkých vekových skupín. Väčšina prípadov sa vyskytuje u mačiek vo veku 1-2 rokov a starších ako 11 rokov. Môže dlho číhať v črevách a spôsobiť mačaciu infekčnú peritonitídu (FIP) v oslabenom imunitnom alebo stresovom stave [3], ktorá je pre mačky známa ako „nevyliečiteľné ochorenie“ s takmer 100% úmrtnosťou.

Aj keď už bola publikovaná liečba FIP pomocou nových terapií [4], je potrebné ďalšie skúmanie účinnosti a bezpečnosti širokospektrálnych antivírusových liekov zameraných na FCoV. GS441524 predstavuje veľký prísľub pri liečbe mačiek s FIP [5], ale v súčasnosti nie je schválený FDA. A čo viac, náklady na liečbu FIP stoja 5000 až 9000 dolárov, čo pre väčšinu bežných rodín predstavuje veľkú finančnú záťaž. Kapsula LH, jeden z prírodných produktov TCM (Tradičnej čínskej medicíny), bola vyrobená za učelom inhibície replikácie SARS-CoV-2 [6]. LH kapsula uplatňuje svoju protichrípkovú aktivitu reguláciou imunitnej odpovede za účelom ovplyvnenia vírusových i hostiteľských reakcií [7]. Kapsula LH bola schválená Národnou zdravotníckou komisiou pre liečbu Covid-19, prospektívna randomizovaná štúdia zahŕňajúca 284 pacientov uskutočňovaná v multicentrickom prostredí naznačuje, že liečba kapsulami LH počas 14 dní výrazne zlepšila mieru ústupu príznakov [8].

Prípadová štúdia

„Big Tangerine“ je jednoročný kastrovaný kocúr čínskej mačky domácej (Felis catus) z domácnosti štyroch mačiek (2 Felis catus, 2 Britské krátkosrsté). U „Big Tangerine“ sa objavila strata chuti k jedlu a chudnutie trvajúce niekoľko týždňov. Ostatné mačky nevykazovali žiadne známky ochorenia. 15. novembra 2020 bol kocúr prevezený na kliniku Guaiguai Pet Hospital (Tianjin, Čína). Abdominocentéza ukázala veľké množstvo ascitu. FCoV sa detegoval pomocou RT-PCR v ascite, a tak bola diagnostikovaná FIP. Medzi príznakmi boli afágia (neschopnosť prehĺtať), hnačka, brušná distenzia (ascites), letargia, chudnutie a ťažkosti s dýchaním (Obrázok 1)

Obrázok 1:
Telesná hmotnosť mačky pred, počas a po zotavení z FIP a časová os. Graficky znázornená hmotnosť mačky: Deň 0 predstavuje diagnostiku FIP na klinike. Liečba LH sa uskutočňovala medzi 10 až 31. dňom. Mačka počas liečby LH stratila 1,5 kg hmotnosti (1. až 15. deň). Po návrate tela do normálu sa hmotnosť mačky rýchlo zvyšovala a neustále narastala i po ukončení liečby, až kým sa neustálila okolo 7,2 kg.

RT-PCR ascitu ukázala vysokú nalož FCoV (Ct hodnota 21,73). Výsledky laboratórnych testov ukázali zvýšené hladiny bielych krviniek (WBC) a neutrofilných granulocytov (Neu), čo naznačuje závažný zápal (tabuľka 1). Okrem toho došlo k zmene imunitnej reakcie: hladina lymfocytov (Lym%) sa významne znížila, čo naznačuje vírusom spôsobené vyčerpanie lymfocytov. Vzhľadom na hnačky a dýchacie ťažkosti mačky sa testoval SAA (marker zápalu a poškodenia tkaniva) (obr. 2A). Pacient dostal vrámci podpornej terapie fyziologický roztok a bielkoviny. Vzhľadom na klinický stav veterinár odporúčal pre mačku eutanáziu alebo experimentálny liek GS-441524. Vzhľadom na vysokú cenu liečby GS-441524 sa majitelia mačky rozhodli hľadať iné možnosti terapie.

NázovDeň 0Deň 30Referenčný rozsahJednotky
Leukocyty (WBC)44.813.855.5-19.510^9/L
Neutrofilné granulocyty (Neu%)94.176.238-80%
Lymfocyty (Lym%)2.217.212-45%
Monocyty (Mon%)2.32.61.00-8.00%
Eosinofily (Eos%)1.43.91.00-11.00%
Basofily (Bas%)00.10.00-1.20%
Neutrofilné granulocyty (Neu#)42.1610.563.12-12.5810^9/L
Lymfocyty (LYM#)0.982.380.73-7.8610^9/L
Monocyty (Mon#)1.040.360.07-1.3610^9/L
Eosinofily (Eos#)0.620.540.06-1.9310^9/L
Basofily (Bas#)00.010.00-0.1210^9/L
Erytrocyty (RBC)5.837.234.62-10.2010^12/L
Hemoglobín (HGB)8511785.0-153.0g/L
Hematokrit (HCT)24.834.626.00-47.00%
Stredný objem erytrocytov (MCV)42.547.938.00-54.00fL
Stredné množstvo hemoglobínu v erytrocyte (MCH)14.616.111.89-18.00pg
Stredná koncentrácia hemoglobínu v erytrocytoch (MCHC)342337290.0-360.0g/L
Šírka distribúcie erytrocytov – variačný koeficient (RDW-CV)20.6166.50-23.00%
Šírka distribúcie erytrocytov – štandardná odchýlka (RDW-SD)40.535.519.30-43.10fL
Trombocyty (PLT)187333100.0-518.010^9/L
Stredný objem trombocytov (MPV)1111.79.90-16.30fL
Šírka distribúcie trombocytov (PDW)10.214.712.00-17.50 
Doštičkový hematokrit (PTC)0.210.390.09-0.70%
Tabuľka 1. Laboratórne údaje týkajúce sa monitorovania liečby FIP

Opatrovateľ mačky hľadal pomoc v tradičnej čínskej medicíne. Vzhľadom na infekciu mačacím koronavírusom a dýchacie ťažkosti mu doporučili kapsulu LH, ktorá bola predpisovaná na liečbu chorôb dýchacieho systému a schválená Národnou komisiou pre zdravie zvierat na liečbu covid-19. FCoV a SARS-CoV-2 zdieľajú čiastočne identitcké sekvencie RNA, preto je pravdepodobné, že antivirotiká zamerané na SARS-CoV-2 budú účinné aj proti FCoV.

Obrázok 2. A,B,C. Hodnota SAA v deň 0 je 21,93 mg/l <0,5 mg/l v deň 30. D, Opuch brucha a ascites v deň 0. E, ascites zmizol v deň 21.

17. novembra 2020 začal „Big Tangerine“ dostávať kapsule LH (Tabuľka 2) trikrát denne 4 kapsuly (0,35 g na kapsulu) v kombinácii s antipyretikami; neboli pozorované žiadne nežiadúce účinky. O 24 hodín neskôr (18. novembra, 1. deň) došlo k zmierneniu dýchavičnosti. V tom čase dostával tekutú stravu pre svoju pokračujúcu anorexiu a hnačky. 48 hodín po užití lieku (19. novembra, 2. deň) bol stav pacienta do značnej miery stabilizovaný a objavila sa prvá mäkká stolica; zlepšil sa aj jeho duševný stav. Dokázal si sadnúť, olizovať si srsť, kým pred pár dňami ešte ležal na zemi a lapal po dychu. 3 dni po zahájení liečby (20. novembra) začal samostatne jesť (aj keď v malom množstve). Počas nasledujúcich 7 dní liečby sa jeho chuť do jedla zlepšila a výpotok sa začal zmenšovať. Počas tejto doby mal mäkkú stolicu. Začiatkom decembra bol kocúr podrobený palpačnému vyšetreniu, ktoré ukázalo, že výpotok takmer úplne zmizol. Ako je znázornené na obrázku 1, so zmiznutím ascitu sa odhadovalo, že je asi o 1,5 kg ľahší, čo bola najnižšia hmotnosť počas celej liečby. 2. decembra všetky príznaky ustúpili. Kocúr začal behať a hrať sa s ostatnými mačkami.

IngredienciaKomponent%
Forsythia suspensa (Zlatovka previsnutá)Sušený plod12.7
Lonicera japonica (Zemolez japonský)Sušený kvetný púčik alebo kvet12.7
Ephedra sinica (Chvojník čínsky)Sušená bylinná stonka4.2
Isatis indigotica (Boryt barvířský)Sušený koreň12.7
Pogostemon cablin (Pačuli všeobecná)Sušená nadzemná časť4.2
Rheum palmatum (Rebarbora dlanitá)Sušený koreň a oddenka2.5
Glycyrrhiza uralensis (Sladovka uralská)Sušený koreň a oddenka4.2
Dryopteris crassirhizomaSušené oddenky a lístky12.7
Rhodiola crenulata (Rozchodnica)Sušený koreň a oddenka4.2
Houttuynia cordata (Hutínia)Sušená nadzemná časť12.7
Prunus sibirica (Marhuľa sibírska)Sušené zrelé semeno4.2
gypsumCaSO4·2H2O12.7
1-mentholC10H20O0.4
Tabuľka 2. Zloženie kapsuly (granuly) Lianhuaqingwen
* Kapsuly LH boli vyrobené na základe liekopisu Čínskej ľudovej republiky.

Výsledok a následné kroky

Pacient pokračoval v užívaní kapsúl LH každý deň až do 9. decembra. Liečebné obdobie trvalo 3 týždne a príznaky sa po vysadení lieku nevrátili. 3. januára bol vyšetrený na klinike pre domáce zvieratá v Guaiguai a jeho krvný obraz a hladina SAA už boli v normálnom rozmedzí, okrem celkového proteínu (8,2 g/dl, normálne 5,4 až 8,2) a močoviny (42 mg/dl, normálne 10-30). (tabuľka 3 a obrázok. 2). Vzorky boli následne testované pomocou FCoV RT-PCR s negatívnym výsledkom, čo znamená, že vírusová nálož FCoV bola nižšia ako limit detekcie. Do predloženia správy (17. marca) sa už príznaky FIP neopakovali.

NázovDeň 30Referenčný rozsahJednoty
Albumín ALB42.2-4.0g/dL
Alkalická fosfatáza ALP3810-90U/L
Alanínaminotransferáza ALT6020-100U/L
Amyláza AMY1082300-1100U/L
Celkový bilirubín TBIL0.50.1-0.6mg/dL
Urea BUN4210.0-30.0mg/dL
Vápnik CA11.78.0-11.8mg/dL
Fosfor PHOS4.53.4-8.5mg/dL
Kreatinín CRE1.50.3-2.1mg/dL
Glukóza GLU10170-150mg/dL
NA+146142-164mmol/L
K+43.7-5.8mmol/L
Celková bielkovina TP8.25.4-8.2g/dL
Globulín GLOB4.21.5-5.7g/dL
Tabuľka 3: Laboratórne hodnoty po liečbe FIP

Diskusia

FIP je smrteľné ochorenie u mačiek spôsobené FCoV, ktorý číha v črevnom systéme. FIP je stále terminálne ochorenie s premenlivou dobou úmrtia, viac ako 95% mačiek mačiek uhynulo niekoľko dní až mesiacov po stanovení diagnózy [9]. Príznaky FIP u mačiek majú dve formy: suchú a vlhkú[10]. Najvýraznejším príznakom vlhkej FIP je výpotok v brušnej a hrudnej dutine [11]. Na zmiernenie príznakov sú používané glukokortikoidy, ako je prednizolón. Po diagnostikovaní ascites FIP, veterinárny lekár možno odporučí eutanáziu, pretože existuje len málo prípadov úspešnej liečby.

V súčasnosti existuje niekoľko účinných terapií. Napríklad nedávno bola publikovaná úspešná liečba FIP pomocou GS441524 [12], GC376 [13] alebo perorálneho analógu adenozínového nukleozidu [14]. GS441524 v kombinácii s antibiotickou liečbou, odporúčaný mnohými veterinárnymi lekármi, preukázal dobrý terapeutický účinok. GS441524 je prekurzor remdesiviru, ktorý sa používal pri liečbe COVID-19. Doba liečby liekom GS441524 trvá 1-3 mesiace, čo môže v Číne znamenať približne 5000 až 9000 dolárov. Bohužiaľ, kvôli cene a dostupnosti (GS441524 ešte nie je oficiálne schálený), sa veľa majiteľov mačiek vzdáva možnosti tejto osvedčenej a účinnej liečby.

V tomto prípade sa veterinár obával, že bez použitia GS441524 mačka neprežije ani týždeň. Majitelia mačky dúfali, že nájdu inú terapiu. LH kapsula, čínsky patentový liek zložený z 13 bylín, je bežne používaný širokospektrálny antivírusový liek vyvinutý na zíklade tradičnej čínskej medicíny [15]. Používa sa na liečbu série chrípkových vírusov, ako je vírusová nádcha, zápal pľúc a pod. [16, 17] Farmakologické a klinické štúdie preukázali, že môže významne zmierniť zápalovú reakciu inhibíciou replikácie vírusu a znížením uvoľňovania cytokínov z hostiteľských buniek. [17]. Je tiež odporúčaný ako jeden z podporných liekov pri liečbe COVID-19 [6, 18, 19]. Preto sme sa pokúsili použiť tento liek na zmiernenie zápalovej reakcie a symptómov spôsobených FIP. Prekvapivo už počas prvého týždňa liečby došlo k výraznému každodennému zlepšeniu. Preto sme tento prípad podrobne zaznamenali pre vedecké účely.

Je potrebné zmieniť niekoľko silných stránok tejto prípadovej štúdie. Po prvé, je to lacný a ľahko dostupný liek pre majiteľov mačiek, na čom môže benefitovať viac mačiek. Najmä v Číne, kde populácia domácich miláčikov poslednom desaťročí prudko vzrástla, zatiaľ čo súčasné kliniky pre domáce zvieratá nemajú dostatočné kapacity na to, aby uspokojili potreby lekárskej starostlivosti o domáce zvieratá. Mnoho domácich miláčikov musí čeliť eutanázii, pretože ich majitelia si nemôžu dovoliť drahé lieky. Po druhé, LH začne účinkovať do týždňa a FIP vylieči asi za mesiac, kým odporúčané trvanie podávania GS-441524 je 84 dní.

Aj keď rozhodnutie o podaní LH bolo založené na zhoršení klinického stavu mačky a dosiahnutých optimistických výsledkoch pouźitia LH, mali by sme s ním zaobchádzať opatrne. Na stanovenie bezpečnosti a účinnosti LH pri liečbe mačacích infekcií mačiek sú potrebné ďalšie štúdie. Je pozoruhodné, že hoci vzorky boli negatívne na FCoV, hodnoty TP a BUN boli o niečo vyššie ako normálna hodnota. Zatiaľ si nemôžeme byť istí, či príčinou boli kapsule LH alebo vírus. Doterajšie klinické štúdie neukázali, či kapsula LH má vedľajšie účinky spôsobujúci poškodenie pečene u človeka. Je zrejmé, že je potrebný ďalší výskum a dáta o hladine BUN v budúcich prípadoch. Aby sme zistili, či sa nejednalo len o ojedinelý prípad, pokusnú liečbu absolvovali aj 3 ďalšie mačky a všetky sa asi po mesiaci zotavili. Z dôvodu neúplných údajov o testoch niektorých mačiek sme ich mohli uviesť iba v doplňujúcich materiáloch.

Závery

Pokiaľ je nám známe, jedná sa o prvý prípad použitia prírodných produktov na zvrátenie (alebo klinické vyliečenie) mačky s FIP. Je potrebná štúdia s viacerými mačkami absolvujúcimi tento liečebný protokol.

Skratky

FCoV: mačací koronavírus;
FIP: Infekčná peritonitída mačiek
Kapsula LH: kapsula Lianhuaqingwen
TCM: Tradičná čínska medicína

Referencie

  1. Pedersen NC, Sato R, Foley JE, Poland AM. Common virus infections in cats, before and after being placed in shelters, with emphasis on feline enteric coronavirus. Journal of feline medicine and surgery. 2004;6(2):83-88.
  2. Felten S, Hartmann K. Diagnosis of Feline Infectious Peritonitis: A Review of the Current Literature. Viruses. 2019;11(11).
  3. Rissi DR. A retrospective study of the neuropathology and diagnosis of naturally occurring feline infectious peritonitis. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 2018;30(3):392-399.
  4. Kim Y, Shivanna V, Narayanan S, et al. Broad-spectrum inhibitors against 3C-like proteases of feline coronaviruses and feline caliciviruses. Journal of virology. 2015;89(9):4942-4950.
  5. Ko WC, Rolain JM, Lee NY, et al. Arguments in favour of remdesivir for treating SARS-CoV-2 infections. International journal of antimicrobial agents. 2020;55(4):105933.
  6. Runfeng L, Yunlong H, Jicheng H, et al. Lianhuaqingwen exerts anti-viral and anti-inflammatory activity against novel coronavirus (SARS-CoV-2). Pharmacological research. 2020;156:104761.
  7. Zhang ZJ, Morris-Natschke SL, Cheng YY, Lee KH, Li RT. Development of anti-influenza agents from natural products. Medicinal research reviews. 2020;40(6):2290-2338.
  8. Hu K, Guan WJ, Bi Y, et al. Efficacy and safety of Lianhuaqingwen capsules, a repurposed Chinese herb, in patients with coronavirus disease 2019: A multicenter, prospective, randomized controlled trial. Phytomedicine : international journal of phytotherapy and phytopharmacology. 2020:153242.
  9. Dickinson PJ, Bannasch M, Thomasy SM, et al. Antiviral treatment using the adenosine nucleoside analogue GS-441524 in cats with clinically diagnosed neurological feline infectious peritonitis. Journal of veterinary internal medicine. 2020;34(4):1587-1593.
  10. Hartmann K. Feline infectious peritonitis. The Veterinary clinics of North America Small animal practice. 2005;35(1):39-79, vi.
  11. Giori L, Giordano A, Giudice C, Grieco V, Paltrinieri S. Performances of different diagnostic tests for feline infectious peritonitis in challenging clinical cases. The Journal of small animal practice. 2011;52(3):152-157.
  12. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, et al. Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. Journal of feline medicine and surgery. 2019;21(4):271-281.
  13. Pedersen NC, Kim Y, Liu H, et al. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. Journal of feline medicine and surgery. 2018;20(4):378-392.
  14. Sharun K, Tiwari R, Dhama K. Protease inhibitor GC376 for COVID-19: Lessons learned from feline infectious peritonitis. Annals of medicine and surgery (2012). 2021;61:122-125.
  15. Addie DD, Curran S, Bellini F, et al. Oral Mutian®X stopped faecal feline coronavirus shedding by naturally infected cats. Research in veterinary science. 2020;130:222-229.
  16. Ding Y, Zeng L, Li R, et al. The Chinese prescription lianhuaqingwen capsule exerts anti-influenza activity through the inhibition of viral propagation and impacts immune function. BMC complementary and alternative medicine. 2017;17(1):130.
  17. Liu L, Shi F, Tu P, et al. Arbidol combined with the Chinese medicine Lianhuaqingwen capsule versus arbidol alone in the treatment of COVID-19. Medicine. 2021;100(4):e24475.
  18. Duan ZP, Jia ZH, Zhang J, et al. Natural herbal medicine Lianhuaqingwen capsule anti-influenza A (H1N1) trial: a randomized, double blind, positive controlled clinical trial. Chinese medical journal. 2011;124(18):2925-2933.
  19. Ren JL, Zhang AH, Wang XJ. Traditional Chinese medicine for COVID-19 treatment. Pharmacological research. 2020;155:104743.
Prečítať “Rýchla liečba ťažkej FIP pomocou prírodných produktov”

Mačací koronavírus a FIP u nedomestikovaných druhov mačiek

1.4.2021, Preklad 8.5.2021
Stout, Alison E., André, Nicole M., and Whittaker, Gary R.
Pôvodný článok: FELINE CORONAVIRUS AND FELINE INFECTIOUS PERITONITIS IN NONDOMESTIC FELID SPECIES

Abstrakt

Mačací koronavírus (FCoV) je hlásený po celom svete a je známe, že spôsobuje ochorenie domestikovaných i nedomestikovaných druhov mačiek. Aj keď FCoV často vedie k miernemu či subklinickému ochoreniu, malá podskupina mačiek podľahne smrteľnej systémovej chorobe, mačacej infekčnej peritonitíde (FIP). Vypuknutie FIP u gepardov (Acinonyx jubatus) v zoologickej zbierke upozornilo na zničujúci účinok zavlečenia FCoV do skupiny zvierat. Okrem gepardov bola FIP zaznamenaná aj u európskych divých mačiek (Felis silvestris), tigra (Panthera tigris), leva horského (Puma concolor) a leva (Panthera leo). Tento článok je prehľadom hlásených prípadov FIP u nedomestikovaných druhov mačiek a upozorňuje na FCoV v populáciách nedomestikovaných mačiek.

Úvod

Infekčné choroby predstavujú významné nebezpečenstvo pre zachovanie voľne žijúcich živočíchov.74 Fragmentácia pôdy predstavuje potenciál pre umožnenie vzniku oblastí s vyššou hustotou populácie zvierat v prirodzených biotopoch, ako je obvyklé, a rozširovanie miest môže zvýšiť interakciu divých mačkovitých šelem s domácimi mačkami.15 Nedávno pandémia COVID-19 upozornila i na nedomestikované mačkovité šelmy, keď bol koronavírus SARS-CoV-2 prvýkrát zistený u tigra (Panthera tigris) v zoologickej záhrade v Bronxe v New Yorku, NY, s následnými prípadmi diagnostikovanými u iných mačiek chovaných v zajatí v tej istej zoo; 122 hoci sa stav týchto zvierat od diagnózy zlepšil, koronavírusy zostávajú predmetom záujmu o zdravie mačiek v domácom aj nedomácom prostredí.

Infekcie mačacím koronavírusom sú v populácii domácich mačiek v súčasnosti výrazne rozšírené. 17 U väčšiny domácich mačiek je ochorenie buď asymptomatické, alebo sa prejavuje ako samolimitujúca mierna hnačka. 83 U malej podskupiny mačiek však dochádza k „vnútornej mutácii“, ktorá vedie k tropizmu makrofágov46, pričom tieto mačky podľahnú systémovému ochoreniu známemu ako FIP. 9,60,99 FCoV klasifikovaný ako alfacoronavírus (druh alfacoronavírus-1) možno rozdeliť do dvoch biotypov: benígny mačací enterický koronavírus, alebo vírus smrteľnej infekčnej peritonitídy mačiek (FIPV) .82 Ďalej je možné vírus klasifikovať podľa sérotypu ako mačací koronavírus typu I alebo typu II.52 Tieto vírusové typy sa pôvodne rozlišovali na základe odlišnej protilátkovej odpovede, ale v poslednej dobe sa navrhuje, aby boli považované za odlišné genetické kmene na základe ich spike glykoproteínov.68 Vírusy typu II sú pri prírodných infekciách omnoho menej bežné, napriek tomu sa ľahšie izolujú a množia v systémoch bunkových kultúr, a tak boli charakterizované podrobnejšie. Vírus typu II sa považuje za odvodený z dvojitej homológnej rekombinácie medzi pôvodným typom FCoV a psím koronavírusom.46

Vírusový spike (hrotový) proteín je hnacím mechanizmom bunkového tropizmu a patogenézy. Je známe, že FCoV receptorom typu II je mačacia aminopeptidáza (fAPN), 114 kým vírusy typu I majú odlišný a zatiaľ neznámy receptor. 21 Ďalšia vlastnosť rozlišujúca medzi týmito dvoma vírusovými typmi spočíva v procese aktivácie fúzie, vírus typu I obsahuje dva proteolytické aktivačné body(v miestach S1/S2 a S29), kým vírus typu II má jediný štiepny bod S29.52 Aj keď je známe, že oba sérotypy spôsobujú FIP, zostáva veľa otázok, pokiaľ ide o prirodzené správanie každého z nich, a o reakciu hostiteľa na infekciu.

LokáciaRokSéroprevalenciaReferencie
Južná Afrika1977–19781.1251
19823.528,45
19890/40a105
1999–2001105/10757
Serengeti/ Tanzánia19858.258,45
24/3926
Keňa19854.128,25,45
Namíbia1999–200119/3957
1992–199821/7272
2002–20043/88b113
Botswana2008–20112.611
Winston, Oregon (epidémia)Pred júnom 19820/258,45
198335/358,45
198516/168,45
Severná Amerika198631/908,45
198749/918,45
198942/10226
1990106/16426
199124/3926
Anglicko19851.128,25,45
Tabuľka 1. Séroprevalencia FCoV u gepardov voľne sa pohybujúcich, i v zajatí.
a) Spárované vzorky celkovo 40 zvierat (80 vzoriek).
b) Došlo k opakovanému odberu vzoriek

Protilátkové reakcie proti FCoV typu I i typu II boli hlásené u mačiek v zajatí v Spojených štátoch, pričom správy špecificky uvádzajú reakciu proti FCoV typu I u gepardov, afrických levov (Panthera leo) a bengálskych tigrov (Panthera tigris tigris). ), a reakciu proti FCoV typu II u gepardov, jaguára (Panthera onca), afrického leva, bengálskych tigrov, rysov (Lynx canadensis), leopardov snežných (Panthera uncia) a leopardov afrických (Panthera pardus pardus) .56 V niektorých prípadoch sa FCoV typu II považuje za prenosnejší v porovnaní s vírusom typu I u domácich druhov mačiek, 123 aj keď kvôli prítomnosti oboch typov vírusov v študovanom zariadení sa to nepodarilo potvrdiť. Situácia u divých mačiek nie je známa.

Klinicky sa u mačiek vyskytujú dve klasické formy ochorenia, a to efúzna alebo neefúzna („vlhká“ alebo „suchá“). Vlhká forma FIP je charakterizovaná výpotkom v brušnej alebo hrudnej dutine, alebo obidvoch, či v perikardiálnych dutinách a suchá forma prítomnosťou pyogranulomatóznych lézií. Klinické príznaky spojené s biotypom FIPV však môžu byť dosť variabilné a nešpecifické. FCoV a FIP zostali významnou globálnou výzvou. Očkovanie sa neodporúča, čiastočne kvôli obavám z negatívnych výsledkov v dôsledku zosilnenia infekcie závislej od protilátok v prítomnosti neneutralizujúcich protilátok.125 Napriek sľubným počiatočným štúdiám 73,84 a ďalším možnostiam liečby stále nie sú k dispozícii schválené antivírusové terapie. Prevencia je zložitá a predsmrtná diagnostika je náročná. Súčasné metodológie PCR a sérologického testovania nerozlišujú medzi patologickými formami vírusu a titre protilátok sú nepredvídateľné. U mačacích populácií je vylučovanie FCoV často pozorované u zvierat, ktoré nie sú FIP pozitívne. Rovnako tak titre protilátok poskytujú iba dôkaz o predchádzajúcej expozícii a u domácich mačiek negatívny test na protilátky nevylučuje možnosť vylučovania FCoV.29 V závislosti na stanovení protilátok môže senzitivita a špecificita poskytnúť variabilnú pomoc pri diagnostike FIP, ako už zistili Felten a Hartmann.28 Zlatým štandardom pre diagnostiku FIP v súčasnosti zostáva imunohistochémia (IHC).28 Pri manažmente druhov chovaných v zajatí môže byť zvládnutie vírusu problematické, neistotu vnášajú aj obmedzené referenčné rozsahy analýzy krvi, scenáre vysokého stresu a možné nové prezentácie.

FIP a FCoV u nedomestikovaných druhov

Gepard (Acinonyx jubatus): V roku 1979 Horzinek a Osterhaus51 prvýkrát demonštrovali sérologickú odpoveď na FCoV u gepardov (tabuľka 1). V roku 1982 náhle vyšlo najavo, že gepardi môžu podľahnúť rovnakému závažnému ochoreniu ako domáce mačky infikované FCoV, keď došlo k prepuknutiu FIP u gepardov chovaných v zajatí v zoologickom parku vo Winstone v Oregone. 27,88 Prvý jedinec (8,5 roka stará samica) bola nedávno uvedená do stáda a mala nešpecifické príznaky choroby vrátane letargie, nechutenstva, dehydratácie, horúčky a ikteru s hematokritom 30%, hyperproteinémiou (9,1g/dl), leukocytózou a azotémiou.88 Pri posmrtnom vyšetrení bol prítomný ascites spolu s fibrinóznymi léziami priľahlými k brušným orgánom a tekutinou v hrudnej dutine.88 Vo viacerých orgánoch bola zaznamenaná petechiácia.88 V nasledujúcich mesiacoch, ktoré uplynili medzi týmto počiatočným prípadom a ďalšími prípadmi FIP, bola u iných gepardov pozorovaná občasná hnačka.27 Patológia vzoriek tkaniva od ďalších zvierat, ktoré uhynuli na FIP, odhalila multifokálne nekrotické lézie postihujúce brušné orgány (pečeň, obličky, slinivku, slezinu), lymfatycké uzliny a štítnu žľazu. Boli tiež pozorované erózie na tvári a ulcerózna glositída.27 Aj keď nie je možné vylúčiť kalicivírus, ktorý tiež spôsobuje tieto ulcerácie, je k dispozícii aj rad nedávnych prípadov s ľudskými pacientmi s COVID-19, u ktorých boli zaznamenané vredy jazyka v dôsledku infekcie.94 Longitudinálne sérologické monitorovanie po uvedení prvého prípadu FIP geparda preukázalo sérokonverziu a do roku 1983 každý gepard v parku bol sérologicky pozitívny.6,27,45 Počas tejto epidémie takmer 60% gepardov podľahlo FIP.25,45 Raná charakterizácia izolátu z geparda zahŕňala naočkovanie niekoľkých bunkových línií, vrátane mačacích obličkových buniek Crandall-Rees (CRFK), plodových buniek Felis catus-4 ( FCWF-4) a dvoch gepardích bunkových línií odvodených z obličiek (AjuKid234) alebo fibroblastov (AjuFib238).24 CRFK bunky vykazovali po naočkovaní gepardím izolátom podobné vlastnosti v porovnaní s dvoma kmeňmi FCoV typu I, zatiaľ čo bunky FCWF-4 boli voči izolátu menej permisívne. Naprieč gepardími bunkovými líniami bola prenosnosť buniek AjuKid234 nízka.24

Ďalšie prípady FIP boli popísané aj vo vrhu troch ulovených, približne 6-mesačných divokých gepardov, súčasne infikovaných Toxoplasma gondii.119 Údaje z klinickej patológie odhalili hypochrómnu anémiu, neutrofíliu, lymfopéniu a eozinopéniu s normálnou celkovou bielkovinou, ale zvýšeným alfa-2 globulínom a gama globulínmi.119 Okrem fibrinóznej peritonitídy a lézií ovplyvňujúcich brušné orgány boli zaznamenané aj edémy pľúc a krv v žalúdku.119 V tejto správe autori poukazujú na nedostatočnú stravu; ďalšie predisponujúce faktory však mohli zahŕňať stres z premiestnenia a genetickú predispozíciu.119 V patologickom výskume 31 mŕtvych gepardov chovaných v zajatí v Severnej Amerike sa FIP považovala za príčinu smrti u dvoch zvierat.71 Aj keď sa FIP nepopierateľne považovala za smrteľnú chorobu domácich mačiek, uvažovalo sa o mnohých hypotézach, vďaka ktorým boli gepardi obzvlášť náchylní na FIP, vrátane genetickej kontroly imunitnej odpovede, najmä rovnorodosti majoritného komplexu histokompatibility (MHC). 25,79 Analýza vírusu infikovaných gepardov preukázala mutácie delécie v géne 7a, aj keď je zaujímavé, že u geparda s FIP boli gény 7a aj 7b neporušené.58 Od prvého zaznamenaného prípadu FIP u geparda zostáva choroba sporadická aj napriek dôkazom o expozícii. Po počiatočných ohniskách epidémie FIP u gepardov neboli pozorované ďalšie ničivé straty, hoci výskum pokračuje aj naďalej.

Po vypuknutí FIP v Oregone monitorovanie FCoV odhalilo bežnú protilátkovú odpoveď na vírus (tabuľka 1). Pri prvotných vyšetreniach sa ukázalo, že vylučovanie stolice a titre protilátok sú často nezhodné.45 V štúdii s chovanými a voľne žijúcimi juhoafrickými gepardmi bola celková pozorovaná séroprevalencia 57% (169/298) v porovnaní s 36% (66/182) u tých, ktorí vylučovali vírusový antigén, hodnotený pomocou vnorenej polymerázovej reťazovej reakcie s reverznou transkripciou (RT/nPCR).57 U 49 zvierat, ktoré vylučovali vírusový antigén, 46 preukázalo protilátkovú odpoveď proti FCoV typu I, 45 vykazovalo protilátkovú odpoveď proti FCoV typu II a tri nevykazovali žiadnu protilátkovú odpoveď.57 Či bola táto vysoká séroprevalencia proti FCoV typu I aj II spôsobená množstvom cirkulujúcich vírusov, krížovou reaktivitou alebo iným faktorom, zostáva neznáme, ale tento nález je jedinečný. U juhoafrických gepardov, ktoré boli pozorované longitudinálne (n¼48), takmer pätina (n¼10) vylučovala antigén vo viac ako jednom časovom bode, a to aj po negatívnom teste po pozitívnom teste.57 V sérologickom výskume Munson a kol. v Namíbii72 boli častejšie séropozitívni samci, pričom séroprevalenciu vykazovalo 5/14 (36%) juvenilných samcov v porovnaní s 0/8 juvenilnými samicami a 13/37 (35%) dospelých samcov v porovnaní s 3/13 (23%) dospelými samicami.

Životný štýl a rizikové faktory voľne sa pohybujúcich druhov a druhov chovaných v zajatí sa môžu líšiť v závislosti od choroby. V štúdii medzi gepardmi v zajatí v Spojených štátoch tri z 22 zdravých gepardov vylučovali vírusový antigén (RT/nPCR) (tabuľka 2) .55 Z troch zvierat vylučujúcich vírusový antigén bolo jedno zviera pozitívne na protilátky proti FCoV typu I a ďalšie dve boli séronegatívne.55 U ďalších 19 zvierat bola protilátková odpoveď stanovená u 15 zvierat, z ktorých 10 nevykazovalo žiadne protilátky, štyri zvieratá boli séropozitívne proti vírusu typu I a jedno zviera bolo séropozitívne proti vírusom typu I i typu II.55 Avšak v ďalšej štúdii na 10 gepardoch, ktorí vírus nevylučovali, boli protilátky bežne proti vírusu typu II (5/10) v porovnaní s typom I (4/10) alebo oboma (1/10). Nesúlad v reakcii špecifických protilátok môže byť spôsobený zmenami v stratégiách riadenia, sezónnymi výkyvmi alebo rozdielmi v zaobchádzaní so vzorkami. Okrem toho rozdiely medzi protilátkovou odpoveďou a vylučovaním stolice predstavujú výzvu týkajúcu sa skutočného stavu choroby zvieraťa, a to tak u gepardov v zajatí, ako aj u divokých gepardov. S cieľom poskytnúť postup pri stratégii testovania boli počas 30 dní v USA odobraté vzorky fekálií od 25 gepardov v zajatí.38 Z týchto vzoriek fekálií bol vírusový antigén nájdený u 13% (4/31 vzoriek) vzoriek výkalov od jedného zvieraťa až po 93% (26/28 vzoriek) vzoriek od jedného zvieraťa.38

Bežný názovRodový druhFrekvencia antigénuReferencie
Mačka divá európskaFelis silvestris5/1544
Mačka divá africkáFelis lybica0/257
Mačka čiernonoháFelis nigripes0/157
Puma americkáPuma concolor0/2037
Mačka jaguarundiPuma yagouaroundi0/1637
  0/143
GepardAcinonyx jubatus22/9045
  66/18257
  3/2255
Mačka bengálskaPrionailurus bengalensis3/3412
Rys španielskyLynx pardinus0/2567
  0/6865
Rys ostrovidLynx lynx0/2102
OcelotLeopardus pardalis0/843
  0/2137
  0/1a62
MargayLeopardus wiedii0/1443
  0/737
Mačka pampováLeopardus colocolo0/2237
Mačka maloškvrnnáLeopardus [Oncifelis] geoffroyi0/143
  0/637
Ocelot stromovýLeopardus tigrinus0/2437
  0/2043
Rys karakalCaracal caracal0/257
Lev africkýPanthera leo0/157
Jaguár americkýPanthera onca0/6137
Leopard škvrnitýPanthera pardus0/257
Tabuľka 2. Detekcia antigénu FCoV u nedomestikovaných mačiek.
a) súčasť diagnostického vyšetrenia

Úloha perzistentných infekcií gepardov pri vývoji ulceróznej kolitídy a iných dlhodobých následkov zostáva pomerne nejasná a predstavuje potenciálnu oblasť pre potrebnú štúdiu.96,112 V roku 1993 Munson71 popísal u dvoch uhynulých gepardov s léziami charakteristickými pre FIP aj patologické zmeny v klkoch tenkého čreva u jedného zvieraťa (FIP nepovažoval za príčinu smrti ani u jedného geparda). Na vzorke deviatich gepardov s nekrotizujúcou kolitídou a hnačkou, ktoré vylučovali FCoV, šesť zvierat preukázalo protilátky len proti FCoV typu I, dve zvieratá vykazovali protilátky proti typu I aj typu II a jedno zviera nebolo pozitívne na protilátky žiadneho sérotypu.56 Ďalej sa FCoV diagnosticky hodnotila u mláďat gepardov vykazujúcich akútnu parézu zadných končatín, ale nepreukázala sa zjavná súvislosť so sérológiou a titre protilátok sa u jednotlivých zvierat v priebehu testovania menili.120,121 Ochorenie mačacej leukoencefalomyelopatie (LFL) u veľkých mačiek bolo rozpoznané u mnohých gepardov a dvoch ďalších druhov mačiek v Spojených štátoch. Pre ochorenie je charakteristická progresívna strata zraku, dezorientácia a ťažkosti s s príjmom potravy.7 V procese porozumenia etiológie LFL bolo 14 zvierat testovaných imunohistochemicky na FCoV, ale žiadne zvieratá v tejto malej podskupine sa neukázali ako pozitívne.7

Európska divá mačka (Felis silvestris): V roku 1993 Watt a kolegovia124 informovali o vypuknutí FIP u európskych divokých mačiek v uzavretej kolónii, ktorá existovala takmer 14 rokov a postihla iba samcov. Zaznamenali sa početné klinické príznaky spolu s multisystémovým orgánovým postihnutím vrátane pečene, obličiek, čreva, mozgu, pľúc, srdca a lymfatických tkanív.124 U dvoch mačiek boli zaznamenané respiračné príznaky.124 Nepodarilo sa zistiť, ako došlo k infikovaniu mačiek a považuje sa za nepravdepodobné, že by vírus mohla zavliecť túlavá mačka. To, či zdrojom kontaminácie mohol byť ošetrovateľ alebo ošetrovatelia v ZOO sa bližšie nezisťovalo. Taktiež sa nezistilo, či došlo k dlhodobému vylučovaniu vírusu. Je zaujímavé, že predchádzajúca štúdia McOrista a kol.64 nebola schopná identifikovať európske divé mačiatka ako sérologicky pozitívne na expozíciu FCoV nepriamym imunofluorescenčným testom (IFA) uskutočňovaným na plazme a namiereným proti kmeňu vírusu Wellcome (tabuľka 3). Najnovšie však Heddergott a kol.44 uviedli 47,1% (16/34) séroprevalencie vo vzorke 34 európskych divokých mačiek v Luxemburgu a zistil, že zvyšujúci sa vek je prediktorom stavu protilátok. Zo 16 séropozitívnych mačiek bolo 75% séropozitívnych na najmenej jednu ďalšiu bežnú mačaciu vírusovú infekciu (vírus mačacej leukémie, mačací parvovírus, mačací kalicivírus alebo mačací herpesvírus).44 Paradoxne, iná skupina európskych divých mačiek bola v Portugalsku séronegatívna (0/26), hoci tretina (5/15) fekálnych vzoriek bola pozitívnych na vírusový antigén (tabuľky 2, 3).19 Rozdiely v odbere a spracovaní vzoriek môžu vysvetliť niektoré nezrovnalosti; Medzi možné ďalšie rozdiely patria interakcie s domácimi a inými mačkovitými šelmami a povaha infekcií FCoV.

LokáciaRokSéroprevalenciaReferencie
Európska divá mačka (Felis silvestris), Škótsko1987–19890/2364
1992–19973/4914
Francúzsko1996–19972/5161
Luxembursko2001–201616/3444
Portugalsko1992–20070/2619
Puma americká (Puma concolor), USA1978–19914/21 (IFA) vs 0/32 (KELA)97a
1987–199016/5881
1990–200425/180b4
2005–20080/977
1990–200874/48033
BrazíliaUnknown3/5103
1998–20040/1830
Kanada1996–20010/1589
Lev africký(Panthera leo), Botswana2003–20050/2191
1992–200016/146b1
2008–20110/1411
2012–20140/1363
Namíbia1991–20015/2231
1999–200116/9857
Južná Afrika1987–19900/32106
1992–200043/3121
Tanzánia1984–1991177/311c47
Uganda1997–19990/1418
Zimbabwe1990–19980/411
Nemecko19890/1d116
Tabuľka 3. Séroprevalencia u nedomestikovaných druhov mačiek podľa krajiny a roku.
a) Felis concolor coryi.
b) Odhad zo stĺpcového grafu prezentovaného v štúdii.
c) Opakovaný odber vzoriek.
d) Súčasť diagnostického vyšetrenia.
IFA ¼ imunoflurescenčný test; KELA ¼ Kinetický enzýmovo viazaný imunosorbentný test.

Puma americká (Puma concolor): Bol popísaný prípad FIP u mladého samca pumy americkej, voľne sa pohybujúceho v Kalifornii, ktorý mal okrem zvačšených lymfatických uzlín tiež lézie v tenkom a hrubom čreve, srdci, pľúcach a mozgu. Je zaujímavé, že obličky sa javili histologicky normálne, ale vírusová RNA bola evidentná.108 Táto kazuistika je jedinečná pri demonštrácii FIP u voľne sa pohybujúceho zvieraťa, najmä u druhu, ktorý často žije osamelo. Riziko ďalších prípadov FIP u voľne sa pohybujúcich púm zostáva neznáme a ďalšie patogény, ako je zoonotické ochorenie Yersinia pseudotuberculosis, boli hlásené u púm s pyogranulomatóznymi léziami pečene a zápalu pobrušnice.3

Podľa sérologického výskumu kalifornských púm sa zdá, že séroprevalencia kolíše v období 18 rokov, počas ktorých sa odobrali vzorky.33 V roku 1992 boli odobraté iba tri vzorky, ale jedno zviera bolo pozitívne, zatiaľ čo v nasledujúcich 3 rokoch nebolo pozitívne žiadne zviera (n ¼46). Do roku 1996 začala séroprevalencia stúpať a vrchol dosiahla v rokoch 2000–2001 a po ďalšom období ochabovania dosiahla najvyššiu séroprevalenciu takmer 50% (n ¼ 29).33 Longitudálne údaje poskytnuté Foleym a kol.33 sú dôležité, pretože predchádzajúce roky nepredikujú budúcu séroprevalenciu. Dodatočná štúdia púm v Skalistých horách demonštruje vysoký stupeň korelácie medzi stavom protilátok u samíc a ich mláďat, a to aj vtedy, keď v čase odberu vzoriek boli mláďatá staré 4 mesiace alebo staršie.4 Štatistické modelovanie navyše naznačuje, že zvyšujúci sa vek a umiestnenie populácie sú rizikovými faktormi pre expozíciu FCoV.4 V Amerike boli hlásené aj ďalšie séroprevalencie (Tabuľka 3).

Tiger (Panthera tigris): FIP bola hlásená u 8-ročného samca tigra v zajatí v Rumunsku, u ktorého sa pôvodne prejavili nešpecifické klinické príznaky.49 Posmrtné vyšetrenie korešpondovalo s FIP a odhalilo uveitídu, výpotok v brušnej dutine a okrem perikarditídy aj seróznu tekutinu v perikardiálnom priestore.49 Farbenie makrofágov na FIP zodpovedalo diagnóze, pričom infikované makrofágy boli identifikované v pľúcach a iných tkanivách.49 Boli tiež zaznamenané depozity amyloidu.49 U mačiek s FIP došlo k zvýšeniu sérového amyloidu A, potenciálne podobne ako u ľudských pacientov so SARS-CoV-2,39,69 Je zaujímavé, že amyloidóza je často pozorovaná u mačiek čiernonohých (Felis nigripes); môžu teda existovať ďalšie hostiteľské faktory, ktoré vedú k prítomnosti amyloidových plakov u tigra.111 Napokon u tigra s FIP bola v slezine rozpoznaná skvapalnená nekróza, aj keď to nemusí byť špecifické pre infekciu FIP.49

Okrem opísaného prípadu FIP u tigra sa v prieskume talianskych zoologických záhrad v rokoch 2004 až 2015 zaznamenal jeden prípad peritonitídy u tigra; avšak to, či súvisel s infekciou FCoV, sa nepodarilo zistiť, a je to nepravdepodobné.101 Kompilácia dát o úmrtnosti tigrov chovaných v zajatí v Indii určila okrem enteritídy, gastritídy, gastroenteritídy, hepatitídy a žalúdočných vredov aj peritonitídu.107 Aj keď nebola zaznamenaná vírusová etiológia, choroby tráviaceho systému boli jednou z najbežnejších príčin úmrtnosti, a to aj počas monzúnového obdobia.107

U sibírskych alebo amurských tigrov (Panthera tigris altaica) bolo 43% zvierat (n ¼44) pozitívnych na prítomnosť protilátok FCoV (tabuľka 4).42 So séroprevalenciou nebolo spojené ani pohlavie, ani vek, aj keď longitudálny monitoring viedol k tomu, že sa tri ďalšie tigre stali séropozitívne.42 V jednej kazuistike sibírskeho tigra, ktorý podľahol morbillivírusovej infekcii, preukázala IFA prítomnosť protilátok proti FCoV, hoci to pravdepodobne neprispelo k úhynu zvieraťa.90 V kazuistike zajatého tigra amurského, ktorý sa pôvodne prezentoval s anorexiou a letargiou, bola IFA negatívna na FCoV; ďalšia diagnostika odhalila bakteriálny pyotorax.104 U iného sibírskeho tigra považovaného za klinicky zdravého bolo pozorované vylučovanie vírusu, ale bez protilátkovej odpovede.56

Z troch bengálskych tigrov umiestnených v tej istej inštitúcii vykazovali dva protilátkové reakcie na FCoV typu I aj typu II a tretí vykazoval protilátky proti typu II napriek tomu, že žiadne z týchto zvierat nevylučovalo vírusový antigén.56

Lev (Panthera leo): V roku 1970 Colby reportoval dva prípady FIP u levov.13 Aj keď táto počiatočná správa neposkytla žiadne klinické podrobnosti, v poslednej dobe bol opísaná očná forma FIP u 15-ročného leva v zajatí, u ktorej sa potvrdila slepota.75 Klinické patologické nálezy u pacienta vrátane anizocytózy a hypochromázie boli pre FIP nešpecifické, hoci PCV (HCT) bol na dolnej hranici normálu (31%) a celková plazmatická bielkovina na vyššej hranici normálu (7,8 g/dl), hodnoty bežne sa vyskytujúce u domácich pacientov s FIP.75 Histopatológia odhalila bilaterálnu panuveitídu a odlúčenie sietnice spolu s infiltrátom lymfocytov, plazmatických buniek a niekoľkých makrofágov.75 V prednej komore bol exsudát charakterizovaný ako eozinofilný a bielkovinový, a v mozgu sa našli lézie.75

U voľne sa pohybujúcich levov vo východnej Afrike bolo 57% vzoriek séra vyhodnotených ako dôkaz protilátkovej odpovede prostredníctvom IFA (tabuľka 3). 47 U afrického leva v zajatí sa už skôr pozorovalo vylučovanie FCoV, ale bez protilátkovej reakcie.56 Podobne dva ďalšie levy v rôznych inštitúciách aktívne vírus nevylučovali, ale vykazovali protilátkové odpovede.56,57 Je zaujímavé, že jeden z týchto levov vykazoval nízkoúrovňovú protilátkovú reakciu na FCoV typu I aj typu II.56. V prípade série levov s encefalitídou bol jeden lev testovaný na protilátky proti FCoV, ale javil sa negatívny.116 V štúdii “inbred” levov v porovnaní s “outbred” populáciou nebol vzťah medzi statusom príbuzenstva a protilátkami FCoV štatisticky významný.115 Longitudinálna štúdia levov v Serengeti preukázala každý rok vysoký stupeň variability, pokiaľ ide o séroprevalenciu, najmä u mladších zvierat.80 Tieto údaje navyše odhalili možné účinky na plodnosť a možnú súvislosť šírenia vírusu a vyššej hustoty populácie.80 Druhá longitudinálna štúdia ukázala vysoký stupeň séroprevalencie; vo väčšine vekových skupín viac ako 50% zvierat demonštrovalo séroprevalenciu a trend rastúcej séroprevalencie so zvyšujúcim sa vekom, až na niekoľko výnimiek34 (doplňujúce údaje zo štúdie). Séroprevalencia FCoV môže navyše predikovať výskyt kalicivírusu alebo vírusu mačacej imunodeficiencie (FIV).34

Bežný názovRodový druhSéroprevalenciaReferencie
Mačka púšťováFelis margarita0/151
ManulOtocolobus manul0/376
  0/6a59
Mačka amurskáPrionailurus bengalensis euptilura0/151
  0/241
Mačka iriomotskáPrionailurus bengalensis iriomotensis14/1770
Mačka plochočeláPrionailurus planiceps0/151
JaguarundiPuma yagouaroundi0/131
  0/1103
OcelotLeopardus pardalis1/1103
  1/130
  0/1031
  0/1235
MargayLeopardus wiedii0/151
  4/4103
Pampas catLeopardus colocolo1/1103
Mačka pampováLeopardus geoffroyi0/931
  1/40118
Ocelot stromovýLeopardus tigrinus0/230
Rys karakalCaracal2/257
  3/3113
ServalLeptailurus serval0/251
JaguárPanthera onca3/4103
Leopard škvrnitýPanthera pardus0/151
  1/257
  0/7113
  0/411
Tiger sumatrianskyPanthera tigris sondaica0/151
Tiger ussurijskýPanthera tigris altaica19/4442
Leopard snežnýPanthera uncia0/2b32
Tabuľka 4. Séroprevalencia u ďalších nedomestikovaných druhov mačiek.
a) Imunodeficientné zvieratá zo Zoo. b) Súčasť diagnostického spracovania, ktoré zahŕňalo dve spárované vzorky.

Serval (Leptailurus serval): Juan-Salle´s a kol.54 reportujú dva prípady FIP v skupine štyroch spolu žijúcich servalov. Prípad 1, dvojročný samec, prestal vstupovať do vnútorného priestoru, kde boli zvieratá bežne kŕmené. Nebolo zistené, či príčinou boli neurologické zmeny chovania, alebo nechutenstvo. Prípad 2 bola 8-ročná samica s implantátom melengesterol-acetátu, s nešpecifickými klinickými príznakmi a miernou brušnou distenziou.54 Prieskumná laparotómia odhalila brušný výpotok a lézie podobné FIP a klinická patológia preukázala leukocytózu a anémiu. Aj keď v prípade 1 neboli hlásené žiadne rozsiahle lézie, histológia odhalila fibrinopurulentnú ventrikulitídu; akumuláciu neutrofilov, fibrínu a makrofágov v mozgu; a ťažkú leptomeningitídu. V obličkách boli prítomné ložiskové pyogranulomatózne lézie.54 V prípade 2 boli pyogranulomatózne lézie okrem pyogranulomatóznej nekrotizujúcej splenitídy prítomné aj v mezentériu, pečeni a žlčníku.54

Rys: VanRensburg a Silkstone119 zmieňujú osobnú komunikáciu o FIP, ktorá postihla najmenej jedného rysa červeného. Z 25 rysov červených v Národnej rekreačnej oblasti Golden Gate neďaleko San Francisca v Kalifornii bol sérologicky pozitívny na FCoV jediný mestský rys červený (tabuľka 5).95 U dvoch rysov červených žijúcich v zajatí v americkej zoologickej zbierke bolo zaznamenané vylučovanie FCoV napriek absencii protilátkovej odpovede.56 Podobne v druhej americkej zoologickej zbierke jeden zdravý rys v zajatí vylučoval FCoV pri absencii protilátkovej odpovede, zatiaľ čo druhý rys vírus nevylučoval, ale vykazoval nízkoúrovňovú protilátkovú odpoveď proti FCoV typu II.56

Rys španielsky (Lynx pardinus) bol kedysi považovaný za jednu z najohrozenejších divých mačkovitých šeliem, a ako také by riziká infekcie FCoV mohli byť devastujúce. V jednej štúdii o 22 rysoch španielskych hodnotených kompetitívnym enzýmovým imunosorbentným testom (ELISA) na séroprevalenciu a 25 zvieratách hodnotených pomocou IFA alebo rýchlou imunochromotografiou, žiadne zvieratá nevykazovali známky expozície alebo aktívnej infekcie FCoV.67. Ďalšie štúdie však ukázali séroprevalenciu približne 26%, bez zjavného vzťahu medzi FCoV a FeLV.65 V samostatnej vzorke rysa španielskeho bolo 19/74 pozitívnych na expozíciu FCoV IFA, hoci 0/68 zvierat vylučovalo vírus vo výkaloch, čo sa hodnotilo pomocou RT- PCR.65 U dvoch ďalších rysov ostrovidov, u ktorých nebolo možné určiť príčinu smrti, nebolo ani u jedného zvieraťa zistené, že je IHC pozitívne na FCoV, napriek pankreatitíde a fibrinóznej serozitíde u jedného z týchto zvierat.102 Bol skúmaný aj vplyv FCoV na vývoj ďalších chorobných patológií vrátane membránovej glomerulonefritídy a vyčerpania lymfoidných buniek, avšak v žiadnej štúdii sa nezistila zjavná súvislosť s rozvojom chorôb.53,86

DruhLokáciaRokSéroprevalenciaReferencie
Rys španielsky (Lynx pardinus)Španielsko1989–20000/3798
  2003–200719/7465
  2004–20060/2267
Rys otrovid (Lynx lynx)Holandsko1977–19780/151
 Švédsko1993–19990/102100
Rys kanadský (Lynx canadensis)Severná Amerika1993–200112/2155
 Kanada20000/589a
Rys červený (Lynx rufus)USA1992–19951/2595
  Neznámy0/1b87
Tabuľka 5. Séroprevalencia FCoV podľa druhovej príslušnosti rysa.
a) Uvedený ako rys. b) Súčasť diagnostického spracovania.

Leopard (Panthera pardus): FIP bola reportovaná aj u leopardov v Nemecku.117 U troch afrických leopardov v dvoch zoologických inštitúciách v USA nebolo pozorované vylučovanie FCoV, ale všetky tri boli sérologicky pozitívne proti FCoV typu II.56 Z ďalších dvoch afrických leopardov v južnej Afrike, iba jedno zviera bolo séropozitívne a žiadne nevylučovalo vírus (tabuľky 2, 4).57

Divoká mačka bengálska (Prionailurus bengalensis): V rokoch 2005 až 2006 bolo 35 z celkových 1453 vzoriek rektálneho výteru získaných z ázijských leopardích mačiek na trhoch s divočinou pozitívnych na nový koronavírus, z ktorého sa zistilo, že spike proteín je fylogeneticky podobný spike proteínom iných alfakoravírusov.16 Tento vírus však vykazoval fylogenetický vzťah mimo skupinu, čo naznačuje, že sa oddelil na začiatku evolučnej histórie koronavírusov, alebo pravdepodobne predstavoval neidentifikovanú skupinu koronavírusov. Novšia analýza naznačuje, že spike proteín má vzťah s novo identifikovaným rodom deltacoronavírusu.110 Podľa predbežne publikovaných výsledkov RT seminested PCR testu zameraného na vírusovú polymerázu, 8,8% (3/34) divokých bengálskych mačiek bolo pozitívnych na pankoronavírus, s blízkym fylogenetickým vzťahom k FCoV.12 U iriomotských mačiek, poddruhu (Prionailurus bengalensis iriomotensis), väčšina zvierat (14/17) testovaných metódou ELISA proti psím koronavírusom preukázala prítomnosť protilátky (tabuľky 2, 4).70

Leopard obláčikový (Neofelis nebulosa): V prieskume príčin mortality nedomestikovaných mačkovitých šelem v biologickom parku Nandankanan v Bhubaneswar, Urísa, India sa peritonitída považovala za príčinu úhynu u jedného leoparda obláčikového; 92 avšak FCoV nebola skúmaná.

Leopard snežný (Panthera uncia): U zdravého snežného leoparda v zajatí bolo pozorované vylučovanie FCoV, aj keď nebola zjavná žiadna protilátková odpoveď.56 Naopak, u dvoch snežných leopardov v rôznych inštitúciách sa nepozorovalo vylučovanie vírusu, ale boli pozitívne na protilátky proti FCoV typu II. 56 V kazuistike asi 6 týždňov starého zajatého odchovaného samca leoparda snežného s neurologickým ochorením vrátane cerebelárnej degenerácie a encefalomyelopatie bol skúmaný FCoV ako potenciálna príčina, ale nakoniec nebol identifikovaný.109

Ocelot (Leopardus pardalis): Filoni a kol.30 uviedli jedného séropozitívneho, uloveného, zjavne zdravého divokého amazonského ocelota, ktorý bol tiež sérologicky pozitívny na mačací herpesvírus1, mačací kalicivírus, mačací parvovírus a Bartonella henselae. Toto jediné pozorovanie mohlo byť anomáliou a výsledkom iných základných zdravotných stavov. Je však zaujímavé, že protilátková odpoveď proti B. henselae bola spojená s protilátkou proti FCoV u domácich mačiek.40 Či podobná asociácia existuje aj u ocelotov alebo iných mačiek, nie je známe. Prirodzená cirkulácia FCoV v u izolovaných ocelotov sa napriek tomu javí ako vzácna(Tabuľky 2, 4).31,35

Mačka močiarna (Felis chaus): V prieskume úmrtnosti nedomestikovaných mačkovitých šeliem v biologickom parku Nandankanan sa peritonitída považovala za príčinu úhynu u jednej džungľovej mačky; 92 avšak FCoV sa neskúmal.

Jaguár americký (Panthera onca): FIP sa považovala za diferenciálnu diagnózu v kazuistike novorodeného jaguára s dýchacími ťažkosťami, ktorý prechádzal do ascitu.36 Potvrdzujúca diagnostika však neprebehla a po rozsiahlej liečbe sa mláďa uzdravilo.36 U dvoch zjavne zdravých jaguárov v zajatí, bolo pozorované vylučovanie FCoV; navyše jedno z týchto zvierat vykazovalo protilátkovú odpoveď na FCoV typu II. (Tabuľky 2, 4)56

Rys karakal (Caracal caracal): U štyroch karakalov bola preukázaná protilátková odpoveď, hoci ani jedno zviera nevylučovalo FCoV (Tabuľky 2, 4).56,57

Diskusia

Mačací koronavírus predstavuje popri ďalších infekčných chorobách výzvu pre snahu o zachovanie nedomestikovaných mačkovitých šeliem.74 Dôveryhodné zázanamy o FIP existujú u siedmich nedomestikovaných druhov mačkovitých šeliem a 15 druhov preukázalo séroprevalenciu. Uvoľňovanie antigénov je však pozorované pomerne zriedkavo. Screening a diagnostické testovanie sú náročné a je stále ťažké určiť zdroj infekcie FCoV. V prípadoch, ktoré uviedli Watt a kol.124 a Juan-Salle a kol., 54 sa považovalo za nepravdepodobné, že by zdrojom nákazy bola túlavá mačka. Či teda vírus u týchto zvierat neustále cirkuloval, alebo či bol vírus zavlečený iným spôsobom, zostáva stále neznáme. Vedie to tak k potrebe byť vždy ostražitý, pokiaľ ide o biologickú bezpečnosť, najmä v prípade ohrozených zvierat. Použitie výkalov pre identifikáciu FCoV vytvára stratégiu ľahkého odberu vzoriek od voľne žijúcich zvierat, i zvierat v zajatí; môže však dôjsť k inhibícii PCR z fekálneho obsahu.20 Okrem toho zradný nástup u niektorých prípadov FIP často vyžaduje skúmanie potenciálu alebo expozície infekcie FCoV. Spektrum klinických prejavov popri „štandardnom klinickom obraze“, zahŕňa i dermatologicke lézie, 10,93 myokarditídy 22 a choroby horných ciest dýchacích.2

Z hlásení o prepuknutí FIP u nedomestikovaných mačiek vyplynulo, že u samcov je v porovnaní so samicami pravdepodobne vyššie riziko, podobne, ako sa pozorovalo aj u domácich mačiek. FIP sa zistila iba u európskych divokých mačiek mužského pohlavia a prostredníctvom jednotlivých hlásení vieme o FIP u horského leva, leva a tigra, ktorá postihla iba samcov. 49,75,108, 124 U domácich mačiek sú samci v prípadoch FIP tiež zastúpení nadmerne.78 Okrem toho i u ľudí infekcia SARSCoV-2 viedla k vážnejším následkom u mužov v porovnaní so ženami.66

Zatiaľ čo útulky a chovateľské stanice predstavujú optimálne miesto pre šírenie FCoV, cirkuláciu FCoV u voľne sa pohybujúcich druhov možno zlepšiť solitérnym životným štýlom niektorých z týchto druhov. Vírus prežije v prostredí relatívne krátky čas, takže prenos sa uskutočňuje predovšetkým priamymi alebo nepriamymi interakciami vrámci druhu alebo s inými mačkovitými šelmami. V niektorých prípadoch môžu byť domáce mačky zdrojom koristi pre väčšie nedomestikované mačkovité šelmy. Či by mohlo dôjsť k nákaze týmto spôsobom, nie je známe, ale mohla by to byť príčina určitých protilátkových odpovedí alebo vylučovania antigénu vo výkaloch. Zmeny biotopov vrátane fragmentácie a rozširovania miest môžu okrem expozície domácich mačiek viesť aj k nárastu interakcií vrámci rovnakého druhu vo voľnej prírode.

Aj keď je testovanie protilátok užitočné pre detekciu predchádzajúcej expozície, a to aj u nedomestikovaných druhov, seronegatívny test nie vždy znamená absenciu vylučovania vírusu.38,56 Tento nesúlad predstavuje výzvu pre pochopenie skutočných úrovní FCoV cirkulujúceho v populáciách divokých mačiek. Niekoľko stratégií testovania preukázalo schopnosť detegovať vylučovanie vírusov s vysokou mierou spoľahlivosti vrátane uskutočniteľnej možnosti získania piatich vzoriek za sebou.38 Ak vezmeme do úvahy kriticky ohrozené druhy, musia byť jednotlivci pred uvedením k jedincom rovnakého druhu adekvátne testovaní, spolu s minimalizáciou stresu, zbytočnou anestéziou atď. Postupné testovanie vzoriek výkalov sa prevádzalo u zvierat v zajatí a podobné stratégie môžu byť užitočné pre pochopenie prítomnosti alebo neprítomnosti FCoV i v populáciách divokých zvierat.

Poďakovanie: Autori si veľmi cenia členov laboratória Whittaker Lab a členov Fondu na ochranu gepardov za prínosnú diskusiu pri príprave tohto rukopisu. Práca Dr. Stouta je podporovaná školiacim programom komparatívnej medicíny National Institutes of Health (T32OD011000). Práca v autorskom laboratóriu (GRW) je čiastočne financovaná z Cornell Feline Health Center a Winn Feline Foundation.

Použitá literatúra

  1. Alexander KA, McNutt JW, Briggs MB, StandersPE, Funston P, Hemson G, Keet D, van Vuuren M. Multi-host pathogens and carnivore management in southern Africa. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2010;33(3):249–265.
  2. Andre´ NM, Miller AD, Whittaker GR. Feline infectious peritonitis virus-associated rhinitis in a cat. J Feline Med Surg Open Rep. 2020;6(1):1–6.
  3. Bernard JM, Newkirk KM, McRee AE, Whittemore JC, Ramsay EC. Hepatic lesions in 90 captive nondomestic felids presented for autopsy. Vet Pathol. 2015;52(2):369–376.
  4. Biek R, Ruth TK, Murphy KM, Anderson CR,Johnson M, DeSimone R, Gray R, Hornocker MG, Gillin CM, Poss M. Factors associated with pathogen seroprevalence and infection in rocky mountain cougars. J Wildl Dis. 2006;42(3):606–615.
  5. Biek R, Zarnke RL, Gillin C, Wild M, Squires JR,Poss M. Serologic survey for viral and bacterial infections in western populations of Canada lynx (Lynx canadensis). J Wildl Dis. 2002;38(4):840–845.
  6. Briggs MB, Evermann JF, McKeirnan AJ. Felineinfectious peritonitis: an update of a captive cheetah population. Feline Pract. 1986;16(2):13–16.
  7. Brower AI, Munson L, Radcliffe RW, Citino SB,Lackey LB, Van Winkle TJ, Stalis I, Terio KA, Summers BA, de Lahunta A. Leukoencephalomyelopathyof mature captive cheetahs and other large felids: a novel neurodegenerative disease that came and went? Vet Pathol. 2014;51(5):1013–1021.
  8. Brown EW, Olmsted RA, Martenson JS, O’BrienSJ. Exposure to FIV and FIPV in wild and captive cheetahs. Zoo Biol. 1993;12(1):135–142.
  9. Brown MA, Troyer JL, Pecon-Slattery J, RoelkeME, O’Brien SJ. Genetics and pathogenesis of feline infectious peritonitis virus. Emerg Infect Dis. 2009; 15(9):1445–1452.
  10. Cannon MJ, Silkstone MA, Kipar AM. Cutaneous lesions associated with coronavirus-induced vasculitis in a cat with feline infectious peritonitis and concurrent feline immunodeficiency virus infection. J Feline Med Surg. 2005;7(4):233–236.
  11. Chaber A-L, Cozzi G, Broekhuis F, Hartley R,JW McNutt. Serosurvey for selected viral pathogens among sympatric species of the African large predator guild in northern Botswana. J Wildl Dis. 2017;53(1): 170–175.
  12. Chen C-C, Chang A-M, Chen W-J, Chang P-J,Lai Y-C, Lee H-H. Molecular survey for selected viral pathogens in wild leopard cats (Prionailurus bengalensis) in Taiwan with an emphasis on the spatial and temporal dynamics of carnivore protoparvovirus 1. BioRxiv [Internet]. 2020.02.21.960492; doi:https://doi. org/10.1101/2020.02.21.960492
  13. Colby ED. Feline infectious peritonitis. Vet MedSmall Anim Clin. 1970;65(8):783–786.
  14. Daniels MJ, Golder MC, Jarrett O, MacDonaldDW. Feline viruses in wildcats from Scotland. J Wildl Dis. 1999;35(1):121–124.
  15. Daszak P, Cunningham A, Hyatt A. Emerginginfectious diseases of wildlife—threats to biodiversity and human health. Science. 2000;287(5452):443–449.
  16. Dong BQ, Liu W, Fan XH, Vijaykrishna D, TangXC, Gao F, Li LF, Li GJ, Zhang JX, Yang LQ, Poon LLM, Zhang SY, Peiris JSM, Smith GJD, Chen H, Guan Y. Detection of a novel and highly divergent coronavirus from Asian leopard Cats and Chinese ferret badgers in southern China. J Virol. 2007; 81(13):6920–6926.
  17. Drechsler Y, Alcaraz A, Bossong FJ, CollissonEW, Diniz PPVP. Feline coronavirus in multicat environments. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2011;41(6):1133–1169.
  18. Driciru M, Siefert L, Prager KC, Dubovi E,Sande R, Princee F, Friday T, Munson L. A serosurvey of viral infections in lions (Panthera leo), from Queen Elizabeth National Park, Uganda. J Wildl Dis. 2006; 42(3):667–671.
  19. Duarte A, Fernandes M, Santos N, Tavares L.
    Virological survey in free-ranging wildcats (Felis silvestris) and feral domestic cats in Portugal. Vet Microbiol. 2012;158(3–4):400–404.
  20. Dye C, Helps CR, Siddell SG. Evaluation of realtime RT-PCR for the quantification of FCoV shedding in the faeces of domestic cats. J Feline Med Surg. 2008; 10(2–3):167–174.
  21. Dye C, Temperton N, Siddell SG. Type I felinecoronavirus spike glycoprotein fails to recognize aminopeptidase N as a functional receptor on feline cell lines. J Gen Virol. 2007;88(Pt 6):1753–1760.
  22. Ernandes MA, Cantoni AM, Armando F, Corradi A, Ressel L, Tamborini A. Feline coronavirusassociated myocarditis in a domestic longhair cat. JFMS Open Rep. 2019;5(2):1–5.
  23. Evermann JF, Burns G, Roelke ME, McKeirnanAJ, Greenlee A, Ward AC, Pfeifer ML. Diagnostic features of an epizootic of feline infectious peritonitis in captive cheetahs. In: Proc Am Assoc Vet Lab Diagn; 1983. 26:365–382.
  24. Evermann JF, Heeney JL, McKeirnan AJ,O’Brien SJ. Comparative features of a coronavirus isolated from a cheetah with feline infectious peritonitis. Virus Res. 1989;13(1):15–27.
  25. Evermann JF, Heeney JL, Roelke ME,
    McKeirnan AJ, O’Brien SJ. Biological and pathological consequences of feline infectious peritonitis virus infection in the cheetah. Arch Virol. 1988;102(3–4): 155–171.
  26. Evermann JF, Laurenson MK, McKeirnan AJ,Caro TM. Infectious disease surveillance in captive and free-living cheetahs: an integral part of the species survival plan. Zoo Biol. 1993;12(1):125–133.
  27. Evermann JF, Roelke ME, Briggs MB. Felinecoronavirus infections of cheetahs: clinical and diagnostic features. Feline Pract. 1986;16(3):21–28.
  28. Felten S, Hartmann K. Diagnosis of felineinfectious peritonitis: a review of the current literature. Viruses. 2019;11(11):1068.
  29. Felten S, Klein-Richers U, Hofmann-LehmannR, Bergmann M, Unterer S, Leutenegger CM, Hartmann K. Correlation of feline coronavirus shedding in feces with coronavirus antibody titer. Pathogens. 2020; 9(8):598.
  30. Filoni C, Cata˜o-Dias JL, Bay G, Durigon EL,Jorge RSP, Lutz H, Hofmann-Lehmann R. First evidence of feline herpesvirus, calicivirus, parvovirus, and Ehrlichia exposure in Brazilian Free-ranging felids. J Wildl Dis. 2006;42(2):470–477.
  31. Fiorello CV, Noss AJ, Deem SL, Maffei L,Dubovi EJ. Serosurvey of small carnivores in the Bolivian Chaco. J Wildl Dis. 2007;43(3):551–557.
  32. Fix AS, Riordan DP, Hill HT, Gill MA, EvansMB. Feline panleukopenia virus and subsequent canine distemper virus infection in two snow leopards (Panthera uncia). J Zoo Wildl Med. 1989;20(3):273–281.
  33. Foley JE, Swift P, Fleer KA, Torres S, GirardYA, Johnson CK. Risk factors for exposure to feline pathogens in California mountain lions (Puma concolor). J Wildl Dis. 2013;49(2):279–293.
  34. Fountain-Jones NM, Packer C, Jacquot M,Blanchet FG, Terio K, Craft ME. Endemic infection can shape exposure to novel pathogens: pathogen cooccurrence networks in the Serengeti lions. Ecol Lett. 2019;22(6):904–913.
  35. Franklin SP, Kays RW, Moreno R, TerWee JA,Troyer JL, VandeWoude S. Ocelots on Barro Colorado Island are infected with feline immunodeficiency virus but not other common feline and canine viruses. J Wildl Dis. 2008;44(3):760–765.
  36. Fransen DR. Feline infectious peritonitis in aninfant jaguar. In: Proc Am Assoc Zoo Vet; 1974. 261– 264.
  37. Furtado MM, Taniwaki SA, de Barros IN,Branda˜o PE, Cata˜o-Dias JL, Cavalcanti S, Cullen L, Filoni C, Almeida Ja´como AT de, Jorge RSP, Silva NDS, Silveira L, Ferreira Neto JS. Molecular detection of viral agents in free-ranging and captive neotropical felids in Brazil. J Vet Diagn Invest. 2017;29(5):660– 668.
  38. Gaffney PM, Kennedy M, Terio K, Gardner I,Lothamer C, Coleman K, Munson L. Detection of feline coronavirus in cheetah (Acinonyx jubatus) feces by reverse transcription-nested polymerase chain reaction in cheetahs with variable frequency of viral shedding. J Zoo Wildl Med. 2012;43(4):776–786.
  39. Giordano A, Spagnolo V, Colombo A, PaltrinieriS. Changes in some acute phase protein and immunoglobulin concentrations in cats affected by feline infectious peritonitis or exposed to feline coronavirus infection. Vet J. 2004;167(1):38–44.
  40. Glaus T, Hofmann-Lehmann R, Greene C,Glaus B, Wolfensberger C, Lutz H. Seroprevalence of Bartonella henselae infection and correlation with disease status in cats in Switzerland. J Clin Microbiol. 1997;35(11):2883–2885.
  41. Goncharuk MS, Kerley LL, Naidenko SV, Rozhnov VV. Prevalence of seropositivity to pathogens in small carnivores in adjacent areas of Lazovskii Reserve. Biol Bull Russ Acad Sci. 2012;39(8):708–713.
  42. Goodrich JM, Quigley KS, Lewis JCM, AstafievAA, Slabi EV, Miquelle DG, Smirnov EN, Kerley LL, Armstrong DL, Quigley HB, Hornocker MG. Serosurvey of free-ranging Amur tigers in the Russian Far East. J Wildl Dis. 2012;48(1):186–189.
  43. Guimaraes AMS, Branda˜o PE, Moraes W de,Cubas ZS, Santos LC, Villarreal LYB, Robes RR, Coelho FM, Resende M, Santos RCF, Oliveira RC, Yamaguti M, Marques LM, Neto RL, Buzinhani M, Marques R, Messick JB, Biondo AW, Timenetsky J. Survey of feline leukemia virus and feline coronaviruses in captive neotropical wild felids from southern Brazil. J Zoo Wildl Med. 2009;40(2):360–364.
  44. Heddergott M, Steeb S, Osten-Sacken N, Steinbach P, Schneider S, Pir JP, Mu¨ller F, Pigneur L-M, Frantz AC. Serological survey of feline viral pathogens in free-living European wildcats (Felis s. silvestris) from Luxembourg. Arch Virol. 2018;163(11):3131–3134.
  45. Heeney JL, Evermann JF, McKeirnan AJ, Marker-Kraus L, Roelke ME, Bush M, Wildt DE, Meltzer DG, Colly L, Lukas J. Prevalence and implications of feline coronavirus infections of captive and freeranging cheetahs (Acinonyx jubatus). J Virol. 1990; 64(5):1964–1972.
  46. Herrewegh AAPM, Smeenk I, Horzinek MC,Rottier PJM, Groot RJ de. Feline coronavirus type II strains 79-1683 and 79-1146 originate from a double recombination between feline coronavirus type I and canine coronavirus. J Virol. Ame Soc Microbiol J. 1998;72(5):4508–4514.
  47. Hofmann-Lehmann R, Fehr D, Grob M, ElgizoliM, Packer C, Martenson JS, O’Brien SJ, Lutz H.
    Prevalence of antibodies to feline parvovirus, calicivirus, herpesvirus, coronavirus, and immunodeficiency virus and of feline leukemia virus antigen and the interrelationship of these viral infections in freeranging lions in east Africa. Clin Diagn Lab Immunol. 1996;3(5):554–562.
  48. Holzworth J. Some important disorders of cats.Cornell Vet. 1963;53:157–160.
  49. Horhogea C, Lazar M. Immunohistochemicalmethods to diagnose atraumatic spleen rupture in feline infectious peritonitis of tiger (Panthera tigris). Rev Chim Buchar. 2017;68(5):1055.
  50. Horzinek MC, Osterhaus AD. The virology andpathogenesis of feline infectious peritonitis. Brief review. Arch Virol. 1979;59(1–2):1–15.
  51. Horzinek MC, Osterhaus ADME. Feline infectious peritonitis: a worldwide serosurvey. Am J Vet Res. 1979;40(10):1487–1492.
  52. Jaimes JA, Millet JK, Stout AE, Andre´ NM, Whittaker GR. A tale of two viruses: the distinct spike glycoproteins of feline coronaviruses. Viruses. 2020; 12(1):83.
  53. Jime´nez A, Sa´nchez B, Pe´rez Alenza D, Garcı´a P, Lo´pez JV, Rodriguez A, Mun˜oz A, Martı´nez F, Vargas A, Pen˜a L. Membranous glomerulonephritis in the Iberian lynx (Lynx pardinus). Vet Immunol Immunopathol. 2008;121(1–2):34–43.
  54. Juan-Salle´s C, Domingo M, Herra´ez P, Ferna´ndez A, Segale´s J, Ferna´ndez J. Feline infectious peritonitis in servals (Felis serval). Vet Rec. 1998; 143(19):535–536.
  55. Kennedy M, Citino S, Dolorico T, McNabb AH,Moffat AS, Kania S. Detection of feline coronavirus infection in captive cheetahs (Acinonyx jubatus) by polymerase chain reaction. J Zoo Wildl Med. 2001;
    32(1):25–30.
  56. Kennedy M, Citino S, McNabb AH, Moffatt AS,Gertz K, Kania S. Detection of feline coronavirus in captive Felidae in the USA. J Vet Diagn Invest. 2002; 14(6):520–522.
  57. Kennedy M, Kania S, Stylianides E, BertschingerH, Keet D, van Vuuren M. Detection of feline coronavirus infection in southern African nondomestic felids. J Wildl Dis. 2003;39(3):529–535.
  58. Kennedy MA, Moore E, Wilkes RP, Citino SB,Kania SA. Analysis of genetic mutations in the 7a7b open reading frame of coronavirus of cheetahs (Acinonyx jubatus). Am J Vet Res. 2006;67(4):627–632.
  59. Ketz-Riley CJ, Ritchey JW, Hoover JP, JohnsonCM, Barrie MT. Immunodeficiency associated with multiple concurrent infections in captive Pallas’ cats (Otocolobus manul). J Zoo Wildl Med. 2003;34(3):239– 245.
  60. Kipar A, Meli ML. Feline infectious peritonitis:
    still an enigma? Vet Pathol. 2014;51(2):505–526.
  61. Leutenegger CM, Hofmann-Lehmann R, RiolsC, Liberek M, Worel G, Lups P, Fehr D, Hartmann M, Weilenmann P, Lutz H. Viral infections in free-living populations of the European wildcat. J Wildl Dis. 1999; 35(4):678–686.
  62. Masot AJ, Gil M, Risco D, Jime´nez OM, Nu´nez˜ JI, Redondo E. Pseudorabies virus infection (Aujeszky’s disease) in an Iberian lynx (Lynx pardinus) in Spain: a case report. BMC Vet Res. 2016;13(1):6.
  63. McDermid KR, Snyman A, Verreynne FJ, Carroll JP, Penzhorn BL, Yabsley MJ. Surveillance for viral and parasitic pathogens in a vulnerable African lion (Panthera leo) population in the Northern Tuli Game Reserve, Botswana. J Wildl Dis. 2017;53(1):54–61.
  64. McOrist S, Boid R, Jones TW, Easterbee N,Hubbard AL, Jarrett O. Some viral and protozool diseases in the European wildcat (Felis silvestris). J Wildl Dis. 1991;27(4):693–696.
  65. Meli ML, Cattori V, Martı´nez F, Lo´pez G, Vargas A, Simo´n MA, Zorrilla I, Mun˜oz A, Palomares F, Lo´pez-Bao JV, Pastor J, Tandon R, Willi B, Hofmann-Lehmann R, Lutz H. Feline leukemia virus and other pathogens as important threats to the survival of the critically endangered Iberian lynx (Lynx pardinus). PLOS ONE. 2009;4(3):e4744.
  66. Meng Y, Wu P, Lu W, Liu K, Ma K, Huang L,Cai J, Zhang H, Qin Y, Sun H, Ding W, Gui L, Wu P.
    Sex-specific clinical characteristics and prognosis of coronavirus disease-19 infection in Wuhan, China: a retrospective study of 168 severe patients. PLOS Pathog. 2020;16(4):e1008520.
  67. Milla´n J, Candela MG, Palomares F, Cubero MJ, Rodrı´guez A, Barral M, de la Fuente J, Almerı´a S, Leo´n-Vizcaı´no L. Disease threats to the endangered Iberian lynx (Lynx pardinus). Vet J. 2009;182(1):114– 124.
  68. Millet JK, Whittaker GR. Host cell proteases: critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Res. 2015;202(2015):120–134.
  69. Mo X-N, Su Z-Q, Lei C-L, Chen D-F, Peng H,Chen R-C, Sang L, Wu H-K, Li S-Y. Serum amyloid A is a predictor for prognosis of COVID-19. Respirology. 2020;25(7):764–765.
  70. Mochizuki M, Akuzawa M, Nagatomo H. Serological survey of the Iriomote cat (Felis iriomotensis) in Japan. J Wildl Dis. 1990;26(2):236–245.
  71. Munson L. Diseases of captive cheetahs (Acinonyx jubatus): results of the cheetah research council pathology survey, 1989–1992. Zoo Biol. 1993;12(1): 105–124.
  72. Munson L, Marker L, Dubovi E, Spencer JA,
    Evermann JF, O’Brien SJ. Serosurveyof viral infections in free-ranging Namibian cheetahs (Acinonyx jubatus). J Wildl Dis. 2004;40(1):23–31.
  73. Murphy BG, Perron M, Bauer K, Park Y,Eckstrand C, Liepnieks M, Pedersen NC. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol. 2018;219(2018):226–233.
  74. Murray DL, Kapke CA, Evermann JF, FullerTK. Infectious disease and the conservation of freeranging large carnivores. Anim Conserv. 1999;2(4): 241–254.
  75. Mwase M, Shimada K, Mumba C, Yabe J,
    Squarre D, Madarame H. Positive immunolabelling for feline infectious peritonitis in an African lion (Panthera leo) with bilateral panuveitis. J Comp Pathol. 2015;152(2–3):265–268.
  76. Naidenko SV, Pavlova EV, Kirilyuk VE. Detection of seasonal weight loss and a serologic survey of potential pathogens in wild Pallas’ cats (Felis [Otocolobus] manul) of the Daurian steppe, Russia. J Wildl Dis. 2014;50(2):188–194.
  77. Nicholson KL, Noon TH, Krausman PR. Serosurvey of mountain lions in southern Arizona. Wildl Soc Bull. 2012;36(3):615–620.
  78. Norris JM, Bosward KL, White JD, Baral RM,Catt MJ, Malik R. Clinicopathological findings associated with feline infectious peritonitis in Sydney, Australia: 42 cases (1990–2002). Aust Vet J. 2005; 83(11):666–673.
  79. O’Brien SJ, Roelke ME, Marker L, Newman A,Winkler CA, Meltzer D, Colly L, Evermann JF, Bush M, Wildt DE. Genetic basis for species vulnerability in the cheetah. Science. 1985;227(4693):1428–1434.
  80. Packer C, Altizer S, Appel M, Brown E, Martenson J, O’Brien SJ, Roelke-Parker M, HofmannLehmann R, Lutz H. Viruses of the Serengeti: patterns of infection and mortality in African lions. J Anim Ecol. 1999;68(6):1161–1178.
  81. Paul-Murphy J, Work T, Hunter D, McFie E,Fjelline D. Serologic survey and serum biochemical reference ranges of the free-ranging mountain lion (Felis concolor) in California. J Wildl Dis. 1994;30(2): 205–215.
  82. Pedersen NC. A review of feline infectiousperitonitis virus infection: 1963–2008. J Feline Med Surg. 2009;11(4):225–258.
  83. Pedersen NC, Allen CE, Lyons LE. Pathogenesisof feline enteric coronavirus infection. J Feline Med Surg. 2008;10(6):529–541.
  84. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, Montgomery E, Murakami E, Liepnieks M, Liu H. Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2019;21(4): 271–281.
  85. Pedersen NC, Sato R, Foley JE, Poland AM.Common virus infection in cats, before and after being placed in shelters, with emphasis on feline enteric coronavirus. J Feline Med Surg. 2004;6(2):83–88.
  86. Pen˜a L, Garcia P, Jime´nez MA´ , Benito A, Alenza MDP, Sa´nchez B. Histopathological and immunohistochemical findings in lymphoid tissues of the endangered Iberian lynx (Lynx pardinus). Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2006;29(2):114–126.
  87. Persky ME, Jafarey YS, Christoff SE, MaddoxDD, Stowell SA, Norton TM. Tick paralysis in a freeranging bobcat (Lynx rufus). J Am Vet Med Assoc.
    2020;256(3):362–364.
  88. Pfeifer ML, Evermann JF, Roelke ME, GallinaAM, Ott RL, McKeirnan AJ. Feline infectious peritonitis in a captive cheetah. J Am Vet Med Assoc. 1983; 183(11):1317–1319.
  89. Philippa JDW, Leighton FA, Daoust PY, NielsenO, Pagliarulo M, Schwantje H, Shury T, Van Herwijnen R, Martina BEE, Kuiken T, Van de Bildt MWG, Osterhaus ADME. Antibodies to selected pathogens in free-ranging terrestrial carnivores and marine mammals in Canada. Vet Rec. 2004;155(5):135–140.
  90. Quigley KS, Evermann JF, Leathers CW, Armstrong DL, Goodrich J, Duncan NM, Miquelle DG. Morbillivirus infection in a wild Siberian tiger in the Russian Far East. J Wildl Dis. 2010;46(4):1252–1256.
  91. Ramsauer S, Bay G, Meli M, Hofmann-Lehmann R, Lutz H. Seroprevalence of selected infectious agents in a free-ranging, low-density lion population in the Central Kalahari Game Reserves in Botswana. Clin Vaccine Immunol. 2007;14(6):808–810.
  92. Rao AT, Acharjyo LN. Etiopathology of mortality in Indian lesser cats at Nandankanan Biological Park. Indian Vet J. 1994;71(6):550–553.
  93. Redford T, Al-Dissi AN. Feline infectious peritonitis in a cat presented because of papular skin lesions. Can Vet J. 2019;60(2):183–185.
  94. Riad A, Kassem I, Hockova B, Badrah M,Klugar M. Tongue ulcers associated with SARS-CoV2 infection: a case series. Oral Dis. 2020. doi:10.1111/ odi.13635
  95. Riley SPD, Foley J, Chomel B. Exposure tofeline and canine pathogens in bobcats and gray foxes in urban and rural zones of a national park in
    California. J Wildl Dis. 2004;40(1):11–22.
  96. Robert N, Walzer C. Pathological disorders incaptive cheetahs. In: Vargas A, Breitenmoser-Wu¨rsten C, Breitenmoser U (eds.). Conservacio´n ex situ del Lince Ibe´rico : un enfoque multidisciplinar [Iberian Lynx ex situ conservation : an interdisciplinary approach]. Madrid (Spain): Fundacio´n Biodiversidad/ IUCN Cat Specialist Group; 2009. p. 265–272.
  97. Roelke M, Forrester D, Jacobson E, Kollias G,Scott F, Barr M, Evermann J, Pirtle E. Seroprevalence of infectious disease agents in free-ranging Florida panthers (Felis concolor coryi). J Wildl Dis. 1993;29(1): 36–49.
  98. Roelke ME, Johnson WE, Milla´n J, Palomares F, Revilla E, Rodrı´guez A, Calzada J, Ferreras P, Leo´nVizcaı´no L, Delibes M, O’Brien SJ. Exposure to disease agents in the endangered Iberian lynx (Lynx pardinus). Eur J Wildl Res. 2008;54(2):171–178.
  99. Rottier PJM, Nakamura K, Schellen P, VoldersH, Haijema BJ. Acquisition of macrophage tropism during the pathogenesis of feline infectious peritonitis is determined by mutations in the feline coronavirus spike protein. J Virol. 2005;79(22):14122–14130.
  100. Ryser-Degiorgis M, Hofmann-Lehmann R,Leutenegger CM, Segerstad CH, Morner T, Mattsson R, Lutz H. Epizootiologic investigations of selected infectious disease agents in free-ranging Eurasian lynx from Sweden. J Wildl Dis. 2005;41(1):58–66.
  101. Scaglione FE, Biolatti C, Pregel P, Berio E,Cannizzo FT, Biolatti B, Bollo E. A survey on zoo mortality over a 12-year period in Italy. PeerJ. 2019;7: e6198.
  102. Schmidt-Posthaus H, Breitenmoser-Wu¨rsten C, Posthaus H, Bacciarini L, Breitenmoser U. Causes of mortality in reintroduced Eurasian lynx in Switzerland. J Wildl Dis. 2002;38(1):84–92.
  103. Schmitt AC, Reischak D, Clavac CL, MonforteCHL, Couto FT, Almeida ABPF, Santos DGG, Souza L, Alves C, Vecchi K. Infecca˜o pelos vı´rus da leucemia felina e da peritonite infecciosa felina em felı´deo selvagem de vida livre e de cativeiro da regia˜o do Pantanal matogrossense. [Feline leukaemia and feline peritonitis virus infection in captive and wildcats from Mato Grosso swamp region]. Acta Sci Vet. 2003;31(3): 185–188.
  104. Schrader GM, Whiteside DP, Slater OM, BlackSR. Conservative management of pyothorax in an Amur tiger (Panthera tigris altaica). J Zoo Wildl Med. 2012;43(2):425–429.
  105. Spencer JA. Lack of antibodies to coronaviruses in a captive cheetah (Acinonyx jubatus) population. J S Afr Vet Assoc. 1991;62(2):124–125.
  106. Spencer JA. Survey of antibodies to felineviruses in free-ranging lions. South Afr J Wildl Res, 1991;21(2):59–61.
  107. Srivastav A, Chakrabarty B. Seasonal distribution of deaths of tigers (Panthera tigris) in Indian zoos. Zoos Print J. 2002;17(3):741–743.
  108. Stephenson N, Swift P, Moeller RB, Worth SJ,Foley J. Feline infectious peritonitis in a mountain lion (Puma concolor), California, USA. J Wildl Dis. 2013; 49(2):408–412.
  109. Stidworthy MF, Lewis JCM, Penderis J, PalmerAC. Progressive encephalomyelopathy and cerebellar degeneration in a captive-bred snow leopard (Uncia uncia). Vet Rec. 2008;162(16):522–524.
  110. Stout AE, Andre´ NM, Jaimes JA, Millet JK, Whittaker GR. Coronaviruses in cats and other companion animals: where does SARS-CoV-2/COVID-19 fit? Vet Microbiol. 2020;247:108777. doi:10.1016/j. vetmic.2020.108777
  111. Terio KA, O’Brien T, Lamberski N, FamulaTR, Munson L. Amyloidosis in black-footed cats (Felis nigripes). Vet Pathol. 2008;45(3):393–400.
  112. Terio KA, Walzer ME, Schmidt-Kuntzel A,Marker L, Citino S. Diseases impacting captive and free-ranging cheetahs. In: Marker L, Boast, LK, Schmidt-Kuntzel A. Cheetahs: biology and conservation. Biodiversity of the world: conservation from genes to landscapes. Cambridge (MA): Academic Press; 2018. p. 349–364.
  113. Thalwitzer S, Wachter B, Robert N, Wibbelt G,Mu¨ller T, Lonzer J, Meli ML, Bay G, Hofer H, Lutz H. Seroprevalences to viral pathogens in free-ranging and captive cheetahs (Acinonyx jubatus) on Namibian farmland. Clin Vaccine Immunol. 2010;17(2):232–238.
  114. 114. Tresnan DB, Levis R, Holmes KV. Feline aminopeptidase N serves as a receptor for feline, canine, porcine, and human coronaviruses in serogroup I. J Virol. 1996;70(12):8669–8674.
  115. Trinkel M, Cooper D, Packer C, Slotow R.
    Inbreeding depression increases susceptibility to bovine tuberculosis in lions: an experimental test using an inbred-outbred contrast through translocation. J Wildl Dis. 2011;47(3):494–500.
  116. Truyen U, Stockhofe-Zurwieden N, KaadenOR, Pohlenz J. A case report: encephalitis in lions. Pathological and virological findings. Dtsch Tierarztl Wochenschr. 1990;97(2):89–91.
  117. Tuch K, Witte KH, Wu¨ller H. Feststellung der Felinen Infektio¨sen Peritonitis (FIP) bei Hauskatzen und Leoparden in Deutschland [Determination of feline infectious peritonitis (FIP) in domestic cats and leopards in Germany]. J Vet Med B Infect Dis Vet
    Public Health. 1974;21(6):426–441.
  118. Uhart MM, Rago MV, Marull CA, Ferreyra Hdel V, Pereira JA. Exposure to selected pathogens in Geoffroy’s cats and domestic carnivores from central Argentina. J Wildl Dis. 2012;48(4):899–909.
  119. Van Rensburg IB, Silkstone MA. Concomitantfeline infectious peritonitis and toxoplasmosis in a cheetah (Acinonyx jubatus). J S Afr Vet Assoc. 1984; 55(4):205–207.
  120. Walzer C, Ku¨bber-Heiss A, Gelbmann W, Suchy A, Weissenblo¨ck H. Acute hind limb paresis in Cheetah (Acinonyx jubatus) cubs. In: Proc Eur Assoc Zoo Wildl Vet; 1998. p. 267–274.
  121. Walzer C, Url A, Robert N, Ku¨bber-Heiss A, Nowotny N, Schmidt P. Idiopathic acute onset myelopathy in cheetah (Acinonyx jubatus) cubs. J Zoo Wildl Med. 2003;34(1):36–46.
  122. Wang L, Mitchell PK, Calle PP, Bartlett SL,McAloose D, Killian ML, Yuan F, Fang Y, Goodman LB, Fredrickson R, Elvinger F, Terio K, Franzen K, Stuber T, Diel DG, Torchetti MK. Complete genome sequence of SARS-CoV-2 in a tiger from a U.S. zoological collection. Microbiol Resour Announc. 2020;9(22):e00468–20.
  123. Wang Y, Su B, Hsieh L, Chueh L. An outbreakof feline infectious peritonitis in a Taiwanese shelter: molecular and epidemiological evidence for horizontal transmission of a novel type II feline coronavirus. Vet Res. 2013;44(1):57.
  124. Watt NJ, MacIntyre NJ, McOrist S. An extended outbreak of infectious peritonitis in a closed colony of European wildcats (Felis silvestris). J Comp Pathol. 1993;108(1):73–79.
  125. Weiss RC, Scott FW. Antibody-mediated enhancement of disease in feline infectious peritonitis: comparisons with dengue hemorrhagic fever. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 1981;4(2):175–189.
  126. Zook BC, King NW, Robison RL, McCombs
    HL. Ultrastructural evidence for the viral etiology of feline infectious peritonitis. Pathol Vet. 1968;5(1):91– 95.
Prečítať “Mačací koronavírus a FIP u nedomestikovaných druhov mačiek”