Virucidné a antivírusové účinky esenciálneho oleja Tymiánu obyčajného na mačací koronavírus

22.4.2021
Cristiana Catella, Michele Camero, Maria Stella Lucente, Giuseppe Fracchiolla, Sabina Sblano, Maria Tempesta, Vito Martella, Canio Buonavoglia, Gianvito Lanave
Pôvodný článok: Virucidal and antiviral effects of Thymus vulgaris essential oil on feline coronavirus

Základné fakty

  • EO fungujú ako antibakteriálne, antivírusové, protiplesňové a insekticídne látky.
  • TEO preukázal účinnosť proti niekoľkým RNA vírusom vrátane CoV.
  • Protiinfekčná aktivita TEO proti FCoV sa hodnotila v bunkách CRFK.
  • Ukázalo sa, že TEO inhibuje replikáciu FCoV in vitro.
  • TEO vykazoval virucidnú aktivitu proti FCoV až 92,86%.

Abstrakt

Mačací infekčný zápal pobrušnice (FIP) je smrteľné systémové ochorenie mačiek spôsobené koronavírusom (CoV) (FIPV). Napriek klinickému významu a vplyvu na zdravie mačiek sú v súčasnosti terapeutické možnosti liečby FIP u mačiek obmedzené. Výskyt pandemického koronavírusu ťažkého respiračného syndrómu typu 2 (SARS-CoV-2), etiologického agens koronavírusovej choroby z roku 2019 (COVID-19), schopného infikovať široké spektrum druhov zvierat vrátane mačiek, vyvolali záujem o vývoj nových molekúl s antivírusovou aktivitou na liečbu infekcií CoV u ľudí a zvierat.

Esenciálne oleje (EO) vzbudili významnú pozornosť svojimi antivírusovým vlastnosťami, ktoré integrujú a v niektorých prípadoch nahrádzajú bežné lieky. Je známe, že Thymus vulgaris EO (TEO) je účinný proti niekoľkým RNA vírusom vrátane CoV. V predloženej štúdii sa antivírusová účinnosť TEO proti FIPV hodnotila in vitro.

TEO v koncentrácii 27μg/ml bol schopný inhibovať replikáciu vírusu s významným znížením o 2 log10 TCID50/50 μl. Okrem toho bola virucidná aktivita testovaná pomocou TEO pri koncentrácii 27 a 270 μg/ml, nad cytotoxickým prahom, na stanovenie zníženia vírusového titra až na 3,25 log10 TCID50/50 μl do 1 hodiny časového kontaktu. Tieto výsledky otvárajú niekoľko perspektív z hľadiska budúcich aplikácií a terapeutických možností pre koronavírusy, keďže FIPV infekcia u mačiek by mohla byť potenciálnym modelom pre štúdium antivirotík proti CoV.

Kľúčové slová

Tymianový éterický olej, Mačací koronavírus, Thymus vulgaris, Tymián obecný, Dúška tymianová, Materina dúška, Tymián obyčajný, FIP

Výsledky

Pandémia koronavírusovej choroby z roku 2019 (COVID-19) spôsobená koronavírusom ťažkého repiračného syndrómu (SARS-CoV-2) (WHO, 2020) podnietila výskum liečby a imunitnej profylaxie s využitím predošlých poznatky zhromaždených o SARS-CoV-1 a živočíšnych CoV (Decaro a kol., 2020). Doteraz nebol schválený žiadny konkrétny liek na liečbu pacientov s COVID-19. Remdesivir, inhibítor RNA-dependentnej RNA polymerázy (RdRp), však preukázal sľubné výsledky (Kabir a kol., 2020). Okrem toho v súčasnosti prebiehajú štúdie na vyhodnotenie účinnosti teikoplanínu a monoklonálnych a polyklonálnych protilátok proti SARS-CoV-2 (Kabir a kol., 2020).

Lieky skúmané u mačiek na liečbu mačacej infekčnej peritonitídy (FIP) boli tiež testované proti COVID-19 u ľudských pacientov (Pedersen a kol., 2018, Pedersen a kol., 2019).

Koronavírusy sú dlho známe práve kvôli existencii FIP, smrteľného systémové ochorenia mačiek. Vírus FIP (FIPV) je virulentný patotyp mačacieho enterického koronavírusu (FCoV) (Kummrow a kol., 2005). Napriek jeho vplyvu na zdravie mačiek sú terapeutické možnosti liečby FIP u mačiek obmedzené a účinné vakcíny nie sú k dispozícii. Okrem toho boli hlásené nepriaznivé účinky vakcín (Tizard, 2020). Vývoj nových molekúl s antivírusovou aktivitou na liečbu infekcií CoV je v súčasnosti vnímaný ako priorita v humánnej aj v živočíšnej medicíne. Infekcia FIPV u mačiek sa považuje za potenciálny model pre štúdium antivirotík proti CoV (Amirian a Levy, 2020).

Rastlinné lieky podnietili záujem spotrebiteľov i vedcov (Hosseinzadeh a kol., 2015) a éterické oleje (EO) extrahované z aromatických a liečivých rastlín zvýšili osobitnú pozornosť pre ich prospešné vlastnosti (de Sousa Barros a kol., 2015). Uvádza sa, že EO vykazujú významné antiseptické, antibakteriálne, antivírusové, antioxidačné, antiparazitárne, protiplesňové a insekticídne účinky (Chouhan a kol., 2017; Ma a Yao, 2020). Nedávno u sumcov experimentálne intoxikovaných Thiamethoxamom (TMX) podávanie EO Thymus vulgaris (TEO) čiastočne znížilo toxické účinky TMX (El Euony a kol., 2020). EO sú tiež potenciálnym rezervoárom inovatívnych terapeutických riešení, ktoré integrujú a v niektorých prípadoch nahrádzajú konvenčné lieky (Reichling a kol., 2009). Napríklad EO Laurus nobilis (Vavrín pravý – Vavřín vznešený) inhiboval SARS CoV typu 1 (SARS-CoV-1) (Loizzo a kol., 2008) a zmes EO bola účinná proti vírusu vtáčej koronavírusovej infekčnej bronchitídy (IBV) (Jackwood et al., 2010). ). Nedávno sa tiež ukázalo, že EO vykazujú antivírusovú aktivitu proti SARS-CoV-2 (Asif a kol., 2020). Ukázalo sa, že TEO je účinný proti niekoľkým RNA vírusom vrátane CoV (Lelešius a kol., 2019; Nadi a kol., 2020).

Zloženie TEO (Specchiasol Bussolengo, Verona – Taliansko) sa stanovilo v troch nezávislých experimentoch pomocou plynovej chromatografie technikou hmotnostnej spektrometrie (GC-MS) (Rosato a kol., 2020). Podrobnosti o príprave vzoriek, prístrojoch a metódach analýzy GC-MS už boli publikované (Salvagno a kol., 2020; Rosato a kol., 2018). Dáta z GC/MS analýz boli vyjadrené ako % plochy ± Modelovanie štruktúrnych rovníc (SEM). Vo všetkých prípadoch bol SEM nižší ako 10%. Štatistická analýza pre SEM bola vykonaná pomocou programu Microsoft Excel Office 2010 (Windows 7 Home Premium, Microsoft Corporation, USA). Celkovo bolo vo vzorke TEO identifikovaných 26 zložiek, čo zodpovedá 98,7% celej zmesi. Podrobné chemické zloženie TEO je uvedené v doplnkovej tabuľke 1.

TEO v koncentrácii 928 mg/ml sa najskôr zriedil v dimetylsulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) a následne v Dulbecco-MEM (D-MEM).

Mačacie obličkove bunky Crandell Reese (CRFK) sa kultivovali v DMEM a kmeni FCoV-II 25/92 (Buonavoglia a kol., 1995) s titrom 105.25 TCID50/50 μl.

Cytotoxicita TEO sa hodnotila pomocou testu XTT (Denizot a Lang, 1986) s použitím súpravy In Vitro Toxicology Assay Kit (Sigma – Aldrich Srl, Miláno, Taliansko) po vystavení buniek rôznym koncentráciám zlúčenín (7.25, 14.5, 29, 58, 116, 232, 464, 928, 1856 μg/ml) počas 72 hodín. Cytotoxicita sa vyhodnocovala spektrofotometrickým meraním absorpčného signálu (optická hustota, OD). Vo všetkých experimentoch boli neošetrené bunky použité ako negatívna kontrola pri 0% cytotoxicite. Ako kontrola vehikula sa použili bunky ošetrené ekvivalentnými riedeniami DMSO. Po logaritmickej konverzii koncentrácií TEO sa údaje získané v testoch cytotoxicity analyzovali pomocou postupu nelineárnej úpravy krivky. Správnosť zhody sa testovala nelineárnou regresnou analýzou krivky dávka-odozva. Maximálna necytotoxická koncentrácia sa považovala za koncentráciu zlúčeniny, pri ktorej životaschopnosť ošetrených buniek CRFK poklesla o nie viac ako 20% (CC20) vzhľadom na negatívnu kontrolu.

Hodnota CC20 TEO bola vyhodnocovaná pri 27μg/ml a vypočítaná na základe priemeru ± štandardná odchýlka (SD) z troch experimentov. Vo všetkých experimentoch DMSO nepreukázal žiadny účinok na bunky.

Na základe výsledkov testu cytotoxicity sa antivírusová aktivita TEO proti kmeňu FCoV-II 25/92 vyhodnocovala pri 27μg/ml a tiež pod cytotoxickým prahom (13,5 μg/ml). Použitie látky pod cytotoxickým prahom nám umožňuje znížiť toxicitu a dosiahnuť efektívne výsledky pri nižších nákladoch. Konfluentné monovrstvy CRFK buniek 24h na 24-jamkových platniach boli infikované 100µl FCoV-II obsahujúceho 10000 TCID50 s multiplicitou infekcie (MOI) 0,14. Po adsorpcii vírusu počas 1 hodiny pri 37°C sa očkovacie látky odstránili, bunkové monovrstvy sa raz premyli a pridal sa TEO. V neošetrených infikovaných bunkách sa použil D-MEM na nahradenie inokula a použil sa ako vírusová kontrola. Po 72 hodinách sa odobrali alikvóty supernatantov na vírusovú titráciu (Lanave a kol., 2019) a kvantifikáciu RNA (Gut a kol., 1999).

Virucidná aktivita TEO proti FCoV-II sa hodnotila predbežnou liečbou vírusu (10000 TCID50) pomocou TEO v koncentrácii 27μg/ml a nad cytotoxickým prahom (270μg/ml), pretože ak sa použije ako virucid, molekula nie je v priamom kontakte s bunkami. Konkrétne bolo 100µl FCoV-II ošetrených TEO (1 ml) pri izbovej teplote. Na experimenty sa použila vírusová kontrola. Po 10 minútach, 30 minútach a 1 hodine sa alikvotné podiely každej zmesi vírusu-TEO a vírusovej kontroly podrobili vírusovej titrácii (Lanave et al., 2019).

Údaje z testov antivírusovej a virucidnej aktivity boli vyjadrené ako priemer ± SD a analyzované analýzou odchýlky (ANOVA) pomocou Tukeyho testu ako post hoc testu (štatistická významnosť stanovená na 0,05).

Štatistické analýzy sa uskutočňovali pomocou softvéru GraphPad Prism v.8.0.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Vírusové titre infikovaných buniek CRFK ošetrených TEO a neošetrených infikovaných buniek (vírusová kontrola) sa vyjadrili ako log10 TCID50/50 ul a vyniesli sa proti koncentráciám liečiva. Porovnaním vírusového titra neošetrených infikovaných buniek (4,25 log10 TCID50/50 μl) s infikovanými bunkami ošetrenými TEO v koncentrácii 13,5 a 27μg/ml došlo k poklesu o 0,25 (p> 0,05) a 2,25 log10 TCID50/50 μl (p < 0,0001), v danom poradí (obr. 1A). To naznačuje, že TEO v koncentrácii 27μg/ml je schopný významne inhibovať replikáciu vírusu. Antivírusová aktivita TEO proti FIPV korešponduje s výsledkami získanými s hydrosolmi Thymus vulgaris in vitro proti vírusu reprodukčného a respiračného syndrómu ošípaných (PRRSV) (Kaewprom a kol., 2017).

Obrázok 1. Vírusové titre supernatantov odobratých 72 hodín po infekcii z neošetrených CRFK buniek infikovaných FCoV (10 TCID50) a ošetrených éterickým olejom Thymus vulgaris (TEO) v rôznych koncentráciách (13,5 a 27μg/ml). 0=Neošetrené CRFK bunky infikovanée FCoV, NA=Nukleová kyselina

Vírusové titre sa hodnotili metódou zriedenia endpointu, vyjadrili sa ako log10 TCID50/50 μl a vyniesli sa proti TEO pri rôznych koncentráciách (A). Vírusové nukleové kyseliny boli kvantifikované pomocou qPCR, vyjadrené ako log10 vírusových NA/10ul a vynesené proti TEO pri rôznych koncentráciách (B). Pruhy na obrázkoch označujú priemery. Chybové pruhy označujú štandardnú odchýlku.

Vírusové nukleové kyseliny (NA) sa vyjadrili ako log10 vírusových NA/10μl infikovaných buniek ošetrených TEO a vírusovou kontrolou a vyniesli sa proti necytotoxickým koncentráciám liečia. Porovnaním vírusovej nálože neošetrených infikovaných buniek (6,53 log10 vírusových NA/10μl) s infikovanými bunkami ošetrenými TEO pri 13,5 a 27 μg/ml bol zaznamenaný pokles o 0,61 (p = 0,0005) a 1,34 (p <0,0001) log10 NAs /10 μl, v danom poradí (obrázok 1B).

Virucidná aktivita TEO bola vyhodnocovaná pri rôznych koncentráciách a pre rôzne doby kontaktu s FCoV-II (obr. 2). Po 10 minútach TEO pri 27 a 270μg/ml sa zistilo zníženie o 1,5 (p = 0,0008) a 2,5 (p <0,0001) log10 TCID50/50μl v porovnaní s vírusovou kontrolou (4,25 log10 TCID50/50 μl) (Obr. 2A). Po 30 minútach TEO pri 27 a 270 μg/ml indukoval pokles o 1,25 (p = 0,0007) a 3,375 (p <0,0001) log10 TCID50/50 μl v porovnaní s vírusovou kontrolou (3,75 log10 TCID50/50 μl) (Obr. 2B). Po 1 hodine TEO pri 27 a 270μg/ml došlo k poklesu o 1,25 (p = 0,0007) a 3,25 (p <0,0001) log10 TCID50/50μl v porovnaní s vírusovou kontrolou (3,50 log10 TCID50/50μl). K vírusovej inaktivácii došlo v závislosti na dávke a čase, počínajúc od 33,33% a dosahujúcou 92,86%, keď sa TEO použil v najvyššej koncentrácii (270 μg/ml), po 1 hodine (obr. 2C). Virucidnú aktivitu TEO možno vysvetliť schopnosťou poškodiť vírusový obal, čím sa zabráni adsorpcii a penetrácii do hostiteľských buniek (Reichling a akol., 2009), ako ukázala elektrónová mikroskopia u obalu herpesvírusu po predbežnej liečbe EO (Shogan a kol., 2006). TEO by preto mohol byť cenným prostriedkom na dezinfekciu povrchov a mohol by byť prísadou pri príprave potravinových výrobkov.

Obrázok 2. Virucidný účinok TEO pri rôznych koncentráciách (27 a 270 μg/ml) proti FCoV (10000 TCID50). Vírus bol inkubovaný s TEO počas 10 minút (A), 30 minút (B) a 60 minút (C) pri izbovej teplote a následne titrovaný v CRFK bunkách. Vírusové titre FCoV boli vyjadrené ako log10 TCID50/50 μl a vynesené proti TEO pri rôznych koncentráciách. Pruhy na obrázkoch označujú priemery. Chybové pruhy označujú štandardnú odchýlku.

Thymus vulgaris je aromatická rastlina stredomorského pôvodu, ktorá obsahuje EO a lipofilné látky (Nabavi a kol., 2015) a jej extrakty sú bohaté na tymol, karvakrol, p-cymén a γ-terpinén (Kowalczyk a kol., 2020).

Thymus vulgaris preukázal antivírusovú aktivitu proti herpes simplex vírusu (HSV) (Nolkemper a kol., 2006), chrípkovému vírusu (Vimalanathan a Hudson, 2014), vírusu Newcastleskej choroy (Rezatofighi a kol., 2014), PRRSV (Kaewprom a kol., 2017) a IBV (Lelešius a kol., 2019), aj keď antivírusový mechanizmus ešte treba objasniť. Naopak, bola už objasnená inhibícia replikácie vírusu ľudskej imunodeficiencie in vitro pomocou TEO (Feriotto a kol., 2018).

Chemické zloženie TEO odhalilo prítomnosť 26 molekúl, z ktorých hlavnými frakciami boli tymol, p-cymén, γ-terpinén, β-linalool, karyofylén. Aby sa znížila cytotoxicita TEO, bolo by zaujímavé identifikovať aktívne molekuly a testovať ich jednotlivo. Ako sa dalo očakávať, hlavnú zložku TEO použitú v tejto štúdii predstavoval tymol. Dokázalo sa, že tymolová frakcia má účinnosť proti HSV (Sharifi-Rad a kol., 2017) a chrípkovým vírusom (Alburn a kol., 1972). Mali by sa testovať ďalšie menej zastúpené frakcie TEO, aby sa vyhodnotila ich antivírusová aktivita.

Demonštrovali sme in vitro antivírusový a virucidný účinok TEO proti FCoV v bunkách CRFK. Tieto štúdie otvárajú niekoľko perspektív z hľadiska budúcich aplikácií a terapeutických možností pre ľudské a zvieracie koronavírusy.

Prehlásenie o konflikte záujmov

Autori prehlasujú, že nedošlo ku konfliktu záujmov.

Dodatok A. Doplňujúce údaje

Tabuľka 1: Chemické zloženie éterického oleja Thymus vulgaris

ČísloZložkaArea%+SEMSI/MSLRIAI
1propanoic acid, ethyl ester0.10+0.0986714714
2α-tricyclene0.13+0.1094915919
3α-thujene1.21+0.9897925926
4α-pinene1.81+0.1195930931
5camphene1.89+0.7096949952
61-octen-3-ol0.37+0.0183974975
7sabinene0.71+0.3293977977
8β-pinene0.56+0.0394978978
9β-myrcene1.42+0.2586985991
10α-phellandrene0.15+0.019110011003
11p-cymene19.64+2.509510241024
12limonene0.6+0.019110331027
13eucalyptol0.89+0.079910231031
14cis-β-terpineol0.13+0.019011451147
15γ-terpinene8.83+0.879410631059
16α-terpinolene0.12+0.018110851089
17β-linalool4.07+1.559710971098
18camphor1.69+0.779811451146
19borneol1.85+0.989711661167
20terpinen-4-ol1.83+0.899611721174
21α-terpineol0.12+0.018611891190
22methyl thymol, ether0.39+0.229012351235
23isothymol methyl ether0.42+0.0294NA1244
24thymol47.01+1.599412901290
25caryophyllene2.18+0.999914171418
26caryophyllene oxide0.58+0.139115811592
 Celkom charakterizované98.7   
 Ostatné 1.3   
Legenda
SEM= Structural Equation Modeling (Modelovanie štrukturálnych rovníc)
SI/MS= Similarity Index/Mass Spectrum (Index podobnosti / hmotnostné spektrum)
LRI=Linear retention index (Lineárny retenčný index)
AI= Arithmetic Index (Aritmetický index)
NA=not assessed (neposudzované)

Referencie

Pridaj komentár

Vaša e-mailová adresa nebude zverejnená.

sk_SKSK