Pri diskusii o infekcii mačacím koronavírusom (FCoV) v prostredí s viacerými mačkami je dôležité pochopiť správne názvoslovie. Termín FCoV je súhrnný termín pre dva historicky pomenované vírusy. Koronavírus bol nakoniec identifikovaný ako pôvodca mačacej infekčnej peritonitídy (FIP) u mačiek a pomenovaný ako vírus FIP alebo FIPV (Ward, 1970; Zook et al., 1968). Následne sa zistilo, že FIPV je mutantná forma FCoV, ktorá sa vyskytovala v tele mačiek infikovaných rozšíreným a minimálne patogénnym enterickým koronavírusom a bola pomenovaná ako feline enteric coronavirus (FECV) (Pedersen a kol., 1981). Aby sa predišlo nedorozumeniam, tento autor uprednostňuje odkaz na formu FCoV, ktorá je relevantná pre danú diskusiu. Preto je vhodné používať termín FIPV, keď sa diskutuje o forme FCoV, ktorá sa nachádza v špecifickom type bielych krviniek (monocyty/makrofágy) v postihnutých tkanivách a telesných tekutinách mačiek s FIP. Termín FECV sa používa, keď sa hovorí o forme FCoV, ktorá spôsobuje chronické a intermitentné infekcie epitelu v dolnej časti čreva zdravých mačiek a vo veľkom množstve sa vylučuje s výkalmi. Enzootický je správny termín pre infekcie, ktoré sa v populácii zvierat udržujú na nízkej a premenlivej úrovni, zatiaľ čo endemický je zodpovedajúci termín používaný pre ľudí. Epizootický sa vzťahuje na náhle a výrazné vypuknutie novej infekcie, zvyčajne s rýchlym priamym šírením na zvieratá všetkých vekových kategórií. Ľudský ekvivalent pojmu epizootický je epidemický. Klinické “príznaky” sú to, čo veterinárni lekári a lekári pozorujú pri fyzickom vyšetrení alebo čo im sprostredkujú majitelia/rodičia, zatiaľ čo symptómy sú to, čo ľudia rozpoznávajú sami u seba a hovoria o tom svojim lekárom.
FECV, podobne ako iné slizničné patogény mačiek, sa v populácii udržiava ako perzistentná alebo opakujúca sa nezjavná infekcia (t. j. enzootická). FECV sa prvýkrát vylučuje v truse približne od 9. – 10. týždňa života, čo sa zhoduje so stratou materskej imunity (Pedersen et al., 2008). Infekcia prebieha fekálno-orálnou cestou a je zameraná na črevný epitel a primárne príznaky enteritídy sú mierne alebo nevýrazné, prechodné a len zriedkavo chronické alebo závažné (Pedersen et al., 2008; Vogel et al., 2010). Následné vylučovanie výkalov je z hrubého čreva a zvyčajne prestane po niekoľkých týždňoch alebo mesiacoch (Herrewegh et al., 1997; Pedersen et al., 2008; Vogel et al., 2010) s rozvojom imunity. Výsledná imunita je bohužiaľ krátkodobá a časté sú opakované infekcie (Pearson et al., 2016; Pedersen et al., 2008. Zdá sa, že časom sa vytvorí silnejšia imunita a mačky staršie ako 3 roky sa javia ako menej náchylné na opätovnú infekciu a stávajú sa fekálnymi vylučovačmi (Addie et al., 2003).
FIP je spôsobená špecifickými mutantmi FECV, ktoré sa vyvíjajú v priebehu infekcie (Poland et al., 1996; Vennema et al., 1995).1 Konečným rizikovým faktorom pre FIP v prostredí s väčším počtom mačiek je podiel mačiek s vysokým titrom protilátok proti mačaciemu koronavírusu a vylučovaním vírusu v truse (Foley et al., 1997). Mutanty spôsobujúce FIP sa vyvíjajú v 10 % alebo viac prípadoch infekcií FECV, ale len zlomok z nich nakoniec spôsobí ochorenie (Poland et al., 1996). Zdá sa, že skutočný výskyt FIP v populácii s enzootickou infekciou FECV sa pohybuje od cca 1% do 10% mačiek, pričom prípady sa vyskytujú v nepredvídateľných intervaloch a líšia sa od jednotlivých prípadov po malé skupiny (Addie a kol., 1995b; Foley a kol., 1997). Zdá sa, že skutočný výskyt je podmienený viacerými faktormi hostiteľa a prostredia, ktoré určitým spôsobom ohrozujú imunitný systém a zvyšujú riziko FIP.1
Vzhľadom na priamy vzťah medzi prítomnosťou FECV a FIP by logickým spôsobom prevencie FIP bolo minimalizovať vystavenie FECV. Vakcína by bola najjednoduchším prístupom ku kontrole infekcie FECV, ale žiadna vakcína nedokáže vytvoriť lepšiu imunitu ako zotavenie z prirodzenej infekcie, čo sa ukázalo v prípade vakcíny SARS-CoV-II (Li a kol., 2019). Na základe toho, čo je známe o slabosti a krátkodobej povahe prirodzenej imunity FECV (Pearson et al., 2016; Pedersen et al., 2008), spolu so značnými rozdielmi v sérotypoch a kmeňoch medzi rôznymi populáciami a regiónmi (Addie et al., 1995b; Liu et al., 2019), je nepravdepodobné, že sa podarí vyvinúť účinné vakcíny proti FECV.
Hoci enzootickej infekcii FECV sa nedá ľahko zabrániť vakcináciou, je možné eliminovať FECV z uzavretej skupiny mačiek pomocou dôkladného testovania na nositeľov a prísnej karantény (Hickman a kol., 1995). FECV je však v prírode taký všadeprítomný a ľahko sa šíri priamym aj nepriamym kontaktom mačky s mačkou a na fomitoch prenášaných na osobách, že na jeho zastavenie sú potrebné najprísnejšie karanténne zariadenia a postupy. Ako prísna musí byť karanténa? Skúsenosti s testovaním a odstraňovaním v spojení s karanténou na elimináciu a prevenciu infekcie FECV sú obmedzené na jednu správu (Hickman a kol., 1995). FECV bol eliminovaný zo špecifického chovu mačiek bez patogénov na UC Davis odstránením vylučovačov vírusu a výrazným sprísnením karanténnych postupov pre zostávajúcu kolóniu (Hickman et al., 1995). Napriek tomu sa FECV do tejto kolónie po niekoľkých rokoch opäť dostal, a to napriek všetkým pokusom zabrániť jeho šíreniu (Pedersen NC, UC Davis, nepublikované, 2022). Jediný príklad účinnej karantény pre FECV bol opísaný pre mačky na Falklandských ostrovoch (Addie et al., 2012). Tieto ostrovy vo vzdialenom južnom Atlantickom oceáne zostali našťastie bez výskytu FECV, pravdepodobne vďaka svojej extrémnej izolácii. Boli prijaté opatrenia na zabránenie budúcemu neúmyselnému zavlečeniu FECV na ostrovy (Addie et al., 2012). Na základe týchto skúseností je nepravdepodobné, že by sa FECV podarilo udržať mimo akejkoľvek skupiny mačiek chovaných v domácom prostredí, ak by neboli dodržané tie najprísnejšie postupy izolácie a prevencie infekcie.
Zaujímavý prístup k prevencii alebo oddialeniu infekcie FECV u mačiatok v chovných staniciach bol označený ako “skoré odstavenie a izolácia” (Addie a kol., 1995a). Tento prístup vychádzal zo zistenia, že mačiatka narodené matkám vystaveným alebo infikovaným FECV získali materskú imunitu voči infekcii až do veku 9 týždňov (Pedersen a kol., 2008). Preto mačiatka odstavené niekoľko týždňov pred stratou tejto imunity (4 – 6 týždňov veku) sú zvyčajne bez infekcie a ak sa odoberú od matky a izolujú od iných mačiek, teoreticky by sa mohli udržať bez vírusu. Tento postup bol spočiatku populárny, ale zariadenia a karanténne postupy potrebné na zabránenie vstupu vírusu je ťažké udržať v chovoch s väčším počtom chovných mačiek (≥ 5 matiek, Hartmann a kol., 2005). Preto eliminácia FECV u mačiatok skorým odstavom a izoláciou bola vo väčšine bežných domovov/chovateľských staníc odsúdená na neúspech vzhľadom na pretrvávajúce priame a nepriame vystavenie infikovaných mačiek FECV. Ďalším problémom skorého odstavu a izolácie je potreba oddeliť mačiatka bez vírusu od ostatných mačiek vo veľkej skupine. Tento problém by sa dal obísť, ak by sa všetky mačky zbavili infekcie v rovnakom čase. To sa dá dosiahnuť sériovým testovaním výkalov na vylučovanie FECV počas určitého obdobia a vyradením všetkých vylučujúcich mačiek spolu s prísnou karanténou. Keďže však značná časť mačiek v chovoch zapojených do enzootického ochorenia FECV vylučuje výkaly (Foley a kol., 1997; Herrewegh a kol., 1997), eliminácia mačiek môže mať vážny vplyv na genofond (Hickman a kol. 1995). To vyvoláva otázku – existuje spôsob, ako eliminovať FECV u všetkých mačiek v skupine súčasne?
Je zaujímavé, že relatívne nedávny objav účinných antivirotík proti FIP (Pedersen a kol., 2018, 2019) poskytol aj teoretickú metódu na odstránenie všetkých vylučujúcich vírusov naraz. Prvé štúdie o takomto použití antivirotík, hoci mali pomerne predbežný charakter, naznačili, že FECV možno eliminovať z uzavretej skupiny mačiek relatívne krátkou liečbou (Addie et al., 2023). Za predpokladu, že FECV možno odstrániť ako enzootický vírus zo skupiny mačiek použitím špecifických antivirotík, aké sú úskalia takéhoto postupu? Prvé úskalie sa týka trvania imunity voči reinfekcii, ktorú by mohla vyvolať krátka liečba antivirotikami. Následná štúdia mačiek úspešne liečených na FIP liekom GS441524 ukázala návrat nevýrazného vylučovania FECV u 5/18 jedincov v priebehu 3 až 12 mesiacov (Zwicklbauer a kol., 2023), čo naznačuje, že liečba, podobne ako zotavenie z prirodzenej infekcie, neposkytuje dlhodobú imunitu. Druhým úskalím sú náklady na antivirotiká na liečbu primárnych a sekundárnych infekcií, časté testovanie stolice na monitorovanie vylučovania a vytvorenie a udržiavanie primeraných karanténnych zariadení a praxe. Preto sú domáce zariadenia so slabými bariérovými izolačnými postupmi na udržanie tejto skupiny mačiek bez FECV počas dlhšieho obdobia odsúdené na neúspech. Tretie úskalie sa týka bežných činností spojených s chovom a vystavovaním plemenných mačiek. Chov plemenných mačiek zahŕňa častú interakciu medzi mačiatkami a staršími mačkami, ako aj medzi ľuďmi, ktorí sú v kontakte s mačkami a medzi sebou navzájom. Je tiež ťažké si predstaviť, že by sa chovateľ plemenných mačiek a vášnivý účastník výstav zriekol všetkých radostí z chovu a vystavovania svojich mačiek tým, že by sa vyhýbal všetkým takýmto kontaktom. Konečná otázka znie – “teraz, keď sú mačky zbavené FECV, čo by sa s nimi ďalej malo robiť?”. Aká je šanca, že po opustení kontrolovaného prostredia zostanú bez FECV po nejakú dlhšiu dobu? Nebudú mať žiadnu imunitu voči FECV a budú veľmi citlivé na najmenšie expozície. To isté bude platiť aj pre skupinu mačiek, z ktorej pochádzajú. Napokon, a to je najväčšia obava, neustála liečba antivirotikami, ktorá je potrebná na udržanie skupiny mačiek bez infekcie FECV, spôsobí vznik rezistencie na lieky. V súčasnosti vieme, že u mačiek liečených na FIP sa môže vyskytnúť rezistencia na GS-441524, a výskumníci z UC Davis1 aj Cornell University3 sa zhodujú, že získanie rezistencie na lieky pri enzootických infekciách FECV by prevážilo akýkoľvek potenciálny prínos takejto liečby na výskyt FIP. FIP je v súčasnosti liečiteľná vo viac ako 90 % prípadov3, a aj keď sa objaví rezistencia na antivirotiká, je vo veľkej miere obmedzená na postihnutú mačku. Dá sa tvrdiť, že infekcii HIV-1 u ľudí sa v súčasnosti predchádza pomocou antivirotík, bez avizovaných obáv z rezistencie na lieky. Liečba prevencie HIV-1 však nie je monoterapiou, ale zahŕňa niekoľko liekov rôznych tried. Liečba viacerými liekmi sa nevykonáva s cieľom zvýšiť účinnosť liečby, ale skôr s cieľom zabrániť vzniku liekovej rezistencie. Ak sa u vírusu vyvinie rezistencia na jeden liek v kokteile liekov, ostatné lieky mu zabránia v replikácii.
Na záver by som chcel parafrázovať: “Len preto, že sa niečo dá urobiť, malo by sa to urobiť?” Autor sa domnieva, že je potrebné vykonať oveľa rozsiahlejšie a lepšie navrhnuté štúdie, ktoré by sa uskutočnili počas dlhého obdobia, skôr než sa začne vážne uvažovať o liečbe asymptomatickej infekcie FECV antivirotikami ako o prostriedku na prevenciu FIP. Celkový výskyt FIP v menších a dobre udržiavaných chovných staniciach, útulkoch a výskumných chovných kolóniách s enzootickou infekciou FECV je často nízky a v súčasnosti je možné vyliečiť viac ako 90 % prípadov FIP, ktoré by mohli vzniknúť (Pedersen a kol, 2019).3 Praktickým spôsobom, ako znížiť výskyt FIP, je udržiavanie nízkeho počtu chovných mačiek a z nich pochádzajúcich mačiatok, udržiavanie väčšieho počtu starších mačiek, nerozmnožovanie jedincov a krvných línií, ktoré viedli k prípadom FIP, a minimalizovanie stresu z častého privádzania nových mačiek a umiestnenia/zmeny umiestnenia.1 Izolácia a skoré odstavenie môžu byť užitočné aj v menších chovoch (Addie et al., 1995a). Problém s FIP v náhradných/ záchranných zariadeniach predstavuje väčší problém, pretože väčšina mačiek pochádza z divokej populácie a často sú veľmi mladé, keď sa k nim dostanú. Často trpia podvýživou, množstvom iných chorôb a sú vystavené vysokému stupňu stresu spojeného s odchytom, rutinnou liečbou, zmenou stravy, adaptáciou na nové prostredie a nakoniec s opätovným umiestnením do domácnosti.1,3
Literatúra
Addie DD, Bellini F, Covell-Ritchie J, Crowe B, Curran S, Fosbery M, Hills S, Johnson E, Johnson C, Lloyd S, Jarrett O. 2023. Stopping Feline Coronavirus Shedding Prevented Feline Infectious Peritonitis. Viruses. 15(4), 818.
Addie DD, Schaap IA, Nicolson L, Jarrett O, 2003. Persistence and transmission of natural type I feline coronavirus infection. J Gen Virol. 84, 2735–2744.
Addie, D.; Jarrett, O. Control of feline coronavirus infections in breeding catteries by serotesting, isolation, and early weaning. 1995a. Feline Pract. 23, 92–95.
Addie DD, Toth S, Murray GD, Jarrett O. 1995b. Risk of feline infectious peritonitis in cats naturally infected with feline coronavirus. Am J Vet Res. 56, 429-34.
Foley JE, Poland A, Carlson J, Pedersen NC, 1997. Risk factors for feline infectious peritonitis among cats in multiple-cat environments with endemic feline enteric coronavirus. J Amer Vet Med Assoc. 210, 13131318.
Hartmann K, 2005. Feline infectious peritonitis Vet Clin North Am Small Anim Pract. 35(1), 39– 79.
Herrewegh AAPM, Mähler M, Hedrich HJ, Haagmans BL, Egberink HF, Horzinek MC, Rottier PJM, de Groot RJ, 1997. Persistence and evolution of feline coronavirus in a closed cat-breeding colony. Virology 234, 349–363.
Hickman MA, Morris JG, Rogers QR, Pedersen NC, 1995. Elimination of feline coronavirus infection from a large experimental specific pathogen-free cat breeding colony by serologic testing and isolation, Feline Practice 23, 96–102.
Li C, Liu Q, Kong F, Guo D, Zhai J, Su M, Sun D. 2019. Circulation and genetic diversity of Feline coronavirus type I and II from clinically healthy and FIP-suspected cats in China. Transbound Emerg Dis. 66, 763-775.
Pearson M, LaVoy A, Evans S, Vilander A, Webb C, Graham B, Musselman E, LeCureux J, VandeWoude S, Dean GA, 2019. Mucosal Immune Response to Feline Enteric Coronavirus Infection. Viruses 11, 906.
Pedersen NC, Theilen G, Keane MA, Fairbanks L, Mason T, Orser B, Che CH, Allison C, 1977. Studies of naturally transmitted feline leukemia virus infection. Am J Vet Res. 38, 1523–1531.
Pedersen NC, Boyle JF, Floyd K, Fudge A, Barker J, 1981. An enteric coronavirus infection of cats and its relationship to feline infectious peritonitis. Am J Vet Res. 42, 368-377. 5
Pedersen NC, Allen CE, Lyons LA, 2008. Pathogenesis of feline enteric coronavirus infection. J Feline Med Surg. 10, 529–541.
Pedersen NC, Liu H, Dodd KA, Pesavento PA, 2009. Significance of coronavirus mutants in feces and diseased tissues of cats suffering from feline infectious peritonitis. Viruses 1, 166-184.
Pedersen NC, Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC, Eckstrand C, Groutas WC, Bannasch M, Meadows JM, Chang KO, 2018. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 20, 378-392.
Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, Montgomery E, Murakami E, Liepnieks M, Liu H, 2019. Efficacy and
safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 21, 271-281.
Poland AM, Vennema H, Foley JE, Pedersen NC, 1996. Two related strains of feline infectious peritonitis virus isolated from immunocompromised cats infected with the feline enteric coronavirus. J Clin Microbiol. 34, 3180-3184.
Uusküla A, Pisarev H, Tisler A., et al., 2023. Risk of SARS-CoV-2 infection and hospitalization in individuals with natural, vaccine-induced and hybrid immunity: a retrospective population-based cohort study from Estonia. Sci Rep 13, 20347.
Vennema H, Poland A, Foley J, Pedersen NC, 1995. Feline infectious peritonitis viruses arise by mutation from endemic feline enteric coronaviruses. Virology 243, 150-157.
Vogel L, Van der Lubben M, , Te Lintelo EG, Bekker CPJ, Geerts T, Schuif LS, Grinwis GCM, Egberink HF, Rottier PJM, 2010. Pathogenic characteristics of persistent feline enteric coronavirus infection in cats. Vet Res. 41, 71.
Ward JM, 1970. Morphogenesis of a virus in cats with experimental feline infectious peritonitis. Virology 41, 191–194.
Zook BC, King NW, Robinson RL, McCombs HL, 1968. Ultrastructural evidence for the viral etiology of feline infectious peritonitis. Vet Path. 5, 91–95.
Zwicklbauer K, Krentz D, Hartmann K, et al., 2023. Long-term follow-up of cats in complete remission after treatment of feline infectious peritonitis with oral GS-441524. J Feline Med Surg. 25(8)
Poznámky pod čiarou
Pedersen NC. History of Feline infectious Peritonitis 1963-2022 – First description to Successful Treatment. https://sockfip.org/wp-content/uploads/2022/04/Review-FIP-1963- 2022-final-version.pdf4.29.22.pdf.
Cornell University blog. Fight FIP. Unraveling feline infectious peritonitis from the ground up. https://blogs.cornell.edu/fightfip/fip-antivirals/.
Cieľom tejto štúdie bolo zistiť bezpečnosť a účinnosť nukleozidového analógu GS-441524 pre mačky trpiace rôznymi formami prirodzene získanej infekčnej peritonitídy mačiek (FIP).
Metódy
Mačky boli vo veku od 3,4 do 73 mesiacov (priemerne 13,6 mesiaca); 26 mačiek malo vlhkú alebo zmiešanú FIP, 5 suchú formu FIP. Mačky so závažnou neurologickou a okulárnou FIP neboli do štúdie prijaté. Skupina začala s GS-441524 v dávke 2,0 mg/kg SC q24h po dobu najmenej 12 týždňov, ktorá sa zvyšovala, keď to bolo indikované, na 4,0 mg/kg SC q24h.
Výsledky
Štyri z 31 mačiek, ktoré mali ťažkú formu ochorenia, uhynuli alebo boli eutanizované do 2-5 dní a piata mačka po 26 dňoch. Zvyšných 26 mačiek dokončilo plánovaných 12 alebo viac týždňov liečby. Osemnásť z týchto 26 mačiek zostáva zdravých v čase publikácie (OnlineFirst, február 2019) po jednom kole liečby, zatiaľ čo osem ďalších utrpelo relapsy choroby v priebehu 3–84 dní. Šesť z relapsov bolo neneurologických a dva neurologické. Tri z ôsmich ralapsujuúcich mačiek boli liečené opäť rovnakou dávkou, zatiaľ čo piatim mačkám bola dávka zvýšená z 2,0 na 4,0 mg/kg každých 24 hodín. Päť mačiek liečených druhýkrát vyššou dávkou, vrátane jednej s neurologickým ochorením, reagovalo dobre a v čase publikácie boli zdravé. Jedna z troch mačiek znovu liečených pôvodnou nižšou dávkou však mala relaps s neurologickým ochorením a bola eutanizovaná, zatiaľ čo dve zostávajúce mačky reagovali priaznivo, ale došlo k druhému relapsu. Tieto dve mačky boli úspešne liečené tretíkrát pri vyššej dávke, čo vo výsledku viedlo k 25 dlhodobo preživším mačkám. Jedna z 25 úspešne liečených mačiek bola následne eutanizovaná z dôvodu pravdepodobného nesúvisiaceho ochorenia srdca, zatiaľ čo 24 zostalo zdravých.
Záver a význam
GS-441524 sa ukázal ako bezpečný a efektívny pri liečbe FIP. Bola stanovená optimálna dávka 4,0 mg/kg SC q24h po dobu najmenej 12 týždňov.
Lieky, ktoré inhibujú replikáciu vírusov, sa stali ústredným bodom zaujmu pri liečbe ľudských akútnych a chronických RNA a DNA infekcií. Vývoj záujmu o antivírusové lieky pre infekcie zvierat bol však oveľa pomalší. To platí najmä pre mačky, ktoré trpia niekoľkými chronickými vírusovými infekciami podobnými tým ľudským. Medzi infekčné činitele patrí vírus mačacej leukémie a imunodeficiencie (FeLV a FIV), mačací herpesvírus (FHV), virulentný systémový kalicivírus a koronavírus spôsobujúci mačaciu infekčnú peritonitídu (FIPV). Infekcie FeLV a FIV sa darí udržiavať pod kontrolou pomocou testovania, izolácie a/alebo očkovania. Ochorenie spojené s FHV bolo prvou mačacou vírusovou infekciou, kde bolo pre liečbu použité antivirotikum. Vysoko smrteľný systémový kalicivírus postihuje iba malý počet mačiek. Infekcia FIPV je najlepším kandidátom pre vývoj antivírusových liekov, pretože vakcíny sú neúčinné, prostredie s mnohými mačkami veľmi komplikuje prevenciu a zabíja 0,3–1,4% mačiek na celom svete.
Výskyt exotických chorôb, ako je ebola, stredovýchodný respiračný syndróm (MERS) a ťažký akútny respiračný syndróm (SARS) u ľudí, podnietil intenzívny výskum liekov, ktoré inhibujú replikáciu vírusu RNA. Jedným z najsľubnejších antivírusových liekov proti vznikajúcim RNA vírusom je proliečivo (prodrug) adenozínový nukleozidový monofosfát GS-5734 (Remdesivir; Gilead Sciences). GS-5734 preukázal účinnosť pri experimentálnej ebole u opíc rhesus a inhiboval epidemické aj zoonotické koronavírusy v tkanivových kultúrach a v myšacích infekčných modeloch. Tieto sľubné zistenia iniciovali výskum GS-5734 a jeho pôvodného nukleozidu GS-441524 proti FIPV infekcii mačiek. GS-441524 a GS-5734 majú porovnateľné hodnoty EC50 (1,0 uM) a CC50 (> 100 uM) proti FIPV v mačacích bunkách. Preto sa rozhodlo pre účely dalších testov s laboratórnymi mačkami zamerať na chemicky menej komplexný GS-441524. Farmakokinetická štúdia na dvoch laboratórnych mačkách preukázala trvalé a účinné plazmatické hladiny GS-441524 vyše 24 hodín po dávke podanej subkutánne (SC) alebo intravenózne (IV). Tieto výsledky sa rozšírili na 10 laboratórnych mačiek s experimentálne indukovanou brušnou efúznou mačacou infekčnou peritonitídou (FIP). Táto štúdia preukázala, že GS-441524 je vysoko účinný proti experimentálnej FIP, a otvorila tak cestu pre túto klinickú štúdiu.
Cieľom tejto štúdie bolo demonštrovať bezpečnosť a účinnosť GS-441524 pri liečbe mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou FIP. Malomolekulárne lieky, ako je GS-441524, majú hmotnosť <900 daltonov a veľkosť približne 1 nm a môžu ľahko prenikať do buniek a interagovať s kľúčovými cieľovými molekulami. Na rozdiel od už publikovaných látok alebo liekov, ktoré inhibujú FIPV brzdením bunkových procesov vírusmi využívaných pre ich replikáciu, malé molekuly, ako je GS-441524, interferujú priamo s vírusom kódovanými replikačnými procesmi.
Materiály a metódy
Príprava lieku
GS-441524 poskytla spoločnosť Gilead Sciences ako čistý a vysoko stabilný prášok, ktorý bol zriedený na koncentráciu 10 alebo 15 mg/ml v 5% etanole, 30% propylénglykole, 45% PEG 400, 20% vode (pH 1,5 s HCI ). Roztok bol umiestnený do sterilných 50 ml sklenených injekčných fľaštičiek, v ktorých sa pretrepal až do rozpustenia a potom sa podrobil sonickej vodnej kúpeli na 5 až 20 minút, kým nebol číry. Zriedený liek bol uložený do chladu a bol použitý v priebehu 3–4 týždňov.
Koncepcia štúdie
Táto štúdia prebiehala podľa protokolov 19336 a 19863 schválených Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat a Výborom pre hodnotenie klinických skúšok Komisie pre klinické skúšky veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice na Kalifornskej univerzite v Davise. Inštitucionálne pravidlá vylučujú použitie chorých mačiek z útulkov alebo z podobných zariadení, kvôli požiadavke legálneho vlastníctva/adopcie a zaobchádzania za špecifických podmienok so súhlasom majiteľa (doplňujúci materiál). Štúdia nezahŕňala kontrolnú skupinu, pretože neexistuje účinná zrovnávacia liečba. Nebola zahrnutá ani placebo skupina, pretože prípravné štúdie in vitro a in vivo naznačovali, že GS-441524 bude bezpečný a účinnejší ako žiadna liečba.
Výber prípadov a potvrdenie diagnózy
Mačky s FIP boli prijaté od majiteľov alebo ich veterinárnych lekárov, ktorí hľadali súčasné možnosti liečby alebo prístup k predchádzajúcej štúdii antivírusových liekov. Počiatočná diagnóza FIP bola založená predovšetkým na charakteristickej signalizácii, klinických anamnézach a príznakoch choroby, výsledkoch bežných laboratórnych testov a vyšetrení brušných alebo hrudných výpotkov. Definitívnejšia diagnóza založená na RT-PCR alebo imunohistochémii bola síce žiaduca, ale nebola nevyhnutnou podmienkou pre zaradenie. Mačky so zjavným očným alebo neurologickým ochorením boli vyradené kvôli pochybnostiam ohľadne schopnosti antivírusových liekov, vrátane GS-441524, preniknúť cez hematoencefalickú alebo hematookulárnu bariéru.
Do štúdie bolo prijatých 31 mačiek a ich majiteľov (tabuľka 1). Majitelia alebo zástupcovia 26 mačiek prišli na úvodnú liečbu priamo do UC Davis a päť majiteľov a ich mačky (CT59, CT73, CT76, CT78, CT80) boli v ošetrení miestneho veterinára. Mačky prítomné na UC Davis boli znovu prehodnotené, ich diagnóza FIP bola znovu potvrdená na základe signalizácie, klinickej anamnézy, fyzikálneho vyšetrenia, výsledkov predchádzajúcich laboratórnych testov a opakovania kompletného krvného obrazu (CBC), sérových bielkovín a analýz výpotkov. Hrudný alebo brušný výpotok u mačiek s vlhkou FIP bol potvrdený ako pozitívny na FIPV 7b RNA pomocou RT-PCR. Mačky so známkami neefúznej FIP boli ďalej testované brušnou a hrudnou ultrasonografiou na primárne lézie. Očné ochorenie bolo potvrdené oftalmologickou službou VMTH, UC Davis. Neurologický stav v prípadoch s možnými príznakmi ochorenia centrálneho nervového systému bol vyhodnocovaný neurologickou službou VMTH.
Tabuľka 1 Zoznam 31 mačiek zaradených do testovania vrátane laboratórneho označenia, mena mačky, plemena, klinickej formy infekčnej peritonitídy (FIP) a dátumu diagnózy
Na základe predchádzajúcich experimentov s tkanivovými kultúrami a farmakokinetických štúdií na laboratórnych mačkách bol počiatočný dávkovací režim pre GS-441524 stanovený na 2,0 mg/kg SC q24h. Na základe skúseností s inhibítorom 3CL proteázy GC376 proti prirodzene sa vyskytujúcej FIP bola určená minimálna doba liečby 12 týždňov. Liečba sa predĺžila o jeden alebo viac týždňov u mačiek, ktoré stále mali abnormálne hodnoty sérových bielkovín. V neskorších štádiách štúdie sa dávka zvýšila z 2,0 na 4,0 mg/kg v prípadoch, keď sa liečba musela predĺžiť, alebo keď došlo k relapsu choroby. Majiteľom bola každé 4 týždne zasielaná nová dávka lieku vo forme vopred natiahnutých injekčných striekačiek Luer lock s objemom 1 alebo 3 ml s 1 palcovými ihlami Luer veľkosti 22G (0,7x25mm). Injekčné striekačky sa uložili do chladničky a pred aplikáciou sa zahriali na izbovú teplotu. Injekcie boli aplikované pozdĺž chrbtice od 2 cm za lopatkami do polovice bedrovej oblasti a do polovice vzdialenosti nadol na susedný hrudník a boky.
Monitorovanie počas počiatočného obdobia liečby
V čase vstupu do testovania bola u mačiek vysadená všetka liečba, ktorá nebola nevyhnutná – antibiotiká, kortikosteroidy, interferóny, pentoxifylín, nesteroidné protizápalové lieky, alebo lieky na tlmenie bolesti. Počas pobytu na UC Davis boli mačky každých 12 hodín monitorované z hľadiska teploty, chuti do jedla, aktivity, močenia a defekácie. Krv bola odoberaná v 1–3 denných intervaloch na vyhodnotenie hematokritu, celkového proteínu, bilirubínu, počtu bielych krviniek a diferenciálneho počtu bielych krviniek.
Vzorky ascitu sa odobrali na začiatku a potom sa odoberali v jedno alebo niekoľko denných intervaloch čo najdlhšie, ako to bolo možné, a testovali sa na úrovne prepisov FIPV 7b RNA kvantitatívnou (q) RT-PCR (IDEXX molekulárna diagnostika). Rezy tkaniva fixovaného formalínom od piatich pitvaných mačiek, boli podrobené imunohistochémii na proteín nukleokapsidy FIPV.
Monitorovanie počiatočnej a dlhodobej reakcie na liečbu
Mačky boli prepustené do domáceho ošetrenia, keď bola zaznamenaná významná priaznivá odpoveď na liečbu, zvyčajne do 3–5 dní. Počas tohto obdobia boli majitelia poučení, ako správne podávať subkutánne injekcie, a boli vyzvaní, aby pokračovali v denných záznamoch o telesnej teplote, aktivite, chuti do jedla, defekácii a močení a týždenných meraniach telesnej hmotnosti. CBC a sérový chemický panel boli robené v mesačných intervaloch miestnymi veterinármi alebo počas návštev VMTH. Bolo potrebné zaznamenávať a okamžite hlásiť akékoľvek abnormálne príznaky alebo správanie. Odôvodnená eutanázia bola zvyčajne vykonaná veterinárnym lekárom majiteľa alebo, ak to bolo možné, v UC Davis. Telá boli okamžite ochladené a zapečatené v plastových vreciach, a odoslané do 2 alebo menej dní v kontajneroch chladených ľadom na UC Davis expresnou poštou. Pitvy boli vykonané jedným z autorov (ML) v Anatomic Pathology Service, School of Veterinary Medicine, UC Davis. Bola rešpektovaná žiadosť majiteľa o konečnú dispozíciu tela.
Výsledky
Signalizácia a prezentácia choroby
Do štúdie bolo zaradených 31 mačiek vo veku od 3,4 do 73 mesiacov (priemerne 13,6 mesiacov) (tabuľka 1). Osemnásť mačiek boli domáce krátkosrsté a dlhosrsté , 13 mačiek predstavovalo zástupcov 10 rôznych plemien (tabuľka 1). Domáce mačky boli adoptované z organizácií na záchranu mačiek (n = 13), útulkov (n = 2) alebo to boli túlavé mačky z okolia (n = 3). Štúdia zahŕňala 14 samíc (7 nekastrovaných; 7 kastrovaných) a 17 samcov (1 nekastrovaný; 16 kastrovaných).
Dvadsaťšesť z 31 mačiek malo vlhkú FIP (6 hrudná, 20 brušná). Päť mačiek malo neefúznu FIP; štyri z nich (CT59, CT64, CT73, CT78) s ochorením lokalizovaným do brucha (mezenterické a ileo/cekálne/kolické lymfatické uzliny) a jedna (CT79) do hrudníka (pľúca, hilárne lymfatické uzliny) (tabuľka 1). Štyri ďalšie mačky vykazovali znaky skoršej suchej FIP, ktorá prešla do efúznej formy (CT57, CT65, CT67, CT71) (tabuľka 1). Hrubé príznaky očného ochorenia zodpovedajúce FIP sa potvrdili oftalmoskopickým vyšetrením u troch z 31 mačiek (CT56, CT65, CT71). Dve mačky (CT71, CT80) neochotne alebo už vôbec nedokázali skákať na vyvýšené miesta, čo naznačovalo neurologické postihnutie.
Výsledky liečby
Štyri mačky boli eutanizované (CT62, CT72, CT75) alebo uhynuli (CT56) počas prvých 2–5 dní kvôli závažnému ochoreniu a iným komplikáciám a piata mačka bola eutanizovaná (CT54) po 26 dňoch z dôvodu chýbajúcej reakcie na liečbu (obrázok 1). Liečba prebiehala bez prerušenia, s výnimkou troch mačiek, ktorým bol v 4. (mačka CT80) alebo 8. týždni (mačky CT53, CT71) poskytnutý dvojtýždňový oddych kvôli problémom s podávaním injekcií a kožným reakciám (obrázok 1). Mačka CT53 bola po druhom relapse liečená po dobu 8 a nie 12 týždňov z dôvodu zvýšenia močoviny v krvi a zvýšenia sérových hladín symetrického dimetylarginínu (SDMA).
Obrázok 1. Časová škála liečby a klinický výsledok 31 mačiek, ktoré boli zaradené do klinickej štúdie GS-441524. Obdobie liečby je označené plnou čiarou (dávka 2 mg/kg) alebo prerušovanou čiarou (dávka 4 mg/kg). Hviezdičky označujú bod relapsu. Dátum ukončenia liečby pre mačky, ktoré dosiahli trvalú klinickú remisiu, je uvedený v zátvorkách. Časový bod a príčina smrti sú označené krížikom
Klinická reakcia 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby, bola dramatická. Horúčka zvyčajne ustúpila do 12–36 hodín (obrázok 2), súčasne s každodenným výrazným zvýšovaním chute do jedla, úrovne aktivity a prírastku hmotnosti. Brušné výpotky rýchlo vymizli počas 1-2 týždňov, počnúc asi 10.-14. dňom po zahájení liečby. Mačky s hrudným výpotkom zvyčajne vykazujúce dýchavičnosť, absolvovali u praktickych súkromných veterinárov odsatie pleurálnych výpotkov ešte pred príchodom na UC Davis. Zbytková dýchavičnosť a hrudný výpotok rýchlo reagovali na liečbu a po 7 dňoch už neboli vôbec viditeľné. Žltačka pomaly odznela v priebehu 2–4 týždňov, súčasne s poklesom hyperbilirubinémie. Známky očného ochorenia začali miznúť do 24-48 hodín a prestali byť zjavné navonok i pre oftalmoskopické vyšetrenie do 7–14 dní. V priebehu liečby začalo dochádzať k zmenšovaniu zväčšených mezenterických a ileo/cekálno/kolických lymfatických uzlín. Všetkých 26 mačiek vyzeralo podľa odhadov majiteľov navonok normálne alebo takmer normálne po 2 týždňoch liečby. Po 2 týždňoch liečby sa kládol dôraz na sledovanie niekoľkých parametrov krvných testov. Kľúčové hodnoty zahŕňali hematokrit, celkový počet bielych krviniek, absolútny počet lymfocytov, celkový sérový proteín, sérový globulín, sérový albumín a pomer albumín: globulín (A:G).
Obrázok 2. Priemer (plná čiara) a 1 SD (smerodajná odchýlka) (čiarkovane) telesných teplôt počas prvých 5 dní liečby GS-441524. Normálny teplotný rozsah pre mačky je 37,7–39,1 °C (100–102,5 ° F). Teploty klesli do normálneho rozsahu do 12–36 hodín od začiatku liečby
Osemnásť z 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov neprerušenej primárnej liečby, nevyžadovalo žiadnu ďalšiu liečbu. Osem ďalších mačiek však utrpelo relapsy choroby v priebehu 3–84 dní (priemerne 23 dní) (obrázok 1). Táto skupina zahŕňala tri mačky, u ktorých došlo k dočasnému prerušeniu počiatočnej liečby (CT53, CT71, CT80), a päť mačiek (CT53, CT57, CT60, CT68, CT73), ktoré vyžadovali predĺženú primárnu liečbu (obrázok 1). Relapsy choroby u 2/8 mačiek (CT57, CT71) mali zjavne neurologický charakter s vysokou horúčkou a silnou zadnou ataxiou a nekoordináciou, zatiaľ čo relapsy choroby u zvyšných šiestich mačiek pozostávali hlavne z horúčky, anorexie a znízenej aktivity. Iba jedna mačka (CT60) mala pri relapse zjavný brušný výpotok. Jedna mačka (CT57) bola eutanizovaná 2 týždne po relapse s neurologickými príznakmi, ktoré nereagovali na druhé kolo liečby.
U ôsmich mačiek bolo rozhodnuté zvýšiť dávku GS-441524 z 2,0 na 4,0 mg/kg, buď z dôvodu predĺženia liečby (CT77, CT80), alebo z dôvodu jedného (CT60, CT68, CT71, CT73) alebo dvoch relapsov (CT53, CT63), alebo preto, že relaps mal neurologickú formu (CT71). Všetkých osem mačiek reagovalo pozitívne na režim zvýšeného dávkovania.
Celkovo 25/26 mačiek liečených 12 týždňov alebo dlhšie dosiahlo trvalú remisiu FIP, hoci jedna z nich následne zomrela na nesúvisiaci problém so srdcom (pozri „Pitevné nálezy“). Najdlhšie prežívajúce mačky v čase publikácie (OnlineFirst, február 2019) ukončili liečbu v auguste 2017 a najkratšie v máji 2018, všetky po ukončení pozorovacieho obdobia, v ktorom ešte mohlo dôjsť k relapsu (tj. 84 dní po ukončení liečby). 24 preživších mačiek bude starostlivo monitorovaných pre prípadný návrat príznakov ochorenia a budú sa pravidelne testovať na celkový pomer bielkovín, globulínu, albumínu a A:G počas prvého roka. Menej intenzívne monitorovanie sa bude vykonávať po zvyšok života mačiek. Majitelia boli upozornení, aby sa vyhli zbytočnému namáhaniu mačiek počas prvých 3 mesiacov, aj keď štyri mačky (CT52, CT58, CT65, CT79) a jeden kocúr (CT76) absolvovali bezproblémovú kastráciu.
Ukazovatele priaznivej reakcie na liečbu
Najjednoduchším dlhodobým meradlom účinnosti liečby bola telesná hmotnosť. K nárastu hmotnosti o 20–120% došlo počas a po liečbe, dokonca aj u mačiek, ktoré v čase diagnózy mali 1 rok alebo viac. Zdá, že výrazný rast sa prejavil aj u mladších mačiek, ako to nezávisle zaznamenali ich majitelia. Tieto výrazné zrýchlenia rastu po liečbe naznačili, že FIP bola u mnohých mačiek nejaký čas pred diagnózou subklinická a ovplyvnila ich rast. Pri sledovaní neskorších účinkov liečby a pri pozorovaní možných toxicít liekov sa osvedčili aj CBC (hematológia) a chemický profil (biochémia).
CBCs (Hematológia)
Mačky vykazovali zvýšený počet bielych krviniek, ktorý klesol na normálne hodnoty v priebehu prvých 2 týždňov liečby (obrázok 3a). Lymfopénia zaznamenaná v čase prijatia vymizla počas prvého týždňa liečby (obrázok 3b). Pri prijatí sa pozorovala mierna až stredne závažná anémia, čo sa prejavilo v hematokrite (PCV) (obrázok 4). Hematokrit sa vrátil na normálne hodnoty až po 6–8 týždňoch liečby. Absolútny celkový počet bielych krviniek a lymfocytov boli jedinými významnými hodnotami počas prvého týždňa liečby, zatiaľ čo PCV poskytol presnejší obraz postupu liečby počas prvých 8 týždňov.
Obrázok 3. (a) Priemerný počet bielych krviniek so štandardnou odchýlkou u 26 mačiek, ktoré dokončili primárny liečebný režim 12 alebo viac týždňov. (b) Priemerný absolútny počet lymfocytov v krvi so štandardnou odchýlkou u 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby
Obrázok 4. Hematokrit (PCV) so štandardnou odchýlkou pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby. Bodkovaná čiara naznačuje trend rastu PCV v priebehu času
Zmeny sérových bielkovín
Mačky s FIP často vykazovali vyššiu ako normálnu celkovú koncentráciu bielkovín v sére, vysokú hladinu sérového globulínu, nízku hladinu sérového albumínu a nízky pomer A:G (obrázky 5–7). Abnormálne hodnoty sérových bielkovín sa progresívne zlepšovali a dosiahli normálne hodnoty po 8–10 týždňoch liečby (obrázky 5–7). Hladina celkového proteínu bola najmenej informatívna, čo naznačuje nízka hodnota R2 (0,1883) trendovej spojnice (obrázok 5). Avšak 3 týždne po zahájení liečby došlo k dramatickému a prechodnému zvýšeniu celkových hladín proteínov (obrázok 5). Tento jav súvisel so zvýšením sérových globulínov (obrázok 6a) v čase rýchleho ústupu brušných výpotkov.
Obrázok 5. Priemerné hladiny celkového proteínu v sére a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby
Obrázok 6. (a) Priemerné hladiny sérového globulínu a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby. (b) Priemerné hladiny sérového albumínu a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby
Obrázok 7. Priemerné pomery albumínu:globulínu (A/G) a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby
Plazmatické hladiny globulínu stúpali počas prvých 3 týždňov liečby, dosiahli vrchol a potom pomaly klesali na maximálnu referenčnú hodnotu 4,5 g/dl alebo nižšiu do 9. týždňa (obrázok 6a). Aj keď sa zdá, že hladiny globulínu v priebehu času reflektovali stav liečby, nízka hodnota R2 (0,3621) ukázala, že sa jedná o menej spoľahlivý ukazovateľ pokroku v liečbe.
Hladiny albumínu v sére 26 mačiek liečených najmenej 12 týždňov boli v čase zahájenia liečby zvyčajne nízke (⩽3,2 g/dl) (obrázok 6b). Hladiny albumínu sa potom pomaly zvyšovali a dosiahli normálnu úroveň po 8 týždňoch. Trendová čiara tohto nárastu albumínu mala vysokú hodnotu R2 (0,79), vďaka čomu boli hladiny sérového albumínu, ako aj PCV, dobrým indikátorom pokroku v liečbe. Ako sa očakávalo, pomer A:G vykazoval v priebehu času rovnako silnú trendovú líniu a okolo 8. týždňa liečby úroveň presiahla hodnotu 0,70 (obrázok 7).
Pokles hladiny vírusovej RNA v bunkách z ascitickej tekutiny v spojitosti s liečbou
Počas prvých 2–9 dní antivírusovej liečby sa odoberali od ôsmich mačiek sekvenčné vzorky ascitu a testovali sa na hladiny vírusovej RNA pomocou qRT-PCR (tabuľka 2). Najspoľahlivejším zdrojom FIPV RNA boli celé výpotky alebo ich bunkové frakcie. U 7/8 mačiek hladiny vírusovej RNA poklesli do 2-5 dní, často na nedetekovateľné hodnoty. U jednej mačky (CT54) sa neprejavil významný pokles hladín vírusovej RNA ani v priebehu 9 dní.
Tabuľka 2 Úrovne prepisov RNA vírusu mačacej infekčnej peritonitídy 7b v celých ascitoch alebo v bunkovej frakcii ascitickej tekutiny počas počiatočnej liečby GS-441524
ID vzorky
Dni liečby
Typ vzorky
Kópie vírusovej RNA/ml
CT52
0
Ascites
9.44 × 104
3
Ascites
Nezistiteľné
CT54
0
Ascites
8.49 × 105
2
Ascites
6.97 × 104
4
Ascites
2.44 × 103
7
Ascites
2.07 × 103
9
Ascites
6.46 × 104
CT62
0
Ascites
5.96 × 103
2
Ascites
1.53 × 103
8
Ascites
Nezistiteľné
CT74
0
Bunky
6.51 × 106
2
Bunky
3.39 × 105
CT75
0
Bunky
9.08 × 106
3
Bunky
4.75 × 105
4
Bunky
2.50 × 105
CT77
0
Ascites
5.47 × 104
2
Ascites
3.93 × 103
CT80
0
Ascites
4.10 × 103
2
Ascites
Nezistiteľné
CT82
0
Ascites
1.13 × 104
5
Ascites
Nezistiteľné
Vedľajšie účinky pozorované počas liečby a po liečbe
Ohraničené reakcie v mieste vpichu. Boli pozorované dva typy reakcií v mieste vpichu, a či boli spôsobené liekom, riedidlom alebo obomi, nebolo zistené. Okamžité reakcie na bolesť sa prejavovali vokalizáciou, občasným vrčaním a posturálnymi zmenami trvajúcimi 30–60 s. Tieto počiatočné reakcie sa časom zmierňovali, pretože majitelia sa stávali viac zručnými v podávaní injekcií a mačky sa tejto rutine postupne prispôsobovali. U šestnástich z 26 liečených mačiek sa prejavili reakcie v mieste vpichu (tabuľka 3). Reakcie boli zjavné najčastejšie počas prvých 4 týždňov a progredovali do otvorených rán iba u 7/16 mačiek. Ulcerácie sa zahojili do 2 týždňov zastrihnutím okolitých chlpov a jemným vyčistením rany vatovým tampónom namočeným v jednom diele peroxidu vodíka pre domácnosť a v dvoch dieloch vody dvakrát denne. Iba tri mačky mali znateľné jazvy v miestach vpichu.
Tabuľka 3 Reakcie v mieste vpichu u 16 z 26 mačiek liečených GS-441524 po dobu 12 týždňov alebo dlhšie
ID mačky
Povrchové lézie
Otvorené rany
Jazvy
CT53
3
1
0
CT58
1
0
0
CT60
0
0
2
CT61
5
0
0
CT63
2
2
0
CT64
1
0
1
CT65
9
1
1
CT66
3
2
0
CT68
4
0
0
CT71
5
1
0
CT73
7
1
0
CT74
3
1
0
CT76
10
0
0
CT78
7
0
0
CT79
2
0
0
CT82
2
0
0
Väčšina lézií bola povrchová a zahŕňala epidermis a nevyžadovala žiadnu liečbu, zatiaľ čo u niektorých došlo k progresii do otvorených rán, ktoré sa uzdravili do 2 týždňov topickou liečbou. Niektoré reakcie zanechali malé trvalé jazvy
Systémové liekové reakcie. Liečba GS-441524 v celkovom období 12–30 týždňov bola pozoruhodne bezpečná. V hodnotách CBC neboli pozorované žiadne dlhodobé abnormality (obrázky 3 a 4). Testy funkcie pečene a obličiek a hladiny amylázy/lipázy zostali počas liečby a po liečbe normálne (doplňujúce obrázky S1 – S3). Jedinou výnimkou bola mačka CT53, u ktorej došlo k progresívnemu zvýšeniu močoviny v krvi (BUN) na 35 mg/dl (referenčný interval [RI] 16–37 µg/dl) a k náhlemu zvýšeniu SDMA (20 µg/dl) (RI 0-14 µg/dl) po 8 týždňoch v treťom kole liečby v režime zvýšenej dávky 4 mg/kg. Aj keď mali tieto príznaky stále miernu povahu, bolo pre istotu rozhodnuté ukončiť liečbu. Tieto abnormality pri testovaní o 1 mesiac neskôr už neboli prítomné a mačka je momentálne v remisii choroby.
Pitevné nálezy
Štyri mačky (CT56, CT62, CT72, CT75) boli eutanizované alebo uhynuli do 2–5 dní od zaradenia do štúdie a pitvy boli vykonané u všetkých okrem mačky CT75. Piata mačka (mačka CT54) bola eutanizovaná po 26 dňoch liečby. Všetkých päť týchto mačiek malo závažné brušné efúzne ochorenie. U mačky CT54 a CT56 sa pri pitve našli dôkazy o rozšírenej pyogranulomatóznej vaskulitíde zahŕňajúcej brušné vnútornosti, centrálny nervový systém a oči. U mačky CT56 došlo aj kompromitácii ileálnej steny v oblasti hustého infiltrátu a sekundárnej bakteriálnej sepse. Mačka CT72 mala ťažkú pyogranulomatóznu vaskulitídu obmedzenú na brucho so stredne ťažkým až ťažkým periférnym edémom a mineralizáciou kôry nadobličiek. Mačka CT62 trpela ťažkou pyogranulomatóznou a fibrinosuppuratívnou peritonitídou, ktorú komplikovala akútna perforácia žalúdka spojená s rastlinným materiálom a intralezionálnymi baktériami svedčiacimi o sepse. Mačka CT75 vykazovala chronickú formu FIP charakterizovanú silným spomalením rastu, masívne nízkym obsahom bielkovín / nízkym obsahom buniek vo výpotku, zrýchlenou činnosťou srdca svedčiacou o poškodení srdcovej funkcie a stredne závažným periférnym edémom. Echokardiogram ukázal bilaterálne zväčšenie predsiení, ale nijaký náznak primárneho srdcového ochorenia. Zdalo sa, že mačka reagovala na GS-441524 a bola prepustená. Mačka upadla o 2 dni neskôr do šoku a bola eutanizovaná bez pitvy.
V čase pitvy mačiek CT56, CT72 a CT75 pri použití qRT-PCR nebol vírus FIPV detekovaný, hoci vzorky ascitu pred liečbou boli pozitívne. Ascites z mačky CT54 vykazoval pozitívny výsledok qRT-PCR počas celej liečby (tabuľka 2) a tkanivá boli v čase pitvy stále imunohistochemicky pozitívne.
Po úspešnom absolvovaní jedného alebo viacerých kôl liečby boli eutanizované aj ďalšie dve mačky. Mačka CT57 bola po jednom kole liečby normálna, ale o 2 týždne neskôr došlo k relapsu so závažnými neurologickými príznakmi. Mačka nereagovala na opakovanú liečbu a bola usmrtená. Lézie typické pre FIP sa našli v mozgu a bruchu, ale boli negatívne na FIPV určený imunohistochémiou pre nukleokapsidový proteín alebo na 7b RNA pomocou qRT-PCR. Mačka CT80 bola úspešne liečená na efúznu brušnú FIP, ale o 4 týždne neskôr sa u nej objavili silné bolesti zadných nôh a krížov. Zistilo sa, že mačka mala výrazné zhrubnutie steny ľavej komory a septa, ktoré spôsobilo vážne zúženie komory (obrázok 8). Mikroskopický vzhľad steny ľavej srdcovej komory bol typický pre vrodenú mačaciu hypertrofickú kardiomyopatiu (HCM). V brušnej dutine, na hrudníku, v očiach, v mozgu alebo v chrbtici sa nezistili žiadne hrubé ani mikroskopické lézie FIP a qRT-PCR nedetekoval FIPV antigén a ani RNA FIPV.
Obrázok 8. Prierez srdcom mačky CT80 vykazujúci extrémnu hypertrofiu steny ľavej komory a septa a extrémne zúženie komory
Diskusia
GS-441524 je za posledné 2-3 roky po GC376 druhým testovaným cieleným antivírusovým liekom pre liečbu FIP. Tieto dva lieky inhibujú vírusovú replikáciu dvoma veľmi odlišnými spôsobmi, buď ukončením vírusovej RNA transkripcie alebo blokovaním štiepenia vírusového polyproteínu. Oba procesy sú dobre známym cieľom pre liečbu niektorých ľudských vírusových ochorení. Kľúčovou otázkou je porovnanie liečby nukleozidovým analógom s liečbou inhibítorom vírusovej proteázy. Tieto dva lieky poskytli prakticky identické výsledky v štúdiách na tkanivových kultúrach a experimentálne infikovaných mačkách. Účinnosť proti prirodzene sa vyskytujúcej FIP sa však javila pri GS-441524 vyššia ako pri GC376. Šesť z 20 mačiek liečených GC376 zostáva dodnes v remisii (Pedersen NC, nepublikované údaje, 2018) v porovnaní s 25/31 mačkami liečenými GS-441524. Ochorenia, ktoré nereagovali na opakovanú liečbu, sa vyskytli u 14/20 mačiek s GC376 ale iba u jednej mačky liečenej GS-441524. 8 zo 14 relapsov spojených s GC376 malo neurologický charakter, v porovnaní s 2/8 relapsmi s GS-441524. Jeden z dvoch neurologických relapsov u mačiek liečených GS-441524 reagoval na opakovanú liečbu vyššou dávkou, zatiaľ čo neurologické relapsy s GC376, dokonca ani pri zvýšenej dávke, už neboli liečiteľné. Obidve liečby spôsobovali podobné reakcie v mieste vpichu. Obidva lieky sa javia ako pomerne bezpečné, hoci GC376 interferoval s vývojom trvalých zubov, keď sa podával mladším mačiatkam.
Aj keď sa zdá, že výsledky klinickej štúdie uprednostňujú GS-441524, niektoré rozdiely mohli byť ovplyvnené tým, ako boli tieto dva lieky podávané. Účinnosť GC376 sa mohla zlepšiť, ak by bolo všetkých 20 mačiek liečených bez prerušenia po dobu 12 týždňov, namiesto toho, aby boli liečené progresívne dlhšími obdobiami, začínajúcimi iba na 2 týždňoch. Päť zo šiestich mačiek vyliečených pomocou GC376 patrilo medzi sedem mačiek, ktoré boli liečené nepretržite po dobu 12 týždňov, zatiaľ čo bola vyliečená iba jedna z 13 mačiek liečených jedenkrát alebo viackrát po kratšiu dobu. Tieto kratšie doby trvania liečby boli nevyhnutné na stanovenie 12-týždňového obdobia použitého pre všetky mačky v tejto štúdii. Klinická štúdia GC376 okrem toho zahŕňala menej mačiek a bola limitovaná obmedzeným prísunom lieku, čo sťažilo testovanie ďalších dávkovacích režimov. Preto by sa mal GC376 pred akýmkoľvek konečným porovnaním ďalej študovať s použitím minimálne 12 týždňov s vyššou dávkou a väčším počtom mačiek. Bolo by tiež dôležité niekedy v budúcnosti vyhodnotiť obidva typy liekov v kombinácii, tak ako sa to robí pri HIV/AIDS a hepatitíde C.
V každej štúdii tohto typu treba počítať s predčasnými úmrtiami, ale ako by sa mali posudzovať pri analýze účinnosti? Päť predčasných úmrtí v tejto štúdii bolo zahrnutých do analýzy účinnosti GS-441524, ale boli vyradené v štúdii GC376. Pre zahrnutie úmrtí do štúdie je dôležité zistenie statusu vírusu v čase smrti. Vírusová RNA sa nezistila u troch pitvaných mačiek, ktoré uhynuli po 2–5 dňoch liečby s GS-441524, čo naznačuje, že liek bol účinný, ale choroba bola v príliš pokročilom štádiu. Nebolo to tak v prípade štvrtej pitvanej mačky, ktorá prežila 26 dní; hladiny vírusovej RNA počas celého obdobia liečby neklesli a príznaky choroby sa nezmiernili. Preto je možné, že táto mačka uhynula v dôsledku neúspešného zastavenia replikácie vírusu. Rezistencia na GS-5734 (Remdesivir), proliečivo GS-441524, bola spojená s mutáciami aminokyselín v RNA polymeráze a korekčnou exonukleázou v tkanivovými kultúrami propagovaných koronavírusoch. Či sa u tejto mačky vyskytla podobná rezistencia, bude ešte treba zistiť. Rezistencia na lieky bola pozorovaná u aj u jednej mačky v teste GC376. Našťastie žiadna z ďalších mačiek v súčasnej štúdii nevykazovala príznaky rezistencie na lieky. U budúcich mačiek, ktoré nereagujú vôbec alebo reagujú nedostatočne na primárnu alebo sekundárnu liečbu, je však potrebné túto možnosť vziať do úvahy.
Počiatočná dávka GS-441524 použitá v predloženej štúdii bola stanovená na základe predchádzajúcich farmakokinetických a experimentálnych infekčných štúdií s laboratórnymi mačkami. Tieto štúdie naznačili, že 2,0 a 5,0 mg/kg SC q24h po dobu 14 dní by boli rovnako účinné aj pri klinickej štúdii. Preto bola pre klinické testovanie zvolená dávka 2,0 mg/kg, pretože by to znížilo spotrebu lieku o 60%. Aj keď bolo toto rozhodnutie potvrdené u 18/26 mačiek, osem ďalších mačiek buď utrpelo relapsy choroby (dve dokonca dvarát), alebo si vyžiadali dlhšie trvanie liečby, aby sa kľúčové hodnoty krvi dostali späť do normálu. Preto bolo urobené rozhodnutie zvýšiť dávku GS-441524 z 2,0 mg/kg na 4,0 mg kg SC q24h u mačiek, u ktorých došlo k relapsu alebo vyžadovali predĺženú liečbu. Úspešnosť 4,0 mg/kg SC q24h u najmenej 12 takýchto mačiek, ako aj u jednej mačky s neurologickým ochorením, nás priviedla k záveru, že ide o účinnejšie dávkovanie a malo by sa stať základom pre budúcu liečbu.
Bolo dôležité sledovať jednoduché biologické ukazovatele pokroku v priebehu ⩾ 12 týždňovej liečby. Ako užitočné markery boli identifikované hladiny HCT (PCV), hladiny celkového proteínu v sére, globulínu a albumínu a pomer A:G. Na základe týchto parametrov sa ukázalo, že mačky sa po 6–10 týždňoch liečby ešte celkom nezotavili. Toto zistenie potvrdilo minimálne 12-týždňové trvanie liečby stanovené v predchádzajúcej klinickej štúdii GC376. Chronická anémia (anémia zápalu) postihuje 18–95% ľudí s akútnymi a chronickými infekciami a je normocytová/normochromická a nesúvisí s nedostatkom železa. Dobrým ukazovateľom aktivity ochorenia boli aj plazmatické hladiny albumínu, a je známe, že nízky albumín a nízky HCT (PCV) korešpondujú s výskytom chronického ochorenia. Hyperglobulinémia u mačiek s FIP bola klasifikovaná ako infekčná/zápalová a je spôsobená zvýšením vo všetkých triedach gama globulínov a variabilnými prírastkami vo frakcii alfa-2 globulínov. Výrazná tendencia mačiek s FIP k vysokej sérovej hladine globulínu a nízkej hladine albumínu robí z pomeru A:G obzvlášť dobrý indikátor aktivity ochorenia.
Očakávalo sa, že čistokrvné mačky nebudú rovnako dobre reagovať na liečbu z dôvodu geneticky oslabenej schopnosti imunologicky reagovať na FIPV, a že mladšie mačky s vlhkou FIP budú na liečbu reagovať najlepšie. V tejto štúdii však nakoniec čistokrvné mačky reagovali rovnako dobre ako obyčajné mačky, a plemená zastúpené mačkami v štúdii odrážali najpopulárnejšie súčasné plemená. Staršie mačky a mačky s čistou neefúznou FIP reagovali na liečbu GS-441524 rovnako dobre, ako mladé mačky a mačky s vlhkou FIP. Za predpokladu, že sa dá pomocou GS-441524 liečiť aj časť mačiek s očným a neurologickým ochorením, sa dá povedať, že by sa už žiadne prejavy FIP nemuseli považovať za neliečiteľné.
Bezpečnostný profil GS-441524 bol pôsobivý. Na základe CBC a sérových chemických hodnôt počas celkových liečebných období v trvaní od 12 do 30 týždňov sa až na jednu možnú výnimku nepozorovali žiadne významné systémové príznaky toxicity. Jedna mačka (CT53) mala mierny nárast BUN a SDMA v 8. týždni tretieho kola liečby a v rámci preventívnych opatrení si vynútila pozastavenie liečby. Na základe predchádzajúcich skúseností s GC376 boli obavy z účinku GS-441524 na vývoj trvalého chrupu. Tri mačky (CT52, CT74, CT77) v tejto štúdii boli vo veku 4 mesiacov alebo mladšie a stále mali juvenilný chrup a žiadna z nich nevykazovala žiadne následné zubnej abnormality. U GS-441524 sa pozorovali reakcie v mieste vpichu, ale ich počet bol pozoruhodne nízky a boli ľahko liečiteľné. Nezistilo sa, či je na vine liek, riedidlo alebo oboje. pH riedidla 1,5 bolo hlboko pod minimálnou hraničnou hodnotou 4,5 stanovenou FDA (Food and Drug Administration), avšak liečivá tohto typu sa ťažko rozpúštajú a stabilizujú pri fyziologicky priaznivejšom pH. Napriek tomu by sa malo vyhodnotiť viac fyziologických riedidiel.
Jedna mačka v štúdii (CT80) mala znepokojivé klinické príznaky. Aj keď mačka vykazovala efúznu brušnú FIP, mala aj dlhodobé príznaky nejasného zakrivenia zadnej končatiny, bolesti krížov, pravidelných epizód padania, neochoty skákať na vyššie miesta a nevysvetliteľných a prechodných zmien správania. Tieto príznaky viedli k liečbe mačky ešte dlho po zmiznutí brušného výpotku. Nakoniec sa prijalo rozhodnutie liečbu prerušiť a zistiť, či sa vrátia charakteristické príznaky FIP. Mačka bola nakoniec eutanizovaná a pri pitve bolo zistené, že má vrodený typ HCM a žiadne zvyškové lézie FIP alebo vírusovej RNA v akýchkoľvek tkanivách. Dilatačná kardiomyopatia bola hlásená u 17,6% ľudí infikovaných HIV pri chronickej antiretrovírusovej liečbe. Dospelo sa však k záveru, že príčinou srdcového ochorenia u tejto mačky nebol GS441524. Ochorenie srdca u tejto mačky bolo hypertrofické na rozdiel od dilatačnej formy pozorovanej u pacientov s HIV, a navyše je HCM u útulkových mačiek pomerne bežná.
Závery
Výsledky získané od 31 mačiek liečených GS-441524 prekonali všetky očakávania a naznačujú, že FIP, bez ohľadu na signalizáciu alebo formu ochorenia, je s použitím nukleozidových analógov liečiteľné ochorenie. Koncepcia štúdie a parametre liečby vyplývajúce z tohto obmedzeného klinického testovania budú dôležité pre ďalšie úsilie v komercializácii tohto alebo podobných liekov proti FIP.
Obrázok S1. Priemerné hladiny pečeňových enzýmov (IU / L) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.
Obrázok S2. Priemerné hladiny lipázy a amylázy v sére (IU/L) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.
Obrázok S3. Priemerné hladiny BUN a kreatinínu u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.
Poďakovania
Ďakujeme pracovníkom Centra pre zdravie spoločenských zvierat za pomoc pri preprave liekov (Lyra Pineda-Nelson a Nancy Bei) a za prezentáciu údajov (Cynthia Echeverria). Sme vďační najmä mnohým majiteľom a 31 mačkám, ktoré sa zúčastnili emotívnej a náročnej cesty, ktorá predčila všetky očakávania. Sme vďační aj praktickým súkromným veterinárom, ktorí pomáhali s pravidelnými krvnými testami a boli tu pre nás a ich pacientov/majiteľov, keď to bolo potrebné.
Poznámky
Prijaté: 28. decembra 2018
Doplnkový materiál: K dispozícii sú nasledujúce súbory: Formulár súhlasu klienta.
Obrázok S1: Priemerné hladiny pečeňových enzýmov (IU / l) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.
Obrázok S2: Priemerné hladiny lipázy a amylázy v sére (IU / l) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.
Obrázok S3: Priemerné hladiny urey a kreatinínu v krvi u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.
Konflikt záujmov: MP a EM sú zamestnancami spoločnosti Gilead Sciences, Foster City, CA, USA a majú v spoločnosti podiely.
Finančné prostriedky: Finančnú podporu pre túto štúdiu poskytli Centrum pre spoločenské zdravie zvierat UC Davis, Fond Philipa Raskina v Kansas City a početní darcovia organizácii SOCK FIP podľa pokynov pani Carol Horace. GS-441524 použitý v tomto pokuse bol poskytnutý spoločnosťou Gilead Sciences, Foster City, CA.
Literatúra
1.
De Clercq, E, Li, G. Approved antiviral drugs over the past 50 years. Clin Microbiol Rev 2016; 29: 695–747. Google Scholar | Crossref | Medline
2.
Hartmann, K. Efficacy of antiviral chemotherapy for retrovirus-infected cats: what does the current literature tell us? J Feline Med Surg 2015; 17: 925–939. Google Scholar | SAGE Journals | ISI
3.
Thomasy, SM, Shull, O, Outerbridge, CA. Oral administration of famciclovir for treatment of spontaneous ocular, respiratory, or dermatologic disease attributed to feline herpesvirus type 1: 59 cases (2006–2013). J Am Vet Med Assoc 2016; 249: 526–538. Google Scholar | Crossref | Medline
4.
Pedersen, NC, Elliott, JB, Glasgow, A. An isolated epizootic of hemorrhagic-like fever in cats caused by a novel and highly virulent strain of feline calicivirus. Vet Microbiol 2000; 73: 281–300. Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
5.
Kim, Y, Shivanna, V, Narayanan, S. Broad-spectrum inhibitors against 3C-like proteases of feline coronaviruses and feline caliciviruses. J Virol 2015; 89: 4942–4950. Google Scholar | Crossref | Medline
6.
Pedersen, NC, Kim, Y, Liu, H. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2018; 20: 378–392. Google Scholar | SAGE Journals | ISI
7.
Pesteanu-Somogyi, LD, Radzai, C, Pressler, BM. Prevalence of feline infectious peritonitis in specific cat breeds. J Feline Med Surg 2006; 8: 1–5. Google Scholar | SAGE Journals | ISI
8.
Riemer, F, Kuehner, KA, Ritz, S. Clinical and laboratory features of cats with feline infectious peritonitis – a retrospective study of 231 confirmed cases (2000–2010). J Feline Med Surg 2016; 18: 348–356. Google Scholar | SAGE Journals | ISI
9.
Rohrbach, BW, Legendre, AM, Baldwin, CA. Epidemiology of feline infectious peritonitis among cats examined at veterinary medical teaching hospitals. J Am Vet Med Assoc 2001; 218: 1111–1115. Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
10.
Warren, TK, Jordan, R, Lo, MK. Therapeutic efficacy of the small molecule GS-5734 against Ebola virus in rhesus monkeys. Nature 2016; 531: 381–385. Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
Murphy, BG, Perron, M, Murakami, E. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol 2018; 219: 226–233. Google Scholar | Crossref | Medline
13.
Takano, T, Endoh, M, Fukatsu, H. The cholesterol transport inhibitor U18666A inhibits type I feline coronavirus infection. Antiviral Res 2017; 145: 96–102. Google Scholar | Crossref | Medline
14.
Takano, T, Nakano, K, Doki, T. Differential effects of viroporin inhibitors against feline infectious peritonitis virus serotypes I and II. Arch Virol 2015; 160: 1163–1170. Google Scholar | Crossref | Medline
15.
Kim, Y, Liu, H, Galasiti Kankanamalage, AC. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad- spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog 2016; 12: DOI: 10.1371/journal.ppat.1005531. Google Scholar | Crossref
16.
Gut, M, Leutenegger, CM, Huder, JB. One-tube fluorogenic reverse transcription-polymerase chain reaction for the quantitation of feline coronaviruses. J Virol Methods 1999; 77: 37–46. Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
17.
Agostini, ML, Andres, EL, Sims, AC. Coronavirus susceptibility to the antiviral remdesivir (GS-5734) is mediated by the viral polymerase and the proofreading exoribonuclease. MBio 2018; 9. DOI: 10.1128/mBio.00221-18. Google Scholar
18.
Weiss, G, Goodnough, LT. Anemia of chronic disease. N Engl J Med 2005; 352: 1011–1023. Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
19.
Kurnick, JE, Ward, HP, Pickett, JC. Mechanism of the anemia of chronic disorders: correlation of hematocrit value with albumin, vitamin B12, transferrin, and iron stores. Arch Intern Med 1972; 130: 323–326. Google Scholar | Crossref | Medline
20.
Taylor, SS, Tappin, SW, Dodkin, SJ. Serum protein electrophoresis in 155 cats. J Feline Med Surg 2010; 12: 643–653. Google Scholar | SAGE Journals | ISI
21.
Hirschberger, J, Hartmann, K, Wilhelm, N. Clinical symptoms and diagnosis of feline infectious peritonitis. Tierarztl Prax 1995; 23: 92–99. Google Scholar | Medline
22.
Pedersen, NC, Liu, H, Gandolfi, B. The influence of age and genetics on natural resistance to experimentally induced feline infectious peritonitis. Vet Immunol Immunopathol 2014; 28: 152–154. Google Scholar
23.
Jain, N, Reddy, DH, Verma, SP. Cardiac abnormalities in HIV-positive patients: results from an observational study in India. J Int Assoc Provid AIDS Care 2014; 13: 40–46. Google Scholar | SAGE Journals
24.
Payne, JR, Brodbelt, DC, Luis Fuentes, V. Cardiomyopathy prevalence in 780 apparently healthy cats in rehoming centres (the CatScan study). J Vet Cardiol 2015; 17 Suppl 1: S244–S257. Google Scholar | Crossref | Medline
Bezpečnosť a účinnosť inhibítora 3C-Like proteázy GC376 bola testovaná na skupine klientmi vlastnených mačiek s rôznymi formami infekčnej peritonitídy (FIP).
Metódy
Do klinického testu bolo prijatých 20 mačiek vo veku od 3,3 do 82 mesiacov (priemerne 10,4 mesiaca) s rôznymi formami FIP. Štrnásť mačiek malo vlhkú alebo zmiešanú FIP a šesť mačiek malo suchú FIP. GC376 sa podával subkutánne každých 12 hodín v dávke 15 mg/kg. Mačky s neurologickými príznakmi boli zo štúdie vylúčené.
Výsledky
Devätnásť z 20 mačiek liečených GC376 sa uzdravilo do 2 týždňov od začiatku liečby. Príznaky choroby sa však po 1–7 týždňoch od primárnej liečby vrátili, a relapsy a nové prípady sa nakoniec liečili minimálne 12 týždňov. Relapsy, ktoré prestali reagovať na liečbu, sa vyskytli u 13 z týchto 19 mačiek v priebehu 1-7 týždňov od počiatočnej alebo opakovanej liečby. Závažné neurologické ochorenie sa vyskytlo u 8/13 mačiek, u ktorých zlyhala liečba, a u piatich mačiek sa opakovali brušné lézie. V čase písania tohto článku bolo sedem mačiek v remisii choroby. Päť mačiatok vo veku 3,3–4,4 mesiaca s vlhkou FIP bolo liečených 12 týždňov a po ukončení liečby a v čase písania článku boli v remisii ochorenia 5–14 mesiacov (priemerne 11,2 mesiaca). Šieste mačiatko bolo po 12 týždňoch liečby v remisii 10 týždňov, došlo však k relapsu a dobre reaguje na druhé kolo liečby s GC376. Siedma bola 6,8-ročná mačka s postihnutím mezenterických lymfatických uzlín, ktorej sa podarilo dosiahnuť remisiu po troch relapsoch, ktoré si vyžadovali postupne dlhšie opakované liečby počas 10 mesiacov. Vedľajšie účinky liečby zahŕňali pálenie pri aplikácii injekcie a občasné ložiská subkutánnej fibrózy a vypadávanie chlpov. U mačiek liečených pred 16.-18. týždňom došlo k spomalenému vývoju a abnormálnemu rastu trvalých zubov.
Závery a význam
GC376 sa ukázal byť sľubný pri liečbe mačiek s konkrétnymi formami FIP a otvoril tak dvere k cielenej antivírusovej liečbe.
Úvod
Lieky, ktoré priamo inhibujú replikáciu vírusov, sa stali kľúčovými oporami pri liečbe chronických vírusových infekcií, ako je HIV/AIDS, vírusu hepatitídy C (HCV), vírusu hepatitídy B, herpesvírusu a akútnych infekcií, ako je chrípka. RNA vírusy, ako sú HIV-1 a HCV, obsahujú ideálne ciele pre inhibíciu vírusov, ako sú RNA-závislá RNA polymeráza a proteáza. Proteázy sú obzvlášť dobrým cieľom, pretože sa podieľajú na dozrievaní vírusov (HIV) alebo na produkcii funkčných vírusových proteínov (HCV). Inhibítory proteázy sa tiež používajú v kombinácii s inhibítormi reverznej transkripcie pri celoživotnej liečbe HIV/AIDS. Kombinácie rôznych inhibítorov proteázy sú vysoko účinné pri liečbe infekcie HCV u ľudí. Preto nie je prekvapujúce, že vírusová proteáza by mala byť atraktívny cieľ aj pre výskum infekcií zvierat spôsobených RNA vírusom. Kim a kol. syntetizovali peptidylové zlúčeniny, ktoré sú zamerané na 3C-like (3CLpro) proteázy, a hodnotila ich účinnosť proti mačaciemu koronavírusu (FCoV) a mačaciemu kalicivírusu, ako aj proti dôležitým ľudským RNA vírusom, ktoré kódujú 3CLpro alebo príbuznú 3C proteázu. Identifikovali sériu zlúčenín, ktoré vykazovali silnú inhibičnú aktivitu proti rôznym koronavírusom, vrátane FCoV, s vysokým rozsahom bezpečnosti. Účinnosť ich inhibítorov 3CLpro bola predmetom pokusov u myší infikovaných vírusom hepatitídy A59, myšacím koronavírusom, a zistilo sa, že spôsobujú významné zníženie titrov vírusov a patologických lézií.
V súčasnosti neexistujú komerčne dostupné antivírusové lieky na koronavírusové infekcie u ľudí alebo zvierat a štúdie Kim a kol. dokázali, že inhibícia 3CLpro môže viesť k potlačeniu replikácie koronavírusu in vivo. Ukázali, že niektoré z ich inhibítorov 3CLpro sú vhodné ako terapeutické prostriedky proti týmto dôležitým vírusom u domácich a divokých mačiek. Potvrdila to štúdia s využitím experimentálnej infekcie vírusom mačacej infekčnej peritonitídy u laboratórnych mačiek. Aj keď je experimentálna infekcia FIPV vysoko smrteľná, akonáhle infekcia dosiahla definovateľné štádium, 14–20 dní trvajúca liečba pomocou GC376 viedla k rýchlej remisii ochorenia u šiestich mačiek, ktorá v čase publikácie článku trvala už viac ako 12 mesiacov.
Materiály a metódy
Oficiálne protokoly
Táto štúdia prebiehala podľa protokolu 18731 schváleného Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat a Výborom pre hodnotenie klinických skúšok Komisie pre klinické skúšky veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice na Kalifornskej univerzite v Davise. Tento protokol podrobne popisuje podmienky testovania nového inhibítora proteázy GC376 u mačiek vlastnených klientom. Každý vlastník bol povinný prečítať si podmienky štúdie a vyjadriť s nimi súhlas.
Organizácia klinickej štúdie
Predmetom štúdie bolo vyhodnotenie inhibítora 3CLpro GC376 u skupiny mačiek s prirodzene získanou FIP. Štúdia nezahŕňala skupinu s placebom, pretože, ako poznamenali Miller a Brody, “hlavnou etickou zásadou v placebom kontrolovaných klinických skúškach je, že pokiaľ pre daný stav existuje preukázaná účinná liečba, je testovanie proti placebu neetické“. GC376 sa už preukázal ako vysoko účinný pri liečbe mačiek s experimentálne indukovanou FIP pred touto štúdiou, čím vznikol predpoklad existujúcej účinnej liečby. Placebo kontrolu nahradila skupina s prirodzene prebiehajucou chorobou. Žiadna z 20 liečených mačiek nepreukázala pretrvávajúce priaznivé reakcie na liečbu, ktorú dostali pred liečbou GC376.
Inštitucionálne pravidlá vylúčili použitie mačiek získaných z útulkov alebo podobných zariadení na výskum tohto typu, a vyžadovali, aby všetky mačky boli v legálnom vlastníctve/adoptované, a aby sa s nimi zaobchádzalo s výslovným súhlasom majiteľa. Mačky s klinicky zjavným neurologickým ochorením boli vylúčené. Do štúdie bolo nakoniec zahrnutých 20 mačiek z rôznych oblastí USA, rôzneho veku a s rôznymi formami FIP. Táto relatívne malá skupina mačiek poskytla cenné poznatky o koncepcii pokusu, interakcii a súlade s vlastníkom, sledovaní bezpečnosti a účinnosti, stanovení minimálneho dávkovacieho režimu, hodnotení relapsov choroby počas liečby alebo po nej a stanovení klinických foriem FIP, ktoré sú pre liečbu najvhodnejšie. Tieto informácie, dúfajme, pomôžu pri ďalších testoch potrebných na udeľovanie licencií a prípadnú komercializáciu GC376 a na vykonávanie podobných testov budúcich antivírusových liekov na FIPV a iných chronických vírusových infekcií mačiek.
Popis testovacej skupiny
Do pokusu bolo zapojených 20 mačiek a ich majiteľov a príslušné informácie o každej mačke sú uvedené v tabuľke 1 a o celej pokusnej skupine na obrázku 1. Mačky boli do štúdie zaradené s rôznym stupňom predbežného testovania zo strany veterinárnych lekárov primárnej starostlivosti. Toto testovanie zvyčajne zahŕňalo kompletný krvný obraz (CBC) s celkovým plazmatickým proteínom, globulínom (G), albumínom (A), A:G; chemický profil séra a analýzu výpotkov vrátane celkového proteínu, skutočného alebo odhadovaného počtu buniek a typu zápalových buniek. U malého podielu mačiek sa uskutočnilo ďalšie testovanie, ktoré obsahovalo titre protilátok FIPV, ultrazvuk brušnej alebo hrudnej oblasti, biopsie postihnutého tkaniva a kvantitatívnu PCR v reálnom čase (qRT-PCR) z výpotkov.
Tabuľka 1 Základné údaje, pôvod, hlavné klinické príznaky a hlavné zistenia pri pitve po liečbe inhibítorom proteázy GC376
FS = samica kastrovaná; F = samica nekastrovaná; DSH = domáca krátkosrstá; KR = záchranené mačiatko; B = mozog; Int = črevo; DLH = domáca dlhosrstá; E = oko; L = pečeň; MLN = mezenterické lymfatické uzliny; Him = himalájsky; Col = hrubé črevo; S = slezina; Om = omentum; P = pobrušnica; MC = kastrovaný samec; M = nekastrovaný samec; K = oblička; A = nadoblička; Lu = pľúca; FC = mačacia kolónia; RM = ragmuffin; Dia = bránica;SD = Štandardná odchýlka; CT = Chovná stanica
*Neuskutočnila sa žiadna pitva, ale boli prítomné terminálne neurologické príznaky † Ťažký mozgový edém, neboli zaznamenané žiadne typické zápalové lézie
Obrázok 1. Demografické údaje o mačkách zaradených do štúdie. (a–c) Koláčové grafy sumarizujúce percento pacientov: (a) vek v mesiacoch, (b) plemeno alebo (c) pôvod. (d) Stĺpcový graf zobrazujúci formy mačacej infekčnej peritonitídy (FIP) zaradených pacientov. M = mesiace; DSH = domáca krátkosrstá; DLH = domáca dlhosrstá; MD = Maryland; OH = Ohio; Tx = Texas; FL = Florida; IL = Illinois; CT = Connecticut; CA = Kalifornia
Mačky s klinickými príznakmi svedčiacimi o neurologickom postihnutí boli zo štúdie vylúčené na základe skorších nepublikovaných experimentálnych štúdií s GC376. Jedna mačka, ktorá dlhodobo prežila predchádzajúcu štúdiu farmakokinetiky a účinnosti GC376, mala recidívu FIP prejavujúcu sa neurologickými príznakmi 6 mesiacov po tom, čo sa javila ako úspešná liečba akútnej infekcie.6 Táto mačka nereagovala na opakovanú procedúru s GC376, ktorá podnietila štúdiu schopnosti lieku preniknúť do mozgu. Úrovne GC376 v mozgu laboratórnych mačiek predstavovali iba 3% plazmatických koncentrácií liečiva.
Potvrdenie ochorenia
Diagnóza FIP bola potvrdená v čase vstupu do štúdie na základe základných údajov, klinickej anamnézy, vyšetrenia výsledkov predchádzajúcich laboratórnych testov, fyzikálneho vyšetrenia a opakovania základných analýz krvi a výpotku. Ručná palpácia brucha bola zvyčajne dostatočná na identifikáciu ascitu, zväčšených mezenterických lymfatických uzlín, zväčšenia slepého čreva a s nimi spojených ileo-cekálno-kolických lymfatických uzlín, tumorov v obličkách a infiltrácie hrubého čreva. Ručná palpácia sa v prípade potreby doplnila ultrazvukom. Oči sa spočiatku vyšetrovali priamym svetlom na akékoľvek abnormality v sietnici, na zrazeniny v prednej komore alebo na zadnej strane rohovky a záblesky v komorovej vode. Prítomnosť očného ochorenia sa potvrdila úplným oftalmoskopickým vyšetrením vykonaným oftalmologickou službou Veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice (VMTH), UC Davis. Prítomnosť FIPV sa ďalej potvrdila pomocou qRT-PCR, buď z brušných alebo hrudných výpotkov odobratých v čase prijatia, alebo v čase pitvy. Sekvenovanie génu FIPV proteázy sa uskutočňovalo na mačkách, u ktorých došlo k relapsu počas liečby, aby sa určilo, či došlo k potenciálnej mutácii spôsobujúcej rezistenciu na liečivo.
Diagnóza FIP sucho-vlhkej (zmiešanej) FIP u troch mačiek (CT03, CT10 a CT14) bola založená na difúznom zväčšení hrubého čreva a anamnéze riedkej stolice, krvi a hlienu v stolici, napínania na defekáciu a stolice malého kalibru pred výskytom brušných efúzií. FIP hrubého čreva bola opísaná ako špecifická variantná forma neefuzívnej FIP. Podozrenie na zmiešanú FIP bolo aj u mačiek CT01, CT02 a CT12 z dôvodu zastavenia rastu, ktorý o mnoho týždňov predchádzal výskyt brušných výpotkov.
Liečebný režim
GC376 bol syntetizovaný vo vysoko čistej forme a pripravený v koncentrácii 53 mg/ml v 10% etanole a 90% polyetylénglykole 400, ako bolo opísané vyššie. GC376 bol podávaný subkutánne (SC) v dávke 15 mg/kg každých 12 hodín SC, pokiaľ nie je uvedené inak. Účinná dávka pre mačky s experimentálne indukovanou FIP bola 10 mg/kg / q12 h SC, ale dávka sa zvýšila na 15 mg/kg potom, čo prvá mačka (CT01) nereagovala na nižšiu dávku 10 mg/kg stanovenú predchádzajúcimi farmakokinetickými štúdiami. Išlo o klinické rozhodnutie založené na reakcii tejto jednej mačky na liečbu.
Monitorovanie odpovede na liečbu Mačky s FIP boli na základe predbežného testovania a počiatočného vyhodnotenia v čase prezentácie na UC Davis hospitalizované najmenej 5 dní a okamžite začali liečbu. Najmenej dvakrát denne boli podrobne vyšetrené na rektálnu teplotu, pulz, dýchanie, chuť do jedla a aktivitu. Použila sa hrudkujúca podstielka, ktorá umožňovala denné hodnotenie objemu a konzistencie stolice a močenia. Celá krv sa odoberala do EDTA alebo heparínu venepunkciou pred zahájením liečby, v dvojdňových intervaloch počas hospitalizácie, v čase prepustenia a v dvojtýždňových intervaloch počas prvého mesiaca a potom v mesačných alebo väčších intervaloch. Rutinné vyšetrenie krvi v každom časovom bode zahŕňalo minimálne hematokrit, celkový plazmatický proteín, ikterický index, celkový počet bielych krviniek, diferenciálny rozpočet bielych krviniek a absolútny počet neutrofilov, lymfocytov a monocytov a eozinofilov. Kvôli kontrole potenciálnej toxicity liekov sa pravidelne zaznamenávali hodnoty chemického zloženia krvného séra. Vzorky brušných výpotkov sa získavali paracentézou každý druhý deň, pokiaľ sa dali získať, čo bolo zvyčajne prvých 3–7 dní. Mačky s dýchavičnosťou boli vyšetrené hrudnou ultrasonografiou a vzorka tekutín bola získaná ultrazvukom vedenou paracentézou. Výpotky sa skúmali na prítomnosť fibrínových zrazenín, prímes neutrofilov a malých/veľkých mononukleárnych buniek, intenzitu žltého sfarbenia, viskozitu pôsobením vlákien a celkový obsah bielkovín. Bunkové pelety z peritoneálnych alebo hrudných výpotkov boli tiež skúmané pomocou qRT-PCR na hladinu vírusovej RNA, ako už bolo opísané.
Mačky boli vydané svojim majiteľom, keď bola zaznamenaná pozitívna reakcia na liečbu, zvyčajne do 5 dní. Majiteľ (majitelia) boli buď vedúcim veterinárnym lekárom, alebo veterinárnym lekárom primárnej starostlivosti poučení, ako podať liek dvakrát denne subkutánnou injekciou. Miesta vpichu sa menili tak, aby zahŕňali hornú líniu od zátylku po strednú časť chrbta a po stranách hrudníka a bokov. Dbalo sa na to, aby sa zabránilo ukladaniu liečiva do dermis alebo postupne na rovnakom podkožnom mieste. Majitelia boli vyzvaní, aby udržiavali denné záznamy o rektálnej teplote, aktivite, chuti do jedla, defekácii a močení a týždenné až dvojtýždňové telesné hmotnosti. Periodické vzorky krvi pre CBC a chemické hodnoty séra boli odoberané osobnými veterinárnymi lekármi majiteľov a zaslané do komerčných veterinárnych diagnostických laboratórií. Akékoľvek abnormálne príznaky alebo správanie bolo potrebné zaznamenať a okamžite hlásiť. Eutanázia sa v prípade potreby uskutočňovala buď na UC Davis, alebo veterinárnym lekárom primárnej starostlivosti. Telá mačiek usmrtené veterinárnymi lekármi primárnej starostlivosti boli okamžite schladené a odoslané v obaloch s ľadom expresnou poštou do UC Davis na pitvu. Požiadavky majiteľov o zaobchádzanie a konečnú dispozíciu tela boli rešpektované.
Výsledky
Stanovenie dĺžky liečby
Prvých päť mačiek v štúdii bolo spočiatku liečených 2 týždne (CT01, CT02, CT03, CT04 a CT05). U všetkých mačiek bolo pozorované rýchle zlepšenie zdravotného stavu a liečba bola ukončená. Napriek priaznivej počiatočnej odpovedi sa príznaky ochorenia opakovali 1 (CT01, CT05), 2 (CT03, CT04) alebo 7 (CT02) týždňov po ukončení 2-týždňovej liečby (obrázok 2). Mačky boli potom liečené znova, dôvodom bolo postupné predlžovanie primárnej a sekundárnej doby liečby, kým ich FIP ostávala citlivá na GC376 (pozri CT04, CT22, obrázok 2). Nové mačky, ktoré sa dostali do štúdie, sa ďalej liečili 3 (CT07) alebo 4 týždne (CT08, CT16). Mačky CT08 a CT16 spočiatku reagovali, ale ich príznaky choroby sa počas liečby objavili znova. U mačky CT08 sa vyvinula neurologická choroba, zatiaľ čo u mačky CT16 sa opakovane vyskytli brušné lézie (tabuľka 1). Primárne a sekundárne liečebné doby sa potom predĺžili na 9 týždňov (CT07, CT09, CT10, CT14) (obrázok 2). U mačky CT09 sa vyvinuli neurologické príznaky počas 9-týždňovej základnej liečby a nakoniec bola utratená, keď sa príznaky choroby stali závažnými. U mačky CT07 sa vyskytlo neurologické ochorenie 6 týždňov po začiatku druhej liečby. Od tohto bodu boli všetky nové mačky prijaté to štúdie a staršie mačky, ako napríklad CT10, liečené alebo znovu liečené najmenej 12 týždňov. Prínos 12-týždňovej liečby bol najzrejmejší u mačky CT04, ktorá bola predtým liečená už trikrát s kratšou dobou liečby nasledovanou relapsom (obrázok 2). Liečba bola ukončená u mačiek, ktoré nemali klinické ani laboratórne príznaky choroby po 12 týždňoch primárnej ani sekundárnej liečby. Zistilo sa, že minimálna doba liečby by mala byť okolo 12 týždňov. Mačka CT21 bola liečená 17 týždňov z dôvodu oneskoreného zlepšenia počtu celkových bielkovín a bielych krviniek (obrázok 2). U tejto mačky došlo k relapsu pleurálnej FIP o 13 týždňov neskôr a v čase písania tohto článku bola podrobená ďalšej liečbe.
Orázok 2. Časová škála liečby a klinický výsledok 20 mačiek, ktoré vstúpili do klinickej štúdie s inhibítorom proteázy GC376. Obdobia, počas ktorých boli mačky liečené, sú označené plnými čiarami. Je uvedený dátum posledného dňa liečby pre šesť mačiek, ktoré dosiahli trvalú klinickú remisiu. Mačka 21 bola v čase písania tohto článku ešte v liečbe. Zvyšných 13 mačiek podľahlo neneurologickej FIP alebo neurologickej FIP po ukončení primárnej alebo sekundárnej liečby do 0-7 týždňov
Odpoveď na počiatočnú liečbu a ukazovatele priaznivej reakcie
Počas prvých 1–4 týždňov liečby sa u 19/20 mačiek prejavilo dramatické a progresívne zlepšovanie zdravotného stavu. Výnimkou bola mačka CT16, ktorá reagovala poklesom teploty v konečníku počas prvých 4 dní liečby. Horúčka sa však vrátila a zdravotný stav sa nasledujúcich 23 dní naďalej zhoršoval a mačka bola eutanizovaná. Horúčka (>38,9 °C) u ďalších 19 mačiek zmizla do 24–48 hodín, so súčasným zlepšením chuti do jedla, aktivity, rastu a prírastku hmotnosti. Brušné výpotky boli zvyčajne nezistiteľné do 2 týždňov. Zvyškový hrudný výpotok zostávajúci po počiatočnej terapeutickej drenáži po 3 dňoch u mačky CT20 takmer zmizol. Renálne tumory u mačiek CT02 a CT13 sa tiež rýchlo zmenšili a po 2 týždňoch už neboli hmatateľné. Zväčšené mezenterické lymfatické uzliny sa k normálnej veľkosti vracali pomalšie. Hmatateľné zhrubnutie hrubého čreva a s ním spojené ileo-cekálno-kolické útvary reagovali najpomalšie a u mačky CT03 pretrvávali aj napriek liečbe a návratu k inak normálnemu zdravotnému stavu. Žltačka, častý nález u mladších mačiek s efuzívnou FIP, pomaly ustupovala počas 2 alebo viac týždňov, súčasne so znižovaním hyperbilirubinémie. Príznaky očnej choroby začali miznút do 48 hodín a zmizli do 1 týždňa bez ohľadu na počiatočnú závažnosť (obrázok 3).
Obrázok 3. Vzhľad očí mačky CT08 pred zahájením liečby (a) a o týždeň neskôr (b). U tejto mačky sa o 3 týždne po začiatku liečby rozvinuli závažné neurologické príznaky.
Prírastok hmotnosti bol jednoduchým a presným kritériom rastu a zlepšenia zdravia. Ako vzťažná hodnota pre tento parameter bola použitá hmotnosť mačky CT04, najstaršej mačky v teste (obrázok 4a). Mačka CT04 vykazovala signifikantný úbytok hmotnosti o 30%. Po každom kole liečby pribrala, krátko pred každým relapsom choroby začala chudnúť a po každej liečbe opäť pribrala. Po 9,3 mesiacoch bez liečby a po liečbe (4,8 kg až 7,19 kg) znovu získala všetku svoju stratenú váhu. Všetky mačiatka s trvalou remisiou počas a po antivírusovej liečbe ustavične priberali na váhe, čo naznačuje, že pri antivírusovej liečbe pokračoval normálny rast (obrázok 4b). Jedna mačka (CT15) a dvaja kocúri (CT17, 20) boli bez komplikácií kastrovaní počas remisie choroby.
Obrázok 4. Antivírusová liečba a zmeny telesnej hmotnosti. (a) Mačka CT04, 6,8-ročný kastrovaný samec, ktorý mal suchú mačaciu infekčnú peritonitídu (FIP), absolvoval štyri cykly antivírusovej liečby s narastajúcim trvaním, ako je znázornené bodkovanými políčkami. Pred každou recidívou schudol a po následnej liečbe pribral. (b) Prírastky hmotnosti u štyroch mačiatok vo veku 3,5-4,4 mesiaca počas a po antivírusovej liečbe sú znázornené bodkami. Bodkovaný obdĺžnik označuje dĺžku antivírusovej liečby (12 týždňov)
Lymfopénia bola bežným klinickým príznakom mačiek s vlhkou FIP (obrázok 5) a mala tendenciu priamo korelovať so závažnosťou brušného zápalu, čo naznačovala viskozita, prítomnosť fibrínových vlákien, obsah bielkovín, počet buniek a stupeň žltej farby výpotku. Lymfopénia sa zlepšila pri liečbe všetkých mačiek s vlhkou FIP okrem CT16, ale nepomohla predpovedať relapsy choroby, ktoré sa vyskytli potom (obrázok 5a). U mačiek so suchou FIP lymfopénia nebola tak výrazná, a pre hodnotenie odpovede na liečbu nebola užitočná tak, ako iné parametre (obrázok 5b).
Obrázok 5. Priemer a smerodajná odchýlka (SD) absolútneho počtu lymfocytov u liečených pacientov s (a) vlhkou alebo (b) suchou mačacou infekčnou peritonitídou (FIP). a) Dvanásť mačiek (prázdny krúžok), u ktorých sa prejavil brušný alebo hrudný výpotok, a ktoré boli liečené až 12 týždňov. Trinásta mačka (CT16, plný krúžok) s brušným výpotkom reagovala na liečbu zle. b) Sedem mačiek so suchou alebo vlhkou formou FIP a s následnou liečbou v trvaní 6 týždňov.
Celkové hladiny bielkovín v plazme ako nepriamy indikátor koncentrácie globulínu boli pri vyšetrení často zvýšené, ale hodnoty boli počas prvých 4 týždňov veľmi variabilné a často prechodne stúpali počas resorpcie výpotkov. Mačky, u ktorých nakoniec liečba nebola úspešná, mali tendenciu mať vyššie celkové koncentrácie plazmatických proteínov na začiatku liečby a mali tendenciu udržiavať si vyššie hladiny počas liečby ako mačky, ktoré úspešne dosiahli trvalú remisiu (obrázok 6).
Obrázok 6. Priemer a SD celkových hladín bielkovín v plazme u 20 mačiek počas obdobia 12 týždňov. Trinásť mačiek utrpelo v rôznych týždňoch liečby (W) smrteľné relapsy a sedem mačiek dosiahlo trvalú remisiu po 12 týždňoch liečby (W-SV)
Zníženie hladiny vírusovej RNA v bunkách z ascitickej tekutiny v spojitosti s liečbou
Sekvenčné vzorky ascitu boli odobraté niekoľkým tým istým mačkám počas prvých 6–25 dní antivírusovej liečby a boli testované na hladiny vírusovej RNA pomocou qRT-PCR. Hladiny FIPV sú často nízke alebo negatívne v krvi mačiek s FIP a najvyššie sú v bunkách z výpotkov. Preto boli najspoľahlivejším zdrojom FIPV RNA bunky z ascitu alebo pleurálneho výpotku. Mačky CT15, CT16 a CT17 mali 955, 1699 a 2937-krát vyššie hladiny vírusovej RNA, v danom poradí, ako CT02, ktoré mali najnižšiu vírusovú záťaž v efúzii pred liečbou (obrázok 7). Hladiny vírusovej RNA sa v priebehu 2 týždňov znížili až 1567463-násobne v porovnaní s hodnotami pred liečbou, s výnimkou mačky CT16 (obrázok 8), ktorá mala druhú najvyššiu hladinu vírusovej RNA pred antivírusovou liečbou medzi 12 mačkami so vzorkami výpotkov dostupnými na testovanie ( Obrázok 7). Absencia rýchleho poklesu hladín vírusovej RNA u mačky CT16 spolu s ťažkou lymfopéniou môže vysvetľovať, prečo nereagovala na liečbu. CT10 tiež mala o niečo pomalší pokles hladiny vírusu a po antivírusovej liečbe dvakrát relapsovala. Je pozoruhodné, že hladiny vírusovej RNA v bunkách ascitu u mačiek CT15, CT17 a CT18 klesali najrýchlejšie a boli tiež medzi piatimi mačkami, u ktorých došlo k trvalej remisii ochorenia. Či príčinou bola vlastnosť jednotlivých izolátov FIPV, alebo forma a závažnosť choroby hostiteľa nebolo zistené.
Obrázok 7. Relatívne počiatočné hladiny RNA vírusu infekčnej peritonitídy mačiek (FIPV) vo výpotkových vzorkách pacientov pred antivírusovou liečbou. Na vzorkách efúzií pacientov pred zahájením liečby sa uskutočnila kvantitatívna PCR v reálnom čase. Relatívne základné hladiny vírusovej RNA ako násobné rozdiely v porovnaní s úrovňou vírusu pred liečbou CT02, mačka s najnižšími hladinami RNA. Úroveň transkriptov RNA bola vypočítaná pre každého pacienta pomocou metódy ∆Ct s referenčným génom pre beta-aktín
Obrázok 8. Zníženie RNA vírusu mačacej infekčnej peritonitídy zo sekvenčných vzoriek výpotku počas liečby GC376 u mačiek CT10, CT12, CT15, CT16, CT17, CT18 a CT23. Každý bod označuje násobné zníženie hladiny vírusovej RNA oproti hladine nameranej pred liečbou (deň 0). Hladiny vírusovej RNA sa stanovili pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase metódou ∆Ct a beta-aktín referenčným génom
Zlyhanie liečby v dôsledku recidívy brušnej FIP alebo výskytu neurologického ochorenia
Trinásť z 20 mačiek v teste nakoniec podľahlo recidíve choroby. Jedna mačka (CT16) nevykázala významné zlepšenie a bola eutanizovaná 3 týždne po začiatku 4-týždňového liečebného režimu (obrázky 2 a 8), 8), zatiaľ čo u ostatných 12 došlo k variabilnému obdobiu remisie ochorenia po primárnej alebo sekundárnej liečbe trvajúcej 3–17 týždňov (priemerne 7,8 týždňa) (obrázok 2). Všetky z týchto 13 mačiek okrem jednej (CT09) boli pitvané (tabuľka 1). Osem z týchto mačiek bolo eutanizovaných kvôli závažným neurologickým príznakom a päť z dôvodu recidívy brušnej choroby (obrázok 2). Pri vyšetrení boli sekundárne detekované tri mačky, ktoré podľahli neurologickému ochoreniu (CT05, CT08, CT13) v dôsledku okulárnej FIP (tabuľka 1). Medzi najskoršie príznaky neurologického ochorenia patrili horúčka, ktorá pretrvávala aj napriek pokračujúcej liečbe, apatia, občasné svalové zášklby uší a svalov, neobvyklé pohyby pri prehĺtaní, nutkavé naťahovanie končatín a strata normálnej mentality, ktorá sa prejavila krátkymi epizódami strnulých pohľadov alebo chradnutím. Tieto príznaky pretrvávali pri liečbe niekoľko dní alebo týždňov, ale nakoniec došlo k nekoordinácii a tonickým/klonickým záchvatom. Výskyt a rýchla progresia neurologických príznakov po prerušení liečby boli výraznejšie, ako počas liečby (obrázok 2).
Päť mačiek (CT03, CT07, CT10, CT14 a CT16) malo recidívu typických intraabdominálnych lézií pri absencii neurologických príznakov počas alebo po liečbe (tabuľka 1). U štyroch z nich sa vyskytli ileocekálne útvary (CT03, CT07 a CT14) alebo zväčšená lymfatická uzlina hrubého čreva (CT10), ktorá sa po primárnej liečbe zmenšila (CT03, CT10 a CT14) alebo už nebola hmatateľná (CT07). Avšak CT03 naďalej trpela ťažkou zápchou, napínaním a stolicou podobajúcou sa zubnej paste. Závažnosť obštrukcie hrubého čreva si vyžiadala resekciu hrubého čreva, ktorá zmiernila klinické príznaky, ale nezabránila prípadnému opätovnému výskytu brušných choroby. Všetky tri mačky, u ktorých sa vyskytli silné ileo-cekálno-kolické infiltráty, stále vykazovali dôkazy o tejto forme FIP pri pitve a imunohistochémia preukázala antigén FIPV v makrofágoch v granulomatóznom zápale (obrázok 9).
Obrázok 9. Rez zo silne zhrubnutej steny resekovaného hrubého čreva z mačky CT03. Imunoperoxidáza (hnedá farba) sfarbená na mačací antigén vírusu infekčnej peritonitídy je pozorovaná v makrofágoch okolo periférie granulomatóznej lézie. K perzistencii vírusu v hrubom čreve došlo počas liečby a ústupu ďalších príznakov ochorenia (napr. efuzívnej peritonitídy)
Pokusy o liečbu neurologickej choroby zvýšením dávky lieku a predĺžením trvania liečby
Pre zmiernenie neurologických príznakov sme sa pokúsili zvýšiť dávku GC376, čím sa zvýšila jeho hladina v krvi a množstvo liečiva, ktoré prešlo cez hematoencefalickú bariéru. Mačka CT01 vykazovala efúznu FIP a bola pôvodne liečená GC376 (10 mg/kg q12h SC po dobu 9 dní). Mačka reagovala dobre, ale v 9. deň sa horúčka sa vrátila a dávka sa zvýšila na 15mg/kg každých 12 hodín po dobu 5 dní. Horúčka zmizla a liečba bola ukončená v deň 14. O 3 dni neskôr sa horúčka vrátila spolu s neurčitými neurologickými príznakmi pozostávajúcimi zo zášklbu svalov, abnormálneho naťahovania končatín a abnormálnych hltacích pohybov. Mačke bola okamžite znovu nasadená dávka 15 mg/kg každých 12h SC a jej stav sa zlepšil, ale krátko potom sa zhoršil s návratom horúčky a rovnakými neurčitými neurologickými príznakmi s miernou nekoordináciou. Dávka sa potom zvýšila na 50 mg/kg každých 12 hodín SC po dobu 14 dní a jej stav sa zlepšil na takmer normálny stav. Liečba bola zastavená, ale okamžite sa vrátili neurologické príznaky. Mačka bola potom liečená ďalšie štyri dni dávkou 50 mg/kg q12 h SC, počas ktorých sa neurologické príznaky opäť zlepšili. Padlo však rozhodnutie ukončiť liečbu úplne. Stav mačky zostal stabilný 1 týždeň a potom sa u nej rozvinula extrémna nekoordinácia, demencia a tonické/klonické záchvaty. Bola vykonaná eutanázia a pitva preukázala lézie iba v mozgu.
Mačka CT12 dobre reagovala na liečbu dávkou 15 mg/kg q12 h SC; rektálna teplota sa vrátila k normálu do 48 hodín a brušný výpotok zmizol do 2 týždňov. Mačka sa po druhom týždni liečby javila ako normálna, potom však mala pretrvávajúcu horúčku 38,9–40°C. Majitelia cítili, že mačka má inak normálnu aktivitu a chuť k jedlu, takže liečba pokračovala v rovnakom dávkovaní. Horúčka však pretrvávala, boli zaznamenané jemné príznaky zmeny správania a mačka nerástla podľa očakávania. Mačka pokračovala v liečbe ďalších 15 týždňov, počas ktorých sa dávka liečiva prechodne dvakrát znižovala (tj. na 10 mg/kg každých 12 hodín a 15 mg/kg každých 24 hodín) počas niekoľkých dní, horúčka sa však zvýšila a zakaždým sa znížila aktivita. Obnovilo sa dávkovanie 15mg/kg každých 12 hodín. Mačka naďalej vykazovala príznaky premenlivej horúčky a nejasné príznaky správania, ale majitelia boli optimistickí, pokiaľ ide o apetít a úroveň aktivity mačky. Liečba mačky bola potom zastavená, pretože ďalšie použitie lieku na tento účel nebolo možné odôvodniť. Stav mačky zostal nezmenený s pretrvávajúcou horúčkou, samotárskym správaním a zastavením rastu ďalších 5 týždňov. V 22. týždni sa objavili závažné neurologické príznaky pozostávajúce z nekoordinácie, demencie a záchvatov a mačka bola eutanizovaná. Makroskopické i mikroskopické lézie boli obmedzené na mozog.
Testovanie na vznik vírusovej rezistencie
O vzniku vírusu rezistentného na liečivo sa uvažovalo u mačky CT03, u ktorej došlo k relapsu s brušnými léziami po počiatočnej priaznivej reakcii na liečbu granulomatóznej kolitídy a zmiešanej FIP. V čase pitvy boli v brušnej dutine stále prítomné granulomatózne lézie a v mozgu sa nenašli žiadne makroskopické ani mikroskopické lézie (tabuľka 1). Preto recidíva ochorenia nesúvisela s neurologickým ochorením a perzistentný antigén FIPV bol identifikovaný v makrofágoch v granulomatóznych léziách. Uskutočnilo sa sekvenčné porovnanie medzi 3CLpro z efúzie pred liečbou a z omenta odobratým pri pitve o 95 dní neskôr. V 3CLpro sa však nenašla žiadna substitúcia aminokyselín, čo naznačuje, že výskyt vírusu rezistentného na liečivá nebol príčinou opakovaného ochorenia mačky.
Porovnávali sa tiež 3CLpro sekvencie vírusovej RNA pred liečbou s tými, ktoré boli získané o 25 dní (CT16), 139 dní (CT02), 149 dní (CT12) a 231 dní (CT10) neskôr v čase pitvy. V tomto období neboli pozorované žiadne rozdiely v 3CLpro. Sekvencie tiež zostali nezmenené u CT02, CT16 a CT12 od času prijatia až po pitvu. Vírusová 3CLpro z pľúc a sleziny mačky CT10, ktorá relapsovala dvakrát počas 8 mesiacov a bola znovu liečená, vykazovala substitúciu Asp-to-Ser v polohe 25 a substitúciu Lys-to-Asp v polohe 260 v porovnaní s vírusom z abdominálnej kvapaliny získanej pred liečbou. Presné účinky týchto mutácií na funkciu proteázy sa v súčasnosti skúmajú. Uvádza sa, že genetická evolúcia kvázi druhov vírusových proteínov nastáva v priebehu času u pacientov chronicky infikovaných RNA vírusom (HCV) a môže viesť k sporadickým zmenám aminokyselín.
Výskyt trvalých klinických remisií
Sedem z 20 mačiek v štúdii liečby GC376, z ktorých všetky absolvovali najmenej 12 týždňov nepretržitej liečby, bolo kategorizovaných ako potenciálne liečebné úspechy na základe viac ako 12 týždňov trvajúcej remisie choroby po ukončení liečby (Obrázok 2). Šesť z týchto mačiatok malo vo veku 3,3–4,4 mesiaca akútnu efúznu brušnú (CT15, CT17, CT18, CT21, CT23) alebo pleurálnu (CT20) formu ochorenia a boli liečené nepretržite 12 alebo 17 (mačka CT21) týždňov (tabuľka 1, obrázok 2). Siedma mačka (CT04), 6,8-ročný krížený kastrovaný kocúr so suchou FIP obmedzenou na mezenterickú lymfatickú uzlinu, tiež dosiahol dlhodobú remisiu, ale až po štyroch cykloch liečby so zvyšujúcim sa trvaním (Tabuľka 1, Obrázok 2).
Šesť z týchto dlhodobo preživších mačiek malo na začiatku liečby abnormality v CBC, hematokrite a celkových proteínoch, ale v čase ukončenia liečby mali úplne normálne hodnoty v krvi. Avšak mačka CT21 mala aj po 12 týždňoch zvýšené hladiny bielkovín v plazme a zvýšený počet bielych krviniek a v liečbe pokračovala ďalších 5 týždňov. Počty plazmatických bielkovín a bielych krviniek sa zlepšili po ďalších 5 týždňoch liečby, stále však neboli v referenčnom rozsahu. Trinásť týždňov po ukončení liečby sa u mačky vyvinul typický FIP výpotok v hrudnej dutine s horúčkou. Tekutina z hrudníka bola odsatá, aby sa zlepšilo dýchanie, a mačka začala s druhým kolom GC376 a v čase písania článku bola afebrilná, aktívna a po 8 týždňoch liečby jedla normálne. Liečba bude trvať 12 týždňov, ak sa znova neobjavia žiadne známky ochorenia.
Vedľajšie účinky pozorované počas liečby a po liečbe
Počas a po liečbe GC376 boli pozorované dva vedľajšie účinky. Liek pri injekčnej aplikácii často spôsoboval štípanie/pálenie. Subkutánne opuchy sa vyskytli, keď sa v rovnakom mieste aplikovalo príliš veľa injekcií, ale tie rýchlo ustúpili. U jednej mačky (CT12) sa približne v 14. týždni 18-týždňového obdobia liečby vyskytla hlboko lokalizovaná ulcerácia medzi lopatkami. Pri pitve však nebol pozorovaný žiadny dôkaz dermálnej FIP a išlo pravdepodobne o reakciu na nepretržité injekcie v rovnakom mieste. Prieskum siedmich dlhodobo preživších mačiek preukázal citeľné ohniskové podkožné zhrubnutie. U jednej mačky sa na röntgenových snímkach objavili štyri zvápenatené hrčky veľkosti hrášku. Tieto hrčky boli chirurgicky odstránené spolu s okolitým fibrotickým tkanivom. Traja ďalší dlhodobo preživší majú 1–3 malé ohniskové oblasti s trvalou stratou chlpov v miestach vpichu, ktoré sú zakryté okolitým srsťou (obrázok 10). Majitelia a ich veterinári boli požiadaní, aby tieto lézie pravidelne kontrolovali kvôli prípadným zmenám, či výskytu nových lézií.
Obrázok 10. Ohnisková oblasť permanentného vypadávania chlpov spôsobená nechceným ukladaním GC376 do epidermy mačky CT21. Tieto oblasti boli zvyčajne prekryté chlpmi a neboli zvonka viditeľné
Najvýznamnejším vedľajším účinkom spojeným s dlhodobou liečbou bol juvenilný chrup. Normálna tvorba, rast a prerezanie trvalých zubov sa oneskorili u všetkých štyroch liečených mačiatok vo veku 3,3–4,4 mesiaca. Očné zuby, rezáky, štvrtý premolár a molár boli postihnuté najmenej, zatiaľ čo druhý a tretí premolár boli postihnuté najviac (obrázok 11). Dospelé zuby sa javili menšie ako normlingválne a to spolu s oneskoreným prerezaním viedlo buď k ponechaniu mliečnych špičákov, nevypadnutiu mliečnych zubov alebo k čiastočnému prerezaniu abnormálnych trvalých zubov k súčasne ponechaným mliečnym zubom. U žiadneho z dlhodobo preživších neboli pozorované žiadne iné anatomické alebo fyziologické defekty a neboli zaznamenané ani u pitvaných mačiek.
Obázok 11. Dospelý chrup mačky CT17, ktorá bola liečená 12 týždňov GC376, počnúc vekom 4,4 mesiaca. Je viditeľný ponechaný horný ľavý mliečny špičák. Zdá sa, že horný druhý a tretí premolár sú mliečne. Malé trvalé tretie premoláre sa čiastočne prerezali lingválne k mliečnym tretím horným premolárom. Gingiva obklopujúca ponechaný špičák a premoláre je zapálená. Dospelé špičáky sa javia tiež menšie ako zvyčajne. Zdá sa, že trvalý pravý špičák a štvrtý horný premolár sa prerezali normálne
Pitevné nálezy
Telá 12/13 mačiek, u ktorých liečba nebola úspešná, boli podrobené pitve vrátane hrubého a histologického vyšetrenia a imunohistochémie postihnutých tkanív pre FIPV antigén. Odobrané a vyšetrené tkanivá zahŕňali reprezentatívne rezy všetkých hlavných brušných a hrudných orgánov, mozgu a očí. Hrubé vyšetrenie identifikovalo tri odlišné prezentácie. Päť mačiek nejavilo výrazné známky aktívnej FIP (CT01, CT02, CT05, CT08, C12), tri mali lézie zodpovedajúce neefúznej FIP (CT07, CT10, CT13) a štyri mali efúznu peritonitídu s multiorgánovým postihnutím (CT03, CT14, CT16, CT22). Histológia piatich mačiek, ktoré nevykazovali dostatočné dôkazy o chorobe, preukázala väčšinou mierne mononukleárne infiltráty, zvyčajne perivaskulárny zápal v oku, pečeni, črevnej stene a obličkách. Tri mačky s neefúznou FIP mali mierny až závažný zápal v mnohých orgánoch s najťažšími léziami v oku, mezenterických lymfatických uzlinách, obličkách a pľúcach. Tri mačky s efúznou FIP mali závažný pyogranulomatózny zápal vo viacerých brušných orgánoch vrátane omenta, pobrušnice, črevnej steny, mezenterických lymfatických uzlín, pečene a sleziny.
Závažný zápal typický pre cerebrálnu FIP bol prítomný v mozgu všetkých okrem jednej (CT07) z ôsmich mačiek, ktoré sa podrobili pitve bez výrazných hrubých známok FIP alebo s neefúznou FIP. Jedna mačka bez charakteristických mozgových lézií mala ťažký mozgový edém. Naproti tomu typické FIP lézie chýbali v mozgu všetkých troch pitvaných mačiek s efúznou FIP. Stereotypné FIP lézie mozgu boli charakterizované stredne ťažkou až ťažkou chronickou meningoencefalitídou a ventrikulitídou spojenou s periventrikulárnou nekrózou parenchýmu (obrázok 12a). Štvrtá komora bola postihnutá najťažšie a meningitída bola najčastejšie pozorovaná ventrálne do malého mozgu a mozgového kmeňa. Často sa pozorovali silné perivaskulárne manžety spojené s vaskulitídou. FIP antigén sa demonštroval imunoperoxidázovým zafarbením v mozgu 6/7 prípadov stereotypnej cerebrálnej FIP (obrázok 12b). Tkanivá z 11 pitvaných mačiek, sa testovali na prítomnosť FIPV RNA pomocou qRT-PCR. Všetky vykázali pozitívny výsledok, čím sa stanovila perzistencia vírusu u mačiek, u ktorých liečba nebola úspešná.
Obrázok 12. Fotomikrografy lézie v mozgu mačky CT08. U tejto mačky sa počas počiatočnej liečby GC376 vyskytlo závažné neurologické ochorenie. (a) Štvrtá komora obsahuje bielkovinovú tekutinu zmiešanú s početnými neutrofilmi a makrofágmi, ktoré multifokálne zasahujú do okolitého zriedeného neuropilu. Veľké manžety lymfocytov a plazmatických buniek obklopujú krvné cievy (*) (farbenie hematoxylínom, zväčšenie 20x). (b) Viaceré bunky pripomínajúce peritoneálne makrofágy (vyznačená malá oblasť na obrázku 12a) vykazujú pozitívnu imunoreaktivitu pre mačací infekčný antigén peritonitídy (kontrastné farbivo hematoxylín, zväčšenie 600x).
Diskusia
Úspech v liečbe GC376 pri experimentálnej infekcii FIPV nás motivoval k preskúmaniu účinnosti GC376 pri prirodzene vyvinutej FIP. Medzi experimentálnou efúznou brušnou FIP a prirodzene sa vyskytujúcou chorobou existujú významné rozdiely. Experimentálna choroba obchádza kritické počiatočné štádium, ktoré začína u mačiatok vystavením neškodnému mačaciemu enterickému koronavírusu (FECV). Prirodzene sa vyskytujúca FIP je výsledkom špecifických mutantov, ktoré vznikajú po infekcii FECV, a FIP sa vyskytuje za prítomnosti imunity voči FECV. Experimentálna FIP je naopak indukovaná u mačiek, ktoré sa nestretli s koronavírusom intraperitoneálnou injekciou veľkej dávky purifikovaného FIPV získaného od laboratórnej mačky. Prirodzene sa vyskytujúca choroba je často subklinická po mnoho týždňov alebo mesiacov pred pozorovaním vonkajších príznakov choroby, zatiaľ čo experimentálne príznaky choroby sa objavia do 2–4 týždňov a rýchlo progredujú. Prirodzene sa vyskytujúca FIP má rôzne klinické formy, zatiaľ čo experimentálna infekcia má takmer vždy abdominálnu efúznu podobu. FIP v prírode je tiež ovplyvnená prostredím chorobu zvyšujúcich kofaktorov, zatiaľ čo experimentálne ochorenie sa vyskytuje u mačiek bez vonkajších vplyvov. Rozdiely môžu vysvetľovať, prečo sa choroba vyvinie len u malej časti mačiek prirodzene vystavených FIPV, zatiaľ čo 80–100% experimentálne infikovaných mačiek zomiera. Naše predpovede sa ukázali ako správne a prirodzene sa vyskytujúca FIP sa liečila oveľa ťažšie ako experimentálna choroba. Je však potrebné zdôrazniť, že tento pokus by nebol schválený bez informácií získaných z farmakokinetických štúdií, štúdií akútnej a chronickej toxicity a účinnosti uskutočňovaných na laboratórnych mačkách.
Bol to prvý pokus o použitie cieleného antivírusového lieku proti systémovému a vysoko smrteľnému veterinárne významnému ochoreniu. Aj keď zatiaľ nie sú k dispozícii žiadne špecifické antivírusové lieky na koronavírusové infekcie u ľudí alebo zvierat, na liečbu boli vyvinuté antivírusové lieky na iné vírusové infekcie ľudí, ako sú HCV a HIV-1, a použitie týchto liekov poskytlo solídny základ pre ich aplikáciu na choroby zvierat, ako je FIP. HCV infikuje hlavne pečeňové bunky a u väčšiny ľudí spôsobuje pretrvávajúcu vírusovú infekciu. Avšak len asi u 20–30% z nich sa rozvinú ochorenia pečene v časovom horizonte 20–30 rokov. Infekciu HCV je možné eliminovať nešpecifickou antivírusovou liečbou (interferón a ribavirín) po dobu 6–12 mesiacov u približne polovice pacientov a nedávnym zavedením priamo pôsobiacich antivírusových liekov v trvaní 3–6 mesiacov sa počas liečby podstatne zvýšila miera vyliečenia na viac ako 90% . HIV infekcia u ľudí vedie k predĺženému asymptomatickému stavu a nakoniec k pokročilému ochoreniu na HIV. HIV-1 infikuje T lymfocyty a makrofágy a prežíva v latentnom stave. Viac ako 30 antiretrovírusových liekov, z ktorých väčšina sa používa v kombinácii dvoch alebo viacerých liekov, sa úspešne použilo na zníženie vírusovej záťaže na nedetegovateľnú hladinu v krvi pacientov s HIV/AIDS. Vírus sa však po prerušení antivírusovej liečby vracia a vyžaduje tak celoživotnú antivírusovú liečbu. Šírenie vírusu do mozgu, ktoré je sprostredkované hlavne vírusom infikovanými makrofágmi, a následný vývoj neurologického ochorenia sa vyskytuje u viac ako 50% infekcií HIV. Neurologické zhoršenie preto stále zostáva dôležitým problémom aj v tejto dobe antivírusovej liečby. Tieto precedensy antivírusovej liečby infekcií HCV a HIV-1 ukazujú, že výsledok liečby (vírusový klírens vs perzistencia vírusu), trvanie liečby (konečná vs kontinuálna) a prítomnosť neurologických následkov sú výrazne ovplyvnené vírusovou patogenézou.
Táto štúdia bola obmedzená na 20 mačiek s FIP, ktoré predstavovali spektrum veku a foriem choroby. Aj keď bol počet liečených mačiek malý, zhromaždilo sa prekvapivé množstvo informácií, napríklad o tom, ako dlho sa má liečiť, o možných vedľajších účinkoch, o tom, ako identifikovať klinickú formu FIP, ktorá bude s najväčšou pravdepodobnosťou reagovať na liečbu, a potenciálnych ukazovateľoch zlyhania liečby a jej úspešnosti. Klinická štúdia bola založená na skúsenostiach získaných z farmakokinetických štúdií a štúdií účinnosti vykonaných na laboratórnych mačkách. Počiatočné obdobie liečby bolo na základe experimentálnych štúdií stanovené na 2 týždne, nakoniec sa však predĺžilo na 12 týždňov a viac na základe skúseností získaných v priebehu testovania. Toto konečné liečebné obdobie sa blížilo k 3–6 mesiacom používaným na liečbu infekcie HCV u ľudí s priamo pôsobiacimi antivírusovými liekmi. Na základe experimentálnych štúdií boli očakávané ťažkosti s liečením neurologických foriem choroby. Vedľajšie účinky boli prijateľné a zahŕňali pálenie pri aplikácii injekcie a dermálny a podkožný zápal, keď sa na rovnaké miesta podalo príliš veľa liečiva. Tento jav bol už predtým pozorovaný aj u laboratórnych mačiek. Závažnejší vedľajší účinok, ktorý sa predtým u laboratórnych mačiek nepozoroval, sa obmedzil na mačiatka a zahŕňal spomalený vývoj dospelých zubov a retenciu alebo oneskorenú stratu mliečnych zubov.
Liečba GC376 bola úspešná v indukcii významnej remisie príznakov ochorenia a regresie lézií u 19/20 mačiek. Tento výsledok potvrdzuje naše zistenia rýchleho zvratu klinických príznakov u laboratórnych mačiek s experimentálnou FIP liečených GC376, a rozšíril naše znalosti o účinkoch lieku na široké spektrum foriem prirodzene sa vyskytujúcej FIP. Mačky pochádzali z rôznych častí USA a dokonca aj z Peru, čo potvrdzuje, že geograficky rozmanité kmene FIPV boli voči tomuto inhibítoru rovnako citlivé. K výraznému zníženiu transkriptov vírusovej RNA vo výpotkoch došlo v priebehu niekoľkých dní liečby spolu s rýchlym zlepšením zdravotného stavu. Remisia ochorenia však pretrvávala 3 mesiace a dlhšie iba u 7/20 týchto mačiek. Neschopnosť dosiahnuť dlhodobú remisiu ochorenia bola nakoniec spojená s výskytom neurologického ochorenia pri absencii rozsiahlych brušných lézií alebo s opakovaním/pretrvávaním rozsiahlych brušných lézií za prítomnosti histologických lézií v mozgu a/alebo v očiach. Tieto objavy naznačujú, že FIPV má väčšiu tendenciu šíriť sa z telesných dutín do mozgu, ako sa pôvodne predpokladalo, najmä ak sa mu poskytne dostatok času. Toto rozšírenie s najväčšou pravdepodobnosťou zahŕňa infikované makrofágy, ktoré vstupujú do mozgu malými krvnými cievami v mozgových blanách a ependyme.
U mačky, u ktorých sa vyskytlo neurologické ochorenie, sa tak stalo buď počas liečby (CT05, CT08, CT22), alebo 2 (CT01, CT02, CT09), 3 (CT13) alebo 6 (CT10) týždňov po ukončení liečby. Najpravdepodobnejším vysvetlením tohto oneskorenia, ako aj určitej terapeutickej výhody vyšších dávok, bolo to, že časť GC376 bola stále schopná preniknúť do mozgu. Hladiny GC376 v mozgovomiechovom moku predstavovali iba 3% plazmy v mozgu 2 hodiny po subkutánnej injekcii v dávke 10 mg/kg (nezverejnené údaje). Aj keď boli relatívne koncentrácie liečiva v mozgu u týchto mačiek nízke, stále boli 21,4-krát vyššie ako hladiny potrebné na inhibíciu replikácie vírusu v tkanivovej kultúre. Na základe tohto zistenia sa predpokladalo, že vyššie dávky umožňujú prienik vyššieho množstva liečiva do mozgu. Tento predpoklad bol podporený skúsenosťami s dvoma mačkami, ktoré vykazovali neurologické príznaky. Zvýšenie dávky GC376 na 50 mg/kg každých 12 hodín u jednej mačky (CT01) viedlo k znateľnému zlepšeniu, ale neeliminovalo príznaky ochorenia mozgu. Zdá sa, že predĺženie liečby o takmer 3 mesiace v dávke 15mg/kg každých 12 h oddialilo progresiu neurologických príznakov u druhej mačky (CT12), zatiaľ čo pokusy znížiť celkovú dennú dávku u tejto mačky na 10mg/kg každých 12 hodín alebo 15mg/kg každých 24 hodín spôsobili zhoršenie neurologických príznakov. To naznačuje, že dávky 15 mg/kg každých 12 hodín alebo vyššie umožnili dostatočnému množstvu GC376 prekonať hematoencefalickú bariéru, aby spomalil, ale neeliminoval neurologické príznaky.
Vysoký výskyt ochorení centrálneho nervového systému (CNS) v tejto štúdii bol vyšší, ako sa uvádzalo predtým, a bol neočakávaný, pretože mačky so známkami postihnutia mozgu alebo miechy boli zo štúdie vylúčené. Choroby CNS sa ukázala omnoho pravdepodobnejšia u starších mačiek so suchou alebo zmiešanou formou FIP ako u mladých mačiek s vlhkou FIP. To naznačuje, že FIPV môže u mnohých mačiek preniknúť do mozgu, ak je mu poskytnutý dostatok času. Zdá sa, že pri infekcii CNS zohrávajú úlohu makrofágy peritoneálneho typu, pretože FIPV infikované bunky v mozgu mačiek s neurologickou FIP sa viac podobajú skôr peritoneálnym makrofágom ako rezidentným mozgovým makrofágom. To by nemalo byť prekvapujúce, pretože makrofágy migrujú do rôznych tkanív, vrátane mozgu, na vykonávanie imunitného dohľadu a sú tiež cieľmi pre celý rad infekčných agensov, ako sú FIPV a HIV-1. Infikované makrofágy hrajú hlavnú úlohu pri šírení vírusu do mozgu u pacientov s HIV a detekcia vírusu v mozgu je možná v priebehu niekoľkých týždňov po infikovaní. K neurologickému poškodeniu však zvyčajne dôjde v neskoršom štádiu. Lieky proti HIV tiež znižujú frekvenciu závažných neurologických porúch, podobne, ako sa pozorovalo v tejto štúdii o FIPV a GC376. Existujú aj alternatívne vysvetlenia. Je možné, že extra-CNS účasť môže inhibovať rozvoj mozgových ochorení a naopak. Je bežné, že sa ochorenie CNS vyskytuje pri neprítomnosti viscerálneho ochorenia a naopak. Potlačenie replikácie vírusu v neneuronálnych tkanivách môže tiež zvýšiť pozitívnu selekciu mutantov, ktoré sú neurotropnejšie alebo neurovirulentnejšie. Dôkaz druhej možnosti by si však vyžadoval veľké štúdie s použitím laboratórnych mačiek.
Zdalo sa, že určité formy FIP ovplyvňovali úspešnosť liečby. Chovanie GC376 pri liečbe okulárnej FIP bolo paradoxné, pretože táto forma mimoriadne dobre reagovala na GC376. Aj keď očné lézie reagovali na liečbu, všetky tri mačky s postihnutím očí nakoniec podľahli mozgovým ochoreniam, čo podporilo blízky anatomický vzťah oka a CNS. Chronické ileocekálne postihnutie a postihnutie hrubého čreva a spomalený rast u starších mačiek v tejto štúdii taktiež predstavovali zlú prognózu. U mnohých z týchto mačiek sa objavil brušný výpotok iba ako terminálny prejav ich choroby. Hostiteľské faktory tiež spojené so zníženou odpoveďou na antivírusovú liečbu pri iných vírusových infekciách, ako je HCV, zahŕňajú vek, pohlavie, cirhózu alebo fibrózu pečene, rasu alebo telesnú hmotnosť.
Vznik rezistencie je hlavným problémom každého antivírusového lieku, ale FIPV sa zriedka prenáša z mačky na mačku, a rezistencia na liečivo, ak by sa vyskytla, by predstavovala problém iba pre jednotlivé liečené mačky, a nie pre celú populáciu. Aj keď vírusová rezistencia na GC376 nebola pozorovaná až do 20 pasáží in vitro, čo naznačuje, že rezistencia sa nedá získať ľahko, dlhodobá a opakovaná liečba in vivo môže predstavovať silnejší selekčný faktor. Zdá sa však, že vírusová rezistencia nebola zodpovedná za relapsy brušných chorôb u piatich liečených mačiek. Tieto mačky mali granulomatózne útvary, často v hrubom čreve a ileo-cekálno-kolických lymfatických uzlinách, ktoré mohli poskytovať chránené miesto na pretrvanie vírusov. Ochrana patogénov v granulómoch je pre mykobaktérie dobre zdokumentovaným javom a vzťahuje sa na ďalšie patogény, ako sú vírusy. Stav ochorenia pečene (cirhóza) pri infekcii HCV tiež zvyšuje riziko relapsu a vyžaduje dlhšiu liečbu, čo tiež naznačuje, že vírusy môžu byť chránené pred liekmi, keď sa nachádzajú na určitých chránených miestach. Formácia „ochranných granulómov“ zahŕňa veľké množstvo chemokínov a cytokínov a zvyšovanie regulácie chemokínových receptorov, adresínov, selektínov a integrínov. Perzistencia patogénov na týchto chránených miestach môže vyžadovať vyššiu dávka lieku a dlhšiu dobu trvania liečby.
Zlyhania liečby môžu tiež byť výsledkom neschopnosti hostiteľa dosiahnuť ochrannú imunitnú reakciu počas obdobia, keď je potlačená replikácia vírusu. Takéto zlyhanie sa pozorovalo pri infekcii HCV u ľudí. Imunita sprostredkovaná T-lymfocytmi hrá dôležitú úlohu v ochrannej imunite, ktorá sa vyskytuje asi u 20% akútnej infekcie HCV, a pri rovnakom alebo väčšom podiele infekcie FIPV. Je ešte potrebné preskúmať možnú synergiu vírusového klírensu sprostredkovaného T-lymfocytmi a antivírusovej terapie u mačiek s FIP. Prínosom by mohla byť aj kombinácia antivírusových liekov a stimulantov imunity T-lymfocytov pri liečbe FIP, ako je kombinácia interferónov a ribavirínu pri liečbe infekcie HCV.
Trvalá remisia u 6/7 mačiek liečených 12 týždňov alebo dlhšie bola do istej miery predvídateľná. Tieto mačky boli vo veku 3,3–4,4 mesiaca, keď sa u nich prejavili akútne príznaky brušnej (C15, C17, C18, CT21, CT23) alebo hrudnej efúznej FIP (CT20). To ich urobilo mladšími ako všetky ostatné mačky v štúdii okrem troch (CT8, CT16, CT21) a viac sa podobali 16-týždňovým laboratórnym mačkám s akútnym nástupom efúznej FIP, ktoré dobre reagovali na GC376. Choroba, ak je akútna, dáva vírusu na prienik do mozgu alebo očí málo času. Akútnosť ich ochorenia mohla tiež umožniť kratšiu dobu, aby infekcia natrvalo narušila akúkoľvek ochrannú imunitnú odpoveď. Siedma mačka, CT04, bola oproti týmto šiestim mladším mačkám extrémom. CT04 bola so svojimi 6,8 rokmi najstaršou mačkou v štúdii, u ktorej došlo k výraznému úbytku hmotnosti (30%) a ochoreniu obmedzenému na mezenterické lymfatické uzliny. CT04 utrpela relapsy choroby vyžadujúce obnovenie liečby, ale všetky relapsy boli identické so vstupým stavom a nezahŕňali CNS. Je známe, že mačky s touto formou FIP prechádzajú spontánnou remisiou, čo naznačuje, že existuje bod zlomu medzi imunitou a chorobou. Mačky CT04 a CT21 demonštrovali múdre rozhodnutie znovuzahájenia liečby pri relapse, za predpokladu, že relapsy nezahŕňajú oči alebo nervový systém a stále reagujú na lieky.
Stanovenie minimálnej doby trvania liečby bolo založené na postupnom predlžovaní trvania liečby na základe priaznivej reakcie na liečbu. Na základe experimentálnych štúdií sa očakávalo, že môžu byť postačujúce 2 týždne liečby; to sa teda použilo ako východiskový bod. Táto štúdia však naznačila, že minimálna doba liečby sa blížila k 12 týždňom, čo sa prekvapivo blížilo k zvyčajnému 12-týždňovému obdobiu, ktoré je potrebné na liečbu ľudí s HCV pomocou inhibítorov proteázy. Avšak doba liečby HCV sa môže pohybovať od 8 do 24 týždňov u rôznych ľudí. Mačka CT21 bola navonok zdravá, aktívna a po 12 týždňoch liečby rástla, ale celkový počet bielkovín a bielych krviniek sa stále nevrátil do normálu, ako tomu bolo u ostatných šiestich mačiek. Napriek tomu sa rozhodlo o ukončení liečby po 17 týždňoch z dôvodu dlhého obdobia navonok normálneho zdravia. To, či by dlhodobejšia liečba mohla zabrániť relapsu choroby 13 týždňov po ukončení liečby, si môžeme len domýšľať, ale zvyšuje to pochybnosť o tom, aká dlhá má vôbec byť potrebná doba liečby u niektorých mačiek. Nastoľuje sa tiež otázka, ako dlhé musí byť obdobie remisie, aby sme mohli prehlásiť že došlo k uzdraveniu, a nielen k dlhodobej remisii. Najdlhšie obdobie bez choroby bolo v čase písania tohto článku viac ako 11 mesiacov, pričom päť ďalších mačiek bolo bez známok infekcie po dobu 5–9 mesiacov. Na základe klinických a histologických dôkazov neurologického ochorenia v čase smrteľných relapsov sa zdá, že sa vírus nakoniec dostane do mozgu a že to môže byť najdôležitejším obmedzujúcim faktorom pri antivírusovej liečbe FIP.
Aj keď dlhodobo prežila iba jedna tretina mačiek, 20 mačiek v tejto štúdii poskytuje základ pre budúce štúdie s GC376 a ďalšími antivírusovými liekmi, ktoré budú nasledovať. Nie všetky mačky budú liečiteľné, ale to by nemalo zastaviť úsilie. V tejto obmedzenej štúdii sa takmer všetkým liečeným mačkám vrátil normálny zdravotný stav, aj keď iba na niekoľko týždňov alebo mesiacov. Je dôležité si uvedomiť univerzálnosť vírusových patogénov a využiť priekopnícky vývoj liekov, ktoré sa klinicky uplatňujú pri liečbe ľudských chorôb, ako je HIV/AIDS, hepatitída C, MERS, SARS, Ebola a chrípka.
Závery
Inhibícia FIPV 3CLpro s pomocou GC376 sa za podmienok štúdie ukázala ako účinná a viedla k zníženiu replikácie vírusu a k remisii príznakov choroby u mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou FIP mimo CNS. K trvalej remisii v tejto štúdii však dochádzalo skôr u mačiatok vo veku nižšom ako 18 týždňov s akútnou vlhkou FIP alebo u mačiek so suchou FIP obmedzenou na mezenterickú lymfatickú uzlinu a je menej pravdepodobné, že sa vyskytne u mačiek starších ako 18 týždňov so suchou, zmiešanou alebo okulárnou formou FIP. Neschopnosť dosiahnuť trvalú remisiu bola spojená buď s vysokým výskytom neurologických ochorení počas alebo po ukončení liečby alebo s recidívou brušných lézií. Zdá sa, že antivírusová liečba spomalila progresiu neurologického ochorenia, ale nedokázala ju zvrátiť pri dávke použitej v tejto štúdii. Príčina recidívy extra-neurologického ochorenia pri liečbe nebola stanovená, ale nesúvisela s mutáciami v oblasti viažucej proteázu.
Konflikt záujmov: YK, KOC a WCG majú v rukopise patentové nároky na inhibítory proteázy. Ostatní autori neprehlasujú žiadne potenciálne konflikty záujmov v súvislosti s výskumom, autorstvom alebo publikovaním tohto článku.
Financovanie: Hlavná podpora tejto štúdie bola umožnená vďaka grantu od Morris Animal Foundation, Denver, CO, USA. Ďalšie prostriedky na technickú podporu a starostlivosť o zvieratá poskytli Fond Philipa Raskina, Kansas City, SOCK FIP, grant National Institutes of Health R01AI109039 a Centrum pre zdravie spoločenských zvierat, Kalifornská univerzita, Davis, CA, USA.
Literatúra
1.
Prokofjeva, MM, Kochetkov, SN, Prassolov, VS. Therapy of HIV infection: current approaches and prospects. Acta Naturae 2016; 8: 23–32. Google Scholar | Crossref | Medline
2.
Carter, W, Connelly, S, Struble, K. Reinventing HCV treatment: past and future perspectives. J Clin Pharmacol 2017; 57: 287–296. Google Scholar | Crossref | Medline
3.
Kim, Y, Lovell, S, Tiew, KC. Broad-spectrum antivirals against 3C or 3C-like proteases of picornaviruses, noroviruses, and coronaviruses. J Virol 2012; 86: 11754–11762. Google Scholar | Crossref | Medline
4.
Kim, Y, Mandadapu, SR, Groutas, WC. Potent inhibition of feline coronaviruses with peptidyl compounds targeting coronavirus 3C-like protease. Antiviral Res 2013; 97: 161–168. Google Scholar | Crossref | Medline
5.
Kim, Y, Shivanna, V, Narayanan, S. Broad-spectrum inhibitors against 3C-like proteases of feline coronaviruses and feline caliciviruses. J Virol 2015; 89: 4942–4950. Google Scholar | Crossref | Medline
6.
Kim, Y, Liu, H, Galasiti Kankanamalage, AC. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog 2016; 12: e1005531. Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
7.
Miller, FG, Brody, H. What makes placebo-controlled trials unethical? Am J Bioethics 2002; 2: 3–9. Google Scholar | Crossref | Medline
8.
Chiodo, GT, Tolle, SW, Bevan, L. Placebo-controlled trials good science or medical neglect? West J Med 2000; 172: 271–273. Google Scholar | Crossref | Medline
9.
Van Kruiningen, HJ, Ryan, MJ, Shindel, NM. The classification of feline colitis. J Comp Pathol 1983: 93: 275–294. Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
10.
Pedersen, NC, Eckstrand, C, Liu, H. Levels of feline infectious peritonitis virus in blood, effusions, and various tissues and the role of lymphopenia in disease outcome following experimental infection. Vet Microbiol 2015; 175: 157–166. Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
11.
Pellerin, M, Lopez-Aquirre, Y, Penin, F. Hepatitis C virus quasispecies variability modulates nonstructural protein 5A transcriptional activation, pointing to cellular compartmentalization of virus-host interactions. J Virol 2004; 78: 4617–4627. Google Scholar | Crossref | Medline
12.
Pedersen, NC, Allen, CE, Lyons, LA. Pathogenesis of feline enteric coronavirus infection. J Feline Med Surg 2008; 10: 529–541. Google Scholar | SAGE Journals | ISI
13.
Pedersen, NC . A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963–2008. J Feline Med Surg 2009; 11: 225–258. Google Scholar
14.
Pedersen, NC . An update on feline infectious peritonitis: virology and immunopathogenesis. Vet J 2014; 201: 123–132. Google Scholar | Crossref | Medline
15.
Pedersen, NC, Liu, H, Durden, M. Natural resistance to experimental feline infectious peritonitis virus infection is decreased rather than increased by positive genetic selection. Vet Immunol Immunopathol 2016; 171: 17–20. Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
16.
Pedersen, NC, Liu, H, Gandolfi, B. The influence of age and genetics on natural resistance to experimentally induced feline infectious peritonitis. Vet Immunol Immunopathol 2014; 162: 33–40. Google Scholar | Crossref | Medline
17.
Clifford, DB . HIV-associated neurocognitive disease continues in the antiretroviral era. Top HIV Med 2008; 16: 94–98. Google Scholar | Medline
18.
Foley, JE, Lapointe, JM, Koblik, P. Diagnostic features of clinical neurologic feline infectious peritonitis. J Vet Intern Med 1998; 12: 415–423. Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
19.
Mesquita, LP, Hora, AS, de Siqueira, A. Glial response in the central nervous system of cats with feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2016; 18: 1023–1030. Google Scholar | SAGE Journals | ISI
Valcour, V, Sithinamsuwan, P, Letendre, S. Pathogenesis of HIV in the central nervous system. Curr HIV/AIDS Rep 2011; 8: 54–61. Google Scholar | Crossref | Medline
22.
Joseph, SB, Arrildt, KT, Sturdevant, CB. HIV-1 target cells in the CNS. J Neurovirol 2015; 21: 276–289. Google Scholar | Crossref | Medline
23.
Spudich, S, Gonzalez-Scarano, F. HIV-1-related central nervous system disase: current issues in pathogenesis, diagnosis and treatment. Cold Spring Harb Perspect Med 2012; 2: a007120 Google Scholar | Crossref | Medline
24.
Cavalcante, LN, Lyra, AC. Predictive factors associated with hepatitis C antiviral therapy response. World J Hepatology 2015; 7: 1617–1631. Google Scholar | Crossref | Medline
25.
Saunders, BM, Cooper, AM. Restraining mycobacteria: role of granulomas in mycobacterial infections. Immunol Cell Biol 2000; 78: 334–334. Google Scholar | Crossref | Medline
26.
Smyk-Pearson, S, Tester, IA, Klarquist, J. Spontaneous recovery in acute human hepatitis C virus infection: functional T-cell thresholds and relative importance of CD4 help. J Virol 2008; 82: 1827–1837. Google Scholar | Crossref | Medline
27.
Legendre, AM, Bartges, JW. Effect of polyprenyl immunostimulant on the survival times of three cats with the dry form of feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2009; 11: 624–626. Google Scholar | SAGE Journals | ISI
28.
Legendre, AM, Kuritz, T, Galyon, G. Polyprenyl immunostimulant treatment of cats with presumptive non-effusive feline infectious peritonitis in a field study. Front Vet Sci 2017; 4: 7. Google Scholar | Crossref | Medline
Pred vysokou školou som nikdy nepremýšľal o tom, že by som bol veterinárom, aj keď som vyrastal na hydinovej farme v južnej Kalifornii a mal som všetky druhy zvierat. V roku 1957 som sa ako stredoškolák presťahoval do južnej Nevady a pracoval som ako dobrovoľník na miestnom ranči s dobytkom, ktorý sa pohyboval na veľkých plochách štátnej pôdy. Mojím cieľom po nástupe na univerzitu na Nevadskej univerzite v Rene bolo byť učiteľom odborného poľnohospodárstva. V druhom ročníku ma inšpiroval kurz, ktorý som absolvoval v odbore Veterinárne vedy, a ktorý vyučoval veterinárny výskumný pracovník Dr. Donald Marble. Otvoril mi oči pre kariéru vo veterinárnom lekárstve, o čom som pred jeho kurzom ani neuvažoval. Úplne som tomu prepadol a prihlásil som sa na veterinárnu školu na Kalifornskej univerzite v Davise v roku 1963. Veterinárnu školu som miloval a štúdium veterinárneho lekárstva som považoval za najväčšiu vzdelávaciu skúsenosť v biológii a medicíne, aká bola dostupná. Moje prvé skúsenosti s infekčnou peritonitídou mačiek (FIP) prišli v roku 1964, keď som pracoval s jedným doktorandom na veterinárnom patologickom programe. Príčina FIP nebola v tom čase známa a neexistovalo žiadne ochorenie zvierat alebo ľudí, ktoré by sa jej podobalo. Z tejto práce čerpal môj prvý odborný článok, na ktorom som sa podieľal ako spoluautor a bol publikovaný v roku 1967. Práve na veterinárnej škole vzrástol môj záujem o medicínu mačiek, hlavne kvôli mojej láske k nim a skúsenostiam s divokými mačkami na hydinovej farme môjho otca. Vo výuke, ale aj klinickej praxi som si uvedomil veľký nedostatok vedomostí o mačkách a ich o chorobách. Ako staršieho študenta ma najviac zaujímali infekčné a imunologické ochorenia s dôrazom na mačky a psy. Toto bola veľká príležitosť pre niekoho, kto pôvodne chcel byť lekárom dobytka. V rokoch 1967-68 som absolvoval stáž v odbore medicíny a chirurgie malých zvierat na Colorado State University a potom som odcestoval s manželkou a malou dcérou do Austrálie, kde som absolvoval doktorandské štúdium na Austrálskej národnej univerzite, John Curtin School of Medical Research v odbore experimentálna patológia a imunológia. Moje tri roky v Canberre boli druhou najväčšou vzdelávacou skúsenosťou v mojom živote a viedli ma k celoživotnej fascinácii austrálskym vnútrozemím, najmä flórou západnej Austrálie. Titul PhD som získal na ANU koncom roku 1971 a začiatkom roku 1972 som sa vrátil na Fakultu veterinárneho lekárstva UC Davis, kde som sa venoval výskumu rakoviny. To mi veľmi nevyhovovalo, ale našťastie môj dekan rozpoznal moje klinické schopnosti a požiadal ma, aby som nastúpil na klinickú fakultu ako odborný asistent. Odvtedy som zostal v Davise. Do dôchodku som odišiel v roku 2010 ako emeritný profesor. Na škole som zostal aktívne pôsobiť v oblasti výskumu až do roku 2020, kedy som do dôchodku odišiel definitívne.
Roky, ktoré som na UC Davis strávil ako člen fakulty, sú plné spomienok a zážitkov. Bol som 17 rokov aktívnym klinickým lekárom s kvalifikáciou pre internú medicínu malých zvierat, 21 rokov som vyučoval infekčné choroby, imunologické choroby a medicínu mačiek a potom som väčšinu času strávil administratívou a výskumom. Pôsobil som ako predseda oddelenia a neskôr som bol riaditeľom Veterinárneho genetického laboratória a zakladateľom a riaditeľom Centra pre zdravie spoločenských zvierat. Hlavným predmetom môjho výskumného záujmu boli infekčné ochorenia mačiek, a to mi umožnilo významne prispieť k nášmu porozumeniu mačacej leukémie (FeLV), kaliciviróze, herpesviróze a vírusu mačacej imunodeficiencie (FIV). Najviac som však bol posadnutý mačacím koronavírusom a jeho súvislosťou s infekčnou peritonitídou mačiek. Zistil som, že mačací koronavírus je príbuzný s koronavírusom psov a ošípaných, a že existuje ako všadeprítomný a väčšinou nepatogénny enterický vírus mačiek (takzvaný mačací enterický koronavírus – FECV). Najdôležitejším objavom bol vzťah FIP k FECV a postulát, že vírus FIP je špecifickou mutáciou FECV, ktorá je pre každú mačku podobná, ale jedinečná. Získať tento poznatok nebolo ľahké, pretože FIP odkrývala svoje tajomstvá len kúsok po kúsku a s veľkou nevôľou postupne po niekoľko desaťročí. Teraz už máme takmer kompletné znalosti o tom , ako vírus FIP vzniká a ako spôsobuje rôzne klinické formy FIP. Aj keď chápeme, ako vírusy FIP spôsobujú ochorenie, všetky pokusy o vývoj ochranných vakcín sa skončili neúspechom. To viedlo k štúdiám o tom, ako faktory hostiteľa a prostredia ovplyvňujú výskyt FIP. Aj keď sme týmto faktorom rozumeli už pomerne dobre a na základe týchto poznatkov sme mohli znížiť výskyt FIP, FIP aj naďalej ostávala hlavným zabijakom mačiek. Niekedy okolo roku 2015 som si uvedomil, že zrejme nebudeme schopní efektívne zabrániť vzniku FIP, a že by sme sa mali namiesto toho pokúsiť nájsť liek. Možnosť liečby bola založená na rastúcom využívaní antivírusovej terapie pre ľudské choroby spôsobené herpesvírusom, vírusom chrípky, HIV a vírusom hepatitídy typu C. Obzvlášť dôležité boli skúsenosti s liečbou hepatitídy C, ktorú tiež spôsobuje RNA vírus. Pri liečbe infekčnej hepatitídy typu C boli obzvlášť pozoruhodné inhibítory vírusovej proteázy. Moju pozornosť zaujal článok o inhibítoroch vírusových proteáz zvieracích RNA vírusov od výskumníkov z Kansas State University. To viedlo k prvej dôležitej spolupráci a objavu, že inhibítor vírusovej proteázy nazývaný GC376 dokáže vyliečiť FIP asi u jednej tretiny mačiek alebo aj viac. Následný výskum ďalšej triedy antivírusových liekov, nazývaných nukleozidové analógy, pre vírus Ebola viedol k spolupráci s vedcami z Gilead Sciences na jednej z ich zlúčenín s názvom GS-441524. V priebehu dvoch rokov tak boli objavené dva celkom odlišné antivírusové lieky, ktoré sú schopné vyliečiť FIP. Zvyšok je história – Za posledné dva roky boli pomocou GS-441524 na celom svete z FIP vyliečené tisíce mačiek.
V živote a kariére vedca sa nestáva často, že môže byť zapojený do takmer každej fázy poznávania novej infekčnej choroby ako je FIP, a svoju kariéru ukončiť nájdením lieku. Prvé zmienky o FIP pochádzajú z konca 50. rokov a neexistujú dôkazy o tom, že by existovala už oveľa skôr. Preto sa v istom zmysle FIP u mačiek podobá chorobe COVID-19 u ľudí, a skutočnosť, že obidve choroby sú spôsobené koronavírusom, by nemala zostať nepovšimnutá. Dúfajme, že vedcom skúmajúcim COVID-19 nebude trvať 50 rokov, kým pochopia a nájdu liek na infekciu SARS-CoV-2. Som spokojný so svojou kariérou a mojim prínosom k zdraviu mačiek na mnohých frontoch, nielen FIP. FIP ale bola vždy dôstojným protivníkom, ktorý upútaval moju pozornosť. Je toho ešte veľa, čo sa musíme naučiť, a dúfam, že nastupujúca mladšia generácia bude pokračovať v štúdiu tejto fascinujúcej choroby.
Stále som dotazovaný na vzťah medzi GS-441524 a veľmi nádejnou liečbou pre Covid-19 – Remdesivirom. GS-441524 je biologicky aktívna zložka Remdesiviru a na celom svete sa bežne používa na bezpečnú a efektívnu liečbu mačacej infekčnej peritonitídy (FIP) už viac ako 18 mesiacov. FIP je bežné a fatálne koronavírové ochorenie mačiek. GS-441424 a Remdesivir sú takmer identické lieky. Remdesivir je forma GS-441424, ktorú sa spoločnosť Gilead Sciences rozhodla používať u ľudí pre liečbu COVID-19, a momentálne prebiehajú klinické testy v Číne, USA a niekoľkých ďalších krajinách. Remdesivir je tzv. prodrug. Prodrug je transformovaný infikovanými bunkami na aktívnu zložku, ktorá je v tomto prípade GS-441524 s pridaním jednej fosfátovej skupiny (t.j.GS-5734). Vedci z Gileadu mierne zmenili GS-5734, aby chránili pridanú fosfátovú skupinu a umožnili absorpciu do buniek. Táto forma GS-441524 je známa ako Remdesivir. Po preniknutí do bunky jej enzýmy odstránia ochranu, čím sa získa GS-5734. GS-5734 sa ďalej v bunkách aktivuje pridaním dvoch ďalších fosfátov a vzniká trifosfátovová forma GS-441524. Toto je molekula, ktorá inhibuje produkciu vírusovej RNA. GS-441524 sme sa rozhodli použiť na liečbu FIP preto, lebo mal rovnaké antivirotické vlastnosti ako Remdesivir a v tom čase Gilead Sciences nepočítal s jeho použitím u ľudí. GS-441524 je taktiež omnoho lacnejší ako Remdesivir. Preto nebol zjavný konflikt medzi použitím jednej formy pre mačky a inej formy pre človeka. Gilead však prišiel k presvedčeniu, že náš výskum mačiek by ovplyvnil schválenie Remdesiviru pre použitie v humánnej medicíne a odmietol povoliť GS-441524 pre liečbu zvierat. Toto odmietnutie spojené so zúfalou potrebou liečby FIP na celom svete viedlo k vzniku čínskeho čierneho trhu s GS-441524. FIP je významným problémom domácich mačiek v Číne a čínski majitelia mačiek sa dožadovali liečby FIP ešte zúfalejší ako majitelia v iných krajinách. Prvé práce opisujúce liečbu FIP pomocou GS-441524 boli uverejnené v rokoch 2018 a 2019 a odvtedy liečbu absolvovali tisíce mačiek. Napriek týmto skúsenostiam lekárska obec, vrátane výskumných pracovníkov, zjavne nevedela o použití GS-441524 na liečbu FIP a jej vzťahu k Remdesiviru. Veterinári majú pritom značné ale nedocenené skúsenosti s koronavírusmi, koronavírusovými chorobami a vakcínami ošípaných, teliat a hydiny. Fretky tiež trpia závažným ochorením podobným FIP spôsobeným vlastným druhom koronavírusu. Čo sa stane s GS-441524 pre mačky, ak sa preukáže, že Remdesivir je bezpečný a účinný pri liečbe Covid-19? GS-441524 je prvým kritickým krokom vo výrobe Remdesiviru a je logické predpokladať, že povedie k existencii konkurencie v jeho použití pre mačky a ľuďí. Pozitívne je, že celosvetové schválenie Remdesiviru môže tiež pomôcť zmeniť názor proti udeleniu práv na použitie GS-441524 u zvierat. Ak by bol Remdesivir schválený na humánne použitie (hoci aj v prípade neschválenia samotného GS-441524), mohol by sa stať legálne dostupným aj pre použitie vo veterinárnej medicíne. Bezpečnosť a účinnosť Remdesiviru pre liečbu FIP však ešte nebola preskúmaná.
-Niels C. Pedersen, DVM, PhD, Škola veterinárnej medicíny, UC Davis..
Po polstoročí venovanom štúdiu tohto vírusu dokázal 76-ročný lekár pred dvoma rokmi prísť s vakcínou pre mačky.
DAVIS, Kalifornia – Koronavírus je mysliach mnohých ľudí na celom svete spojený s chorobou COVID-19, ale lekári upozorňujú, že koronavírusy sú s nami už celé desaťročia.
Profesor Dr. Niels Pedersen z UC Davis v Kalifornii študoval vírus pol storočia. Jeho zameranie? Špecifický kmeň vyskytujúci sa u mačiek spôsobujúci mačaciu infekčnú preitonitídu (FIP).
„Svojho času išlo o pomerne nezvyčajné ochorenie, ale pre mačky vysoko smrteľné, opradené množstvom záhad a tým aj veľmi zaujímavé,“ vysvetlil Pedersen. „Takže som okrem iného z toho urobil svoje celoživotné dielo.“
Po polstoročí venovanom štúdiu tohto vírusu dokázal 76-ročný lekár pred dvoma rokmi prísť s vakcínou, ktorá sa v súčasnosti účinne používa na liečbu mačiek.
Je to liek, o ktorom si myslí, že by sa mohol použiť na liečbu koronavírusu u ľudí, ale pre majiteľov domácich miláčikov to nie je lacná záležitosť.
„Liečba spočíva v podávaní injekcie po dobu 12 týždňov, táto liečba môže stáť až 10 000 dolárov, napriek tomu existujú tisíce ľudí, ktorí už svoje mačky liečili,“ uviedol.
Pedersen však hovorí, že jeho výskum a práca sú ignorované.
„Je tiež zvláštne, že veľa z toho, čo sme sa už v tomto období naučili prostredníctvom FIP u mačiek, sa dá aplikovať aj na ľudskú chorobu COVID-19, ale opomína sa to,“ uviedol Pedersen.
Pedersen uviedol, že ak sa v súčasnosti pripravuje vakcína pre ľudí, predstavitelia verejného zdravotníctva nemusia nevyhnutne znovu objavovať koleso.
„Poznatky o týchto vakcínach sa môžu využiť pre všetky vakcíny, ktoré sa v budúcnosti budú vyvíjať pre ľudí,“ vysvetlil Pedersen.
Narodil som sa v roku 1943. Môj otec bol dánsky emigrant a matka bola dcéra dánskych emigrantov. Dozvedel som sa však, že po otcovej línii mám aj švédske korene. Prvých 14 rokov svojho života som strávil v južnej Kalifornii (Azusa a San Dimas), kde si moji rodičia prenajali a potom vlastnili niekoľko rodinných hydinových fariem. Aj keď veľkoobchodné a maloobchodné vajcia boli ich hlavným predmetom podnikania, pre sviatočné obdobia chovali aj kačice, husi a morky. Môj otec mal rád mačky, ale nie ako domáce zvieratá. Na farme ich vždy choval veľké množstvo, aby udržal populáciu hlodavcov na nízkej úrovni a ich stravu dopĺňali vajíčka s krvou. Miloval som najrôznejšie zvieratá a choval som holuby, bažanty, divoké kačky. Ako domáce zviera som mal dokonca aj kozu a králika. Avšak mojou najvačsou láskou boli mačky.
Mojou prvou mačacou spoločníčkou bola biela krátkosrstá samica s hnedastými ušami, ktorá sa volala MoMo (matka mačky v mojom detskom jazyku). Žila so mnou 14 rokov a pravidelne a neskôr nepravidelne ma obdarovávala vrhmi mačiatok. Spriatelil som sa tiež s mnohými divokými mačkami a jednou z mojich úloh bolo sedieť s krabicou mačiatok, keď zákazníci prichádzali kupovať vajcia. Našiel som domovy pre veľa mačiatok a raz za čas som dostal 25 alebo 50 centov. Spoznal som charakter a osobnosť mačiek viac, ako ktokoľvek iný. Môj život sa zmenil v roku 1956, keď obrovský letný požiar v kopcoch okolo našej farmy San Dimas spôsobil, že teplota okolo kurčiat vystúpila na viac ako 53°C a prišli sme o všetku vodu použivanú na ich chladenie. Do týždňa zomrelo na následky úpalu šesťdesiattisíc kurčiat. Táto nešťastná udalosť bola v skutočnosti požehnaním, pretože malé rodinné hydinárske farmy v južnej Kalifornii sa rýchlo stávali neziskovými a táto udalosť prinútila môjho otca po 30 rokoch opustiť chov hydiny. Speňažil všetok majetok, ktorý mal nejakú cenu, a vymenil ho za malé teplé jarné letovisko v južnej Nevade a odvtedy bola moja rodina skutočnou strednou triedou. Rekreačné stredisko sa nachádzalo v údolí zvanom Upper Muddy , v ktorom sa tiež nachádzal veľký dobytčí ranč. Stredná škola bola vzdialená 20 míľ v meste Overton a škola začínala jazdou autobusom o 6:30. Na strednú školu som nastúpil ako nováčik s veľkou trémou a hneď v prvý deň vyučovania som sa okamžite zamiloval do svojej budúcej manželky (Gerie). Malá stredná škola a život v mormónskej farmárskej komunite mi priniesli najrôznejšie skúsenosti, ktoré by som nemal, keby som navštevoval oveľa väčšiu strednú školu v južnej Kalifornii. Každý schopný chlapec súťažne športoval a bolo tu mnoho zaujímavých kurzov a mimoškolských aktivít. Každý študent sa musel zúčastnňovať viacerých aktivít. Moje najväčšie stredoškolské skúsenosti boli s Future Farmers of America (Budúci Americkí Farmári) a nakoniec som sa stal štátnym úradníkom FFA.
V roku 1961 som bol prijatý na Nevadskú univerzitu v Rene na štipendiá z Union Pacific Railroad a Nadácie Maxa E. Fleishmana s úmyslom stať sa učiteľom odborného poľnohospodárstva. Čoskoro som si uvedomil, že to asi nebola najlepšia voľba kariéry, ale nemal som ani potuchy o ničom inom. Na konci prvého ročníka som však prestúpil na Animal Sciences (Zvieracie vedy) a v druhom ročníku som začal navštevovať omnoho náročnejšie predmety v rámci prípravy na prípadný titul Ph.D. v tomto obore. Môj život sa opäť zmenil, keď som sa prihlásil na kurz veterinárnych vied, ktorý viedol jeden z dvoch veterinárov, ktorí boli zodpovední za malý program veterinárnych vied na UNR. Nikdy predtým som nemal žiadne priame skúsenosti s veterinármi. Doktor Marble naštartoval môj záujem o veterinárnu medicínu a dokonca mi dovolil pomáhať mu s niektorými z jeho experimentálnych operácií. Okamžite ma to chytilo a na poslednú chvíľu som sa prihlásil na tri veterinárne školy, UC Davis, WSU a CSU. Prijali ma na všetky tri školy, ale rozhodol som sa ísť na UC Davis v Kalifornii, ktorá bola bližšie k môjmu domovu. Som rodený Kalifornčan (a adaptovaný Nevaďan). Mal som tiež šťastie, že mi školné platil štát Nevada podľa Western Interstate Compact for Higher Education (WICHE).
Na veterinárnu školu som nastúpil v septembri 1963 s úmyslom stať sa praktickým lekárom hovädzieho dobytka (moje druhé a tretie lásky sú kravy a hydina). Pracoval som cez víkendy a prázdniny na niekoľkých vedeckých projektoch a ešte viac som sa zamiloval do výskumu. V auguste 1964 som sa oženil so svojou stredoškolskou láskou Gerie. Vo voľnom čase som s jedným z postgraduálnych študentov patológie pracoval na novej chorobe mačiek nazývanej mačací infekčný zápal pobrušnice a bol som spoluautorom môjho prvého vedeckeho článku o FIP v roku 1964. Bol som zhrozený nedostatkom znalostí o mačkách a ich chorobách, ale to ma nezastavilo. Po absolutóriu na veterinárnej škole som absolvoval internú medicínu pre malé zvieratá a chirurgiu na Colorado State University, čo významne ovplyvnilo môj ďalší život a kariéru. Opäť som si uvedomil, ako málo vieme o chorobách mačiek, a ešte viac som si uvedomil svoju celoživotnú spriaznenosť a porozumenie s týmto druhom. Pred začatím stáže v roku 1967 som bol prijatý ako postgraduálny študent na John Curtin School of Medical Research (JCSMR), Australian National University, Canberra, A.C.T., Austrália. Austrália ma fascinovala celý môj život a JCSMR mi poskytla nielen skvelé skúsenosti s výskumom, ale aj moje prvé skúsenosti s touto rozľahlou a krásnou krajinou. Po ukončení praxe som krátko pracoval v ako praktik pre celebrity v Hollywoode, aby som si zarobil peniaze na to, aby som svoju rodinu (mal som už dcéru) dostal do Austrálie. Štúdium v oblasti výskumu na Katedre experimentálnej patológie na JCSMR bolo bezkonkurenčné, ale úplne nesúviselo s mojou budúcou kariérou. Naučil som ale o experimentálnych metódach. V roku 1972 som získal titul Ph.D. z experimentálnej patológie a imunológie s vyznamenaním v roku. Moja láska k Austrálii, ktorú som si ako dieťa pestoval v knihách, sa stala celoživotnou vášňou. Mojou záľubou je identifikácia a fotografovanie rastlín západnej Austrálie. V našom dome vo Winters v Kalifornii mám veľkú zbierku fotografií kvitnúcich krovín západnej Austrálie.
Dr. Pedersen, ako dlhoročný riaditeľ Centra pre zdravie spoločenských zvierat (CCAH), viedol tím, ktorý zháňal peniaze a navrhol svoj súčasný domov. Budova CCAH bola dokončená v roku 2006 za cenu 16 miliónov dolárov, pričom všetky boli získané zo súkromných zdrojov. Je považovaná za jednu z najkrajších a najfunkčnejších budov v areáli a je sídlom piatich klinických služieb a štyroch hlavných výskumných programov.
Začiatkom roku 1972 som sa vrátil do USA na výskumnú pozíciu na škole veterinárneho lekárstva v UC Davis, kde som študoval rakovinu zvierat spojenú s retrovírusmi. Toto bol môj prvý zážitok s vírusom mačacej leukémie, ktorú sme videli ešte počas môjho študia u mnohých mačiek, ale ktorej príčina bola vtedy neznáma. Prvý rok vo výskume mi nešiel veľmi dobre a zvažoval som odchod na postdoktorandskú pozíciu v oblasti transplantačnej imunológie na Washingtonskej univerzite. Pred formalizáciou tejto pozície mi ale zavolal dekan Veterinárnej školy a opýtal sa ma, či by som zvážil prijatie miesta na klinike internej medicíny pre malé zvieratá. Dekan Pritchard bol unavený z najímania lekárov síce s bohatými klinickými skúsenosťami, ale so slabými vedeckými schopnosťami. Rozhodol sa skúsiť prijímať na kliniku ľudí s veľkými skúsenosťami z výskumu a dobrým klinickým potenciálom. Stal som sa tak prvým z veľkého počtu zamestnancov na UC Davis s profesionálmym pozadím tohto druhu. Ukázalo sa, že to bolo veľmi múdre rozhodnutie, pretože klinický program na UC Davis sa čoskoro stal svetoznámy nielen kvôli vysokej klinickej úrovni, ale aj vysokej úrovni výskumu.
Na UC Davis som pôsobil od roku 1972 a dôchodok som dosiahol v októbri 2013 ako Mimoriadny emeritný profesor. Prvých 17 rokov som strávil na klinikách, učil som a pracoval som vo výskume. Po zvyšok môjho pôsobenia v Davise sa moja kariéra oveľa viac týkala administratívy a výskumu. Po pôsobení vo funkcii predsedu oddelenia som sa stal zakladateľom a riaditeľom Centra pre zdravie spoločenských zvierat a o niekoľko rokov neskôr aj riaditeľom Laboratória pre veterinárnu genetiku. Táto posledná uvedená funkcia znovu zapálila môj záujem o úlohu genetiky pri chorobách. Výskum infekčných a imunologických chorôb mačiek a psov ma sprevádzal celú moju kariéru. Stále pracujem a pokračujem v mojej prvej láske, výskume. Nemám v pláne odísť do dôchodku, pokiaľ mi to zdravie dovolí, pretože pre mňa je dôchodok vo výskume oveľa lepší ako dôchodok.
Aj keď som skúmal mnoho infekčných chorôb mačiek, FIP zostáva mojou prvou láskou, ak sa týmto termínom dá nazvať choroba, ktorá je stále tak rozšírená a takmer vždy smrteľná. Naučil som sa nazerať na FIP ako na „dôstojného protivníka“. Je to nepochybne jedna z najkomplexnejších a najnáročnejších infekčných chorôb, aké existujú, a snaha nájsť prevenciu a liečbu je to, čo ma najviac poháňa. Uvedomujem si, že odpovede neprídu len tak. Nie je to ako výskum ľudských chorôb, ktoré nemajú problémy s financovaním, či už od jednotlivcov alebo organizácií, ktoré majú osobný záujem na objave liečby. Dúfam, že sa budem naďalej usilovať o to, aby sa choroba udržala v centre záujmu, a môžem povedať, že nie som sám. Nedávno som recenzoval viac ako 100 klinických a vedeckých publikácií o FIP, ktoré predložili výskumné skupiny z celého sveta od roku 2008. Žiadna iná choroba mačiek nezískala tak veľkú pozornosť.
Prikladám podrobnejší životopis mojej kariéry s dôrazom na výskum FIP, ktorý ma stále pohlcuje. Moje najväčšie kariérne úspechy boli na poli infekčných chorôb mačiek, ako sú FeLV, FIV, FCV, FECV a FIPV. Moja učebnica o chorobách v prostredí s viacerými mačkami, ktorá sa dnes už stala klasikou , je možno mojím najlepším kreatívnym dielom. Avšak moja manželka, tri dcéry, syn a 7 (čoskoro 8) vnúčat, zatiaľ všetky úspešné, sú mojím najväčším odkazom. Dúfam ale, že aspoň nejaký čas ostanú viditeľné aj moje „odtlačky labiek“ prostredníctvom literatúry o chorobách mačiek. A ešte niečo, ako domáce zvieratá som vždy mal mačky – vždy iba dve a vždy samcov.
–Niels C. Pedersen
Poznámka: Keď Dr. Pedersen zmieňuje podrobnejší kariérny životopis, myslel tým hlavne množstvo publikovaných článkov, ktoré nájdete vo vedeckých periodikách.
Toto je snímka z roku 1991, keď som dostal prvé ocenenie Jean Holzworth za výskum mačiek. Dr. Holzworth bola pre mňa najlepším odborníkom pre mačaciu medicínu, aký kedy žil. DVM získala na Cornellovej univerzite a celý život strávila v nemocnici Angell Memorial Animal Hospital v Bostone. Napísala prvú modernú učebnicu o chorobách mačiek a považoval som ju za dobrú priateľku a inšpiráciu. Presvedčila ma o niečom, čomu som vždy veril – nemôžete byť skvelým veterinárnym lekárom pre mačky bez hlbokých a dôverných znalostí o tomto druhu vrátane všetkého od anatómie a fyziológie až po správanie. -DR. P.
Manželka Dr. Pedersena Gerie s najnovšími členmi rodiny SOCK FIP – nedávno adoptovali dvoch bratov Piper (vpravo) a Froda (vľavo). Frodo a Piper patria medzi mnohé bývalé experimentálne mačky, ktoré si Pedersenovci za posledných 40 rokov adoptovali.
SK 
EN