Terapeutický účinok antihumánnej TNF-alfa protilátky a itrakonazolu pri liečbe FIP

31.3.2020, Preklad 25.4.2021
Tomoyoshi Doki, Masahiro Toda, Nobuhisa Hasegawa, Tsutomu Hohdatsu & Tomomi Takano
Pôvodný článok: Therapeutic effect of an anti-human-TNF-alpha antibody and itraconazole on feline infectious peritonitis

Abstrakt

Infekčná peritonitída mačiek (FIP) je smrteľné ochorenie voľne žijúcich a domácich druhov mačiek. Aj keď niektoré lieky sa ukázali ako účinné pri liečbe FIP, v klinickej praxi sú stále nedostupné. V tejto štúdii sme hodnotili terapeutický účinok kombinovaného použitia adalimumabu (antihumánna TNF-alfa monoklonálna protilátka, ADA) a itrakonazolu (ICZ), ktoré sú veterinárnym lekárom v súčasnosti k dispozícii. Neutralizačná aktivita ADA proti fTNF-alfa-indukovanej cytotoxicite sa merala v bunkách WEHI-164. Desať mačiek bez špecifických patogénov (SPF) bolo naočkovaných intraperitoneálne FIPV KU-2 typu I. Mačkám, u ktorých sa vyvinula FIP, sa ADA (10 mg/zviera) podávala dvakrát medzi dňom 0 a dňom 4 po zahájení liečby. ICZ (50 mg/hlava, SID) sa podával orálne každý deň od dňa 0 po začiatku liečby. ADA preukázala na dávke závislú neutralizačnú aktivitu proti rfTNF-alfa. V experimente na zvieratách 2 z 3 mačiek preukázali zlepšenie klinických symptómov FIP a výsledkov biochémie, zvýšenie počtu lymfocytov v periférnej krvi a pokles hladiny alfa 1-AGP v plazme po zahájení liečby. Jedna z mačiek na liečbu nereagovala a bola eutanizovaná, aj keď hladina vírusového génu v ascite po zahájení liečby dočasne poklesla. Zistilo sa, že ADA má neutralizačnú aktivitu proti rfTNF-alfa. Kombinované použitie ADA a ICZ ukázalo terapeutický účinok na experimentálne indukovanú FIP. Tieto lieky považujeme za možnosť liečby, kým nebudú účinné lieky proti FIPV legálne dostupné.

Úvod

Vírus infekčnej peritonitídy mačiek (FIPV), mačací koronavírus (FCoV) z čeľade Coronaviridae, spôsobuje u voľne žijúcich a domácich druhov mačiek smrteľné ochorenie nazývané infekčná peritonitída mačiek (FIP). U mačiek, u ktorých sa vyvinie FIP, je postihnutých niekoľko orgánov vrátane pečene, pľúc, sleziny, seróz, obličiek, očí a centrálneho nervového systému a tvorbu lézií v týchto orgánoch sprevádza nekróza a pyogénny granulomatózny zápal. U niektorých mačiek bolo zaznamenané hromadenie pleurálneho výpotku a ascitickej tekutiny ^[1].

Virión FCoV sa skladá hlavne z nukleokapsidy (N), obalu (E), membrány (M) a peplomerových spike (S) proteínov. FCoV sú klasifikované do dvoch sérotypov, FCoV typu I a II, na základe rozdielov v aminokyselinovej sekvencii S proteínu ^{[2, 3]}. FCoV typu II bol generovaný genómovou rekombináciou medzi FCoV I. typu a psím koronavírusom II. typu (CCoV) ^[4,5,6]. Niekoľko sérologických a genetických prieskumov ukázalo, že FCoV typu I je dominantný a že väčšina prípadov FIP je spôsobená infekciou FIPV typu I ^[7,8,9].

Už skôr sme ukázali, že TNF(tumor nekrotizujúci faktor)-alfa hrá rozhodujúcu úlohu v progresii FIP. TNF-alfa je nadmerne produkovaný makrofágmi infikovanými FIPV. TNF-alfa sa podieľa na lymfopénii a zvýšených hladinách bunkového receptora FIPV sérotypu II, aminopeptidázy N (APN) ^{[10, 11]}. Tiež sa uvádza, že apoptóza neutrofilov u mačiek s FIP je inhibovaná TNF-alfa ^[12]. Toto zistenie naznačuje, že neutrofília u mačiek s FIP je spôsobená prežitím neutrofilov indukovaným TNF-alfa. Zistili sme, že monoklonálna protilátka (mAb) 2-4 s vysokou neutralizačnou aktivitou proti mačaciemu TNF-alfa (fTNF-alfa) je použiteľná ako liečba FIP ^{[13, 14]}. Avšak mAb anti-fTNF-alfa nebola nikdy uvedená na trh a nemôže byť klinicky použitá v zvieracích nemocniciach. V humánnej medicíne sa antihumánna TNF-alfa mAb používa na liečbu zápalových ochorení, ako je reumatoidná artritída a Crohnova choroba ^[15]. Je komerčne dostupná a je možné aj jej použitie vo veterinárni praxi. Nie je však známe, či je táto ľudská protilátka účinná proti FIP, chorobe mačiek.

Pre liebu FIPV bolo opísaných niekoľko antivírusových látok ^{[16,17,18,19,20]}. Bolo potvrdené, že tieto lieky znižujú množenie FIPV, ale nie sú komerčne distribuované ako veterinárne lieky. Už skôr sme zistili, že itrakonazol (ICZ), ktorý sa používa vo veterinárnej medicíne, znižuje množenie FIPV typu I ^[21,22,23]. Terapeutické účinky ICZ u mačiek s FIP však zostávajú nejasné.

V tejto štúdii sme hodnotili, či má adalimumab (ADA), antihumánna TNF-alfa mAb, neutralizačnú aktivitu proti fTNF-alfa. Ďalej sme hodnotili terapeutické účinky ADA a ICZ na FIP ich podávaním mačkám s experimentálne indukovanou FIP.

Materiály a metódy

Bunkové kultúry a vírusy

Bunky myšieho sarkómu WEHI-164 sa udržiavali v rastovom médiu RPMI 1640 doplnenom o 10% FCS, 600 U benzylpenicilínu draselného na ml, 240μg streptomycínsulfátu na ml a 50μM 2-merkaptoetanolu. Bunky myšieho sarkómu WEHI-164 boli z American Type Culture Collection (ATCC CRL1751).

FIPV KU-2 typu I sa pestoval v celých plodových (fcwf)-4 bunkách Felis catus pri 37°C. FIPV typu I KU-2 typu I bol izolovaný v našom laboratóriu.

Monoklonálna protilátka

Anti-fTNF-alfa mAb 2-4 boli opísané v ^[13] a bolo preukázané, že majú neutralizačnú aktivitu pre rekombinantný fTNF-alfa (rfTNF-alfa) a prirodzený fTNF-alfa. mAb 2-4 sa purifikovali z hybridomového kultivačného supernatantu pomocou proteínu G Sepharose (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA). Anti-humánna TNF-alfa mAb, adalimumab (ADA, Humira®), bola zakúpená od Eisai Co., Ltd. (Tokio, Japonsko) ako roztok 20mg/0,2 ml. ADA sa zriedil na koncentráciu 2mg/ml vo fyziologickom roztoku.

Itrakonazol

Itrakonazol (ICZ) bol zakúpený od spoločnosti NICHI-IKO (Toyama, Japonsko) a poskytnutý ako tableta (100 mg). Mačkám bola podávaná polovica tablety, rozdrvená na prášok a zmiešaná s jedlom.

Neutralizácia mačacieho TNF-alfa pomocou ADA v bunkách WEHI-164

Neutralizácia TNF-alfa v bunkách WEHI-164 sa testovala podľa popisu Doki a kol. ^[13]. Stručne povedané, bunky WEHI-164 sa suspendovali pri hustote 1×10⁶ buniek/ml v riediacom médiu obsahujúcom 1μg aktinomycínu D (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) na ml a predinkubovali sa pri 37°C po dobu 3 hodín. Sériovo zriedené mAb sa zmiešali s 40ng rfTNF-alfa na ml. Zmes sa inkubovala pri 37°C počas 1 hodiny. Predinkubované bunky sa naočkovali v objeme 50μl do jamiek 96-jamkovej doštičky. Potom sa do každej jamky pridalo 50 mikrolitrov zmesi. Po inkubácii pri teplote 37°C počas 24 hodín sa pridalo 10μl roztoku WST-8 (WST-8 Cell Proliferation Assay Kit; Kishida Chemical Co., Ltd., Osaka, Japonsko) a merala sa absorbancia vyrobeného formazanu pri 450nm. Percento neutralizácie bolo vypočítané pomocou nasledujúceho vzorca: Neutralizácia (%) = (OD jamiek obsahujúcich mAb a rfTNF-alfa – OD jamiek obsahujúcich rfTNF-alfa bez mAb)/OD jamiek bez mAb a rfTNF-alfa × 100.

Pokus na zvieratách

Boli dodržané všetky príslušné národné a inštitucionálne smernice pre starostlivosť a použitie zvierat. Protokol o experimentovaní na zvieratách bol schválený prezidentom Kitasato University na základe rozhodnutia Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť a použitie zvierat na Kitasato University (schválenie č. 18-152). Mačky bez špecifických patogénov (SPF) boli chované v našom vlastnom laboratóriu a udržiavané v izolovanom zariadení s regulovanou teplotou.

Experimentálny harmonogram

Podľa experimentálneho harmonogramu zobrazeného na obr. 1 bolo 10 mačiek SPF (9- alebo 10-mesačné domáce krátkosrsté mačky) naočkovaných intraperitoneálne FIPV KU-2 typu I (103,6 TCID50/ml/zviera). Potom sa u mačiek denne vyšetrovali klinické príznaky a merala sa ich telesná teplota a hmotnosť. Mačkám, u ktorých sa vyvinula FIP, sa ADA (10 mg/zviera) podávala dvakrát intravenózne medzi dňom 0 a dňom 4 po začiatku liečby. ICZ (50mg/zviera, SID) sa podával orálne každý deň od dňa 0 po zahájení liečby. Krv sa odoberala mačkám v týždňových intervaloch po naočkovaní vírusom a v čase podania ADA. Heparinizovaná krv sa použila na meranie úplného a diferenciálneho počtu buniek a na izoláciu plazmy. Vzorky plazmy sa až do dňa analýzy skladovali pri -30°C. Mačky boli eutanizované po dosiahnutí humánneho koncového bodu alebo 60 dní po infikovaní. Diagnózy FIP boli potvrdené posmrtným vyšetrením s odhalením peritoneálnych a pleurálnych výpotkov a pyogranulómu v hlavných orgánoch.

Meranie plazmatického alfa1-glykoproteínu (AGP)

Plazmatické koncentrácie AGP sa stanovili pomocou mačacej doštičky alfa1 AG (The Institute for Metabolic Ecosystem Lab., Osaki, Japonsko) podľa protokolu výrobcu.

Meranie koncentrácie plazmatického vaskulárneho endoteliálneho rastového faktora (VEGF)

Plazmatické koncentrácie VEGF sa stanovili pomocou humánnej VEGF ELISA súpravy (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) podľa protokolu výrobcu. Súprava ELISA primárne deteguje mačaciu VEGF izoformu 164 ^[24].

Kvantitatívna RT-PCR v reálnom čase (qRT-PCR)

Na kvantifikáciu vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu sa uskutočnila qRT-PCR s použitím primeru zameraného na 3’-UTR ^[17]. Jeden mililiter ascitu sa zhromaždil od mačky č. 6 a po centrifugácii sa supernatant a bunky uložili oddelene. Celková RNA sa izolovala zo supernatantu a buniek z ascitu pomocou súpravy na izoláciu RNA vysokej čistoty (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemecko) podľa pokynov výrobcu. RNA bola reverzne transkribovaná a amplifikovaná s použitím RNA-direct Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Osaka, Japonsko) so špecifickými primermi 3′-UTR-F (5′-GGAGGTACAAGCAACCCTATT-3 ‘) a 3′-UTR-R (5’-GATCCAGACGTTAGCTCTTCC-3 ‘) a sonda (FAM-5′-AGATCCGCTATGACGAGCCAACAA-3’-BHQ1). Reakcia sa uskutočňovala v celkovom objeme 20μl/jamku na 48-jamkových doštičkách PCR s použitím systému StepOne Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pri teplote 90°C počas 30s, 60°C počas 20 minút a pri 95°C počas 1 minúty, potom nasledovalo 45 cyklov pri 90°C počas 15s a 60°C počas 1 minúty. Na získanie kontrolnej RNA na kvantifikáciu sa cDNA fragmenty amplifikované s primérmi 3’-UTR-F a 3’-UTR-R klonovali do pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA). Linearizovaný a purifikovaný plazmid bol transkribovaný pomocou RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7 (Promega, Madison, WI, USA) podľa pokynov výrobcu. Koncentrácia transkribovanej RNA sa merala pomocou spektrofotometra. Boli pripravené desaťnásobné riedenia transkriptu RNA v rozmedzí od 1×10¹ do 1×10⁹ kópií/μl s 10ng MS2 RNA na ml. Počet kópií RNA sa vypočítal podľa postupu opísaného v Fronhoffs a kol. ^[25]. Zásobné roztoky in vitro transkribovanej RNA sa skladovali pri -80°C a zriedené pracovné roztoky sa skladovali pri -30°C.

Proteínová sekvencia

Odvodené aminokyselinové sekvencie mačacieho a humánneho TNF-alfa sa získali z RefSeq (prístupové čísla NP_001009835.1 a NP_000585.2). Porovnanie odvodených aminokyselinových sekvencií mačacieho a ľudského TNF-alfa sa uskutočnilo s použitím Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

Výsledky

Neutralizačná aktivita ADA proti rfTNF-alfa

Porovnanie odvodených aminokyselinových sekvencií mačacích a humánnych TNF-alfa je znázornené na obr. 2. Zistilo sa, že sekvencie sú identické na 89,7%.

Neutralizačná aktivita ADA proti rfTNF-alfa sa merala pomocou testu cytotoxicity WEHI-164. ADA neutralizovala aktivitu rfTNF-alfa spôsobom závislým od dávky, podobne ako anti-fTNF-alfa mAb 2-4 (obr. 3). Dávka mAb2-4 a ADA potrebná na inhibíciu bunkovej smrti o 50% (IC50) bola 18,1 ± 4,9 ng/ml, respektíve 36,9 ± 23,4 ng/ml.

Zmeny telesnej teploty a telesnej hmotnosti

Desať mačiek SPF bolo naočkovaných intraperitoneálne 103,6 TCID50 FIPV KU-2 typu I. Tri mačky (2, 3 a 6) vykazovali horúčku, anorexiu, letargiu a žltačku. Distenzia brucha spôsobená ascitom sa pozorovala u mačky č. 6. Tieto 3 mačky boli použité v nasledujúcich experimentoch ako FIP mačky. Liečba mačiek 2, 3 a 6 sa začala 34., 32. a 21. deň po naočkovaní vírusom.

Zmeny telesnej teploty a telesnej hmotnosti u troch mačiek sú znázornené na obr. 4. U všetkých sa vyvinula horúčka ≥ 39°C niekoľko dní pred zahájením liečby (obr. 4A). U mačiek 2 a 3 sa telesná teplota znížila na rozsah pred nástupom FIP 7. deň po začiatku liečby. Potom sa telesná teplota mačky č. 3 sa zvýšila na 38,7°C 31. deň po zahájení liečby. Telesná teplota mačky č. 6 zostala na ≥ 39,0°C aj po začiatku liečby.

U mačiek 2 a 3 sa nepozoroval žiadny úbytok telesnej hmotnosti v porovnaní s telesnou hmotnosťou v deň 0 liečby (obr. 4B). Telesná hmotnosť mačky č. 6 naďalej klesala od dňa 0 do dňa 15, čo malo za následok 8% stratu v porovnaní s dňom 0.

Zmeny počtu WBC a lymfocytov

Celkový počet bielych krviniek a počet lymfocytov sa meral u mačiek infikovaných FIPV. U mačiek 2 a 3 sa počas celého experimentu pozorovala malá zmena v celkovom počte bielych krviniek (obr. 5A). U mačky č. 6 sa celkový počet bielych krviniek zvýšil po zahájení liečby a po šiestom dni zostal na hodnote ≥ 20 000 buniek/μl.

U mačiek 2 a 3 sa počet lymfocytov po zahájení liečby mierne zvýšil (obr. 5B). U mačky č. 6, počet lymfocytov zostal počas celého experimentu nízky. Znížila sa na približne 800 buniek/μl v deň 6 po začiatku liečby, ale obnovila sa takmer na úroveň pred prepuknutím FIP v deň 13 a nevykazovala výraznú zmenu až do humánneho koncového bodu.

Zmeny v plazmatickej koncentrácii alfa1-kyslého glykoproteínu (AGP)

Hladina alfa 1-AGP v plazme sa merala postupne u troch mačiek. U všetkých troch mačiek sa zvýšila na vysokú hladinu ≥ 750 μg / ml na začiatku liečby (obr. 6). U mačiek 2 a 3 sa plazmatická hladina alfa 1-AGP znížila takmer na hladinu pred vývojom FIP v 14. a 16. deň po zahájení liečby. Avšak u mačky č. 6 bolo zvýšenie plazmatickej hladiny alfa 1-AGP potlačené až do 6. dňa po začiatku liečby, ale na 13. deň sa zvýšilo na približne 1 900μg/ml.

Zmeny koncentrácie plazmatického vaskulárneho endoteliálneho rastového faktora (VEGF)

Plazmatická hladina VEGF sa postupne merala u troch mačiek. U mačky č. 2 zostal nízky (obr. 7). U mačky č. 3, sa dočasne zvýšila na približne 200 pg/ml v deň 5 pred zahájením liečby, ale znížila sa takmer na úroveň pred nástupom FIP v deň 0 liečby a po nej nevykazovala žiadny nárast. U mačky č. 6 sa plazmatická hladina VEGF zvýšila po inokulácii FIPV na približne 170 pg/ml v deň 0 liečby. Potom sa znížila počnúc 6. dňom liečby a bola podobná úrovni pred prepuknutím FIP v 13. deň.

Hladiny vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu u mačky č. 6

Hladiny vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu zhromaždených od mačky č. 6 bolo kvantifikovaných pomocou qRT-PCR. Úroveň vírusovej RNA dočasne poklesla na 4. deň po zahájení liečby v supernatante aj v bunkách z ascitu (obr. 8). V deň 20 po začiatku liečby sa však hladiny vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu zvýšili na dvojnásobok úrovní v deň 0 liečby.

Biochemický panel

Po liečbe sa merali TP a pomer A/G, čo sú diagnostické indexy FIP, a AST, LDH a TB, ktoré súvisia s funkciou pečene (obr. 9). TP sa mierne zvýšila u mačky č. 3, ale u všetkých troch mačiek zostala v normálnom rozmedzí. Na druhej strane pomer A/G poklesol po vystavení FIPV u všetkých troch mačiek a v deň 0 liečby bol ≤ 0,8. U mačky č. 2, pomer A/G zostal podobný ako po začiatku liečby až do konca experimentu. U mačky č. 3, klesal až do 16. dňa liečby, ale potom už nevykazoval žiadny ďalší pokles. U mačky č. 6 pokračovalo znižovanie aj po zahájení liečby.

AST, LDH a TB boli vyššie ako normálne rozmedzie v deň 0 alebo 3 liečby u všetkých troch mačiek. U mačiek 2 a 3 sa AST, LDH a TB znížili takmer na hladiny pred nástupom FIP v deň 7 alebo 9 po zahájení liečby. U mačky č. 6, AST, LDH a TB boli vyššie ako normálne rozmedzie v deň 0 alebo 4 po zahájení liečby a naďalej sa zvyšovali až do konca experimentu.

Diskusia

Silný terapeutický účinok možno dosiahnuť, ak sa mačkam s FIP podáva mAb anti-fTNF-alfa, ktorý potláča aktivitu TNF-alfa, exacerbátor FIP, v kombinácii s ICZ, ktorý znižuje proliferáciu (množenie) FIPV. Avšak schválenie mAb anti-fTNF-alfa ako veterinárneho lieku v každej krajine je nákladné a časovo náročné. Preto sme sa zamerali na antiľudskú TNF-alfa mAb, ktorá sa už používa na liečbu ľudských zápalových chorôb.

Pred uskutočnením pokusov na zvieratách sme skúmali, či antihumánna TNF-alfa mAb môže neutralizovať fTNF-alfa. ADA, ktorá je antihumánnou TNF-alfa mAb, demonštrovala na dávke závislú neutralizačnú aktivitu proti rfTNF-alfa, podobnú anti-fTNF-alfa mAb 2-4. Deväť skôr reportovaných anti-fTNF-alfa mAb, malo IC50 v rozmedzí od 5 do 700ng/ml proti rfTNF-alfa pri rovnakej koncentrácii ^[13]. IC50 ADA (36,9 ± 23,4 ng/ml) naznačuje, že má vysokú neutralizačnú aktivitu proti fTNF-alfa v porovnaní s týmito anti-fTNF-alfa mAb. Spravidla mAb proti ľudským cytokínom nevykazujú žiadnu krížovo reaktívnu neutralizačnú aktivitu proti živočíšnym cytokínom. Avšak Aguirre a kol. uviedli, že ľudský a mačací TNF-alfa majú podobné neutralizačné epitopy ^[26]. Navyše odvodená aminokyselinová sekvencia ľudského TNF-alfa je na 89,7% identická so sekvenciou mačacieho TNF-alfa a v obidvoch je prítomných 10 z 12 rezíduí, ktoré interagujú s ADA ^[27]. To sa javí ako dôvod silnej neutralizačnej aktivity adalimumabu proti mačaciemu TNF-alfa.

ADA a ICZ sme podávali mačkám s experimentálne indukovanou FIP a skúmali sme ich terapeutický účinok. Z 10 SPF mačiek, ktoré dostali intraperitoneálne aplikovaný FIPV KU-2 typu I, sa u troch vyvinula FIP. Z týchto troch mačiek bola mačka č. 6 malo zjavný ascit. U týchto troch mačiek sa usúdilo, že si vyvinuli FIP z nasledujúcich dôvodov: i) všetky tri mačky boli infikované FIPV, ii) boli pozorované klinické príznaky súvisiace s FIP, iii) zvýšené plazmatické hladiny alfa-1 AGP a VEGF a iv ) ako referencie boli použité údaje z našich minulých pokusov na zvieratách. ADA (10 mg/zviera) sa podával intravenózne trom mačkám v deň 0 a do 4 dní po začiatku liečby. Okrem toho sa ICZ (50mg/zviera) podával orálne každý deň, počínajúc dňom 0 liečby. U mačiek 2 a 3 bolo po zahájení liečby pozorované zlepšenie klinických príznakov a výsledkov chemických testov krvi, zvýšenie počtu lymfocytov v periférnej krvi a pokles hladiny alfa 1-AGP v plazme. Symptomatické zlepšenia sa pozorovali medzi 1. a 2. týždňom po začiatku liečby. Ďalej u mačiek 2 a 3 neboli na konci experimentu patologicky pozorované žiadne ascity alebo pyogénne granulómy a do konca liečebného obdobia neboli pozorované žiadne zmeny naznačujúce opakovanie FIP. Mačka č. 6 nereagovala na liečbu a bola eutanizovaná, aj keď hladina vírusového génu v ascite po zahájení liečby dočasne poklesla. Tieto výsledky silne naznačujú, že anti-humánne TNF-alfa mAb a ICZ sú účinné pri liečbe FIP.

VEGF je produkovaný makrofágmi infikovanými FIPV a zlepšuje permeabilitu mačacích endotelových buniek ^[28]. U mačiek s FIP koreluje plazmatická hladina VEGF s množstvom ascitu. Mačka č. 6, u ktorej bol zrejmý ascites pri predbežnom i palpačnom vyšetrení (pri eutanázii sa získalo 160ml ascitu), mala počas 3 týždňov vysokú hladinu VEGF v plazme ≥100pg/ml. U mačiek 2 a 3, u ktorých neboli zaznamenané žiadne príznaky ascitu, však plazmatická hladina VEGF zostala nízka alebo sa zvýšila iba dočasne. Potvrdilo sa teda, že plazmatická hladina VEGF koreluje s množstvom ascitu u mačiek s FIP.

Je známe, že azolové antifungálne látky vrátane ICZ majú hepatotoxicitu ako vedľajší účinok a pravdepodobne vyvolávajú cholestázu a žltačku ^{[29,30,31,32]}. Pretože sa u mačiek s FIP pozoruje zvýšenie pečeňových enzýmov, rozvoj nežiaducich účinkov po podaní ICZ by bol znepokojujúci. U mačiek 2 a 3 sa však hladiny markerov pečeňových funkcií, ktoré sa zvyšovali v priebehu liečby, vrátili do normálneho rozsahu a plazmatická žltačka zmizla. Žiadne nežiadúce účinky ICZ teda neboli zaznamenané. Z hľadiska nežiadúcich účinkov sa teda podávanie ICZ považuje pre FIP mačky za bezpečné.

Nedávno boli ako lieky na inhibíciu proliferácie FIPV vyvinuté GC-376, inhibítor 3C-like proteázy, a GS-441524, nukleozidový analóg ^{[16,17,18,19,20}]. GC-376 a GS-441524 sú účinné lieky, ktoré majú terapeutické účinky u 30 – 80% mačiek s FIP. Aj keď sa očakáva, že tieto lieky budú užitočné ako liečba FIP, ešte neboli schválené. V klinickej praxi preto nie sú k dispozícii žiadne lieky na liečbu FIP. V tejto štúdii sme preukázali, že kombinované použitie ADA a ICZ, ktoré sú veterinárnym lekárom v súčasnosti k dispozícii, je účinné pri liečbe FIP. Tieto lieky považujeme za liečebnú možnosť, kým nebudú dostupné antivírusové lieky ako GC-376 a GS-441524. Tieto antivírusové lieky navyše majú terapeutické účinky na FIP mechanizmami odlišnými od mechanizmov ADA a ICZ ^{[16, 18, 21, 23]}. V budúcnosti môže hodnotenie terapeutických účinkov ich súčasného použitia pomôcť pri vývoji účinnejšej liečby FIP.

Závery

Predmetom výskumu boli terapeutické účinky adalimumabu, antihumánnej TNF-alfa mAb a itrakonazolu na FIP. Zistilo sa, že adalimumab má neutralizačnú aktivitu proti rfTNF-alfa, podobne ako anti-fTNF-alfa mAb. FIP bola úspešne liečená u 2 z 3 mačiek s experimentálne indukovanou FIP podávaním adalimumabu a itrakonazolu.

Literatúra

1. Pedersen NC (2014) An update on feline infectious peritonitis: diagnostics and therapeutics. Vet J 201:133–141. https://doi.org/10.1016/j.tvjl.2014.04.016Article PubMed Google Scholar 
2. Tekes G, Thiel HJ (2016) Feline coronaviruses: pathogenesis of feline infectious peritonitis. In: Ziebuhr J (ed) Advances in virus research, vol. 96, Academic Press, pp 193–218
3. Jaimes JA, Whittaker GR (2018) Feline coronavirus: insights into viral pathogenesis based on the spike protein structure and function. Virology 517:108–121. https://doi.org/10.1016/j.virol.2017.12.027CAS Article PubMed Google Scholar 
4. Decaro N, Mari V, Campolo M et al (2009) Recombinant canine coronaviruses related to transmissible gastroenteritis virus of swine are circulating in dogs. J Virol 83:1532–1537. https://doi.org/10.1128/jvi.01937-08CAS Article PubMed Google Scholar 
5. Herrewegh AA, Smeenk I, Horzinek MC et al (1998) Feline coronavirus type II strains 79-1683 and 79-1146 originate from a double recombination between feline coronavirus type I and canine coronavirus. J Virol 72:4508–4514CAS Article PubMed Google Scholar 
6. Terada Y, Shiozaki Y, Shimoda H et al (2012) Feline infectious peritonitis virus with a large deletion in the 59-terminal region of the spike gene retains its virulence for cats. J Gen Virol 93:1930–1934. https://doi.org/10.1099/vir.0.043992-0CAS Article PubMed Google Scholar 
7. Addie DD, Schaap IAT, Nicolson L, Jarrett O (2003) Persistence and transmission of natural type I feline coronavirus infection. J Gen Virol 84:2735–2744. https://doi.org/10.1099/vir.0.19129-0CAS Article PubMed Google Scholar 
8. Kummrow M, Meli ML, Haessig M et al (2005) Feline coronavirus serotypes 1 and 2: seroprevalence and association with disease in Switzerland. Clin Diagn Lab Immunol 12:1209–1215. https://doi.org/10.1128/CDLI.12.10.1209-1215.2005CAS Article PubMed Google Scholar 
9. Hohdatsu T, Okada S, Ishizuka Y et al (1992) The prevalence of types I and II feline coronavirus infections in cats. J Vet Med Sci 54:557–562. https://doi.org/10.1292/jvms.54.557CAS Article PubMed Google Scholar 
10. Takano T, Hohdatsu T, Hashida Y et al (2007) A “possible” involvement of TNF-alpha in apoptosis induction in peripheral blood lymphocytes of cats with feline infectious peritonitis. Vet Microbiol 119:121–131. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2006.08.033CAS Article PubMed Google Scholar 
11. Takano T, Hohdatsu T, Toda A et al (2007) TNF-alpha, produced by feline infectious peritonitis virus (FIPV)-infected macrophages, upregulates expression of type II FIPV receptor feline aminopeptidase N in feline macrophages. Virology 364:64–72. https://doi.org/10.1016/j.virol.2007.02.006CAS Article PubMed Google Scholar 
12. Takano T, Azuma N, Satoh M et al (2009) Neutrophil survival factors (TNF-alpha, GM-CSF, and G-CSF) produced by macrophages in cats infected with feline infectious peritonitis virus contribute to the pathogenesis of granulomatous lesions. Arch Virol 154:775–781. https://doi.org/10.1007/s00705-009-0371-3CAS Article PubMed Google Scholar 
13. Doki T, Takano T, Nishiyama Y et al (2013) Generation, characterization and therapeutic potential of anti-feline TNF-alpha MAbs for feline infectious peritonitis. Res Vet Sci 95:1248–1254. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2013.09.005CAS Article PubMed Google Scholar 
14. Doki T, Takano T, Kawagoe K et al (2016) Therapeutic effect of anti-feline TNF-alpha monoclonal antibody for feline infectious peritonitis. Res Vet Sci 104:17–23. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2015.11.005CAS Article PubMed Google Scholar 
15. Tracey D, Klareskog L, Sasso EH et al (2008) Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: a comprehensive review. Pharmacol Ther 117:244–279CAS Article PubMed Google Scholar 
16. Kim Y, Lovell S, Tiew K-C et al (2012) Broad-spectrum antivirals against 3C or 3C-like proteases of picornaviruses, noroviruses, and coronaviruses. J Virol 86:11754–11762. https://doi.org/10.1128/JVI.01348-12CAS Article PubMed Google Scholar 
17. Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC et al (2016) Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog 12:e1005531. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005531CAS Article PubMed Google Scholar 
18. Murphy BG, Perron M, Murakami E et al (2018) The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol 219:226–233. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2018.04.026CAS Article PubMed Google Scholar 
19. Pedersen NC, Kim Y, Liu H et al (2018) Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 20:378–392. https://doi.org/10.1177/1098612X17729626Article PubMed Google Scholar 
20. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M et al (2019) Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 21:271–281. https://doi.org/10.1177/1098612X19825701Article PubMed Google Scholar 
21. Takano T, Akiyama M, Doki T, Hohdatsu T (2019) Antiviral activity of itraconazole against type I feline coronavirus infection. Vet Res 50:5. https://doi.org/10.1186/s13567-019-0625-3Article PubMed Google Scholar 
22. Takano T, Endoh M, Fukatsu H et al (2017) The cholesterol transport inhibitor U18666A inhibits type I feline coronavirus infection. Antivir Res 145:96–102. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2017.07.022CAS Article PubMed Google Scholar 
23. Takano T, Wakayama Y, Doki T (2019) Endocytic pathway of feline coronavirus for cell entry: differences in serotype-dependent viral entry pathway. Pathogens 8:300. https://doi.org/10.3390/pathogens8040300CAS Article Google Scholar 
24. Koga L, Kobayashi Y, Yazawa M et al (2002) Nucleotide sequence and expression of the feline vascular endothelial growth factor. J Vet Med Sci 64:453–456. https://doi.org/10.1292/jvms.64.453CAS Article PubMed Google Scholar 
25. Fronhoffs S, Totzke G, Stier S et al (2002) A method for the rapid construction of cRNA standard curves in quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Mol Cell Probes 16:99–110. https://doi.org/10.1006/mcpr.2002.0405CAS Article PubMed Google Scholar 
26. Aguirre A, Escobar A, Ferreira V et al (2003) An anti-human recombinant tumor necrosis factor alpha (TNFα) monoclonal antibody recognizes an epitope in feline TNFα. Vet Res 34:177–184. https://doi.org/10.1051/vetres:2002064CAS Article PubMed Google Scholar 
27. Hu S, Liang S, Guo H et al (2013) Comparison of the inhibition mechanisms of Adalimumab and Infliximab in treating tumor necrosis factor α-associated diseases from a molecular view. J Biol Chem 288:27059–27067. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.491530CAS Article PubMed Google Scholar 
28. Takano T, Ohyama T, Kokumoto A et al (2011) Vascular endothelial growth factor (VEGF), produced by feline infectious peritonitis (FIP) virus-infected monocytes and macrophages, induces vascular permeability and effusion in cats with FIP. Virus Res 158:161–168. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2011.03.027CAS Article PubMed Google Scholar 
29. García Rodrǐguez LA, Duque A, Castellsague J et al (1999) A cohort study on the risk of acute liver injury among users of ketoconazole and other antifungal drugs. Br J Clin Pharmacol 48:847–852. https://doi.org/10.1046/j.1365-2125.1999.00095.xArticle PubMed Google Scholar 
30. Kao WY, Su CW, Huang YS et al (2014) Risk of oral antifungal agent-induced liver injury in Taiwanese. Br J Clin Pharmacol 77:180–189. https://doi.org/10.1111/bcp.12178CAS Article PubMed Google Scholar 
31. Susan M, Grant SPC (1989) Itraconazole. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in superficial and systemic mycoses. Drugs 37:310–344Article Google Scholar 
32. Khoza S, Moyo I, Ncube D (2017) Comparative hepatotoxicity of fluconazole, ketoconazole, itraconazole, terbinafine, and griseofulvin in rats. J Toxicol. https://doi.org/10.1155/2017/6746989Article PubMed Google Scholar 

Poďakovania

Ďakujeme členom nášho laboratória za podporu pokusov na zvieratách. Táto práca bola čiastočne podporená organizáciou KAKENHI (Grants-in-Aid for Scientific Research (B), č. 16H05039) z Ministerstva školstva, kultúry, športu, vedy a techniky v Japonsku a Grantom na výskum univerzity Kitasato pre mladých vedcov z Univerzita Kitasato.

Etické vyhlásenia

Konflikt záujmov

Autori si nie sú vedomí žiadnych potenciálnych konfliktov záujmov v súvislosti s výskumom, autorstvom alebo publikovaním tohto článku.

Etické schválenie

Boli dodržané všetky príslušné národné a inštitucionálne smernice pre starostlivosť a použitie zvierat. Protokol o experimentovaní na zvieratách bol schválený prezidentom Kitasato University na základe rozhodnutia Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť a použitie zvierat na Kitasato University (schválenie č. 18-152). Mačky SPF boli chované v našom vlastnom laboratóriu a udržiavané v izolovanom zariadení s regulovanou teplotou. Veľkosti vzoriek boli určené na základe našich skúseností s modelmi infekcie FIPV a bol použitý minimálny počet mačiek.

Informovaný súhlas

Informovaný súhlas bol získaný od zákonného opatrovníka všetkých experimentálnych zvierat popísaných v tejto práci pre uskutočnené postupy. V rámci tejto publikácie nie sú identifikovateľné žiadne zvieratá ani ľudia, a preto nebol potrebný ďalší informovaný súhlas so zverejnením.

Ďalšie informácie

Poznámka vydavateľa

Springer Nature zostáva neutrálny, pokiaľ ide o jurisdikčné nároky v publikovaných mapách a inštitucionálnych prepojeniach.

Redaktorka: Sheela Ramamoorthy.