Archívy Klinické štúdie - FIP Warriors CZ/SK ®

11. 12. 202129. 3. 2023

Liečba FIP subkutánnym remdesivirom nasledovaným perorálnymi tabletami GS-441524

Richard Malik DVSc PhD FACVS Centrum FASM pre Veterinárne vzdelávanie, Univerzita v Sydney
Pôvodný článok: Treatment of FIP in cats with subcutaneous remdesivir followed by oral GS-441524 tablets

Poznámka prekladateľa: Článok obsahuje informácie o reálnom obsahu GS-441524 v tabletách. Tento obsah ale nemusí zodpovedať “ekvivalentnému” množstvu GS-441524 v tabletách od iných výrobcov, kde je reálny obsah GS-441524 vždy o niečo vyšší kvôli známej zníženej biologickej dostupnosti perorálne používaného liečiva. Preto nie je možné jednoducho a jednoznačne porovnávať doporučene dávkovanie GS-441524 od firmy BOVA v Austrálii a u nás.

Úvod

Infekčná peritonitída mačiek (FIP) je infekčné ochorenie, najmä mladých mačiek. Dochádza k nemu, keď mačací enterický koronavírus množiaci sa v črevách prechádza kritickou mutáciou, ktorá zmení jeho tkanivový tropizmus z enterocytov na makrofágy. Vírus FIP potom cirkuluje po tele v makrofágoch – jedná sa o ultimátny mechanizmus trójskeho koňa. To vedie k diseminovanej infekcii a rozvoju fibrinoidnej nekrotizujúcej vaskulitídy a serozitídy v dôsledku ukladania imunitných komplexov pozostávajúcich z mačacích protilátok a FIP vírusových antigénov.

Vo všeobecnosti existujú dve formy FIP – efuzívna („vlhká“) FIP a neefuzívna („suchá“) FIP. Vlastný chorobný proces sa môže vyskytnúť v brušnej dutine, hrudnej dutine, osrdcovníku, očiach alebo centrálnom nervovom systéme. Kombinácie suchej a vlhkej FIP s postihnutím rôznych tkanív nie sú ničím nezvyčajným.

Až donedávna bola diagnóza infekčnej peritonitídy mačiek (FIP) pre mačacieho pacienta rozudkom smrti. V posledných rokoch však táto predstava bola postavená na hlavu ako výsledok priekopníckej práce profesora Nielsa C. Pedersena a kolegov z UC Davis.

Za posledných 12 mesiacov mnohí veterinári v Austrálii tiež úspešne zvládli mnoho prípadov FIP pomocou remdesiviru a GS-441524.

Omega-interferón (Virbagen) a polyprenyl imunostimulant (PPI) boli prvé lieky používané na liečbu FIP a obe mali u niektorých pacientov isté účinky. Omega interferón bol užitočný v prípadoch efuzívnej („vlhkej“) FIP, často kombinovanej s nízkou dávkou prednizolónu podľa Ishidovho protokolu, zatiaľ čo PPI, ktorého priekopníkom bol Al Legendre, bol užitočnejší v prípadoch neefuzívnej FIP. V niektorých prípadoch boli oba lieky použité súčasne. Problém bol v tom, že obe formy terapie boli často drahé, najmä keď sa používali oba lieky, takže aj keď sa pacienti zlepšili a mohli mať prechodné klinické remisie počas liečby, trvalé klinické vyliečenia boli zriedkavé. V dôsledku toho väčšina veterinárov stále považovala diagnózu FIP za predohru eutanázie.

To všetko sa zmenilo pred niekoľkými rokmi vďaka vyvrcholeniu celoživotneho výskumu FIP Dr. Nielsa Pedersena. Niels je úžasný veterinár, Severoameričan s dánskym pôvodom. Vyrastal na slepačej farme a pôvodne chcel byť klinickým lekárom pre veľké zvieratá, ale s veľkou predvídavosťou sa rozhodol pre vedeckú dráhu. Krátko po promócii odcestoval do Canberry na John Curtin School of Medical Research na ANU, kde koncom 60-tych rokov získal doktorát z imunológie o odmietaní obličkového transplantátu u profesora Bede Morrisa, pričom použil ovce ako experimentálny model na štúdium kinetiky lymfocytov.

Keď sa Niels vrátil na UC Davis, zameral sa na štúdium infekcií a imunity. Aj keď prispel k veľkému množstvu tém z internej medicíny a genomiky psov a mačiek, FIP sa stala jeho obľúbenou chorobou pre svoju obyčajnosť a súčasnú zložitosť. Jeho štúdium siaha od 80. rokov 20. storočia, keď sa špecializoval na diagnostiku, virológiu a patogenézu, až po súčasnosť, s čoraz väčším zameraním na terapiu.

Niels v spolupráci s kolegami z Kansas State University ukázal, že účelovo navrhnutý inhibítor proteázy GC-376 by mohol zabrániť a vyliečiť experimentálne indukovanú FIP u laboratórnych mačiek.^1,2 Klinické štúdie v teréne s mačkami s prirodzene sa vyskytujúcou chorobou boli sklamaním, najmä keď mačky mali okulárnu formu FIP alebo ochorenie CNS. Nevzdal sa, a tak prešiel na iný liek – GS-441524^3,4 – nukleozidový analóg vyvinutý severoamerickou farmaceutickou spoločnosťou Gilead. Ukázalo sa, že táto molekula je oveľa účinnejšia ako GC-376 na liečbu FIP, a to ako pri experimentálnych infekciách, tak aj v spontánnych prípadoch FIP. Počnúc farmakokinetikou a štúdiami s eskaláciou dávky s použitím širokého spektra klinických prípadov, Niels a kolegovia zistili, že potrebná dávka závisí od toho, či mal pacient suchú alebo vlhkú FIP, a či došlo k postihnutiu očí alebo centrálneho nervového systému (CNS).⁵

Prekvapivo, Gilead, výrobca, ktorý vyvinul GS441524, doteraz neprejavil záujem o vývoj tejto molekuly pre liečbu mačiek. Aby sa vyplnila prázdno pre účinnú terapiu FIP na celom svete, rôzne laboratóriá v Číne a východnej Európe začali vyrábať GS-441524 a predávať ho na čiernom trhu.

Široká dostupnosť GS-441524, často vysokej kvality a spočiatku veľmi vysokej ceny, poskytla oddaným majiteľom spôsob, ako zachrániť ich mačky s FIP. Štúdie klinickej patologičky Samanthy Evansovej z Ohio State University naznačili mieru vyliečenia približne 80 % v teréne. Obstarávanie lieku bolo donedávna komplikované a plné problémov, ktoré sa na určitej úrovni obchádzali pomocou rôznych „FIP Warriors“ skupín na Facebooku. Nanešťastie pre austrálskych milovníkov mačiek, APVMA a Vet Boards nakoniec pochopili, čo sa deje a Border Force značne sťažila získavanie GS-441524 a jeho bezpečný dovoz pre veterinárne použitie. Varovania regulačných orgánov a veterinárnych výborov pred trestným stíhaním boli namierené proti veterinárom, ktorí umožňovali liečbu mačiek s FIP pomocou liekov z čierneho trhu.

Je iróniou, že nové riešenie tohto problému priniesla pandémia COVID 19. Gilead vyvinul remdesivir (GS-5734) ako liek na liečbu hepatitídy C, Eboly a ľudského koronavírusového ochorenia. Remdesivir je proliečivo GS-441524, ktoré obsahuje dodatočný chemický bočný reťazec (vrátane fosfátovej skupiny), ktorý má zlepšiť intracelulárnu penetráciu (obrázok 1B). Remdesivir (ako produkt Veklury) získal dočasnú registráciu (na dva roky) od TGA v júli 2020 na liečbu infekcií SARS-CoV-2 u ľudských pacientov s COVID-19. Tento proces registrácie by za normálnych okolností trval niekoľko rokov, ale závažnosť pandémie urýchlila tento proces s prihladnutím na predbežné dáta z klinických testov. Keďže sa remdesivir stal licencovaným ľudským liekom a Gilead licencoval výrobu po celom svete, znamenalo to viac možností prístupu ku kvalitnej surovine. Tým sa obišli problémy s užívaním lieku zakúpeného na čiernom trhu, ako aj problémy neznámej čistoty a konzistencie produktu v priebehu času.

V roku 2020 spoločnosť na výrobu veterinárnych zmesí BOVA Australia zabezpečila spoľahlivé dodávky remdesiviru vo vhodnom formáte na IV a subkutánnu aplikáciu. Štúdie v Austrálii určili, že doba použiteľnosti po rekonštitúcii presahuje 12 dní a potvrdili účinnosť in vitro proti koronavírusom v tkanivových kultúrach. Analytická čistota liečiva sa pravidelne kontroluje pomocou HPLC. Za posledný rok veterinári v každom štáte Austrálie používali remdesivir na liečbu mačiek s FIP. Vyskytlo sa množstvo efuzívnych a neefuzívnych prípadov, vrátane niektorých mačiek s postihnutím oka (uveitída) a iných s multifokálnym ochorením CNS. Na základe liečby približne 500 mačiek liečených medzi októbrom 2020 a novembrom 2021 sa remdesivir ukazuje ako vysoko účinný pri zvládaní infekcií FIP. Umožnuje o niečo jednoduchšiu subkutánnu aplikáciu a zdá sa, že injekcia je o niečo menej bolestivá v porovnaní s GS-441524 a nespôsobuje lokálne reakcie v mieste vpichu, ktoré sa pozorujú pri injekčnom podaní GS-441524. Pôvodne sa remdesivir používal výhradne v Austrálii, hoci posledné 2 mesiace je dostupný aj v Británii od BOVA UK.

Molekulová hmotnosť remdesiviru je 603 g/mol, zatiaľ čo molekulová hmotnosť GS-441524 je 291 g/mol. To by mohlo naznačovať, že liečba mačiek remdesivirom vyžaduje približne dvojnásobné dávkovanie v porovnaní s GS-441524, aj keď to nezohľadňuje možné zlepšenie intracelulárnej penetrácie remdesiviru do určitých tkanív v porovnaní s GS-441524. Navrhovaná dávka remdesiviru u ľudských pacientov s COVID19 je 200 mg intravenózne (IV), po ktorej nasleduje 100 mg IV denne. Pre 70 kg ľudského pacienta to predstavuje dennú dávku 1,3 mg/kg, takže pri použití alometrického škálovania bola dávka 5-10 mg/kg denne pre mačku považovaná za správnu. Naša skúsenosť z prvých 500 prípadov však bola taká, že veľa mačiek nakoniec pre trvalé vyliečenie potrebovalo vyššiu dávku remdesiviru, a preto sme upravili naše odporúčané dávkovanie smerom nahor (pozri nižsie). Remdesivir poskytuje BOVA ako sterilný roztok s koncentráciou 10 mg/ml pripravený na použitie v 10 ml injekčnej vialke.

Obrázok 1. (A) BOVA Remdesivir rekonštituovaný a pripravený na liečbu. Po rekonštitúcii je obsah injekčnej vialky stabilný najmenej 120 dní pri teplote 5°C – a zvyčajne sa injekčná vialka spotrebuje za 3-7 dní. Vialku je najlepšie uchovávať v chladničke. (B) Dráha, ktorú remdesivir absolvuje intracelulárne, aby sa aktivoval ako GS-441524.

V súčasnosti sú Austrália a Spojené kráľovstvo jedinými krajinami, kde je remdesivir ľahko dostupný na predpis pre veterinárne použitie. Veterinári v Indii, na Novom Zélande, v Južnej Afrike a v niektorých častiach Európy však tiež začali pre prístup k lieku využívat dodávateľov humánnych liečiv.

Diagnostika

Obrázok 2: Úžasne komplexný a praktický prehľad diagnostiky FIP od Severine Tasker .

Úplná diferenciálna diagnostika FIP presahuje rámec tohto článku, ale čitateľom dôrazne odporúčame prečítať si vynikajúci článok od Séverine Tasker v Journal of Feline Medicine & Surgery.⁶

Hoci sa FIP môže vyskytnúť u mačiek v akomkoľvek veku, väčšina prípadov sa vyskytuje u mačiatok a mačiek mladších ako 3 roky. Pretrvávajúca a často vysoká horúčka, ktorá nereaguje na antibiotickú liečbu (a často ani NSAID), je bežným nálezom, rovnako ako zvýšená hladina celkového proteínu v plazme v dôsledku zvýšených koncentrácií globulínu (difúzna gamapatia pri elektroforéze séra). Pri efuzívnej alebo „vlhkej“ FIP môže pomer albumínu ku globulínu klesnúť na < 0,45. Reaktanty akútnej fázy, ako je sérový amyloid A a α1-kyslý glykoproteín, majú tendenciu byť výrazne zvýšené. Mnoho mačiek s FIP vykazuje tiež sekundárnu imunitne sprostredkovanú hemolytickú anémiu, zvýšené aktivity AST a ALT a ikterus.

Pre včasnú diagnózu je rozhodujúce diagnostické zobrazovanie, čo bolo značne uľahčené zavedením digitálnej rádiológie a rozšírenou dostupnosťou diagnostického ultrazvuku v praxi malých zvierat. Pleurálny výpotok je ľahko rozpoznateľný z röntgenových snímok hrudníka, zatiaľ čo brušný výpotok je najlepšie detekovaný pomocou ultrazvuku (obrázok 3), najmä ak sú k dispozícii vysokofrekvenčné sondy. Za zmienku stojí, že v niektorých prípadoch môžu byť kapsy s tekutinou ohniskové a lokalizované. Často je okolo obličky pod obličkovým puzdrom nejaká tekutina, mačiatka môžu mať edém skrota, zatiaľ čo v ojedinelých prípadoch je výpotok obmedzený na perikardiálny vak. Ale kľúčové je – hľadať (i) výpotok v akejkoľvek telesnej dutine, (ii) granulómy v obličkách, pečeni alebo pľúcach, (iii) zväčšené vnútrobrušné a mezenterické lymfatické uzliny (obrázok 5) alebo výrazné zhrubnutie iliocekokolickej oblasti („fokálna FIP“) (obrázok 5). Röntgenové snímky hrudníka po drenáži pleurálneho výpotku môžu ukázať zmeny zodpovedajúce vírusovej pneumónii.

Obrázok 2: (A) Ultrazvukové vyšetrenie brucha ukazujúce hojnú vysoko echogénnu tekutinu (vlákna fibrínu) u mačky s ascitom s vysokým obsahom bielkovín v dôsledku efuzívnej FIP. (B) Efúzia obsahuje viskóznu žltú až slamovo sfarbenú tekutinu. (C) Röntgenový snímok brucha so vzhľadom brúseného skla naznačujúci tekutinu v bruchu.

Ak uvidíte výpotok – urobte punkciu – pretože tekutina je najlepšou diagnostickou vzorkou.

Obrázok 3: Výrazná mezenterická lymfadenomegália u mačky so suchou FIP.

Charakteristická je tekutina s vysokým obsahom bielkovín, často žltej až slamovej farby (obrázok 3B). Ak v orgáne vidíte granulóm alebo ak sú zreteľne zväčšené lymfatické uzliny – urobte FNA (aspiračná biopsia tenkou ihlou), urobte náter, použite farbenie s RapidDiff a hľadajte neutrofily a makrofágy (pyogranulomatózny zápal) bez viditeľných infekčných agens (obrázok 4) . Dve choroby, ktoré sa najčastejšie zamieňajú s FIP u dospelých mačiek, sú lymfóm a niektoré typy lymfocytickej cholangitídy (spojené s ascitom s vysokým obsahom bielkovín).

Obrázok 4: RapidDiff zafarbený náter aspirátu tenkou ihlou z mezenterických lymfatických uzlín 4-ročnej orientálnej mačky so suchou FIP. Výrazné makrofágy sú kľúčom k cytologickej diagnóze. Fotografiu poskytla Trish Martin.

Efuzívne ochorenie je samozrejme diagnostikovateľné oveľa ľahšie, pretože ascitická, perikardiálna alebo pleurálna tekutina poskytuje vhodnú vzorku, ktorá môže byť vyšetrená cytologicky, analýzou tekutiny a podrobená imunofluorescencii (IFA) na FIP antigén alebo PCR s reverznou transkriptázou na detekciu FIP nukleovej kyseliny. IFA sa vykonáva na VPDS, B14, University of Sydney (prostredníctvom Vetnostics, QML, ASAP, VetPath, Gribbles alebo IDEXX). Väčšinou je však najlacnejšie odoslať vzorku priamo do univerzitného laboratória.

Suchá FIP je problematickejšia, pretože zvyčajne vyžaduje aspiračnú biopsiu tenkou ihlou pyogranulomatóznych lézií v pečeni, obličkách alebo brušných lymfatických uzlinách. Občas môžu prípady vlhkej FIP paradoxne vykazovať vzorky tekutiny, ktoré sú negatívne pri testovaní IFA a/alebo PCR, no pacient stále pravdepodobne má FIP, čo sa prejavuje priaznivou odpoveďou na liečbu remdesivirom alebo GS-441524.

Liečba

Od októbra 2020 liečime mačky s FIP pomocou remdesiviru (IV a SCI) a odnedávna pomocou GS-441524 (orálne), takže naše protokoly sa skúsenosťami neustále vyvíjajú. Doteraz bolo liečených asi 500 mačiek. Snažíme sa vyhnúť tomu, aby sme boli v našich odporúčaniach príliš normatívni, pretože máme podozrenie, že neexistuje jednotný protokol, ktorý by vyhovoval všetkým pacientom, a každý prípad predstavuje jedinečné okolnosti, vrátane veľkosti pacienta, či je mačka stále „šťastná“ a je primerane, alebo je deprimovaná a dehydrovaná. Dôležitým faktorom je emocionálna a finančná angažovanosť majiteľa. Kľúčovou vlastnosťou, ktorú treba spomenúť, je, že oba lieky sú veľmi bezpečné, dokonca aj u chorých mačiek a mačiatok.

Všimnite si, že nasledujúce odporúčané dávky sú vyššie ako tie, ktoré boli pôvodne odporúčané pred rokom. Aj keď u mnohých pacientov fungovali nižšie dávky, zistili sme, že ide často o nesprávnu ekonomickú úvahu, pretože recidíva ochorenia na konci liečby a rozvoj vírusovej rezistencie počas liečby zrejme súvisia s nedostatočným počiatočným dávkovaním. Takže sme sa od začiatku naučili byť agresívnejší, čo je z dlhodobého hľadiska lacnejšie (tj nevyžaduje sa 2. terapia)

Naša najväčšia skúsenosť je spojená s remdesivirom. Tento liek je drahý a majiteľ sa musí zaviazať k nákladnému liečebnému procesu, ktorý trvá 3 mesiace. Pre väčšinu klientov to predstavuje emocionálnu a finančnú záťaž. Môj názor je, že v mnohých prípadoch je lepšie vynaložiť peniaze na antivírusovú terapiu ako takú, než na rozsiahlu diagnostiku a monitorovanie.

Obrázok 5: Výrazné zhrubnutie iliocekokolickej oblasti mačky Devon Rex s takzvanou „fokálnou FIP“, zvyčajnou formou neefuzívnej FIP. Fotografiu poskytla Penny Tisdall.

Jedným z prístupov u novodiagnostikovaných mačiek so závažným ochorením je hospitalizácia mačiek počas prvých 3-4 dní liečby. Pacienti začínajú liečbu remdesivirom, keď dostávajú IV tekutinovú terapiu (typicky 2-4 ml/kg/h; prvý deň Hartmannov roztok alebo Plasmalyte a následne 0,45 % NaCl a 2,5 % dextrózu s obsahom 20 mmol KCl/l). V 1. deň hospitalizácie sa remdesivir podáva vo vysokej dávke intravenózne (10–15 mg/kg zriedených na 10 ml fyziologickým roztokom a podáva sa POMALY počas 20–30 minút alebo dlhšie, manuálne alebo pomocou infúznej pumpy; u ľudských pacientov aplikácia trvá 2 hodiny), aby sa dosiahla zvýšená štartovacia dávka distribučného objemu liečiva. Tým sa dosiahne rýchla antivírusová účinnosť. V prípadoch s ochorením CNS odporúčame dennú IV dávku 20 mg/kg. Mnohé mačky sa môžu niekoľko hodín po IV infúzii remdesiviru javiť ako trochu deprimované. U ľudských pacientov môže remdesivir spôsobiť reakcie súvisiace s infúziou, vrátane nízkeho krvného tlaku, nevoľnosti, zvracania, potenia alebo triašky, ale u našich mačacích pacientov sme tieto javy nepozorovali.

Výhodou zahájenia liečby intravenózne je, že dehydratácia, ak je prítomná, sa upraví a máte IV prístup v prípade, že potrebujete podať iné lieky (napr. antikonvulzíva, kortikosteroidy). Dôležité je, že akonáhle je zavedený IV katéter, denné injekcie remdesiviru nespôsobujú žiadnu bolesť ani nepohodlie. Ak však mačka žerie a je diagnostikovaná v počiatočnom štádiu priebehu ochorenia, potom IV terapia nie je potrebná a rovnaké dávky možno podávať subkutánne, čím sa ušetrí veľa peňazí.

Mačky s FIP liečené remdesivirom sa typicky výrazne zlepšujú počas prvých 2-3 dní. Zistili sme však, že prípady efúzie a najmä tie, ktoré sa pred liečbou prejavili pleurálnym výpotkom, by sa mali dôkladne sledovať, pretože kombinácia antivírusového účinku remdesiviru a väčšej než udržiavacej dávky kryštaloidov môže viesť k prechodnému zhoršeniu pleurálneho výpotku. To vyžaduje drenáž dvakrát denne pomocou motýľovej ihly 19G (1,1mm – krémová farba) a 3-cestného uzatváracieho kohútika (ideálne pomocou ultrazvukového vedenia na nájdenie najlepšieho miesta pre zavedenie ihly). Tieto „sekundárne“ pleurálne výpotky môžu byť smrteľné, ak sa nezistia včas a zdá sa, že sa vyskytujú približne v 1 z 10 prípadov efuzívnych FIP liečených remdesivirom.

Ďalším problémom, ktorý sa v tejto dobe občas vyskytuje, je rozvoj neurologických príznakov, vrátane záchvatov. Náš názor je, že nejde o účinok lieku ako taký, ale skôr o demaskovanie subklinickej CNS FIP. Takéto mačky potrebujú starostlivé pozorovanie, zatiaľ čo vývoj záchvatov vyžaduje použitie antikonvulzívnych liekov, ako je midazolam (0,3 mg/kg IV), alfaxan alebo propofol (podávaný IV, aby bol účinný), po ktorom nasleduje levetiracetam (Keppra) (10–20 mg /kg, PO každých 8 hodín). Fenobarbitón je spoľahlivé antikonvulzívum, má však tendenciu zvyšovať metabolizmus mnohých liekov, a kým lepšie nepochopíme farmakokinetiku a metabolizmus remdesiviru a GS-441524, je pravdepodobne bezpečnejšie používať levetiracetam. Niektorí lekári tiež podávajú dexametazón alebo prednizolón ako jednorazovú liečbu na zmiernenie zápalu CNS.

Hoci obhajujeme úvodnú IV terapiu pre najťažšie prípady FIP, mačky a mačiatka, ktoré sú stále „šťastné“ a jedia, na začiatku nevyžadujú IV terapiu a môžu namiesto toho začať subkutánnymi injekciami v dávke 10-12 mg/kg/deň ( 20 mg/kg pri ochorení CNS). To je, samozrejme, oveľa lacnejšie, pretože mačky alebo mačiatka nemusia byť umiestnené na infúznej pumpe a hospitalizové v nemocnici, v stresujúcom prostredí. U klientov, ktorí majú finančné limity, môže byť toto vhodnejší spôsob zahájenia terapie. Niektorí šikovní kolegovia, ako napríklad Jim Euclid, vyvinuli hybridný prístup, kde mačiatka dostávajú subkutánne tekutiny denne ako bolus s injektovaným remdesivirom.

Následne boli mačkám podávané priebežné subkutánne injekcie remdesiviru. Pôvodne to trvalo 84 dní a takéto prípady predstavovali väčšinu prípadov, ktoré sme doteraz riešili. V poslednom čase na úvodnú terapiu používame agresívny IV/SCI remdesivir a potom mačky prechádzajú na perorálny GS-441524 počas 10 týždňov trvajúcej konsolidačnej terapie.

Po počiatočnom používaní nižších dávok, ktoré neboli úspešné u každého pacienta, teraz používame nasledujúce liečebné protokoly:

pre mačky s vlhkou FIP: 10-12 mg/kg raz denne (SID) počas 2 týždňov
pre mačky s výrazným postihnutím oka: 15 mg/kg SID subkutánnou injekciou (SCI) počas 2 týždňov; mačkám s ťažkou uveitídou by sa mali podávať aj lokálne kortikosteroidy (Pred Forte alebo Maxidex) 2-3 dni (nie dlhšie!) a atropínová očná masť
pre mačky s neurologickou FIP s príznakmi CNS: podávajte 20 mg/kg SID SCI počas 2-4 týždňov. ⁵

Je dôležité, aby majitelia boli riadne poučení o tom, ako optimálne podávať denné injekcie. Mačky budú vnímať injekciu ako menej bolestivú, ak sa roztok remdesiviru v injekčnej striekačke nechá zohriať na izbovú teplotu, namiesto toho, aby sa podával vychladený z chladničky. Okrem toho, ak ich naučíte jednoduchým úkonom, ako je používanie novej ihly pri aplikácii injekcii (t. j. použite inú ihlu, ako je tá, ktorá sa používa na natiahnutie lieku z vialky) a používanie ihiel priemeru 21G (0,8mm – zelené) alebo 23G (0,6mm – modré), injekcie budú znesiteľnejšie. Aj keď sú ihly 21G väčšie, u niektorých mačiek to možno dáva výhodu rýchlejšej aplikácie injekcie. Alternatívne môžu veterinári pripraviť kvôli zjednodušeniu pre majiteľa injekcie na celý týždeň, ktoré budú uchovávať v chladničke, a každý deň tak budú aplikovať novú injekciu.

U mačiek, ktoré naďalej vnímajú SC injekcie ako bolestivé, sme použili gabapentín perorálne (50 až 100 mg na mačku) a/alebo transmukozálne alebo SC podávaný buprenorfín 30-60 minút pred injekciou na sedáciu/analgéziu. Oblasť, do ktorej sa má podať injekcia, sa môže tiež ostrihať, aby sa 30 minút pred injekciou mohol aplikovať lokálny krém EMLA. BOVA vyrába rýchlejšie pôsobiaci lokálny anestetický gél, ktorý môže byť užitočný u niektorých pacientov. Vo výnimočných prípadoch sme zavádzali cefalický katéter každých 4-5 dní, aby majitelia mohli podávať IV terapiu namiesto SC injekcií. Zdá sa, že reakcie v mieste vpichu, ktoré boli hlásené v súvislosti s injekčne podávaným GS-441524 v zahraničí, sa pri remdesivire nevyskytujú.

Po 2-4 týždňoch užívania remdesiviru a po vymiznutí tekutiny v bruchu a zlepšení alebo vymiznutí očných a CNS príznakov teraz navrhujeme prechod na tablety GS-441524. Robí sa to z 3 dôvodov: (i) znižuje to náklady (ii) odstraňuje problém s bolestivosťou SC injekcií (iii) u niektorých pacientov je to efektívnejšie. Injekcie Remdesiviru sú pravdepodobne spoľahlivejšie ako perorálny GS-441524 a v najhorších prípadoch by ste sa mohli rozhodnúť podávať ich 4 týždne, ale pre väčšinu mačiek stačia 2 týždne a pohodlie a nižšie náklady na perorálnu formuláciu predbehnú všetko ostatné.

Používanie tabliet GS-441524 je v Austrálii pomerne nové, ale vo veľkej miere sa používa v zámorí. Odporúčaná perorálna dávka GS441524 je zvyčajne rovnaká ako dávka SCI/IV remdesiviru: vlhké prípady FIP dostanú 10-12 mg/kg PO SID, očné prípady 15 mg/kg PO SID a prípady CNS 20 mg/kg ( alebo vyššie). GS-441524 je ekonomickejší a je dokonca bezpečnejší ako remdesivir. V prípadoch CNS, kde sa podávajú veľké dávky, je pravdepodobne najlepšie podávať 10 mg/kg PO každých 12 hodín (BID), aby sa obišiel “stropný” efekt, o ktorom sa hovorí v súvislosti s obmedzenou absorpciou vysokých dávok.

Obrázok 6. Fokálna suchá FIP s pyogranulomatóznym zápalom intraabdominálnych lymfatických uzlín. Namiesto vykonania exploračnej laparotómie, biopsie lymfatických uzlín, histológie a imunohistológie môže byť v prípade vysokého podozrenia na FIP nákladovo efektívnejšie vyskúšať 3-dňovú IV liečbu remdesivirom. FNA zväčšenej lymfatickej uzliny je pravdepodobne ideálnou diagnostickou možnosťou pre lekárov s týmto súborom zručností.

Prečo sú dávkovania približne rovnaké? Na báze mg/kg má GS441524 dvakrát toľko aktívnych molekúl ako remdesivir (kvôli rozdielu v ich molekulovej hmotnosti), ale biologická dostupnosť GS-441524 je možno iba 50 % (absorbuje sa len polovica toho, čo sa podá, a to je ovplyvnené kŕmením a tiež efektom stropnej dávky) – takže tieto dva faktory sa navzájom rušia.

Odporúčame, aby sa tablety GS-441524 podávali s malým pamlskom, aby sa zamaskovala tabletka, pričom hlavné jedlo sa podáva o 1 hodinu neskôr. Tablety, ktoré poskytuje BOVA, sú 50 mg tablety s príchuťou tuniaka, so štyrmi deliacimi ryhami, takže ich možno rozdeliť na polovicu alebo dokonca na štvrtiny.

V situáciách, keď si majitelia nemôžu dovoliť úplnú liečbu, po prvotnej liečbe remdesivirom/GS-441524 používame meflochín (Lariam; 5 mg/kg perorálne raz denne v kapsulách alebo 62,5 mg dvakrát týždenne) .

Phillip McDonagh, Jacqui Norris, Merran Govendir a kolegovia zo Sydney School of Veterinary Science preukázali, že meflochín má antivírusový účinok .⁷ K tomu pravdepodobne dochádza tým, že meflochín si uzurpuje biochemické intracelulárne dráhy využívané vírusom FIP, čo je mechanizmus, ktorý bol nedávno preukázaný aj pri klofazimíne⁸ (lieku proti lepre), a niekoľkých ďalších liekoch. U niekoľkých mačiek, kde si majitelia nemohli dovoliť úplnú kúru remdesivirom, sa meflochín ukázal ako účinný pre dosiahnutie hranice klinického vyliečenia.

Hlavnou výhodou nákupu remdesiviru a GS-441524 od BOVA na liečbu prípadov FIP je, že produkty, ktoré používame, podliehajú kontrole kvality. Ide len o napísanie receptu s menom a adresou klienta, menom pacienta a dávkou, ktorá sa má podať, a kompaundátor môže zvyčajne poskytnúť vialky alebo tablety ktorémukoľvek veterinárnemu lekárovi v Austrálii do 24-48 hodín.

V súčasnosti je cena 100 mg vialky remdesiviru 250$ plus GST a poštovné (celková cena zvyčajne cca. 280$). GS-441524 sa predáva v balení 10 tabliet za 600$ plus poštovné a balné. Kúpou viacerých vialiek a tabliet súčasne sa samozrejme znížia poštovné a manipulačné poplatky. Veríme, že väčšina majiteľov sa bude cítiť oveľa pohodlnejšie, keď získa produkt od známej austrálskej spoločnosti, než aby posielali peniaze do zámoria a dúfali, že lieky neznámej kvality na čiernom trhu sa bezpečne dostanú do Austrálie bez toho, aby ich zadržala colnica.

Neexistuje žiadny dôvod, prečo by dobre motivovaný veterinár nemohol tieto prípady zvládnuť vo svojej vlastnej praxi. To je často pre majiteľa pohodlnejšie, najmä ak zápasia s každodennými injekciami a potrebujú praktika vo svojej blízkosti.

Obrázok 7: Tablety Gs-441524 od BOVA Australia. Sú s príchuťou tuniaka. Môžu byť rozdelené na polovice alebo dokonca štvrtiny. OVEĽA JEDNODUCHŠIE ako injekcie pre väčšinu mačiek. Menej stresu a menej nákladov.

Veterinári, ktorí chcú preskúmať túto možnosť, alebo majú všeobecné otázky o manažmente prípadov FIP, môžu poslať e-mail Sally Coggins (dr.sallyc@gmail.com), Richardovi Malikovi (richard.malik@sydney.edu.au), Davidovi Hughesovi (concordvets@concordvets.com.au), Grette Howard (drgretta@gmail.com) alebo profesorke Jacqui Norris ( jacqui.norris@sydney.edu.au), o radu v súvislosti s diagnózou alebo liečbou. Mnoho austrálskych veterinárnych lekárov so záujmom o FIP dosiahlo značné odborné znalosti v manažmente týchto prípadov. Napríklad Andrew Spanner v Adelaide liečil viac ako 20 prípadov s vynikajúcimi výsledkami. Je teda už mnoho lekárov pre mačaciu medicínu a odborníkov na internú medicínu so skúsenosťami s liečbou FIP, a tak majú veterinári, ktorí váhajú s liečbou svojich vlastných prípadov, možnosť doporučiť svojim klientom týchto odborníkov.

Medzi lekárov, ktorí akceptujú prípady FIP od všeobecných lekárov, patria napríklad: QLD Rhett Marshall, Marcus Gunew, Alison Jukes, Rachel Korman; NSW Katherine Briscoe, Michael Linton, Randolph Baral, Melissa Catt; VIC – Carolyn O’Brien, Keshuan Chow, Amy Lingard; WA-Martine Van Boeijen a Univerzitná veterinárna nemocnica Murdoch; TAS Moira van Dorsselaer.

Všetci títo lekári (a pravdepodobne ešte viac, o ktorých nevieme) radi prijmú prípady na diagnostiku a terapiu. Všetci s vami pravdepodobne radi prediskutujú manažment prípadov.

Obrázok 8: Bengálske mačiatko s CNS a očnou FIP (A: pred) a (B: po) po Remdesivire. Táto mačka mala tiež pľúcne granulómy.

Sally Coggins, spolupracujúca s Larou Boland, Emily Pritchard, docentkou Mary Thompsonovou a profesorkou Jacqui Norris na Sydney School of Veterinary Science, má záujem o liečbu prípadov s komplexnou diagnózou a monitorovaním poskytovaným zadarmo . Bude to tvoriť súčasť doktorandského programu Sally, takže jej budete pomáhať napredovať v štúdiu tým, že jej budete posielať prípady. Dúfame, že pomocou týchto študií, získame lepšiu predstavu o tom, ako rýchlo mačky reagujú, a kedy presne možno liečbu bezpečne ukončiť. Majitelia si budú musieť zaplatiť iba za remdesivir a GS-441524 na terapiu. Táto skupina má tiež záujem o liečbu prípadov interferónom-omega a meflochínom.

Väčšine prípadov FIP sa darí veľmi dobre pri liečbe GS-441524 alebo remdesivirom. Niels Pedersen zhromaždil úžasný zdroj pre veterinárnych lekárov, ktorí sa zaujímajú o manažment prípadov FIP – https://sockfip.org/dr – pedersen – research/ . Stránka uvádza aj niekoľko odporúčaní, ako sledovať mačky počas liečby. Nie som veľmi orientovaný na protokol, takže pre mňa sú kľúčové veci, ktoré treba sledovať, ako chuť do jedla, postoj, úroveň aktivity a zmeny telesnej hmotnosti a kondície v priebehu času. Väčšina lekárov rada monitoruje hematológiu a biochémiu séra každý mesiac, aby sa zabezpečilo, že všetky merateľné abnormality sa zlepšujú, hoci to môže byť pre pacienta stresujúce a zvyšuje to náklady na liečbu. Kompromisom je odobranie niekoľkých kvapiek krvi na sledovanie PCV, celkového proteínu v plazme (TPP) pomocou refraktometrie a farby plazmy – tak sa dá určiť, či sa anémia zlepšuje, ikterus ustupuje a či sa znižuje koncentrácia gamaglobulínu, čo má za následok nižšie TPP.

Neznepokojujte sa prechodným zvýšením koncentrácií globulínu na začiatku liečby; keď sa absorbujú výpotky s vysokým obsahom bielkovín, do plazmy pacienta sa dostane veľa imunoglobínov. Tento jav môže byť bežný až do 8. týždňa liečby, ale vymizne do 12. týždňa.

Obrázok 9: MRI obrázok v priečnej rovine po kontraste s vážením T1. Poznámka: dilatácia laterálnych komôr s veľmi miernym zvýraznením ependymálnej výstelky (oranžové šípky). Obrázok s láskavým dovolením Christine Thomas.

A čo mačiatko s multifokálnym ochorením CNS, kde je FIP CNS najpravdepodobnejšou príčinou klinických príznakov? Tradičným prístupom je sérológia (na vylúčenie kryptokokózy a toxoplazmózy), dobrá anamnéza a test tiamínu na vylúčenie nedostatku vitamínu B1, potom MRI skeny (obrázok 9) a odber CSF na analýzu tekutín a multiplexnú neuro-qPCR analýzu ). Tento prístup je veľmi drahý a existuje aj isté riziko z anestézie a najmä odberu CSF. Zistili sme, že 3-5 dňová intravenózna alebo sc. liečba remdesivirom sa môže použiť ako terapeutická skúška u mačiek s pravdepodobnou CNS FIP a je cenovo výhodnou alternatívou k úplnému diagnostickému spracovaniu, ktoré môže stáť 3-5000$ alebo viac .

Podobne, ak je voľbou exploračná laparotómia, biopsia abnormálnych tkanív, histológia a imunohistochémia pre FIP antigén na diagnostiku suchej intraabdominálnej FIP oproti 3–5-dňovej liečbe s remdesivirom alebo GS-441524, môže sa zvážiť test s použitím lieku, čo je lepšia voľba z hľadiska pohody pacienta a znížených nákladov. U väčšiny mačiek s neefuzívnou FIP nastáva rýchle zlepšenie pomocou antivírusovej terapie, s normalizáciou horúčky, zlepšením chuti do jedla a lepším celkovým postojom v priebehu 2 až 3 dní. Ak pacient nereaguje na antivírusovú terapiu, potom je samozrejme rozumná exploračná laparotómia a biopsia reprezentatívnych orgánov, keďže hlavnými diferenciálnymi diagnózami sú lymfóm a lymfocytická cholangitída.

Toto je vecou osobného prístupu každého lekára. FNA na cytologické a niekedy imunohistochemické vyšetrenie alebo PCR je presvedčivou neinvazívnou možnosťou tam, kde je táto expertíza dostupná, ale niekedy nedá definitívnu odpoveď. Niektorí veterinári trvajú na diagnostike tkaniva a pozitívnej imunohistológii alebo PCR u každého pacienta, zatiaľ čo iní by radi „liečili liečiteľné“ pomocou 3–5-dňového nasadenia remdesiviru/GS-441524 a pristúpili k exploratívnej laparotómii, až keď neexistuje jednoznačná odpoveď na terapiu.

Je neuveriteľne uspokojujúce vidieť premenu mačiek a mačiatok, ktorým nie je dobre, na normálne a šťastné mačky. Je to naozaj niečo, čo vám ako lekárovi zdvihne náladu. Je to dobrá veda a dobrá veterinárna medicína!

Závery

V minulosti bola diagnóza FIP intelektuálnym cvičením, aby sme utrpenie mačky alebo mačiatka mohli ukončiť s istotou presnej diagnózy. Teraz, vďaka celoživotnmu štúdiu FIP Dr. Nielsa Pedersena, sme schopní úspešne liečiť možno 80 % alebo viac mačiek s FIP, ak má klient dostatok financií. Je príliš skoro predpovedať, či alebo koľko z nich sa bude neskôr opakovať.

Existuje potreba intenzívneho štúdia v diagnostike a manažmente prípadov, ale s vynaložením potrebného úsilia by dobrý praktický veterinár mal byť schopný spolupracovať s odhodlaným majiteľom na dosiahnutí klinického vyliečenia. Najdôležitejšie je neklásť príliš veľa prekážok do cesty oddaného majiteľa a podporovať ho počas 12-týždňového maratónskeho liečebného kurzu tým, že mu pomôžete nájsť najlepší spôsob liečby svojho pacienta. Môže to zahŕňať sedatívnu/analgetickú liečbu, ktorá pomôže mačke zlepšiť ovládateľnosť a predchádzať nepríjemným pocitom, keď klient privedie svoju mačku na kliniku denne na injekcie remdesiviru alebo prechod na tablety GS-441524, keď je stres z injekcií pre vlastníka príliš veľký. Je dôležité zvládnuť dlhú cestu a možno poskytnúť platobný plán, ktorý umožní odhodlaným klientom zlepšiť cenovú dostupnosť liečby.

Napokon, vplyv COVID-19 na výskum koronavírusov bol skutočne hlboký a vo vývoji je niekoľko veľmi sľubných liekov, ako napríklad molnupiravir od spoločnosti Merck a ďalší perorálny liek od spoločnosti Pfizer.

CELKOVÉ ZHRNUTIE

2-stupňový prístup k terapii

1.fáza – INDUKCIA

IV/SC injekcie Remdesiviru

Pre mačky s vlhkou FIP: 10-12 mg/kg remdesiviru subkutánnou injekciou (SCI) raz denne (SID) počas 2 týždňov
Pre mačky s postihnutím oka: 15 mg/kg SID remdesivir SCI počas 2 týždňov
Pre mačky s neurologickými príznakmi FIP a CNS: remdesivir 20 mg/kg SID počas 2 týždňov

2. fáza – KONSOLIDÁCIA

Po 2 týždňoch injekčného podávania remdesiviru prejdite na tablety GS-441524

Pre mačky s vlhkou FIP: 10-12 mg/kg GS-441524 perorálne SID počas 10 týždňov
Pre mačky s postihnutím oka: 15 mg/kg SID GS-441524 perorálne SID počas 10 týždňov
Pre mačky s neurologickými príznakmi FIP a CNS: GS-441524 10 mg/kg perorálne BID (20 mg/kg/deň) počas 10 týždňov

Literatúra

Kim, Y.; Liu, H.; Galasiti Kankanamalage, A.C.; Weerasekara, S.; Hua, D.H.; Groutas, W.C.; Chang, K.O.; Pedersen, N.C. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog. 2016, 12, e1005531.
Pedersen, N.C.; Kim, Y.; Liu, H.; Galasiti Kankanamalage, A.C.; Eckstrand, C.; Groutas, W.C.; Bannasch, M.; Meadows, J.M.; Chang, K.O. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2018, 20, 378–392.
Murphy, B.G.; Perron, M.; Murakami, E.; Bauer, K.; Park, Y.; Eckstrand, C.; Liepnieks, M.; Pedersen, N.C. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet. Microbiol. 2018, 219, 226–233.
Pedersen, N.C.; Perron, M.; Bannasch, M.; Montgomery, E.; Murakami,
E.; Liepnieks, M.; Liu, H. Efficacy, and safety of the nucleoside analog GS441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2019, 21, 271–281.
Dickinson PJ, Bannasch M, Thomasy SM, et al. Antiviral treatment using the adenosine nucleoside analogue GS-441524 in cats with clinically diagnosed neurological feline infectious peritonitis. Journal of Veterinary Internal Medicine. 2020. doi: 10.1111/jvim.15780.
Tasker S. Diagnosis of feline infectious peritonitis: Update on evidence supporting available tests. Journal of Feline Medicine and Surgery.
2018;20(3):228-243. doi:10.1177/1098612X18758592
McDonagh, P.; Sheehy, P.A.; Norris, J.M. Identification, and characterisation of small molecule inhibitors of feline coronavirus replication. Vet. Microbiol. 2014, 174, 438–447.
Yuan, S., Yin, X., Meng, X. et al. Clofazimine broadly inhibits coronaviruses including SARS-CoV-2. Nature (2021).
https://doi.org/10.1038/s41586-021-03431-4
https://sockfip.org/ – NAJLEPŠÍ zdroj na internete alebo kdekoľvek pre FIP.

Obrázok 10: Dve mačky so suchou FIP po úspešnej terapii. Ako mi nie tak dávno napísal jeden zanietený mladý veterinár v e-maile – „to je dôvod, prečo som robil vedu!“

NÁKLADY:

2 kg mačiatko s vlhkou FIP
4×100 mg vialky remdesiviru – 1000$
35×50 mg tabliet GS-441524 – 2100$
Manipulácia a GST – 30$ plus 310$ = 340$
Celkom 3440$, približne 290$ týždenne počas 12 týždňov

4 kg mačka so suchou FIP
7×100 mg vialiek remdesiviru – 1750$
70×50 mg tabliet GS-441524 – 4200$
Manipulácia a GST 30$ plus 600$
Celkom 6550$, asi 545$ týždenne počas 12 týždňov

Obrázok 11: Dvaja súrodenci, u ktorých sa vyvinula FIP a boli úspešne vyliečení remdesivirom a GS441524.

25. 4. 202129. 3. 2023

Terapeutický účinok antihumánnej TNF-alfa protilátky a itrakonazolu pri liečbe FIP

31.3.2020, Preklad 25.4.2021
Tomoyoshi Doki, Masahiro Toda, Nobuhisa Hasegawa, Tsutomu Hohdatsu & Tomomi Takano
Pôvodný článok: Therapeutic effect of an anti-human-TNF-alpha antibody and itraconazole on feline infectious peritonitis

Abstrakt

Infekčná peritonitída mačiek (FIP) je smrteľné ochorenie voľne žijúcich a domácich druhov mačiek. Aj keď niektoré lieky sa ukázali ako účinné pri liečbe FIP, v klinickej praxi sú stále nedostupné. V tejto štúdii sme hodnotili terapeutický účinok kombinovaného použitia adalimumabu (antihumánna TNF-alfa monoklonálna protilátka, ADA) a itrakonazolu (ICZ), ktoré sú veterinárnym lekárom v súčasnosti k dispozícii. Neutralizačná aktivita ADA proti fTNF-alfa-indukovanej cytotoxicite sa merala v bunkách WEHI-164. Desať mačiek bez špecifických patogénov (SPF) bolo naočkovaných intraperitoneálne FIPV KU-2 typu I. Mačkám, u ktorých sa vyvinula FIP, sa ADA (10 mg/zviera) podávala dvakrát medzi dňom 0 a dňom 4 po zahájení liečby. ICZ (50 mg/hlava, SID) sa podával orálne každý deň od dňa 0 po začiatku liečby. ADA preukázala na dávke závislú neutralizačnú aktivitu proti rfTNF-alfa. V experimente na zvieratách 2 z 3 mačiek preukázali zlepšenie klinických symptómov FIP a výsledkov biochémie, zvýšenie počtu lymfocytov v periférnej krvi a pokles hladiny alfa 1-AGP v plazme po zahájení liečby. Jedna z mačiek na liečbu nereagovala a bola eutanizovaná, aj keď hladina vírusového génu v ascite po zahájení liečby dočasne poklesla. Zistilo sa, že ADA má neutralizačnú aktivitu proti rfTNF-alfa. Kombinované použitie ADA a ICZ ukázalo terapeutický účinok na experimentálne indukovanú FIP. Tieto lieky považujeme za možnosť liečby, kým nebudú účinné lieky proti FIPV legálne dostupné.

Úvod

Vírus infekčnej peritonitídy mačiek (FIPV), mačací koronavírus (FCoV) z čeľade Coronaviridae, spôsobuje u voľne žijúcich a domácich druhov mačiek smrteľné ochorenie nazývané infekčná peritonitída mačiek (FIP). U mačiek, u ktorých sa vyvinie FIP, je postihnutých niekoľko orgánov vrátane pečene, pľúc, sleziny, seróz, obličiek, očí a centrálneho nervového systému a tvorbu lézií v týchto orgánoch sprevádza nekróza a pyogénny granulomatózny zápal. U niektorých mačiek bolo zaznamenané hromadenie pleurálneho výpotku a ascitickej tekutiny ^[1].

Virión FCoV sa skladá hlavne z nukleokapsidy (N), obalu (E), membrány (M) a peplomerových spike (S) proteínov. FCoV sú klasifikované do dvoch sérotypov, FCoV typu I a II, na základe rozdielov v aminokyselinovej sekvencii S proteínu ^{[2, 3]}. FCoV typu II bol generovaný genómovou rekombináciou medzi FCoV I. typu a psím koronavírusom II. typu (CCoV) ^[4,5,6]. Niekoľko sérologických a genetických prieskumov ukázalo, že FCoV typu I je dominantný a že väčšina prípadov FIP je spôsobená infekciou FIPV typu I ^[7,8,9].

Už skôr sme ukázali, že TNF(tumor nekrotizujúci faktor)-alfa hrá rozhodujúcu úlohu v progresii FIP. TNF-alfa je nadmerne produkovaný makrofágmi infikovanými FIPV. TNF-alfa sa podieľa na lymfopénii a zvýšených hladinách bunkového receptora FIPV sérotypu II, aminopeptidázy N (APN) ^{[10, 11]}. Tiež sa uvádza, že apoptóza neutrofilov u mačiek s FIP je inhibovaná TNF-alfa^[12]. Toto zistenie naznačuje, že neutrofília u mačiek s FIP je spôsobená prežitím neutrofilov indukovaným TNF-alfa. Zistili sme, že monoklonálna protilátka (mAb) 2-4 s vysokou neutralizačnou aktivitou proti mačaciemu TNF-alfa (fTNF-alfa) je použiteľná ako liečba FIP ^{[13, 14]}. Avšak mAb anti-fTNF-alfa nebola nikdy uvedená na trh a nemôže byť klinicky použitá v zvieracích nemocniciach. V humánnej medicíne sa antihumánna TNF-alfa mAb používa na liečbu zápalových ochorení, ako je reumatoidná artritída a Crohnova choroba ^[15]. Je komerčne dostupná a je možné aj jej použitie vo veterinárni praxi. Nie je však známe, či je táto ľudská protilátka účinná proti FIP, chorobe mačiek.

Pre liebu FIPV bolo opísaných niekoľko antivírusových látok ^{[16,17,18,19,20]}. Bolo potvrdené, že tieto lieky znižujú množenie FIPV, ale nie sú komerčne distribuované ako veterinárne lieky. Už skôr sme zistili, že itrakonazol (ICZ), ktorý sa používa vo veterinárnej medicíne, znižuje množenie FIPV typu I ^[21,22,23]. Terapeutické účinky ICZ u mačiek s FIP však zostávajú nejasné.

V tejto štúdii sme hodnotili, či má adalimumab (ADA), antihumánna TNF-alfa mAb, neutralizačnú aktivitu proti fTNF-alfa. Ďalej sme hodnotili terapeutické účinky ADA a ICZ na FIP ich podávaním mačkám s experimentálne indukovanou FIP.

Materiály a metódy

Bunkové kultúry a vírusy

Bunky myšieho sarkómu WEHI-164 sa udržiavali v rastovom médiu RPMI 1640 doplnenom o 10% FCS, 600 U benzylpenicilínu draselného na ml, 240μg streptomycínsulfátu na ml a 50μM 2-merkaptoetanolu. Bunky myšieho sarkómu WEHI-164 boli z American Type Culture Collection (ATCC CRL1751).

FIPV KU-2 typu I sa pestoval v celých plodových (fcwf)-4 bunkách Felis catus pri 37°C. FIPV typu I KU-2 typu I bol izolovaný v našom laboratóriu.

Monoklonálna protilátka

Anti-fTNF-alfa mAb 2-4 boli opísané v^[13] a bolo preukázané, že majú neutralizačnú aktivitu pre rekombinantný fTNF-alfa (rfTNF-alfa) a prirodzený fTNF-alfa. mAb 2-4 sa purifikovali z hybridomového kultivačného supernatantu pomocou proteínu G Sepharose (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA). Anti-humánna TNF-alfa mAb, adalimumab (ADA, Humira®), bola zakúpená od Eisai Co., Ltd. (Tokio, Japonsko) ako roztok 20mg/0,2 ml. ADA sa zriedil na koncentráciu 2mg/ml vo fyziologickom roztoku.

Itrakonazol

Itrakonazol (ICZ) bol zakúpený od spoločnosti NICHI-IKO (Toyama, Japonsko) a poskytnutý ako tableta (100 mg). Mačkám bola podávaná polovica tablety, rozdrvená na prášok a zmiešaná s jedlom.

Neutralizácia mačacieho TNF-alfa pomocou ADA v bunkách WEHI-164

Neutralizácia TNF-alfa v bunkách WEHI-164 sa testovala podľa popisu Doki a kol. ^[13]. Stručne povedané, bunky WEHI-164 sa suspendovali pri hustote 1×10⁶ buniek/ml v riediacom médiu obsahujúcom 1μg aktinomycínu D (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) na ml a predinkubovali sa pri 37°C po dobu 3 hodín. Sériovo zriedené mAb sa zmiešali s 40ng rfTNF-alfa na ml. Zmes sa inkubovala pri 37°C počas 1 hodiny. Predinkubované bunky sa naočkovali v objeme 50μl do jamiek 96-jamkovej doštičky. Potom sa do každej jamky pridalo 50 mikrolitrov zmesi. Po inkubácii pri teplote 37°C počas 24 hodín sa pridalo 10μl roztoku WST-8 (WST-8 Cell Proliferation Assay Kit; Kishida Chemical Co., Ltd., Osaka, Japonsko) a merala sa absorbancia vyrobeného formazanu pri 450nm. Percento neutralizácie bolo vypočítané pomocou nasledujúceho vzorca: Neutralizácia (%) = (OD jamiek obsahujúcich mAb a rfTNF-alfa – OD jamiek obsahujúcich rfTNF-alfa bez mAb)/OD jamiek bez mAb a rfTNF-alfa × 100.

Pokus na zvieratách

Boli dodržané všetky príslušné národné a inštitucionálne smernice pre starostlivosť a použitie zvierat. Protokol o experimentovaní na zvieratách bol schválený prezidentom Kitasato University na základe rozhodnutia Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť a použitie zvierat na Kitasato University (schválenie č. 18-152). Mačky bez špecifických patogénov (SPF) boli chované v našom vlastnom laboratóriu a udržiavané v izolovanom zariadení s regulovanou teplotou.

Experimentálny harmonogram

Podľa experimentálneho harmonogramu zobrazeného na obr. 1 bolo 10 mačiek SPF (9- alebo 10-mesačné domáce krátkosrsté mačky) naočkovaných intraperitoneálne FIPV KU-2 typu I (103,6 TCID50/ml/zviera). Potom sa u mačiek denne vyšetrovali klinické príznaky a merala sa ich telesná teplota a hmotnosť. Mačkám, u ktorých sa vyvinula FIP, sa ADA (10 mg/zviera) podávala dvakrát intravenózne medzi dňom 0 a dňom 4 po začiatku liečby. ICZ (50mg/zviera, SID) sa podával orálne každý deň od dňa 0 po zahájení liečby. Krv sa odoberala mačkám v týždňových intervaloch po naočkovaní vírusom a v čase podania ADA. Heparinizovaná krv sa použila na meranie úplného a diferenciálneho počtu buniek a na izoláciu plazmy. Vzorky plazmy sa až do dňa analýzy skladovali pri -30°C. Mačky boli eutanizované po dosiahnutí humánneho koncového bodu alebo 60 dní po infikovaní. Diagnózy FIP boli potvrdené posmrtným vyšetrením s odhalením peritoneálnych a pleurálnych výpotkov a pyogranulómu v hlavných orgánoch.

Meranie plazmatického alfa1-glykoproteínu (AGP)

Plazmatické koncentrácie AGP sa stanovili pomocou mačacej doštičky alfa1 AG (The Institute for Metabolic Ecosystem Lab., Osaki, Japonsko) podľa protokolu výrobcu.

Meranie koncentrácie plazmatického vaskulárneho endoteliálneho rastového faktora (VEGF)

Plazmatické koncentrácie VEGF sa stanovili pomocou humánnej VEGF ELISA súpravy (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) podľa protokolu výrobcu. Súprava ELISA primárne deteguje mačaciu VEGF izoformu 164 ^[24].

Kvantitatívna RT-PCR v reálnom čase (qRT-PCR)

Na kvantifikáciu vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu sa uskutočnila qRT-PCR s použitím primeru zameraného na 3’-UTR ^[17]. Jeden mililiter ascitu sa zhromaždil od mačky č. 6 a po centrifugácii sa supernatant a bunky uložili oddelene. Celková RNA sa izolovala zo supernatantu a buniek z ascitu pomocou súpravy na izoláciu RNA vysokej čistoty (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemecko) podľa pokynov výrobcu. RNA bola reverzne transkribovaná a amplifikovaná s použitím RNA-direct Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Osaka, Japonsko) so špecifickými primermi 3′-UTR-F (5′-GGAGGTACAAGCAACCCTATT-3 ‘) a 3′-UTR-R (5’-GATCCAGACGTTAGCTCTTCC-3 ‘) a sonda (FAM-5′-AGATCCGCTATGACGAGCCAACAA-3’-BHQ1). Reakcia sa uskutočňovala v celkovom objeme 20μl/jamku na 48-jamkových doštičkách PCR s použitím systému StepOne Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pri teplote 90°C počas 30s, 60°C počas 20 minút a pri 95°C počas 1 minúty, potom nasledovalo 45 cyklov pri 90°C počas 15s a 60°C počas 1 minúty. Na získanie kontrolnej RNA na kvantifikáciu sa cDNA fragmenty amplifikované s primérmi 3’-UTR-F a 3’-UTR-R klonovali do pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA). Linearizovaný a purifikovaný plazmid bol transkribovaný pomocou RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7 (Promega, Madison, WI, USA) podľa pokynov výrobcu. Koncentrácia transkribovanej RNA sa merala pomocou spektrofotometra. Boli pripravené desaťnásobné riedenia transkriptu RNA v rozmedzí od 1×10¹ do 1×10⁹ kópií/μl s 10ng MS2 RNA na ml. Počet kópií RNA sa vypočítal podľa postupu opísaného v Fronhoffs a kol. ^[25]. Zásobné roztoky in vitro transkribovanej RNA sa skladovali pri -80°C a zriedené pracovné roztoky sa skladovali pri -30°C.

Proteínová sekvencia

Odvodené aminokyselinové sekvencie mačacieho a humánneho TNF-alfa sa získali z RefSeq (prístupové čísla NP_001009835.1 a NP_000585.2). Porovnanie odvodených aminokyselinových sekvencií mačacieho a ľudského TNF-alfa sa uskutočnilo s použitím Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

Výsledky

Neutralizačná aktivita ADA proti rfTNF-alfa

Porovnanie odvodených aminokyselinových sekvencií mačacích a humánnych TNF-alfa je znázornené na obr. 2. Zistilo sa, že sekvencie sú identické na 89,7%.

**Obrázok 2.**
Porovnanie aminokyselinovej sekvencie mačacieho a ľudského TNF-alfa. *: rezíduá, ktoré interagujú s adalimumabom

Neutralizačná aktivita ADA proti rfTNF-alfa sa merala pomocou testu cytotoxicity WEHI-164. ADA neutralizovala aktivitu rfTNF-alfa spôsobom závislým od dávky, podobne ako anti-fTNF-alfa mAb 2-4 (obr. 3). Dávka mAb2-4 a ADA potrebná na inhibíciu bunkovej smrti o 50% (IC50) bola 18,1 ± 4,9 ng/ml, respektíve 36,9 ± 23,4 ng/ml.

**Obrázok 3.**
Krivka neutralizačnej dávky a odpovede proti rekombinantnému fTNF-alfa. Neutralizačná aktivita ADA proti fTNF-alfa indukovanej cytotoxicite sa merala v bunkách WEHI-164. Bunky WEHI-164 boli ošetrené zmesami sériových riedení ADA a fTNF-alfa a po 24 hodinách bola meraná hladina TNF-alfa indukovanej cytotoxicity.

Zmeny telesnej teploty a telesnej hmotnosti

Desať mačiek SPF bolo naočkovaných intraperitoneálne 103,6 TCID50 FIPV KU-2 typu I. Tri mačky (2, 3 a 6) vykazovali horúčku, anorexiu, letargiu a žltačku. Distenzia brucha spôsobená ascitom sa pozorovala u mačky č. 6. Tieto 3 mačky boli použité v nasledujúcich experimentoch ako FIP mačky. Liečba mačiek 2, 3 a 6 sa začala 34., 32. a 21. deň po naočkovaní vírusom.

Zmeny telesnej teploty a telesnej hmotnosti u troch mačiek sú znázornené na obr. 4. U všetkých sa vyvinula horúčka ≥ 39°C niekoľko dní pred zahájením liečby (obr. 4A). U mačiek 2 a 3 sa telesná teplota znížila na rozsah pred nástupom FIP 7. deň po začiatku liečby. Potom sa telesná teplota mačky č. 3 sa zvýšila na 38,7°C 31. deň po zahájení liečby. Telesná teplota mačky č. 6 zostala na ≥ 39,0°C aj po začiatku liečby.

**Obrázok 4.**
Zmeny telesnej teploty a hmotnosti mačiek. †: Mačka bola eutanizovaná, pretože jej klinický stav dosiahol humánny koncový bod

U mačiek 2 a 3 sa nepozoroval žiadny úbytok telesnej hmotnosti v porovnaní s telesnou hmotnosťou v deň 0 liečby (obr. 4B). Telesná hmotnosť mačky č. 6 naďalej klesala od dňa 0 do dňa 15, čo malo za následok 8% stratu v porovnaní s dňom 0.

Zmeny počtu WBC a lymfocytov

Celkový počet bielych krviniek a počet lymfocytov sa meral u mačiek infikovaných FIPV. U mačiek 2 a 3 sa počas celého experimentu pozorovala malá zmena v celkovom počte bielych krviniek (obr. 5A). U mačky č. 6 sa celkový počet bielych krviniek zvýšil po zahájení liečby a po šiestom dni zostal na hodnote ≥ 20 000 buniek/μl.

U mačiek 2 a 3 sa počet lymfocytov po zahájení liečby mierne zvýšil (obr. 5B). U mačky č. 6, počet lymfocytov zostal počas celého experimentu nízky. Znížila sa na približne 800 buniek/μl v deň 6 po začiatku liečby, ale obnovila sa takmer na úroveň pred prepuknutím FIP v deň 13 a nevykazovala výraznú zmenu až do humánneho koncového bodu.

Zmeny v plazmatickej koncentrácii alfa1-kyslého glykoproteínu (AGP)

Hladina alfa 1-AGP v plazme sa merala postupne u troch mačiek. U všetkých troch mačiek sa zvýšila na vysokú hladinu ≥ 750 μg / ml na začiatku liečby (obr. 6). U mačiek 2 a 3 sa plazmatická hladina alfa 1-AGP znížila takmer na hladinu pred vývojom FIP v 14. a 16. deň po zahájení liečby. Avšak u mačky č. 6 bolo zvýšenie plazmatickej hladiny alfa 1-AGP potlačené až do 6. dňa po začiatku liečby, ale na 13. deň sa zvýšilo na približne 1 900μg/ml.

**Obrázok 6.**
Zmeny plazmatickej koncentrácie alfa1-kyslého glykoproteínu (AGP) u mačiek. †: Mačka bola eutanizovaná, pretože jej klinický stav dosiahol humánny koncový bod

Zmeny koncentrácie plazmatického vaskulárneho endoteliálneho rastového faktora (VEGF)

Plazmatická hladina VEGF sa postupne merala u troch mačiek. U mačky č. 2 zostal nízky (obr. 7). U mačky č. 3, sa dočasne zvýšila na približne 200 pg/ml v deň 5 pred zahájením liečby, ale znížila sa takmer na úroveň pred nástupom FIP v deň 0 liečby a po nej nevykazovala žiadny nárast. U mačky č. 6 sa plazmatická hladina VEGF zvýšila po inokulácii FIPV na približne 170 pg/ml v deň 0 liečby. Potom sa znížila počnúc 6. dňom liečby a bola podobná úrovni pred prepuknutím FIP v 13. deň.

Hladiny vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu u mačky č. 6

Hladiny vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu zhromaždených od mačky č. 6 bolo kvantifikovaných pomocou qRT-PCR. Úroveň vírusovej RNA dočasne poklesla na 4. deň po zahájení liečby v supernatante aj v bunkách z ascitu (obr. 8). V deň 20 po začiatku liečby sa však hladiny vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu zvýšili na dvojnásobok úrovní v deň 0 liečby.

**Obrázok 8.**
Hladiny vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu zhromaždených od mačky č. 6 bolo kvantifikovaných pomocou qRT-PCR. Úroveň vírusovej RNA dočasne poklesla na 4. deň po zahájení liečby v supernatante aj v bunkách z ascitu (obr. 8). V deň 20 po začiatku liečby sa však hladiny vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu zvýšili na dvojnásobok úrovní v deň 0 liečby.

Biochemický panel

Po liečbe sa merali TP a pomer A/G, čo sú diagnostické indexy FIP, a AST, LDH a TB, ktoré súvisia s funkciou pečene (obr. 9). TP sa mierne zvýšila u mačky č. 3, ale u všetkých troch mačiek zostala v normálnom rozmedzí. Na druhej strane pomer A/G poklesol po vystavení FIPV u všetkých troch mačiek a v deň 0 liečby bol ≤ 0,8. U mačky č. 2, pomer A/G zostal podobný ako po začiatku liečby až do konca experimentu. U mačky č. 3, klesal až do 16. dňa liečby, ale potom už nevykazoval žiadny ďalší pokles. U mačky č. 6 pokračovalo znižovanie aj po zahájení liečby.

AST, LDH a TB boli vyššie ako normálne rozmedzie v deň 0 alebo 3 liečby u všetkých troch mačiek. U mačiek 2 a 3 sa AST, LDH a TB znížili takmer na hladiny pred nástupom FIP v deň 7 alebo 9 po zahájení liečby. U mačky č. 6, AST, LDH a TB boli vyššie ako normálne rozmedzie v deň 0 alebo 4 po zahájení liečby a naďalej sa zvyšovali až do konca experimentu.

Diskusia

Silný terapeutický účinok možno dosiahnuť, ak sa mačkam s FIP podáva mAb anti-fTNF-alfa, ktorý potláča aktivitu TNF-alfa, exacerbátor FIP, v kombinácii s ICZ, ktorý znižuje proliferáciu (množenie) FIPV. Avšak schválenie mAb anti-fTNF-alfa ako veterinárneho lieku v každej krajine je nákladné a časovo náročné. Preto sme sa zamerali na antiľudskú TNF-alfa mAb, ktorá sa už používa na liečbu ľudských zápalových chorôb.

Pred uskutočnením pokusov na zvieratách sme skúmali, či antihumánna TNF-alfa mAb môže neutralizovať fTNF-alfa. ADA, ktorá je antihumánnou TNF-alfa mAb, demonštrovala na dávke závislú neutralizačnú aktivitu proti rfTNF-alfa, podobnú anti-fTNF-alfa mAb 2-4. Deväť skôr reportovaných anti-fTNF-alfa mAb, malo IC50 v rozmedzí od 5 do 700ng/ml proti rfTNF-alfa pri rovnakej koncentrácii ^[13]. IC50 ADA (36,9 ± 23,4 ng/ml) naznačuje, že má vysokú neutralizačnú aktivitu proti fTNF-alfa v porovnaní s týmito anti-fTNF-alfa mAb. Spravidla mAb proti ľudským cytokínom nevykazujú žiadnu krížovo reaktívnu neutralizačnú aktivitu proti živočíšnym cytokínom. Avšak Aguirre a kol. uviedli, že ľudský a mačací TNF-alfa majú podobné neutralizačné epitopy ^[26]. Navyše odvodená aminokyselinová sekvencia ľudského TNF-alfa je na 89,7% identická so sekvenciou mačacieho TNF-alfa a v obidvoch je prítomných 10 z 12 rezíduí, ktoré interagujú s ADA ^[27]. To sa javí ako dôvod silnej neutralizačnej aktivity adalimumabu proti mačaciemu TNF-alfa.

ADA a ICZ sme podávali mačkám s experimentálne indukovanou FIP a skúmali sme ich terapeutický účinok. Z 10 SPF mačiek, ktoré dostali intraperitoneálne aplikovaný FIPV KU-2 typu I, sa u troch vyvinula FIP. Z týchto troch mačiek bola mačka č. 6 malo zjavný ascit. U týchto troch mačiek sa usúdilo, že si vyvinuli FIP z nasledujúcich dôvodov: i) všetky tri mačky boli infikované FIPV, ii) boli pozorované klinické príznaky súvisiace s FIP, iii) zvýšené plazmatické hladiny alfa-1 AGP a VEGF a iv ) ako referencie boli použité údaje z našich minulých pokusov na zvieratách. ADA (10 mg/zviera) sa podával intravenózne trom mačkám v deň 0 a do 4 dní po začiatku liečby. Okrem toho sa ICZ (50mg/zviera) podával orálne každý deň, počínajúc dňom 0 liečby. U mačiek 2 a 3 bolo po zahájení liečby pozorované zlepšenie klinických príznakov a výsledkov chemických testov krvi, zvýšenie počtu lymfocytov v periférnej krvi a pokles hladiny alfa 1-AGP v plazme. Symptomatické zlepšenia sa pozorovali medzi 1. a 2. týždňom po začiatku liečby. Ďalej u mačiek 2 a 3 neboli na konci experimentu patologicky pozorované žiadne ascity alebo pyogénne granulómy a do konca liečebného obdobia neboli pozorované žiadne zmeny naznačujúce opakovanie FIP. Mačka č. 6 nereagovala na liečbu a bola eutanizovaná, aj keď hladina vírusového génu v ascite po zahájení liečby dočasne poklesla. Tieto výsledky silne naznačujú, že anti-humánne TNF-alfa mAb a ICZ sú účinné pri liečbe FIP.

VEGF je produkovaný makrofágmi infikovanými FIPV a zlepšuje permeabilitu mačacích endotelových buniek ^[28]. U mačiek s FIP koreluje plazmatická hladina VEGF s množstvom ascitu. Mačka č. 6, u ktorej bol zrejmý ascites pri predbežnom i palpačnom vyšetrení (pri eutanázii sa získalo 160ml ascitu), mala počas 3 týždňov vysokú hladinu VEGF v plazme ≥100pg/ml. U mačiek 2 a 3, u ktorých neboli zaznamenané žiadne príznaky ascitu, však plazmatická hladina VEGF zostala nízka alebo sa zvýšila iba dočasne. Potvrdilo sa teda, že plazmatická hladina VEGF koreluje s množstvom ascitu u mačiek s FIP.

Je známe, že azolové antifungálne látky vrátane ICZ majú hepatotoxicitu ako vedľajší účinok a pravdepodobne vyvolávajú cholestázu a žltačku ^{[29,30,31,32]}. Pretože sa u mačiek s FIP pozoruje zvýšenie pečeňových enzýmov, rozvoj nežiaducich účinkov po podaní ICZ by bol znepokojujúci. U mačiek 2 a 3 sa však hladiny markerov pečeňových funkcií, ktoré sa zvyšovali v priebehu liečby, vrátili do normálneho rozsahu a plazmatická žltačka zmizla. Žiadne nežiadúce účinky ICZ teda neboli zaznamenané. Z hľadiska nežiadúcich účinkov sa teda podávanie ICZ považuje pre FIP mačky za bezpečné.

Nedávno boli ako lieky na inhibíciu proliferácie FIPV vyvinuté GC-376, inhibítor 3C-like proteázy, a GS-441524, nukleozidový analóg ^{[16,17,18,19,20}]. GC-376 a GS-441524 sú účinné lieky, ktoré majú terapeutické účinky u 30 – 80% mačiek s FIP. Aj keď sa očakáva, že tieto lieky budú užitočné ako liečba FIP, ešte neboli schválené. V klinickej praxi preto nie sú k dispozícii žiadne lieky na liečbu FIP. V tejto štúdii sme preukázali, že kombinované použitie ADA a ICZ, ktoré sú veterinárnym lekárom v súčasnosti k dispozícii, je účinné pri liečbe FIP. Tieto lieky považujeme za liečebnú možnosť, kým nebudú dostupné antivírusové lieky ako GC-376 a GS-441524. Tieto antivírusové lieky navyše majú terapeutické účinky na FIP mechanizmami odlišnými od mechanizmov ADA a ICZ ^{[16, 18, 21, 23]}. V budúcnosti môže hodnotenie terapeutických účinkov ich súčasného použitia pomôcť pri vývoji účinnejšej liečby FIP.

Závery

Predmetom výskumu boli terapeutické účinky adalimumabu, antihumánnej TNF-alfa mAb a itrakonazolu na FIP. Zistilo sa, že adalimumab má neutralizačnú aktivitu proti rfTNF-alfa, podobne ako anti-fTNF-alfa mAb. FIP bola úspešne liečená u 2 z 3 mačiek s experimentálne indukovanou FIP podávaním adalimumabu a itrakonazolu.

Literatúra

Pedersen NC (2014) An update on feline infectious peritonitis: diagnostics and therapeutics. Vet J 201:133–141. https://doi.org/10.1016/j.tvjl.2014.04.016 Article PubMed Google Scholar
Tekes G, Thiel HJ (2016) Feline coronaviruses: pathogenesis of feline infectious peritonitis. In: Ziebuhr J (ed) Advances in virus research, vol. 96, Academic Press, pp 193–218
Jaimes JA, Whittaker GR (2018) Feline coronavirus: insights into viral pathogenesis based on the spike protein structure and function. Virology 517:108–121. https://doi.org/10.1016/j.virol.2017.12.027 CAS Article PubMed Google Scholar
Decaro N, Mari V, Campolo M et al (2009) Recombinant canine coronaviruses related to transmissible gastroenteritis virus of swine are circulating in dogs. J Virol 83:1532–1537. https://doi.org/10.1128/jvi.01937-08 CAS Article PubMed Google Scholar
Herrewegh AA, Smeenk I, Horzinek MC et al (1998) Feline coronavirus type II strains 79-1683 and 79-1146 originate from a double recombination between feline coronavirus type I and canine coronavirus. J Virol 72:4508–4514CAS Article PubMed Google Scholar
Terada Y, Shiozaki Y, Shimoda H et al (2012) Feline infectious peritonitis virus with a large deletion in the 59-terminal region of the spike gene retains its virulence for cats. J Gen Virol 93:1930–1934. https://doi.org/10.1099/vir.0.043992-0 CAS Article PubMed Google Scholar
Addie DD, Schaap IAT, Nicolson L, Jarrett O (2003) Persistence and transmission of natural type I feline coronavirus infection. J Gen Virol 84:2735–2744. https://doi.org/10.1099/vir.0.19129-0 CAS Article PubMed Google Scholar
Kummrow M, Meli ML, Haessig M et al (2005) Feline coronavirus serotypes 1 and 2: seroprevalence and association with disease in Switzerland. Clin Diagn Lab Immunol 12:1209–1215. https://doi.org/10.1128/CDLI.12.10.1209-1215.2005 CAS Article PubMed Google Scholar
Hohdatsu T, Okada S, Ishizuka Y et al (1992) The prevalence of types I and II feline coronavirus infections in cats. J Vet Med Sci 54:557–562. https://doi.org/10.1292/jvms.54.557 CAS Article PubMed Google Scholar
Takano T, Hohdatsu T, Hashida Y et al (2007) A “possible” involvement of TNF-alpha in apoptosis induction in peripheral blood lymphocytes of cats with feline infectious peritonitis. Vet Microbiol 119:121–131. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2006.08.033 CAS Article PubMed Google Scholar
Takano T, Hohdatsu T, Toda A et al (2007) TNF-alpha, produced by feline infectious peritonitis virus (FIPV)-infected macrophages, upregulates expression of type II FIPV receptor feline aminopeptidase N in feline macrophages. Virology 364:64–72. https://doi.org/10.1016/j.virol.2007.02.006 CAS Article PubMed Google Scholar
Takano T, Azuma N, Satoh M et al (2009) Neutrophil survival factors (TNF-alpha, GM-CSF, and G-CSF) produced by macrophages in cats infected with feline infectious peritonitis virus contribute to the pathogenesis of granulomatous lesions. Arch Virol 154:775–781. https://doi.org/10.1007/s00705-009-0371-3 CAS Article PubMed Google Scholar
Doki T, Takano T, Nishiyama Y et al (2013) Generation, characterization and therapeutic potential of anti-feline TNF-alpha MAbs for feline infectious peritonitis. Res Vet Sci 95:1248–1254. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2013.09.005 CAS Article PubMed Google Scholar
Doki T, Takano T, Kawagoe K et al (2016) Therapeutic effect of anti-feline TNF-alpha monoclonal antibody for feline infectious peritonitis. Res Vet Sci 104:17–23. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2015.11.005 CAS Article PubMed Google Scholar
Tracey D, Klareskog L, Sasso EH et al (2008) Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: a comprehensive review. Pharmacol Ther 117:244–279CAS Article PubMed Google Scholar
Kim Y, Lovell S, Tiew K-C et al (2012) Broad-spectrum antivirals against 3C or 3C-like proteases of picornaviruses, noroviruses, and coronaviruses. J Virol 86:11754–11762. https://doi.org/10.1128/JVI.01348-12 CAS Article PubMed Google Scholar
Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC et al (2016) Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog 12:e1005531. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005531 CAS Article PubMed Google Scholar
Murphy BG, Perron M, Murakami E et al (2018) The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol 219:226–233. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2018.04.026 CAS Article PubMed Google Scholar
Pedersen NC, Kim Y, Liu H et al (2018) Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 20:378–392. https://doi.org/10.1177/1098612X17729626 Article PubMed Google Scholar
Pedersen NC, Perron M, Bannasch M et al (2019) Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 21:271–281. https://doi.org/10.1177/1098612X19825701 Article PubMed Google Scholar
Takano T, Akiyama M, Doki T, Hohdatsu T (2019) Antiviral activity of itraconazole against type I feline coronavirus infection. Vet Res 50:5. https://doi.org/10.1186/s13567-019-0625-3 Article PubMed Google Scholar
Takano T, Endoh M, Fukatsu H et al (2017) The cholesterol transport inhibitor U18666A inhibits type I feline coronavirus infection. Antivir Res 145:96–102. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2017.07.022 CAS Article PubMed Google Scholar
Takano T, Wakayama Y, Doki T (2019) Endocytic pathway of feline coronavirus for cell entry: differences in serotype-dependent viral entry pathway. Pathogens 8:300. https://doi.org/10.3390/pathogens8040300 CAS Article Google Scholar
Koga L, Kobayashi Y, Yazawa M et al (2002) Nucleotide sequence and expression of the feline vascular endothelial growth factor. J Vet Med Sci 64:453–456. https://doi.org/10.1292/jvms.64.453 CAS Article PubMed Google Scholar
Fronhoffs S, Totzke G, Stier S et al (2002) A method for the rapid construction of cRNA standard curves in quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Mol Cell Probes 16:99–110. https://doi.org/10.1006/mcpr.2002.0405 CAS Article PubMed Google Scholar
Aguirre A, Escobar A, Ferreira V et al (2003) An anti-human recombinant tumor necrosis factor alpha (TNFα) monoclonal antibody recognizes an epitope in feline TNFα. Vet Res 34:177–184. https://doi.org/10.1051/vetres:2002064 CAS Article PubMed Google Scholar
Hu S, Liang S, Guo H et al (2013) Comparison of the inhibition mechanisms of Adalimumab and Infliximab in treating tumor necrosis factor α-associated diseases from a molecular view. J Biol Chem 288:27059–27067. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.491530 CAS Article PubMed Google Scholar
Takano T, Ohyama T, Kokumoto A et al (2011) Vascular endothelial growth factor (VEGF), produced by feline infectious peritonitis (FIP) virus-infected monocytes and macrophages, induces vascular permeability and effusion in cats with FIP. Virus Res 158:161–168. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2011.03.027 CAS Article PubMed Google Scholar
García Rodrǐguez LA, Duque A, Castellsague J et al (1999) A cohort study on the risk of acute liver injury among users of ketoconazole and other antifungal drugs. Br J Clin Pharmacol 48:847–852. https://doi.org/10.1046/j.1365-2125.1999.00095.x Article PubMed Google Scholar
Kao WY, Su CW, Huang YS et al (2014) Risk of oral antifungal agent-induced liver injury in Taiwanese. Br J Clin Pharmacol 77:180–189. https://doi.org/10.1111/bcp.12178 CAS Article PubMed Google Scholar
Susan M, Grant SPC (1989) Itraconazole. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in superficial and systemic mycoses. Drugs 37:310–344Article Google Scholar
Khoza S, Moyo I, Ncube D (2017) Comparative hepatotoxicity of fluconazole, ketoconazole, itraconazole, terbinafine, and griseofulvin in rats. J Toxicol. https://doi.org/10.1155/2017/6746989 Article PubMed Google Scholar

Poďakovania

Ďakujeme členom nášho laboratória za podporu pokusov na zvieratách. Táto práca bola čiastočne podporená organizáciou KAKENHI (Grants-in-Aid for Scientific Research (B), č. 16H05039) z Ministerstva školstva, kultúry, športu, vedy a techniky v Japonsku a Grantom na výskum univerzity Kitasato pre mladých vedcov z Univerzita Kitasato.

Etické vyhlásenia

Konflikt záujmov

Autori si nie sú vedomí žiadnych potenciálnych konfliktov záujmov v súvislosti s výskumom, autorstvom alebo publikovaním tohto článku.

Etické schválenie

Boli dodržané všetky príslušné národné a inštitucionálne smernice pre starostlivosť a použitie zvierat. Protokol o experimentovaní na zvieratách bol schválený prezidentom Kitasato University na základe rozhodnutia Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť a použitie zvierat na Kitasato University (schválenie č. 18-152). Mačky SPF boli chované v našom vlastnom laboratóriu a udržiavané v izolovanom zariadení s regulovanou teplotou. Veľkosti vzoriek boli určené na základe našich skúseností s modelmi infekcie FIPV a bol použitý minimálny počet mačiek.

Informovaný súhlas

Informovaný súhlas bol získaný od zákonného opatrovníka všetkých experimentálnych zvierat popísaných v tejto práci pre uskutočnené postupy. V rámci tejto publikácie nie sú identifikovateľné žiadne zvieratá ani ľudia, a preto nebol potrebný ďalší informovaný súhlas so zverejnením.

Ďalšie informácie

Poznámka vydavateľa

Springer Nature zostáva neutrálny, pokiaľ ide o jurisdikčné nároky v publikovaných mapách a inštitucionálnych prepojeniach.

Redaktorka: Sheela Ramamoorthy.

10. 2. 202129. 3. 2023

Účinnosť a bezpečnosť nukleozidového analógu GS-441524 pri liečbe mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou mačacou infekčnou peritonitídou

13.2.2019, Journal of Feline Medicine and Surgery; Preklad 10.2.2021
Pôvodný článok: Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis
Niels C Pedersen, Michel Perron, Michael Bannasch, Elizabeth Montgomery, Eisuke Murakami, Molly Liepnieks, and Hongwei Liu

Abstrakt

Ciele

Cieľom tejto štúdie bolo zistiť bezpečnosť a účinnosť nukleozidového analógu GS-441524 pre mačky trpiace rôznymi formami prirodzene získanej infekčnej peritonitídy mačiek (FIP).

Metódy

Mačky boli vo veku od 3,4 do 73 mesiacov (priemerne 13,6 mesiaca); 26 mačiek malo vlhkú alebo zmiešanú FIP, 5 suchú formu FIP. Mačky so závažnou neurologickou a okulárnou FIP neboli do štúdie prijaté. Skupina začala s GS-441524 v dávke 2,0 mg/kg SC q24h po dobu najmenej 12 týždňov, ktorá sa zvyšovala, keď to bolo indikované, na 4,0 mg/kg SC q24h.

Výsledky

Štyri z 31 mačiek, ktoré mali ťažkú formu ochorenia, uhynuli alebo boli eutanizované do 2-5 dní a piata mačka po 26 dňoch. Zvyšných 26 mačiek dokončilo plánovaných 12 alebo viac týždňov liečby. Osemnásť z týchto 26 mačiek zostáva zdravých v čase publikácie (OnlineFirst, február 2019) po jednom kole liečby, zatiaľ čo osem ďalších utrpelo relapsy choroby v priebehu 3–84 dní. Šesť z relapsov bolo neneurologických a dva neurologické. Tri z ôsmich ralapsujuúcich mačiek boli liečené opäť rovnakou dávkou, zatiaľ čo piatim mačkám bola dávka zvýšená z 2,0 na 4,0 mg/kg každých 24 hodín. Päť mačiek liečených druhýkrát vyššou dávkou, vrátane jednej s neurologickým ochorením, reagovalo dobre a v čase publikácie boli zdravé. Jedna z troch mačiek znovu liečených pôvodnou nižšou dávkou však mala relaps s neurologickým ochorením a bola eutanizovaná, zatiaľ čo dve zostávajúce mačky reagovali priaznivo, ale došlo k druhému relapsu. Tieto dve mačky boli úspešne liečené tretíkrát pri vyššej dávke, čo vo výsledku viedlo k 25 dlhodobo preživším mačkám. Jedna z 25 úspešne liečených mačiek bola následne eutanizovaná z dôvodu pravdepodobného nesúvisiaceho ochorenia srdca, zatiaľ čo 24 zostalo zdravých.

Záver a význam

GS-441524 sa ukázal ako bezpečný a efektívny pri liečbe FIP. Bola stanovená optimálna dávka 4,0 mg/kg SC q24h po dobu najmenej 12 týždňov.

Kľúčové slová: Nukleozidový analóg, GS-441524, infekčná peritonitída mačiek, FIP, klinická štúdia

Úvod

Lieky, ktoré inhibujú replikáciu vírusov, sa stali ústredným bodom zaujmu pri liečbe ľudských akútnych a chronických RNA a DNA infekcií. Vývoj záujmu o antivírusové lieky pre infekcie zvierat bol však oveľa pomalší. To platí najmä pre mačky, ktoré trpia niekoľkými chronickými vírusovými infekciami podobnými tým ľudským. Medzi infekčné činitele patrí vírus mačacej leukémie a imunodeficiencie (FeLV a FIV), mačací herpesvírus (FHV), virulentný systémový kalicivírus a koronavírus spôsobujúci mačaciu infekčnú peritonitídu (FIPV). Infekcie FeLV a FIV sa darí udržiavať pod kontrolou pomocou testovania, izolácie a/alebo očkovania. Ochorenie spojené s FHV bolo prvou mačacou vírusovou infekciou, kde bolo pre liečbu použité antivirotikum. Vysoko smrteľný systémový kalicivírus postihuje iba malý počet mačiek. Infekcia FIPV je najlepším kandidátom pre vývoj antivírusových liekov, pretože vakcíny sú neúčinné, prostredie s mnohými mačkami veľmi komplikuje prevenciu a zabíja 0,3–1,4% mačiek na celom svete.

Výskyt exotických chorôb, ako je ebola, stredovýchodný respiračný syndróm (MERS) a ťažký akútny respiračný syndróm (SARS) u ľudí, podnietil intenzívny výskum liekov, ktoré inhibujú replikáciu vírusu RNA. Jedným z najsľubnejších antivírusových liekov proti vznikajúcim RNA vírusom je proliečivo (prodrug) adenozínový nukleozidový monofosfát GS-5734 (Remdesivir; Gilead Sciences). GS-5734 preukázal účinnosť pri experimentálnej ebole u opíc rhesus a inhiboval epidemické aj zoonotické koronavírusy v tkanivových kultúrach a v myšacích infekčných modeloch. Tieto sľubné zistenia iniciovali výskum GS-5734 a jeho pôvodného nukleozidu GS-441524 proti FIPV infekcii mačiek. GS-441524 a GS-5734 majú porovnateľné hodnoty EC50 (1,0 uM) a CC50 (> 100 uM) proti FIPV v mačacích bunkách. Preto sa rozhodlo pre účely dalších testov s laboratórnymi mačkami zamerať na chemicky menej komplexný GS-441524. Farmakokinetická štúdia na dvoch laboratórnych mačkách preukázala trvalé a účinné plazmatické hladiny GS-441524 vyše 24 hodín po dávke podanej subkutánne (SC) alebo intravenózne (IV). Tieto výsledky sa rozšírili na 10 laboratórnych mačiek s experimentálne indukovanou brušnou efúznou mačacou infekčnou peritonitídou (FIP). Táto štúdia preukázala, že GS-441524 je vysoko účinný proti experimentálnej FIP, a otvorila tak cestu pre túto klinickú štúdiu.

Cieľom tejto štúdie bolo demonštrovať bezpečnosť a účinnosť GS-441524 pri liečbe mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou FIP. Malomolekulárne lieky, ako je GS-441524, majú hmotnosť <900 daltonov a veľkosť približne 1 nm a môžu ľahko prenikať do buniek a interagovať s kľúčovými cieľovými molekulami. Na rozdiel od už publikovaných látok alebo liekov, ktoré inhibujú FIPV brzdením bunkových procesov vírusmi využívaných pre ich replikáciu, malé molekuly, ako je GS-441524, interferujú priamo s vírusom kódovanými replikačnými procesmi.

Materiály a metódy

Príprava lieku

GS-441524 poskytla spoločnosť Gilead Sciences ako čistý a vysoko stabilný prášok, ktorý bol zriedený na koncentráciu 10 alebo 15 mg/ml v 5% etanole, 30% propylénglykole, 45% PEG 400, 20% vode (pH 1,5 s HCI ). Roztok bol umiestnený do sterilných 50 ml sklenených injekčných fľaštičiek, v ktorých sa pretrepal až do rozpustenia a potom sa podrobil sonickej vodnej kúpeli na 5 až 20 minút, kým nebol číry. Zriedený liek bol uložený do chladu a bol použitý v priebehu 3–4 týždňov.

Koncepcia štúdie

Táto štúdia prebiehala podľa protokolov 19336 a 19863 schválených Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat a Výborom pre hodnotenie klinických skúšok Komisie pre klinické skúšky veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice na Kalifornskej univerzite v Davise. Inštitucionálne pravidlá vylučujú použitie chorých mačiek z útulkov alebo z podobných zariadení, kvôli požiadavke legálneho vlastníctva/adopcie a zaobchádzania za špecifických podmienok so súhlasom majiteľa (doplňujúci materiál). Štúdia nezahŕňala kontrolnú skupinu, pretože neexistuje účinná zrovnávacia liečba. Nebola zahrnutá ani placebo skupina, pretože prípravné štúdie in vitro a in vivo naznačovali, že GS-441524 bude bezpečný a účinnejší ako žiadna liečba.

Výber prípadov a potvrdenie diagnózy

Mačky s FIP boli prijaté od majiteľov alebo ich veterinárnych lekárov, ktorí hľadali súčasné možnosti liečby alebo prístup k predchádzajúcej štúdii antivírusových liekov. Počiatočná diagnóza FIP bola založená predovšetkým na charakteristickej signalizácii, klinických anamnézach a príznakoch choroby, výsledkoch bežných laboratórnych testov a vyšetrení brušných alebo hrudných výpotkov. Definitívnejšia diagnóza založená na RT-PCR alebo imunohistochémii bola síce žiaduca, ale nebola nevyhnutnou podmienkou pre zaradenie. Mačky so zjavným očným alebo neurologickým ochorením boli vyradené kvôli pochybnostiam ohľadne schopnosti antivírusových liekov, vrátane GS-441524, preniknúť cez hematoencefalickú alebo hematookulárnu bariéru.

Do štúdie bolo prijatých 31 mačiek a ich majiteľov (tabuľka 1). Majitelia alebo zástupcovia 26 mačiek prišli na úvodnú liečbu priamo do UC Davis a päť majiteľov a ich mačky (CT59, CT73, CT76, CT78, CT80) boli v ošetrení miestneho veterinára. Mačky prítomné na UC Davis boli znovu prehodnotené, ich diagnóza FIP bola znovu potvrdená na základe signalizácie, klinickej anamnézy, fyzikálneho vyšetrenia, výsledkov predchádzajúcich laboratórnych testov a opakovania kompletného krvného obrazu (CBC), sérových bielkovín a analýz výpotkov. Hrudný alebo brušný výpotok u mačiek s vlhkou FIP bol potvrdený ako pozitívny na FIPV 7b RNA pomocou RT-PCR. Mačky so známkami neefúznej FIP boli ďalej testované brušnou a hrudnou ultrasonografiou na primárne lézie. Očné ochorenie bolo potvrdené oftalmologickou službou VMTH, UC Davis. Neurologický stav v prípadoch s možnými príznakmi ochorenia centrálneho nervového systému bol vyhodnocovaný neurologickou službou VMTH.

Tabuľka 1
Zoznam 31 mačiek zaradených do testovania vrátane laboratórneho označenia, mena mačky, plemena, klinickej formy infekčnej peritonitídy (FIP) a dátumu diagnózy

ID	Meno	Dátum narodenia	Plemeno	Pohlavie	Pôvod	Dátum diagnózy	Forma FIP
CT52	Luna	9.1.2017	Savannah	F	Chovateľ	24.4.2017	Brušná efúzna
CT53	Ice Bear	2.8.2016	DLH	MC	Záchranná skupina	5.5.2017	Brušná efúzna
CT54	Charolett	11.7.2016	Siberian	F	Chovateľ	15.4.2017	Brušná efúzna
CT55	Dempsey	26.6.2016	DSH	MC	Záchranná skupina	15.4.2017	Brušná efúzna
CT56	Mudsa	1.7.2016	DSH	MC	Útulok	12.5.2017	Brušná efúzna
CT57	Boone	31.10.2016	DSH	FS	Záchranná skupina	8.5.2017	Brušná efúzna
CT58	Justyna	17.4.2016	Ragdoll	F	Chovateľ	25.5.2017	Brušná efúzna
CT59	Bubba	11.4.2011	DLH	MC	Túlavá	10.4.2017	Brušná neefúzna
CT60	Joey	25.7.2016	DSH	MC	Záchranná skupina	20.5.2017	Brušná efúzna
CT61	Hudson	1.7.2016	DSH	MC	Záchranná skupina	29.5.2017	Hrudná efúzna
CT62	Luca	10.3.2016	DSH	MC	Záchranná skupina	30.5.2017	Brušná efúzna
CT63	Bao Bao	6.11.2016	DSH	MC	Záchranná skupina	3.6.2017	Brušná efúzna
CT64	Cedrick	27.6.2016	DSH	MC	Záchranná skupina	22.5.2017	Brušná neefúzna
CT65	Mona	14.3.2016	Exotic SH/Persian	F	Chovateľ	11.6.2017	Hrudná efúzna
CT66	Squeekers	7.6.2016	DSH	FS	Útulok	14.6.2017	Brušná efúzna
CT67	Double	2.3.2016	Ragdoll	FS	Chovateľ	20.6.2017	Brušná efúzna
CT68	Tuckerman	8.5.2016	Maine Coon	MC	Záchranná skupina	22.6.2017	Brušná efúzna
CT69	Danny	16.6.2015	Snowshoe	MC	Útulok	22.6.2017	Hrudná efúzna
CT70	Tolstoy	1.8.2014	DSH	MC	Záchranná skupina	25.6.2017	Brušná efúzna
CT71	Amadeus	29.6.2016	DSH	MC	Túlavá	20.6.2017	Hrudná efúzna
CT72	Bella	25.2.2017	British SH	F	Chovateľ	20.6.2017	Brušná efúzna
CT73	Siersha	8.8.2015	DSH	FS	Útulok	21.6.2017	Brušná neefúzna
CT74	Maive	4.3.2017	Siberian	FS	Chovateľ	7.7.2017	Brušná efúzna
CT75	Lucy	31.3.2017	DSH	F	Záchranná skupina	10.7.2017	Brušná efúzna
CT76	Pie	20.7.2016	Exotic SH	M	Chovateľ	28.6.2017	Brušná efúzna
CT77	Mila	15.3.2017	Siberian	FS	Chovateľ	3.7.2017	Brušná efúzna
CT78	Polly	1.3.2016	DSH	MC	Záchranná skupina	22.7.2017	Brušná neefúzna
CT79	Oona	21.9.2016	Himalayan	F	Chovateľ	18.7.2017	Hrudná neefúzna
CT80	Fezzik	17.10.2016	DLH	MC	Túlavá	25.7.2017	Brušná efúzna
CT81	Jewelkat	8.9.2016	Persian	FS	Chovateľ	1.8.2017	Hrudná efúzna
CT82	Tiko	8.4.2016	DSH	MC	Záchranná skupina	6.8.2017	Brušná efúzna

F = samica nekastrovaná; FS = samica kastrovaná; M = samec nekastrovaný; MC = samec kastrovaný; DLH = domáca dlhosrstá; DSH = domáca krátkosrstá; SH = krátkosrstá;

Liečebný režim

Na základe predchádzajúcich experimentov s tkanivovými kultúrami a farmakokinetických štúdií na laboratórnych mačkách bol počiatočný dávkovací režim pre GS-441524 stanovený na 2,0 mg/kg SC q24h. Na základe skúseností s inhibítorom 3CL proteázy GC376 proti prirodzene sa vyskytujúcej FIP bola určená minimálna doba liečby 12 týždňov. Liečba sa predĺžila o jeden alebo viac týždňov u mačiek, ktoré stále mali abnormálne hodnoty sérových bielkovín. V neskorších štádiách štúdie sa dávka zvýšila z 2,0 na 4,0 mg/kg v prípadoch, keď sa liečba musela predĺžiť, alebo keď došlo k relapsu choroby. Majiteľom bola každé 4 týždne zasielaná nová dávka lieku vo forme vopred natiahnutých injekčných striekačiek Luer lock s objemom 1 alebo 3 ml s 1 palcovými ihlami Luer veľkosti 22G (0,7x25mm). Injekčné striekačky sa uložili do chladničky a pred aplikáciou sa zahriali na izbovú teplotu. Injekcie boli aplikované pozdĺž chrbtice od 2 cm za lopatkami do polovice bedrovej oblasti a do polovice vzdialenosti nadol na susedný hrudník a boky.

Monitorovanie počas počiatočného obdobia liečby

V čase vstupu do testovania bola u mačiek vysadená všetka liečba, ktorá nebola nevyhnutná – antibiotiká, kortikosteroidy, interferóny, pentoxifylín, nesteroidné protizápalové lieky, alebo lieky na tlmenie bolesti. Počas pobytu na UC Davis boli mačky každých 12 hodín monitorované z hľadiska teploty, chuti do jedla, aktivity, močenia a defekácie. Krv bola odoberaná v 1–3 denných intervaloch na vyhodnotenie hematokritu, celkového proteínu, bilirubínu, počtu bielych krviniek a diferenciálneho počtu bielych krviniek.

Vzorky ascitu sa odobrali na začiatku a potom sa odoberali v jedno alebo niekoľko denných intervaloch čo najdlhšie, ako to bolo možné, a testovali sa na úrovne prepisov FIPV 7b RNA kvantitatívnou (q) RT-PCR (IDEXX molekulárna diagnostika). Rezy tkaniva fixovaného formalínom od piatich pitvaných mačiek, boli podrobené imunohistochémii na proteín nukleokapsidy FIPV.

Monitorovanie počiatočnej a dlhodobej reakcie na liečbu

Mačky boli prepustené do domáceho ošetrenia, keď bola zaznamenaná významná priaznivá odpoveď na liečbu, zvyčajne do 3–5 dní. Počas tohto obdobia boli majitelia poučení, ako správne podávať subkutánne injekcie, a boli vyzvaní, aby pokračovali v denných záznamoch o telesnej teplote, aktivite, chuti do jedla, defekácii a močení a týždenných meraniach telesnej hmotnosti. CBC a sérový chemický panel boli robené v mesačných intervaloch miestnymi veterinármi alebo počas návštev VMTH. Bolo potrebné zaznamenávať a okamžite hlásiť akékoľvek abnormálne príznaky alebo správanie. Odôvodnená eutanázia bola zvyčajne vykonaná veterinárnym lekárom majiteľa alebo, ak to bolo možné, v UC Davis. Telá boli okamžite ochladené a zapečatené v plastových vreciach, a odoslané do 2 alebo menej dní v kontajneroch chladených ľadom na UC Davis expresnou poštou. Pitvy boli vykonané jedným z autorov (ML) v Anatomic Pathology Service, School of Veterinary Medicine, UC Davis. Bola rešpektovaná žiadosť majiteľa o konečnú dispozíciu tela.

Výsledky

Signalizácia a prezentácia choroby

Do štúdie bolo zaradených 31 mačiek vo veku od 3,4 do 73 mesiacov (priemerne 13,6 mesiacov) (tabuľka 1). Osemnásť mačiek boli domáce krátkosrsté a dlhosrsté , 13 mačiek predstavovalo zástupcov 10 rôznych plemien (tabuľka 1). Domáce mačky boli adoptované z organizácií na záchranu mačiek (n = 13), útulkov (n = 2) alebo to boli túlavé mačky z okolia (n = 3). Štúdia zahŕňala 14 samíc (7 nekastrovaných; 7 kastrovaných) a 17 samcov (1 nekastrovaný; 16 kastrovaných).

Dvadsaťšesť z 31 mačiek malo vlhkú FIP (6 hrudná, 20 brušná). Päť mačiek malo neefúznu FIP; štyri z nich (CT59, CT64, CT73, CT78) s ochorením lokalizovaným do brucha (mezenterické a ileo/cekálne/kolické lymfatické uzliny) a jedna (CT79) do hrudníka (pľúca, hilárne lymfatické uzliny) (tabuľka 1). Štyri ďalšie mačky vykazovali znaky skoršej suchej FIP, ktorá prešla do efúznej formy (CT57, CT65, CT67, CT71) (tabuľka 1). Hrubé príznaky očného ochorenia zodpovedajúce FIP sa potvrdili oftalmoskopickým vyšetrením u troch z 31 mačiek (CT56, CT65, CT71). Dve mačky (CT71, CT80) neochotne alebo už vôbec nedokázali skákať na vyvýšené miesta, čo naznačovalo neurologické postihnutie.

Výsledky liečby

Štyri mačky boli eutanizované (CT62, CT72, CT75) alebo uhynuli (CT56) počas prvých 2–5 dní kvôli závažnému ochoreniu a iným komplikáciám a piata mačka bola eutanizovaná (CT54) po 26 dňoch z dôvodu chýbajúcej reakcie na liečbu (obrázok 1). Liečba prebiehala bez prerušenia, s výnimkou troch mačiek, ktorým bol v 4. (mačka CT80) alebo 8. týždni (mačky CT53, CT71) poskytnutý dvojtýždňový oddych kvôli problémom s podávaním injekcií a kožným reakciám (obrázok 1). Mačka CT53 bola po druhom relapse liečená po dobu 8 a nie 12 týždňov z dôvodu zvýšenia močoviny v krvi a zvýšenia sérových hladín symetrického dimetylarginínu (SDMA).

**Obrázok 1.**
Časová škála liečby a klinický výsledok 31 mačiek, ktoré boli zaradené do klinickej štúdie GS-441524. Obdobie liečby je označené plnou čiarou (dávka 2 mg/kg) alebo prerušovanou čiarou (dávka 4 mg/kg). Hviezdičky označujú bod relapsu. Dátum ukončenia liečby pre mačky, ktoré dosiahli trvalú klinickú remisiu, je uvedený v zátvorkách. Časový bod a príčina smrti sú označené krížikom

Klinická reakcia 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby, bola dramatická. Horúčka zvyčajne ustúpila do 12–36 hodín (obrázok 2), súčasne s každodenným výrazným zvýšovaním chute do jedla, úrovne aktivity a prírastku hmotnosti. Brušné výpotky rýchlo vymizli počas 1-2 týždňov, počnúc asi 10.-14. dňom po zahájení liečby. Mačky s hrudným výpotkom zvyčajne vykazujúce dýchavičnosť, absolvovali u praktickych súkromných veterinárov odsatie pleurálnych výpotkov ešte pred príchodom na UC Davis. Zbytková dýchavičnosť a hrudný výpotok rýchlo reagovali na liečbu a po 7 dňoch už neboli vôbec viditeľné. Žltačka pomaly odznela v priebehu 2–4 týždňov, súčasne s poklesom hyperbilirubinémie. Známky očného ochorenia začali miznúť do 24-48 hodín a prestali byť zjavné navonok i pre oftalmoskopické vyšetrenie do 7–14 dní. V priebehu liečby začalo dochádzať k zmenšovaniu zväčšených mezenterických a ileo/cekálno/kolických lymfatických uzlín. Všetkých 26 mačiek vyzeralo podľa odhadov majiteľov navonok normálne alebo takmer normálne po 2 týždňoch liečby. Po 2 týždňoch liečby sa kládol dôraz na sledovanie niekoľkých parametrov krvných testov. Kľúčové hodnoty zahŕňali hematokrit, celkový počet bielych krviniek, absolútny počet lymfocytov, celkový sérový proteín, sérový globulín, sérový albumín a pomer albumín: globulín (A:G).

**Obrázok 2.**
Priemer (plná čiara) a 1 SD (smerodajná odchýlka) (čiarkovane) telesných teplôt počas prvých 5 dní liečby GS-441524. Normálny teplotný rozsah pre mačky je 37,7–39,1 °C (100–102,5 ° F). Teploty klesli do normálneho rozsahu do 12–36 hodín od začiatku liečby

Osemnásť z 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov neprerušenej primárnej liečby, nevyžadovalo žiadnu ďalšiu liečbu. Osem ďalších mačiek však utrpelo relapsy choroby v priebehu 3–84 dní (priemerne 23 dní) (obrázok 1). Táto skupina zahŕňala tri mačky, u ktorých došlo k dočasnému prerušeniu počiatočnej liečby (CT53, CT71, CT80), a päť mačiek (CT53, CT57, CT60, CT68, CT73), ktoré vyžadovali predĺženú primárnu liečbu (obrázok 1). Relapsy choroby u 2/8 mačiek (CT57, CT71) mali zjavne neurologický charakter s vysokou horúčkou a silnou zadnou ataxiou a nekoordináciou, zatiaľ čo relapsy choroby u zvyšných šiestich mačiek pozostávali hlavne z horúčky, anorexie a znízenej aktivity. Iba jedna mačka (CT60) mala pri relapse zjavný brušný výpotok. Jedna mačka (CT57) bola eutanizovaná 2 týždne po relapse s neurologickými príznakmi, ktoré nereagovali na druhé kolo liečby.

U ôsmich mačiek bolo rozhodnuté zvýšiť dávku GS-441524 z 2,0 na 4,0 mg/kg, buď z dôvodu predĺženia liečby (CT77, CT80), alebo z dôvodu jedného (CT60, CT68, CT71, CT73) alebo dvoch relapsov (CT53, CT63), alebo preto, že relaps mal neurologickú formu (CT71). Všetkých osem mačiek reagovalo pozitívne na režim zvýšeného dávkovania.

Celkovo 25/26 mačiek liečených 12 týždňov alebo dlhšie dosiahlo trvalú remisiu FIP, hoci jedna z nich následne zomrela na nesúvisiaci problém so srdcom (pozri „Pitevné nálezy“). Najdlhšie prežívajúce mačky v čase publikácie (OnlineFirst, február 2019) ukončili liečbu v auguste 2017 a najkratšie v máji 2018, všetky po ukončení pozorovacieho obdobia, v ktorom ešte mohlo dôjsť k relapsu (tj. 84 dní po ukončení liečby). 24 preživších mačiek bude starostlivo monitorovaných pre prípadný návrat príznakov ochorenia a budú sa pravidelne testovať na celkový pomer bielkovín, globulínu, albumínu a A:G počas prvého roka. Menej intenzívne monitorovanie sa bude vykonávať po zvyšok života mačiek. Majitelia boli upozornení, aby sa vyhli zbytočnému namáhaniu mačiek počas prvých 3 mesiacov, aj keď štyri mačky (CT52, CT58, CT65, CT79) a jeden kocúr (CT76) absolvovali bezproblémovú kastráciu.

Ukazovatele priaznivej reakcie na liečbu

Najjednoduchším dlhodobým meradlom účinnosti liečby bola telesná hmotnosť. K nárastu hmotnosti o 20–120% došlo počas a po liečbe, dokonca aj u mačiek, ktoré v čase diagnózy mali 1 rok alebo viac. Zdá, že výrazný rast sa prejavil aj u mladších mačiek, ako to nezávisle zaznamenali ich majitelia. Tieto výrazné zrýchlenia rastu po liečbe naznačili, že FIP bola u mnohých mačiek nejaký čas pred diagnózou subklinická a ovplyvnila ich rast. Pri sledovaní neskorších účinkov liečby a pri pozorovaní možných toxicít liekov sa osvedčili aj CBC (hematológia) a chemický profil (biochémia).

CBCs (Hematológia)

Mačky vykazovali zvýšený počet bielych krviniek, ktorý klesol na normálne hodnoty v priebehu prvých 2 týždňov liečby (obrázok 3a). Lymfopénia zaznamenaná v čase prijatia vymizla počas prvého týždňa liečby (obrázok 3b). Pri prijatí sa pozorovala mierna až stredne závažná anémia, čo sa prejavilo v hematokrite (PCV) (obrázok 4). Hematokrit sa vrátil na normálne hodnoty až po 6–8 týždňoch liečby. Absolútny celkový počet bielych krviniek a lymfocytov boli jedinými významnými hodnotami počas prvého týždňa liečby, zatiaľ čo PCV poskytol presnejší obraz postupu liečby počas prvých 8 týždňov.

**Obrázok 3.**
(a) Priemerný počet bielych krviniek so štandardnou odchýlkou u 26 mačiek, ktoré dokončili primárny liečebný režim 12 alebo viac týždňov. (b) Priemerný absolútny počet lymfocytov v krvi so štandardnou odchýlkou u 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby

**Obrázok 4.**
Hematokrit (PCV) so štandardnou odchýlkou pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby. Bodkovaná čiara naznačuje trend rastu PCV v priebehu času

Zmeny sérových bielkovín

Mačky s FIP často vykazovali vyššiu ako normálnu celkovú koncentráciu bielkovín v sére, vysokú hladinu sérového globulínu, nízku hladinu sérového albumínu a nízky pomer A:G (obrázky 5–7). Abnormálne hodnoty sérových bielkovín sa progresívne zlepšovali a dosiahli normálne hodnoty po 8–10 týždňoch liečby (obrázky 5–7). Hladina celkového proteínu bola najmenej informatívna, čo naznačuje nízka hodnota R2 (0,1883) trendovej spojnice (obrázok 5). Avšak 3 týždne po zahájení liečby došlo k dramatickému a prechodnému zvýšeniu celkových hladín proteínov (obrázok 5). Tento jav súvisel so zvýšením sérových globulínov (obrázok 6a) v čase rýchleho ústupu brušných výpotkov.

**Obrázok 5.**
Priemerné hladiny celkového proteínu v sére a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby

**Obrázok 6.**
(a) Priemerné hladiny sérového globulínu a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby. (b) Priemerné hladiny sérového albumínu a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby

**Obrázok 7.**
Priemerné pomery albumínu:globulínu (A/G) a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby

Plazmatické hladiny globulínu stúpali počas prvých 3 týždňov liečby, dosiahli vrchol a potom pomaly klesali na maximálnu referenčnú hodnotu 4,5 g/dl alebo nižšiu do 9. týždňa (obrázok 6a). Aj keď sa zdá, že hladiny globulínu v priebehu času reflektovali stav liečby, nízka hodnota R2 (0,3621) ukázala, že sa jedná o menej spoľahlivý ukazovateľ pokroku v liečbe.

Hladiny albumínu v sére 26 mačiek liečených najmenej 12 týždňov boli v čase zahájenia liečby zvyčajne nízke (⩽3,2 g/dl) (obrázok 6b). Hladiny albumínu sa potom pomaly zvyšovali a dosiahli normálnu úroveň po 8 týždňoch. Trendová čiara tohto nárastu albumínu mala vysokú hodnotu R2 (0,79), vďaka čomu boli hladiny sérového albumínu, ako aj PCV, dobrým indikátorom pokroku v liečbe. Ako sa očakávalo, pomer A:G vykazoval v priebehu času rovnako silnú trendovú líniu a okolo 8. týždňa liečby úroveň presiahla hodnotu 0,70 (obrázok 7).

Pokles hladiny vírusovej RNA v bunkách z ascitickej tekutiny v spojitosti s liečbou

Počas prvých 2–9 dní antivírusovej liečby sa odoberali od ôsmich mačiek sekvenčné vzorky ascitu a testovali sa na hladiny vírusovej RNA pomocou qRT-PCR (tabuľka 2). Najspoľahlivejším zdrojom FIPV RNA boli celé výpotky alebo ich bunkové frakcie. U 7/8 mačiek hladiny vírusovej RNA poklesli do 2-5 dní, často na nedetekovateľné hodnoty. U jednej mačky (CT54) sa neprejavil významný pokles hladín vírusovej RNA ani v priebehu 9 dní.

Tabuľka 2
Úrovne prepisov RNA vírusu mačacej infekčnej peritonitídy 7b v celých ascitoch alebo v bunkovej frakcii ascitickej tekutiny počas počiatočnej liečby GS-441524

ID vzorky	Dni liečby	Typ vzorky	Kópie vírusovej RNA/ml
CT52	0	Ascites	9.44 × 10⁴
	3	Ascites	Nezistiteľné
CT54	0	Ascites	8.49 × 10⁵
	2	Ascites	6.97 × 10⁴
	4	Ascites	2.44 × 10³
	7	Ascites	2.07 × 10³
	9	Ascites	6.46 × 10⁴
CT62	0	Ascites	5.96 × 10³
	2	Ascites	1.53 × 10³
	8	Ascites	Nezistiteľné
CT74	0	Bunky	6.51 × 10⁶
	2	Bunky	3.39 × 10⁵
CT75	0	Bunky	9.08 × 10⁶
	3	Bunky	4.75 × 10⁵
	4	Bunky	2.50 × 10⁵
CT77	0	Ascites	5.47 × 10⁴
	2	Ascites	3.93 × 10³
CT80	0	Ascites	4.10 × 10³
	2	Ascites	Nezistiteľné
CT82	0	Ascites	1.13 × 10⁴
	5	Ascites	Nezistiteľné

Vedľajšie účinky pozorované počas liečby a po liečbe

Ohraničené reakcie v mieste vpichu. Boli pozorované dva typy reakcií v mieste vpichu, a či boli spôsobené liekom, riedidlom alebo obomi, nebolo zistené. Okamžité reakcie na bolesť sa prejavovali vokalizáciou, občasným vrčaním a posturálnymi zmenami trvajúcimi 30–60 s. Tieto počiatočné reakcie sa časom zmierňovali, pretože majitelia sa stávali viac zručnými v podávaní injekcií a mačky sa tejto rutine postupne prispôsobovali. U šestnástich z 26 liečených mačiek sa prejavili reakcie v mieste vpichu (tabuľka 3). Reakcie boli zjavné najčastejšie počas prvých 4 týždňov a progredovali do otvorených rán iba u 7/16 mačiek. Ulcerácie sa zahojili do 2 týždňov zastrihnutím okolitých chlpov a jemným vyčistením rany vatovým tampónom namočeným v jednom diele peroxidu vodíka pre domácnosť a v dvoch dieloch vody dvakrát denne. Iba tri mačky mali znateľné jazvy v miestach vpichu.

Tabuľka 3
Reakcie v mieste vpichu u 16 z 26 mačiek liečených GS-441524 po dobu 12 týždňov alebo dlhšie

ID mačky	Povrchové lézie	Otvorené rany	Jazvy
CT53	3	1	0
CT58	1	0	0
CT60	0	0	2
CT61	5	0	0
CT63	2	2	0
CT64	1	0	1
CT65	9	1	1
CT66	3	2	0
CT68	4	0	0
CT71	5	1	0
CT73	7	1	0
CT74	3	1	0
CT76	10	0	0
CT78	7	0	0
CT79	2	0	0
CT82	2	0	0

Väčšina lézií bola povrchová a zahŕňala epidermis a nevyžadovala žiadnu liečbu, zatiaľ čo u niektorých došlo k progresii do otvorených rán, ktoré sa uzdravili do 2 týždňov topickou liečbou. Niektoré reakcie zanechali malé trvalé jazvy

Systémové liekové reakcie. Liečba GS-441524 v celkovom období 12–30 týždňov bola pozoruhodne bezpečná. V hodnotách CBC neboli pozorované žiadne dlhodobé abnormality (obrázky 3 a 4). Testy funkcie pečene a obličiek a hladiny amylázy/lipázy zostali počas liečby a po liečbe normálne (doplňujúce obrázky S1 – S3). Jedinou výnimkou bola mačka CT53, u ktorej došlo k progresívnemu zvýšeniu močoviny v krvi (BUN) na 35 mg/dl (referenčný interval [RI] 16–37 µg/dl) a k náhlemu zvýšeniu SDMA (20 µg/dl) (RI 0-14 µg/dl) po 8 týždňoch v treťom kole liečby v režime zvýšenej dávky 4 mg/kg. Aj keď mali tieto príznaky stále miernu povahu, bolo pre istotu rozhodnuté ukončiť liečbu. Tieto abnormality pri testovaní o 1 mesiac neskôr už neboli prítomné a mačka je momentálne v remisii choroby.

Pitevné nálezy

Štyri mačky (CT56, CT62, CT72, CT75) boli eutanizované alebo uhynuli do 2–5 dní od zaradenia do štúdie a pitvy boli vykonané u všetkých okrem mačky CT75. Piata mačka (mačka CT54) bola eutanizovaná po 26 dňoch liečby. Všetkých päť týchto mačiek malo závažné brušné efúzne ochorenie. U mačky CT54 a CT56 sa pri pitve našli dôkazy o rozšírenej pyogranulomatóznej vaskulitíde zahŕňajúcej brušné vnútornosti, centrálny nervový systém a oči. U mačky CT56 došlo aj kompromitácii ileálnej steny v oblasti hustého infiltrátu a sekundárnej bakteriálnej sepse. Mačka CT72 mala ťažkú pyogranulomatóznu vaskulitídu obmedzenú na brucho so stredne ťažkým až ťažkým periférnym edémom a mineralizáciou kôry nadobličiek. Mačka CT62 trpela ťažkou pyogranulomatóznou a fibrinosuppuratívnou peritonitídou, ktorú komplikovala akútna perforácia žalúdka spojená s rastlinným materiálom a intralezionálnymi baktériami svedčiacimi o sepse. Mačka CT75 vykazovala chronickú formu FIP charakterizovanú silným spomalením rastu, masívne nízkym obsahom bielkovín / nízkym obsahom buniek vo výpotku, zrýchlenou činnosťou srdca svedčiacou o poškodení srdcovej funkcie a stredne závažným periférnym edémom. Echokardiogram ukázal bilaterálne zväčšenie predsiení, ale nijaký náznak primárneho srdcového ochorenia. Zdalo sa, že mačka reagovala na GS-441524 a bola prepustená. Mačka upadla o 2 dni neskôr do šoku a bola eutanizovaná bez pitvy.

V čase pitvy mačiek CT56, CT72 a CT75 pri použití qRT-PCR nebol vírus FIPV detekovaný, hoci vzorky ascitu pred liečbou boli pozitívne. Ascites z mačky CT54 vykazoval pozitívny výsledok qRT-PCR počas celej liečby (tabuľka 2) a tkanivá boli v čase pitvy stále imunohistochemicky pozitívne.

Po úspešnom absolvovaní jedného alebo viacerých kôl liečby boli eutanizované aj ďalšie dve mačky. Mačka CT57 bola po jednom kole liečby normálna, ale o 2 týždne neskôr došlo k relapsu so závažnými neurologickými príznakmi. Mačka nereagovala na opakovanú liečbu a bola usmrtená. Lézie typické pre FIP sa našli v mozgu a bruchu, ale boli negatívne na FIPV určený imunohistochémiou pre nukleokapsidový proteín alebo na 7b RNA pomocou qRT-PCR. Mačka CT80 bola úspešne liečená na efúznu brušnú FIP, ale o 4 týždne neskôr sa u nej objavili silné bolesti zadných nôh a krížov. Zistilo sa, že mačka mala výrazné zhrubnutie steny ľavej komory a septa, ktoré spôsobilo vážne zúženie komory (obrázok 8). Mikroskopický vzhľad steny ľavej srdcovej komory bol typický pre vrodenú mačaciu hypertrofickú kardiomyopatiu (HCM). V brušnej dutine, na hrudníku, v očiach, v mozgu alebo v chrbtici sa nezistili žiadne hrubé ani mikroskopické lézie FIP a qRT-PCR nedetekoval FIPV antigén a ani RNA FIPV.

**Obrázok 8.**
Prierez srdcom mačky CT80 vykazujúci extrémnu hypertrofiu steny ľavej komory a septa a extrémne zúženie komory

Diskusia

GS-441524 je za posledné 2-3 roky po GC376 druhým testovaným cieleným antivírusovým liekom pre liečbu FIP. Tieto dva lieky inhibujú vírusovú replikáciu dvoma veľmi odlišnými spôsobmi, buď ukončením vírusovej RNA transkripcie alebo blokovaním štiepenia vírusového polyproteínu. Oba procesy sú dobre známym cieľom pre liečbu niektorých ľudských vírusových ochorení. Kľúčovou otázkou je porovnanie liečby nukleozidovým analógom s liečbou inhibítorom vírusovej proteázy. Tieto dva lieky poskytli prakticky identické výsledky v štúdiách na tkanivových kultúrach a experimentálne infikovaných mačkách. Účinnosť proti prirodzene sa vyskytujúcej FIP sa však javila pri GS-441524 vyššia ako pri GC376. Šesť z 20 mačiek liečených GC376 zostáva dodnes v remisii (Pedersen NC, nepublikované údaje, 2018) v porovnaní s 25/31 mačkami liečenými GS-441524. Ochorenia, ktoré nereagovali na opakovanú liečbu, sa vyskytli u 14/20 mačiek s GC376 ale iba u jednej mačky liečenej GS-441524. 8 zo 14 relapsov spojených s GC376 malo neurologický charakter, v porovnaní s 2/8 relapsmi s GS-441524. Jeden z dvoch neurologických relapsov u mačiek liečených GS-441524 reagoval na opakovanú liečbu vyššou dávkou, zatiaľ čo neurologické relapsy s GC376, dokonca ani pri zvýšenej dávke, už neboli liečiteľné. Obidve liečby spôsobovali podobné reakcie v mieste vpichu. Obidva lieky sa javia ako pomerne bezpečné, hoci GC376 interferoval s vývojom trvalých zubov, keď sa podával mladším mačiatkam.

Aj keď sa zdá, že výsledky klinickej štúdie uprednostňujú GS-441524, niektoré rozdiely mohli byť ovplyvnené tým, ako boli tieto dva lieky podávané. Účinnosť GC376 sa mohla zlepšiť, ak by bolo všetkých 20 mačiek liečených bez prerušenia po dobu 12 týždňov, namiesto toho, aby boli liečené progresívne dlhšími obdobiami, začínajúcimi iba na 2 týždňoch. Päť zo šiestich mačiek vyliečených pomocou GC376 patrilo medzi sedem mačiek, ktoré boli liečené nepretržite po dobu 12 týždňov, zatiaľ čo bola vyliečená iba jedna z 13 mačiek liečených jedenkrát alebo viackrát po kratšiu dobu. Tieto kratšie doby trvania liečby boli nevyhnutné na stanovenie 12-týždňového obdobia použitého pre všetky mačky v tejto štúdii. Klinická štúdia GC376 okrem toho zahŕňala menej mačiek a bola limitovaná obmedzeným prísunom lieku, čo sťažilo testovanie ďalších dávkovacích režimov. Preto by sa mal GC376 pred akýmkoľvek konečným porovnaním ďalej študovať s použitím minimálne 12 týždňov s vyššou dávkou a väčším počtom mačiek. Bolo by tiež dôležité niekedy v budúcnosti vyhodnotiť obidva typy liekov v kombinácii, tak ako sa to robí pri HIV/AIDS a hepatitíde C.

V každej štúdii tohto typu treba počítať s predčasnými úmrtiami, ale ako by sa mali posudzovať pri analýze účinnosti? Päť predčasných úmrtí v tejto štúdii bolo zahrnutých do analýzy účinnosti GS-441524, ale boli vyradené v štúdii GC376. Pre zahrnutie úmrtí do štúdie je dôležité zistenie statusu vírusu v čase smrti. Vírusová RNA sa nezistila u troch pitvaných mačiek, ktoré uhynuli po 2–5 dňoch liečby s GS-441524, čo naznačuje, že liek bol účinný, ale choroba bola v príliš pokročilom štádiu. Nebolo to tak v prípade štvrtej pitvanej mačky, ktorá prežila 26 dní; hladiny vírusovej RNA počas celého obdobia liečby neklesli a príznaky choroby sa nezmiernili. Preto je možné, že táto mačka uhynula v dôsledku neúspešného zastavenia replikácie vírusu. Rezistencia na GS-5734 (Remdesivir), proliečivo GS-441524, bola spojená s mutáciami aminokyselín v RNA polymeráze a korekčnou exonukleázou v tkanivovými kultúrami propagovaných koronavírusoch. Či sa u tejto mačky vyskytla podobná rezistencia, bude ešte treba zistiť. Rezistencia na lieky bola pozorovaná u aj u jednej mačky v teste GC376. Našťastie žiadna z ďalších mačiek v súčasnej štúdii nevykazovala príznaky rezistencie na lieky. U budúcich mačiek, ktoré nereagujú vôbec alebo reagujú nedostatočne na primárnu alebo sekundárnu liečbu, je však potrebné túto možnosť vziať do úvahy.

Počiatočná dávka GS-441524 použitá v predloženej štúdii bola stanovená na základe predchádzajúcich farmakokinetických a experimentálnych infekčných štúdií s laboratórnymi mačkami. Tieto štúdie naznačili, že 2,0 a 5,0 mg/kg SC q24h po dobu 14 dní by boli rovnako účinné aj pri klinickej štúdii. Preto bola pre klinické testovanie zvolená dávka 2,0 mg/kg, pretože by to znížilo spotrebu lieku o 60%. Aj keď bolo toto rozhodnutie potvrdené u 18/26 mačiek, osem ďalších mačiek buď utrpelo relapsy choroby (dve dokonca dvarát), alebo si vyžiadali dlhšie trvanie liečby, aby sa kľúčové hodnoty krvi dostali späť do normálu. Preto bolo urobené rozhodnutie zvýšiť dávku GS-441524 z 2,0 mg/kg na 4,0 mg kg SC q24h u mačiek, u ktorých došlo k relapsu alebo vyžadovali predĺženú liečbu. Úspešnosť 4,0 mg/kg SC q24h u najmenej 12 takýchto mačiek, ako aj u jednej mačky s neurologickým ochorením, nás priviedla k záveru, že ide o účinnejšie dávkovanie a malo by sa stať základom pre budúcu liečbu.

Bolo dôležité sledovať jednoduché biologické ukazovatele pokroku v priebehu ⩾ 12 týždňovej liečby. Ako užitočné markery boli identifikované hladiny HCT (PCV), hladiny celkového proteínu v sére, globulínu a albumínu a pomer A:G. Na základe týchto parametrov sa ukázalo, že mačky sa po 6–10 týždňoch liečby ešte celkom nezotavili. Toto zistenie potvrdilo minimálne 12-týždňové trvanie liečby stanovené v predchádzajúcej klinickej štúdii GC376. Chronická anémia (anémia zápalu) postihuje 18–95% ľudí s akútnymi a chronickými infekciami a je normocytová/normochromická a nesúvisí s nedostatkom železa. Dobrým ukazovateľom aktivity ochorenia boli aj plazmatické hladiny albumínu, a je známe, že nízky albumín a nízky HCT (PCV) korešpondujú s výskytom chronického ochorenia. Hyperglobulinémia u mačiek s FIP bola klasifikovaná ako infekčná/zápalová a je spôsobená zvýšením vo všetkých triedach gama globulínov a variabilnými prírastkami vo frakcii alfa-2 globulínov. Výrazná tendencia mačiek s FIP k vysokej sérovej hladine globulínu a nízkej hladine albumínu robí z pomeru A:G obzvlášť dobrý indikátor aktivity ochorenia.

Očakávalo sa, že čistokrvné mačky nebudú rovnako dobre reagovať na liečbu z dôvodu geneticky oslabenej schopnosti imunologicky reagovať na FIPV, a že mladšie mačky s vlhkou FIP budú na liečbu reagovať najlepšie. V tejto štúdii však nakoniec čistokrvné mačky reagovali rovnako dobre ako obyčajné mačky, a plemená zastúpené mačkami v štúdii odrážali najpopulárnejšie súčasné plemená. Staršie mačky a mačky s čistou neefúznou FIP reagovali na liečbu GS-441524 rovnako dobre, ako mladé mačky a mačky s vlhkou FIP. Za predpokladu, že sa dá pomocou GS-441524 liečiť aj časť mačiek s očným a neurologickým ochorením, sa dá povedať, že by sa už žiadne prejavy FIP nemuseli považovať za neliečiteľné.

Bezpečnostný profil GS-441524 bol pôsobivý. Na základe CBC a sérových chemických hodnôt počas celkových liečebných období v trvaní od 12 do 30 týždňov sa až na jednu možnú výnimku nepozorovali žiadne významné systémové príznaky toxicity. Jedna mačka (CT53) mala mierny nárast BUN a SDMA v 8. týždni tretieho kola liečby a v rámci preventívnych opatrení si vynútila pozastavenie liečby. Na základe predchádzajúcich skúseností s GC376 boli obavy z účinku GS-441524 na vývoj trvalého chrupu. Tri mačky (CT52, CT74, CT77) v tejto štúdii boli vo veku 4 mesiacov alebo mladšie a stále mali juvenilný chrup a žiadna z nich nevykazovala žiadne následné zubnej abnormality. U GS-441524 sa pozorovali reakcie v mieste vpichu, ale ich počet bol pozoruhodne nízky a boli ľahko liečiteľné. Nezistilo sa, či je na vine liek, riedidlo alebo oboje. pH riedidla 1,5 bolo hlboko pod minimálnou hraničnou hodnotou 4,5 stanovenou FDA (Food and Drug Administration), avšak liečivá tohto typu sa ťažko rozpúštajú a stabilizujú pri fyziologicky priaznivejšom pH. Napriek tomu by sa malo vyhodnotiť viac fyziologických riedidiel.

Jedna mačka v štúdii (CT80) mala znepokojivé klinické príznaky. Aj keď mačka vykazovala efúznu brušnú FIP, mala aj dlhodobé príznaky nejasného zakrivenia zadnej končatiny, bolesti krížov, pravidelných epizód padania, neochoty skákať na vyššie miesta a nevysvetliteľných a prechodných zmien správania. Tieto príznaky viedli k liečbe mačky ešte dlho po zmiznutí brušného výpotku. Nakoniec sa prijalo rozhodnutie liečbu prerušiť a zistiť, či sa vrátia charakteristické príznaky FIP. Mačka bola nakoniec eutanizovaná a pri pitve bolo zistené, že má vrodený typ HCM a žiadne zvyškové lézie FIP alebo vírusovej RNA v akýchkoľvek tkanivách. Dilatačná kardiomyopatia bola hlásená u 17,6% ľudí infikovaných HIV pri chronickej antiretrovírusovej liečbe. Dospelo sa však k záveru, že príčinou srdcového ochorenia u tejto mačky nebol GS441524. Ochorenie srdca u tejto mačky bolo hypertrofické na rozdiel od dilatačnej formy pozorovanej u pacientov s HIV, a navyše je HCM u útulkových mačiek pomerne bežná.

Závery

Výsledky získané od 31 mačiek liečených GS-441524 prekonali všetky očakávania a naznačujú, že FIP, bez ohľadu na signalizáciu alebo formu ochorenia, je s použitím nukleozidových analógov liečiteľné ochorenie. Koncepcia štúdie a parametre liečby vyplývajúce z tohto obmedzeného klinického testovania budú dôležité pre ďalšie úsilie v komercializácii tohto alebo podobných liekov proti FIP.

Doplnkový materiál

Formulár súhlasu majiteľa

*Obrázok S1. Priemerné hladiny pečeňových enzýmov (IU / L) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.*

Obrázok S2. Priemerné hladiny lipázy a amylázy v sére (IU/L) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Obrázok S3. Priemerné hladiny BUN a kreatinínu u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Poďakovania

Ďakujeme pracovníkom Centra pre zdravie spoločenských zvierat za pomoc pri preprave liekov (Lyra Pineda-Nelson a Nancy Bei) a za prezentáciu údajov (Cynthia Echeverria). Sme vďační najmä mnohým majiteľom a 31 mačkám, ktoré sa zúčastnili emotívnej a náročnej cesty, ktorá predčila všetky očakávania. Sme vďační aj praktickým súkromným veterinárom, ktorí pomáhali s pravidelnými krvnými testami a boli tu pre nás a ich pacientov/majiteľov, keď to bolo potrebné.

Poznámky

Prijaté: 28. decembra 2018

Doplnkový materiál: K dispozícii sú nasledujúce súbory: Formulár súhlasu klienta.

Obrázok S1: Priemerné hladiny pečeňových enzýmov (IU / l) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Obrázok S2: Priemerné hladiny lipázy a amylázy v sére (IU / l) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Obrázok S3: Priemerné hladiny urey a kreatinínu v krvi u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Konflikt záujmov: MP a EM sú zamestnancami spoločnosti Gilead Sciences, Foster City, CA, USA a majú v spoločnosti podiely.

Finančné prostriedky: Finančnú podporu pre túto štúdiu poskytli Centrum pre spoločenské zdravie zvierat UC Davis, Fond Philipa Raskina v Kansas City a početní darcovia organizácii SOCK FIP podľa pokynov pani Carol Horace. GS-441524 použitý v tomto pokuse bol poskytnutý spoločnosťou Gilead Sciences, Foster City, CA.

Literatúra

1.	De Clercq, E, Li, G. Approved antiviral drugs over the past 50 years. Clin Microbiol Rev 2016; 29: 695–747. Google Scholar \| Crossref \| Medline
2.	Hartmann, K. Efficacy of antiviral chemotherapy for retrovirus-infected cats: what does the current literature tell us? J Feline Med Surg 2015; 17: 925–939. Google Scholar \| SAGE Journals \| ISI
3.	Thomasy, SM, Shull, O, Outerbridge, CA. Oral administration of famciclovir for treatment of spontaneous ocular, respiratory, or dermatologic disease attributed to feline herpesvirus type 1: 59 cases (2006–2013). J Am Vet Med Assoc 2016; 249: 526–538. Google Scholar \| Crossref \| Medline
4.	Pedersen, NC, Elliott, JB, Glasgow, A. An isolated epizootic of hemorrhagic-like fever in cats caused by a novel and highly virulent strain of feline calicivirus. Vet Microbiol 2000; 73: 281–300. Google Scholar \| Crossref \| Medline \| ISI
5.	Kim, Y, Shivanna, V, Narayanan, S. Broad-spectrum inhibitors against 3C-like proteases of feline coronaviruses and feline caliciviruses. J Virol 2015; 89: 4942–4950. Google Scholar \| Crossref \| Medline
6.	Pedersen, NC, Kim, Y, Liu, H. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2018; 20: 378–392. Google Scholar \| SAGE Journals \| ISI
7.	Pesteanu-Somogyi, LD, Radzai, C, Pressler, BM. Prevalence of feline infectious peritonitis in specific cat breeds. J Feline Med Surg 2006; 8: 1–5. Google Scholar \| SAGE Journals \| ISI
8.	Riemer, F, Kuehner, KA, Ritz, S. Clinical and laboratory features of cats with feline infectious peritonitis – a retrospective study of 231 confirmed cases (2000–2010). J Feline Med Surg 2016; 18: 348–356. Google Scholar \| SAGE Journals \| ISI
9.	Rohrbach, BW, Legendre, AM, Baldwin, CA. Epidemiology of feline infectious peritonitis among cats examined at veterinary medical teaching hospitals. J Am Vet Med Assoc 2001; 218: 1111–1115. Google Scholar \| Crossref \| Medline \| ISI
10.	Warren, TK, Jordan, R, Lo, MK. Therapeutic efficacy of the small molecule GS-5734 against Ebola virus in rhesus monkeys. Nature 2016; 531: 381–385. Google Scholar \| Crossref \| Medline \| ISI
11.	Sheahan, TP, Sims, AC, Graham, RL. Broad-spectrum antiviral GS-5734 inhibits both epidemic and zoonotic coronaviruses. Sci Transl Med 2017; 9. DOI: 10.1126/scitranslmed.aal3653. Google Scholar \| Crossref
12.	Murphy, BG, Perron, M, Murakami, E. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol 2018; 219: 226–233. Google Scholar \| Crossref \| Medline
13.	Takano, T, Endoh, M, Fukatsu, H. The cholesterol transport inhibitor U18666A inhibits type I feline coronavirus infection. Antiviral Res 2017; 145: 96–102. Google Scholar \| Crossref \| Medline
14.	Takano, T, Nakano, K, Doki, T. Differential effects of viroporin inhibitors against feline infectious peritonitis virus serotypes I and II. Arch Virol 2015; 160: 1163–1170. Google Scholar \| Crossref \| Medline
15.	Kim, Y, Liu, H, Galasiti Kankanamalage, AC. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad- spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog 2016; 12: DOI: 10.1371/journal.ppat.1005531. Google Scholar \| Crossref
16.	Gut, M, Leutenegger, CM, Huder, JB. One-tube fluorogenic reverse transcription-polymerase chain reaction for the quantitation of feline coronaviruses. J Virol Methods 1999; 77: 37–46. Google Scholar \| Crossref \| Medline \| ISI
17.	Agostini, ML, Andres, EL, Sims, AC. Coronavirus susceptibility to the antiviral remdesivir (GS-5734) is mediated by the viral polymerase and the proofreading exoribonuclease. MBio 2018; 9. DOI: 10.1128/mBio.00221-18. Google Scholar
18.	Weiss, G, Goodnough, LT. Anemia of chronic disease. N Engl J Med 2005; 352: 1011–1023. Google Scholar \| Crossref \| Medline \| ISI
19.	Kurnick, JE, Ward, HP, Pickett, JC. Mechanism of the anemia of chronic disorders: correlation of hematocrit value with albumin, vitamin B12, transferrin, and iron stores. Arch Intern Med 1972; 130: 323–326. Google Scholar \| Crossref \| Medline
20.	Taylor, SS, Tappin, SW, Dodkin, SJ. Serum protein electrophoresis in 155 cats. J Feline Med Surg 2010; 12: 643–653. Google Scholar \| SAGE Journals \| ISI
21.	Hirschberger, J, Hartmann, K, Wilhelm, N. Clinical symptoms and diagnosis of feline infectious peritonitis. Tierarztl Prax 1995; 23: 92–99. Google Scholar \| Medline
22.	Pedersen, NC, Liu, H, Gandolfi, B. The influence of age and genetics on natural resistance to experimentally induced feline infectious peritonitis. Vet Immunol Immunopathol 2014; 28: 152–154. Google Scholar
23.	Jain, N, Reddy, DH, Verma, SP. Cardiac abnormalities in HIV-positive patients: results from an observational study in India. J Int Assoc Provid AIDS Care 2014; 13: 40–46. Google Scholar \| SAGE Journals
24.	Payne, JR, Brodbelt, DC, Luis Fuentes, V. Cardiomyopathy prevalence in 780 apparently healthy cats in rehoming centres (the CatScan study). J Vet Cardiol 2015; 17 Suppl 1: S244–S257. Google Scholar \| Crossref \| Medline

7. 2. 202129. 3. 2023

Účinnosť inhibítora 3C-Like proteázy pri liečbe rôznych foriem získanej mačacej infekčnej peritonitídy

Pôvodný článok: Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis
Publikovaný: 13.9.2017, SAGE – Journal of Feline Medicine and Surgery

Niels C Pedersen,¹ Yunjeong Kim,² Hongwei Liu,¹ Anushka C Galasiti Kankanamalage,³ Chrissy Eckstrand,⁴ William C Groutas,³ Michael Bannasch,¹ Juliana M Meadows,⁵ and Kyeong-Ok Chang²

Abstrakt

Cieľ

Bezpečnosť a účinnosť inhibítora 3C-Like proteázy GC376 bola testovaná na skupine klientmi vlastnených mačiek s rôznymi formami infekčnej peritonitídy (FIP).

Metódy

Do klinického testu bolo prijatých 20 mačiek vo veku od 3,3 do 82 mesiacov (priemerne 10,4 mesiaca) s rôznymi formami FIP. Štrnásť mačiek malo vlhkú alebo zmiešanú FIP a šesť mačiek malo suchú FIP. GC376 sa podával subkutánne každých 12 hodín v dávke 15 mg/kg. Mačky s neurologickými príznakmi boli zo štúdie vylúčené.

Výsledky

Devätnásť z 20 mačiek liečených GC376 sa uzdravilo do 2 týždňov od začiatku liečby. Príznaky choroby sa však po 1–7 týždňoch od primárnej liečby vrátili, a relapsy a nové prípady sa nakoniec liečili minimálne 12 týždňov. Relapsy, ktoré prestali reagovať na liečbu, sa vyskytli u 13 z týchto 19 mačiek v priebehu 1-7 týždňov od počiatočnej alebo opakovanej liečby. Závažné neurologické ochorenie sa vyskytlo u 8/13 mačiek, u ktorých zlyhala liečba, a u piatich mačiek sa opakovali brušné lézie. V čase písania tohto článku bolo sedem mačiek v remisii choroby. Päť mačiatok vo veku 3,3–4,4 mesiaca s vlhkou FIP bolo liečených 12 týždňov a po ukončení liečby a v čase písania článku boli v remisii ochorenia 5–14 mesiacov (priemerne 11,2 mesiaca). Šieste mačiatko bolo po 12 týždňoch liečby v remisii 10 týždňov, došlo však k relapsu a dobre reaguje na druhé kolo liečby s GC376. Siedma bola 6,8-ročná mačka s postihnutím mezenterických lymfatických uzlín, ktorej sa podarilo dosiahnuť remisiu po troch relapsoch, ktoré si vyžadovali postupne dlhšie opakované liečby počas 10 mesiacov. Vedľajšie účinky liečby zahŕňali pálenie pri aplikácii injekcie a občasné ložiská subkutánnej fibrózy a vypadávanie chlpov. U mačiek liečených pred 16.-18. týždňom došlo k spomalenému vývoju a abnormálnemu rastu trvalých zubov.

Závery a význam

GC376 sa ukázal byť sľubný pri liečbe mačiek s konkrétnymi formami FIP a otvoril tak dvere k cielenej antivírusovej liečbe.

Úvod

Lieky, ktoré priamo inhibujú replikáciu vírusov, sa stali kľúčovými oporami pri liečbe chronických vírusových infekcií, ako je HIV/AIDS, vírusu hepatitídy C (HCV), vírusu hepatitídy B, herpesvírusu a akútnych infekcií, ako je chrípka. RNA vírusy, ako sú HIV-1 a HCV, obsahujú ideálne ciele pre inhibíciu vírusov, ako sú RNA-závislá RNA polymeráza a proteáza. Proteázy sú obzvlášť dobrým cieľom, pretože sa podieľajú na dozrievaní vírusov (HIV) alebo na produkcii funkčných vírusových proteínov (HCV). Inhibítory proteázy sa tiež používajú v kombinácii s inhibítormi reverznej transkripcie pri celoživotnej liečbe HIV/AIDS. Kombinácie rôznych inhibítorov proteázy sú vysoko účinné pri liečbe infekcie HCV u ľudí. Preto nie je prekvapujúce, že vírusová proteáza by mala byť atraktívny cieľ aj pre výskum infekcií zvierat spôsobených RNA vírusom. Kim a kol. syntetizovali peptidylové zlúčeniny, ktoré sú zamerané na 3C-like (3CLpro) proteázy, a hodnotila ich účinnosť proti mačaciemu koronavírusu (FCoV) a mačaciemu kalicivírusu, ako aj proti dôležitým ľudským RNA vírusom, ktoré kódujú 3CLpro alebo príbuznú 3C proteázu. Identifikovali sériu zlúčenín, ktoré vykazovali silnú inhibičnú aktivitu proti rôznym koronavírusom, vrátane FCoV, s vysokým rozsahom bezpečnosti. Účinnosť ich inhibítorov 3CLpro bola predmetom pokusov u myší infikovaných vírusom hepatitídy A59, myšacím koronavírusom, a zistilo sa, že spôsobujú významné zníženie titrov vírusov a patologických lézií.

V súčasnosti neexistujú komerčne dostupné antivírusové lieky na koronavírusové infekcie u ľudí alebo zvierat a štúdie Kim a kol. dokázali, že inhibícia 3CLpro môže viesť k potlačeniu replikácie koronavírusu in vivo. Ukázali, že niektoré z ich inhibítorov 3CLpro sú vhodné ako terapeutické prostriedky proti týmto dôležitým vírusom u domácich a divokých mačiek. Potvrdila to štúdia s využitím experimentálnej infekcie vírusom mačacej infekčnej peritonitídy u laboratórnych mačiek. Aj keď je experimentálna infekcia FIPV vysoko smrteľná, akonáhle infekcia dosiahla definovateľné štádium, 14–20 dní trvajúca liečba pomocou GC376 viedla k rýchlej remisii ochorenia u šiestich mačiek, ktorá v čase publikácie článku trvala už viac ako 12 mesiacov.

Materiály a metódy

Oficiálne protokoly

Táto štúdia prebiehala podľa protokolu 18731 schváleného Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat a Výborom pre hodnotenie klinických skúšok Komisie pre klinické skúšky veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice na Kalifornskej univerzite v Davise. Tento protokol podrobne popisuje podmienky testovania nového inhibítora proteázy GC376 u mačiek vlastnených klientom. Každý vlastník bol povinný prečítať si podmienky štúdie a vyjadriť s nimi súhlas.

Organizácia klinickej štúdie

Predmetom štúdie bolo vyhodnotenie inhibítora 3CLpro GC376 u skupiny mačiek s prirodzene získanou FIP. Štúdia nezahŕňala skupinu s placebom, pretože, ako poznamenali Miller a Brody, “hlavnou etickou zásadou v placebom kontrolovaných klinických skúškach je, že pokiaľ pre daný stav existuje preukázaná účinná liečba, je testovanie proti placebu neetické“. GC376 sa už preukázal ako vysoko účinný pri liečbe mačiek s experimentálne indukovanou FIP pred touto štúdiou, čím vznikol predpoklad existujúcej účinnej liečby. Placebo kontrolu nahradila skupina s prirodzene prebiehajucou chorobou. Žiadna z 20 liečených mačiek nepreukázala pretrvávajúce priaznivé reakcie na liečbu, ktorú dostali pred liečbou GC376.

Inštitucionálne pravidlá vylúčili použitie mačiek získaných z útulkov alebo podobných zariadení na výskum tohto typu, a vyžadovali, aby všetky mačky boli v legálnom vlastníctve/adoptované, a aby sa s nimi zaobchádzalo s výslovným súhlasom majiteľa. Mačky s klinicky zjavným neurologickým ochorením boli vylúčené. Do štúdie bolo nakoniec zahrnutých 20 mačiek z rôznych oblastí USA, rôzneho veku a s rôznymi formami FIP. Táto relatívne malá skupina mačiek poskytla cenné poznatky o koncepcii pokusu, interakcii a súlade s vlastníkom, sledovaní bezpečnosti a účinnosti, stanovení minimálneho dávkovacieho režimu, hodnotení relapsov choroby počas liečby alebo po nej a stanovení klinických foriem FIP, ktoré sú pre liečbu najvhodnejšie. Tieto informácie, dúfajme, pomôžu pri ďalších testoch potrebných na udeľovanie licencií a prípadnú komercializáciu GC376 a na vykonávanie podobných testov budúcich antivírusových liekov na FIPV a iných chronických vírusových infekcií mačiek.

Popis testovacej skupiny

Do pokusu bolo zapojených 20 mačiek a ich majiteľov a príslušné informácie o každej mačke sú uvedené v tabuľke 1 a o celej pokusnej skupine na obrázku 1. Mačky boli do štúdie zaradené s rôznym stupňom predbežného testovania zo strany veterinárnych lekárov primárnej starostlivosti. Toto testovanie zvyčajne zahŕňalo kompletný krvný obraz (CBC) s celkovým plazmatickým proteínom, globulínom (G), albumínom (A), A:G; chemický profil séra a analýzu výpotkov vrátane celkového proteínu, skutočného alebo odhadovaného počtu buniek a typu zápalových buniek. U malého podielu mačiek sa uskutočnilo ďalšie testovanie, ktoré obsahovalo titre protilátok FIPV, ultrazvuk brušnej alebo hrudnej oblasti, biopsie postihnutého tkaniva a kvantitatívnu PCR v reálnom čase (qRT-PCR) z výpotkov.

Tabuľka 1
Základné údaje, pôvod, hlavné klinické príznaky a hlavné zistenia pri pitve po liečbe inhibítorom proteázy GC376

ID/Meno	Vek (mes.)	Hmotnosť (kg)	Pohlavie	Plemeno	Pôvod	Symptómy	Stav	Pitva
CT01 (Echo)	5.6	1.64	FS	DSH	KR	Peritonitída, zakrpatená	–	B, Int
CT02 (Cate)	6	2.67	FS	DLH	KR	Peritonitída, zakrpatená	–	B, E, Int, L, MLN
CT03 (Pancake)	7.86	3.18	MC	Him	CT	Suchá (Col) až vlhká	+	Int, L, MLN, S, Om, P
CT04 (Kratos)	82	4.8	MC	DSH	KR	Suchá (MLN)		Remisia
CT05 (Scooter)	10	4.25	MC	DSH	KR	Suchá (E, MLN, K)	–	B, E, L, K, MLN
CT07 (Mac)	6.6	2.6	MC	DSH	KR	Suchá (Col)	+	E, Int, L, MLN, S, K, A, Lu
CT08 (Phoebe)	4.2	2.18	FS	DSH	KR	Suchá (E)	–	B, E, K, MLN, S
CT09 (Sammy)	10.5	2.89	MC	DSH	KR	Suchá (MLN, K)	?^*	B^*
CT10 (Bandit)	17.9	4.06	MC	Him	CT	Suchá (Col) až vlhká	+	B, E, Int, L, MLN, K, Om, P, Lu
CT12 (Daisy)	7.5	2.5	FS	DSH	KR	Peritonitída, zakrpatená	–	B, Int, L, S
CT13 (Leo)	7.4	1.97	MC	Sphynx	CT	Suchá (E, K)	+	B, E, Int, L, MLN, S, K
CT14 (Muffin)	8	2.94	FS	DSH	KR	Suchá (Col) až vlhká	+	E, Int, L, MLN, K, Om, P
CT15 (Flora)	4.3	2.39	F	DSH	FC	Peritonitída		Remisia
CT16 (Bean)	4	1.4	FS	DSH	KR	Peritonitída, zakrpatená	+	B,^† E, Int, L, MLN, S, Om, P
CT17 (Peanut)	4.4	2.3	M	DSH	KR	Peritonitída		Remisia
CT18 (Smokey)	4	1.84	MC	DSH	KR	Peritonitída		Remisia
CT20 (Cloud)	3.3	1.55	M	RM	CT	Pleuritída (MLN)		Remisia
CT21 (Phoebe)	4.8	1.92	F	DSH	KR	Peritonitída		Remisia/relaps/opakovaná liečba
CT22 (Pepper)	3.3	1.6	F	Sibírska	CT	Peritonitída	+	B, E, Om, MLN, Lu, Dia
CT23 (Oakely)	3.9	3.1	FS	DSH	KR	Peritonitída		Remisia
Priemer	10.28	2.59
SD	17.22	0.94

FS = samica kastrovaná; F = samica nekastrovaná; DSH = domáca krátkosrstá; KR = záchranené mačiatko; B = mozog; Int = črevo; DLH = domáca dlhosrstá; E = oko; L = pečeň; MLN = mezenterické lymfatické uzliny; Him = himalájsky; Col = hrubé črevo; S = slezina; Om = omentum; P = pobrušnica; MC = kastrovaný samec; M = nekastrovaný samec; K = oblička; A = nadoblička; Lu = pľúca; FC = mačacia kolónia; RM = ragmuffin; Dia = bránica;SD = Štandardná odchýlka; CT = Chovná stanica

*Neuskutočnila sa žiadna pitva, ale boli prítomné terminálne neurologické príznaky
† Ťažký mozgový edém, neboli zaznamenané žiadne typické zápalové lézie

Obrázok 1.
Demografické údaje o mačkách zaradených do štúdie. (a–c) Koláčové grafy sumarizujúce percento pacientov: (a) vek v mesiacoch, (b) plemeno alebo (c) pôvod. (d) Stĺpcový graf zobrazujúci formy mačacej infekčnej peritonitídy (FIP) zaradených pacientov.
M = mesiace; DSH = domáca krátkosrstá; DLH = domáca dlhosrstá; MD = Maryland; OH = Ohio; Tx = Texas; FL = Florida; IL = Illinois; CT = Connecticut; CA = Kalifornia

Mačky s klinickými príznakmi svedčiacimi o neurologickom postihnutí boli zo štúdie vylúčené na základe skorších nepublikovaných experimentálnych štúdií s GC376. Jedna mačka, ktorá dlhodobo prežila predchádzajúcu štúdiu farmakokinetiky a účinnosti GC376, mala recidívu FIP prejavujúcu sa neurologickými príznakmi 6 mesiacov po tom, čo sa javila ako úspešná liečba akútnej infekcie.6 Táto mačka nereagovala na opakovanú procedúru s GC376, ktorá podnietila štúdiu schopnosti lieku preniknúť do mozgu. Úrovne GC376 v mozgu laboratórnych mačiek predstavovali iba 3% plazmatických koncentrácií liečiva.

Potvrdenie ochorenia

Diagnóza FIP bola potvrdená v čase vstupu do štúdie na základe základných údajov, klinickej anamnézy, vyšetrenia výsledkov predchádzajúcich laboratórnych testov, fyzikálneho vyšetrenia a opakovania základných analýz krvi a výpotku. Ručná palpácia brucha bola zvyčajne dostatočná na identifikáciu ascitu, zväčšených mezenterických lymfatických uzlín, zväčšenia slepého čreva a s nimi spojených ileo-cekálno-kolických lymfatických uzlín, tumorov v obličkách a infiltrácie hrubého čreva. Ručná palpácia sa v prípade potreby doplnila ultrazvukom. Oči sa spočiatku vyšetrovali priamym svetlom na akékoľvek abnormality v sietnici, na zrazeniny v prednej komore alebo na zadnej strane rohovky a záblesky v komorovej vode. Prítomnosť očného ochorenia sa potvrdila úplným oftalmoskopickým vyšetrením vykonaným oftalmologickou službou Veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice (VMTH), UC Davis. Prítomnosť FIPV sa ďalej potvrdila pomocou qRT-PCR, buď z brušných alebo hrudných výpotkov odobratých v čase prijatia, alebo v čase pitvy. Sekvenovanie génu FIPV proteázy sa uskutočňovalo na mačkách, u ktorých došlo k relapsu počas liečby, aby sa určilo, či došlo k potenciálnej mutácii spôsobujúcej rezistenciu na liečivo.

Diagnóza FIP sucho-vlhkej (zmiešanej) FIP u troch mačiek (CT03, CT10 a CT14) bola založená na difúznom zväčšení hrubého čreva a anamnéze riedkej stolice, krvi a hlienu v stolici, napínania na defekáciu a stolice malého kalibru pred výskytom brušných efúzií. FIP hrubého čreva bola opísaná ako špecifická variantná forma neefuzívnej FIP. Podozrenie na zmiešanú FIP bolo aj u mačiek CT01, CT02 a CT12 z dôvodu zastavenia rastu, ktorý o mnoho týždňov predchádzal výskyt brušných výpotkov.

Liečebný režim

GC376 bol syntetizovaný vo vysoko čistej forme a pripravený v koncentrácii 53 mg/ml v 10% etanole a 90% polyetylénglykole 400, ako bolo opísané vyššie. GC376 bol podávaný subkutánne (SC) v dávke 15 mg/kg každých 12 hodín SC, pokiaľ nie je uvedené inak. Účinná dávka pre mačky s experimentálne indukovanou FIP bola 10 mg/kg / q12 h SC, ale dávka sa zvýšila na 15 mg/kg potom, čo prvá mačka (CT01) nereagovala na nižšiu dávku 10 mg/kg stanovenú predchádzajúcimi farmakokinetickými štúdiami. Išlo o klinické rozhodnutie založené na reakcii tejto jednej mačky na liečbu.

Monitorovanie odpovede na liečbu
Mačky s FIP boli na základe predbežného testovania a počiatočného vyhodnotenia v čase prezentácie na UC Davis hospitalizované najmenej 5 dní a okamžite začali liečbu. Najmenej dvakrát denne boli podrobne vyšetrené na rektálnu teplotu, pulz, dýchanie, chuť do jedla a aktivitu. Použila sa hrudkujúca podstielka, ktorá umožňovala denné hodnotenie objemu a konzistencie stolice a močenia. Celá krv sa odoberala do EDTA alebo heparínu venepunkciou pred zahájením liečby, v dvojdňových intervaloch počas hospitalizácie, v čase prepustenia a v dvojtýždňových intervaloch počas prvého mesiaca a potom v mesačných alebo väčších intervaloch. Rutinné vyšetrenie krvi v každom časovom bode zahŕňalo minimálne hematokrit, celkový plazmatický proteín, ikterický index, celkový počet bielych krviniek, diferenciálny rozpočet bielych krviniek a absolútny počet neutrofilov, lymfocytov a monocytov a eozinofilov. Kvôli kontrole potenciálnej toxicity liekov sa pravidelne zaznamenávali hodnoty chemického zloženia krvného séra. Vzorky brušných výpotkov sa získavali paracentézou každý druhý deň, pokiaľ sa dali získať, čo bolo zvyčajne prvých 3–7 dní. Mačky s dýchavičnosťou boli vyšetrené hrudnou ultrasonografiou a vzorka tekutín bola získaná ultrazvukom vedenou paracentézou. Výpotky sa skúmali na prítomnosť fibrínových zrazenín, prímes neutrofilov a malých/veľkých mononukleárnych buniek, intenzitu žltého sfarbenia, viskozitu pôsobením vlákien a celkový obsah bielkovín. Bunkové pelety z peritoneálnych alebo hrudných výpotkov boli tiež skúmané pomocou qRT-PCR na hladinu vírusovej RNA, ako už bolo opísané.

Mačky boli vydané svojim majiteľom, keď bola zaznamenaná pozitívna reakcia na liečbu, zvyčajne do 5 dní. Majiteľ (majitelia) boli buď vedúcim veterinárnym lekárom, alebo veterinárnym lekárom primárnej starostlivosti poučení, ako podať liek dvakrát denne subkutánnou injekciou. Miesta vpichu sa menili tak, aby zahŕňali hornú líniu od zátylku po strednú časť chrbta a po stranách hrudníka a bokov. Dbalo sa na to, aby sa zabránilo ukladaniu liečiva do dermis alebo postupne na rovnakom podkožnom mieste. Majitelia boli vyzvaní, aby udržiavali denné záznamy o rektálnej teplote, aktivite, chuti do jedla, defekácii a močení a týždenné až dvojtýždňové telesné hmotnosti. Periodické vzorky krvi pre CBC a chemické hodnoty séra boli odoberané osobnými veterinárnymi lekármi majiteľov a zaslané do komerčných veterinárnych diagnostických laboratórií. Akékoľvek abnormálne príznaky alebo správanie bolo potrebné zaznamenať a okamžite hlásiť. Eutanázia sa v prípade potreby uskutočňovala buď na UC Davis, alebo veterinárnym lekárom primárnej starostlivosti. Telá mačiek usmrtené veterinárnymi lekármi primárnej starostlivosti boli okamžite schladené a odoslané v obaloch s ľadom expresnou poštou do UC Davis na pitvu. Požiadavky majiteľov o zaobchádzanie a konečnú dispozíciu tela boli rešpektované.

Výsledky

Stanovenie dĺžky liečby

Prvých päť mačiek v štúdii bolo spočiatku liečených 2 týždne (CT01, CT02, CT03, CT04 a CT05). U všetkých mačiek bolo pozorované rýchle zlepšenie zdravotného stavu a liečba bola ukončená. Napriek priaznivej počiatočnej odpovedi sa príznaky ochorenia opakovali 1 (CT01, CT05), 2 (CT03, CT04) alebo 7 (CT02) týždňov po ukončení 2-týždňovej liečby (obrázok 2). Mačky boli potom liečené znova, dôvodom bolo postupné predlžovanie primárnej a sekundárnej doby liečby, kým ich FIP ostávala citlivá na GC376 (pozri CT04, CT22, obrázok 2). Nové mačky, ktoré sa dostali do štúdie, sa ďalej liečili 3 (CT07) alebo 4 týždne (CT08, CT16). Mačky CT08 a CT16 spočiatku reagovali, ale ich príznaky choroby sa počas liečby objavili znova. U mačky CT08 sa vyvinula neurologická choroba, zatiaľ čo u mačky CT16 sa opakovane vyskytli brušné lézie (tabuľka 1). Primárne a sekundárne liečebné doby sa potom predĺžili na 9 týždňov (CT07, CT09, CT10, CT14) (obrázok 2). U mačky CT09 sa vyvinuli neurologické príznaky počas 9-týždňovej základnej liečby a nakoniec bola utratená, keď sa príznaky choroby stali závažnými. U mačky CT07 sa vyskytlo neurologické ochorenie 6 týždňov po začiatku druhej liečby. Od tohto bodu boli všetky nové mačky prijaté to štúdie a staršie mačky, ako napríklad CT10, liečené alebo znovu liečené najmenej 12 týždňov. Prínos 12-týždňovej liečby bol najzrejmejší u mačky CT04, ktorá bola predtým liečená už trikrát s kratšou dobou liečby nasledovanou relapsom (obrázok 2). Liečba bola ukončená u mačiek, ktoré nemali klinické ani laboratórne príznaky choroby po 12 týždňoch primárnej ani sekundárnej liečby. Zistilo sa, že minimálna doba liečby by mala byť okolo 12 týždňov. Mačka CT21 bola liečená 17 týždňov z dôvodu oneskoreného zlepšenia počtu celkových bielkovín a bielych krviniek (obrázok 2). U tejto mačky došlo k relapsu pleurálnej FIP o 13 týždňov neskôr a v čase písania tohto článku bola podrobená ďalšej liečbe.

Orázok 2.
Časová škála liečby a klinický výsledok 20 mačiek, ktoré vstúpili do klinickej štúdie s inhibítorom proteázy GC376. Obdobia, počas ktorých boli mačky liečené, sú označené plnými čiarami. Je uvedený dátum posledného dňa liečby pre šesť mačiek, ktoré dosiahli trvalú klinickú remisiu. Mačka 21 bola v čase písania tohto článku ešte v liečbe. Zvyšných 13 mačiek podľahlo neneurologickej FIP alebo neurologickej FIP po ukončení primárnej alebo sekundárnej liečby do 0-7 týždňov

Odpoveď na počiatočnú liečbu a ukazovatele priaznivej reakcie

Počas prvých 1–4 týždňov liečby sa u 19/20 mačiek prejavilo dramatické a progresívne zlepšovanie zdravotného stavu. Výnimkou bola mačka CT16, ktorá reagovala poklesom teploty v konečníku počas prvých 4 dní liečby. Horúčka sa však vrátila a zdravotný stav sa nasledujúcich 23 dní naďalej zhoršoval a mačka bola eutanizovaná. Horúčka (>38,9 °C) u ďalších 19 mačiek zmizla do 24–48 hodín, so súčasným zlepšením chuti do jedla, aktivity, rastu a prírastku hmotnosti. Brušné výpotky boli zvyčajne nezistiteľné do 2 týždňov. Zvyškový hrudný výpotok zostávajúci po počiatočnej terapeutickej drenáži po 3 dňoch u mačky CT20 takmer zmizol. Renálne tumory u mačiek CT02 a CT13 sa tiež rýchlo zmenšili a po 2 týždňoch už neboli hmatateľné. Zväčšené mezenterické lymfatické uzliny sa k normálnej veľkosti vracali pomalšie. Hmatateľné zhrubnutie hrubého čreva a s ním spojené ileo-cekálno-kolické útvary reagovali najpomalšie a u mačky CT03 pretrvávali aj napriek liečbe a návratu k inak normálnemu zdravotnému stavu. Žltačka, častý nález u mladších mačiek s efuzívnou FIP, pomaly ustupovala počas 2 alebo viac týždňov, súčasne so znižovaním hyperbilirubinémie. Príznaky očnej choroby začali miznút do 48 hodín a zmizli do 1 týždňa bez ohľadu na počiatočnú závažnosť (obrázok 3).

Obrázok 3.
Vzhľad očí mačky CT08 pred zahájením liečby (a) a o týždeň neskôr (b). U tejto mačky sa o 3 týždne po začiatku liečby rozvinuli závažné neurologické príznaky.

Prírastok hmotnosti bol jednoduchým a presným kritériom rastu a zlepšenia zdravia. Ako vzťažná hodnota pre tento parameter bola použitá hmotnosť mačky CT04, najstaršej mačky v teste (obrázok 4a). Mačka CT04 vykazovala signifikantný úbytok hmotnosti o 30%. Po každom kole liečby pribrala, krátko pred každým relapsom choroby začala chudnúť a po každej liečbe opäť pribrala. Po 9,3 mesiacoch bez liečby a po liečbe (4,8 kg až 7,19 kg) znovu získala všetku svoju stratenú váhu. Všetky mačiatka s trvalou remisiou počas a po antivírusovej liečbe ustavične priberali na váhe, čo naznačuje, že pri antivírusovej liečbe pokračoval normálny rast (obrázok 4b). Jedna mačka (CT15) a dvaja kocúri (CT17, 20) boli bez komplikácií kastrovaní počas remisie choroby.

Obrázok 4.
Antivírusová liečba a zmeny telesnej hmotnosti. (a) Mačka CT04, 6,8-ročný kastrovaný samec, ktorý mal suchú mačaciu infekčnú peritonitídu (FIP), absolvoval štyri cykly antivírusovej liečby s narastajúcim trvaním, ako je znázornené bodkovanými políčkami. Pred každou recidívou schudol a po následnej liečbe pribral. (b) Prírastky hmotnosti u štyroch mačiatok vo veku 3,5-4,4 mesiaca počas a po antivírusovej liečbe sú znázornené bodkami. Bodkovaný obdĺžnik označuje dĺžku antivírusovej liečby (12 týždňov)

Lymfopénia bola bežným klinickým príznakom mačiek s vlhkou FIP (obrázok 5) a mala tendenciu priamo korelovať so závažnosťou brušného zápalu, čo naznačovala viskozita, prítomnosť fibrínových vlákien, obsah bielkovín, počet buniek a stupeň žltej farby výpotku. Lymfopénia sa zlepšila pri liečbe všetkých mačiek s vlhkou FIP okrem CT16, ale nepomohla predpovedať relapsy choroby, ktoré sa vyskytli potom (obrázok 5a). U mačiek so suchou FIP lymfopénia nebola tak výrazná, a pre hodnotenie odpovede na liečbu nebola užitočná tak, ako iné parametre (obrázok 5b).

Obrázok 5.
Priemer a smerodajná odchýlka (SD) absolútneho počtu lymfocytov u liečených pacientov s (a) vlhkou alebo (b) suchou mačacou infekčnou peritonitídou (FIP). a) Dvanásť mačiek (prázdny krúžok), u ktorých sa prejavil brušný alebo hrudný výpotok, a ktoré boli liečené až 12 týždňov. Trinásta mačka (CT16, plný krúžok) s brušným výpotkom reagovala na liečbu zle. b) Sedem mačiek so suchou alebo vlhkou formou FIP a s následnou liečbou v trvaní 6 týždňov.

Celkové hladiny bielkovín v plazme ako nepriamy indikátor koncentrácie globulínu boli pri vyšetrení často zvýšené, ale hodnoty boli počas prvých 4 týždňov veľmi variabilné a často prechodne stúpali počas resorpcie výpotkov. Mačky, u ktorých nakoniec liečba nebola úspešná, mali tendenciu mať vyššie celkové koncentrácie plazmatických proteínov na začiatku liečby a mali tendenciu udržiavať si vyššie hladiny počas liečby ako mačky, ktoré úspešne dosiahli trvalú remisiu (obrázok 6).

Obrázok 6.
Priemer a SD celkových hladín bielkovín v plazme u 20 mačiek počas obdobia 12 týždňov. Trinásť mačiek utrpelo v rôznych týždňoch liečby (W) smrteľné relapsy a sedem mačiek dosiahlo trvalú remisiu po 12 týždňoch liečby (W-SV)

Zníženie hladiny vírusovej RNA v bunkách z ascitickej tekutiny v spojitosti s liečbou

Sekvenčné vzorky ascitu boli odobraté niekoľkým tým istým mačkám počas prvých 6–25 dní antivírusovej liečby a boli testované na hladiny vírusovej RNA pomocou qRT-PCR. Hladiny FIPV sú často nízke alebo negatívne v krvi mačiek s FIP a najvyššie sú v bunkách z výpotkov. Preto boli najspoľahlivejším zdrojom FIPV RNA bunky z ascitu alebo pleurálneho výpotku. Mačky CT15, CT16 a CT17 mali 955, 1699 a 2937-krát vyššie hladiny vírusovej RNA, v danom poradí, ako CT02, ktoré mali najnižšiu vírusovú záťaž v efúzii pred liečbou (obrázok 7). Hladiny vírusovej RNA sa v priebehu 2 týždňov znížili až 1567463-násobne v porovnaní s hodnotami pred liečbou, s výnimkou mačky CT16 (obrázok 8), ktorá mala druhú najvyššiu hladinu vírusovej RNA pred antivírusovou liečbou medzi 12 mačkami so vzorkami výpotkov dostupnými na testovanie ( Obrázok 7). Absencia rýchleho poklesu hladín vírusovej RNA u mačky CT16 spolu s ťažkou lymfopéniou môže vysvetľovať, prečo nereagovala na liečbu. CT10 tiež mala o niečo pomalší pokles hladiny vírusu a po antivírusovej liečbe dvakrát relapsovala. Je pozoruhodné, že hladiny vírusovej RNA v bunkách ascitu u mačiek CT15, CT17 a CT18 klesali najrýchlejšie a boli tiež medzi piatimi mačkami, u ktorých došlo k trvalej remisii ochorenia. Či príčinou bola vlastnosť jednotlivých izolátov FIPV, alebo forma a závažnosť choroby hostiteľa nebolo zistené.

Obrázok 7.
Relatívne počiatočné hladiny RNA vírusu infekčnej peritonitídy mačiek (FIPV) vo výpotkových vzorkách pacientov pred antivírusovou liečbou. Na vzorkách efúzií pacientov pred zahájením liečby sa uskutočnila kvantitatívna PCR v reálnom čase. Relatívne základné hladiny vírusovej RNA ako násobné rozdiely v porovnaní s úrovňou vírusu pred liečbou CT02, mačka s najnižšími hladinami RNA. Úroveň transkriptov RNA bola vypočítaná pre každého pacienta pomocou metódy ∆Ct s referenčným génom pre beta-aktín

Obrázok 8.
Zníženie RNA vírusu mačacej infekčnej peritonitídy zo sekvenčných vzoriek výpotku počas liečby GC376 u mačiek CT10, CT12, CT15, CT16, CT17, CT18 a CT23. Každý bod označuje násobné zníženie hladiny vírusovej RNA oproti hladine nameranej pred liečbou (deň 0). Hladiny vírusovej RNA sa stanovili pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase metódou ∆Ct a beta-aktín referenčným génom

Zlyhanie liečby v dôsledku recidívy brušnej FIP alebo výskytu neurologického ochorenia

Trinásť z 20 mačiek v teste nakoniec podľahlo recidíve choroby. Jedna mačka (CT16) nevykázala významné zlepšenie a bola eutanizovaná 3 týždne po začiatku 4-týždňového liečebného režimu (obrázky 2 a 8), 8), zatiaľ čo u ostatných 12 došlo k variabilnému obdobiu remisie ochorenia po primárnej alebo sekundárnej liečbe trvajúcej 3–17 týždňov (priemerne 7,8 týždňa) (obrázok 2). Všetky z týchto 13 mačiek okrem jednej (CT09) boli pitvané (tabuľka 1). Osem z týchto mačiek bolo eutanizovaných kvôli závažným neurologickým príznakom a päť z dôvodu recidívy brušnej choroby (obrázok 2). Pri vyšetrení boli sekundárne detekované tri mačky, ktoré podľahli neurologickému ochoreniu (CT05, CT08, CT13) v dôsledku okulárnej FIP (tabuľka 1). Medzi najskoršie príznaky neurologického ochorenia patrili horúčka, ktorá pretrvávala aj napriek pokračujúcej liečbe, apatia, občasné svalové zášklby uší a svalov, neobvyklé pohyby pri prehĺtaní, nutkavé naťahovanie končatín a strata normálnej mentality, ktorá sa prejavila krátkymi epizódami strnulých pohľadov alebo chradnutím. Tieto príznaky pretrvávali pri liečbe niekoľko dní alebo týždňov, ale nakoniec došlo k nekoordinácii a tonickým/klonickým záchvatom. Výskyt a rýchla progresia neurologických príznakov po prerušení liečby boli výraznejšie, ako počas liečby (obrázok 2).

Päť mačiek (CT03, CT07, CT10, CT14 a CT16) malo recidívu typických intraabdominálnych lézií pri absencii neurologických príznakov počas alebo po liečbe (tabuľka 1). U štyroch z nich sa vyskytli ileocekálne útvary (CT03, CT07 a CT14) alebo zväčšená lymfatická uzlina hrubého čreva (CT10), ktorá sa po primárnej liečbe zmenšila (CT03, CT10 a CT14) alebo už nebola hmatateľná (CT07). Avšak CT03 naďalej trpela ťažkou zápchou, napínaním a stolicou podobajúcou sa zubnej paste. Závažnosť obštrukcie hrubého čreva si vyžiadala resekciu hrubého čreva, ktorá zmiernila klinické príznaky, ale nezabránila prípadnému opätovnému výskytu brušných choroby. Všetky tri mačky, u ktorých sa vyskytli silné ileo-cekálno-kolické infiltráty, stále vykazovali dôkazy o tejto forme FIP pri pitve a imunohistochémia preukázala antigén FIPV v makrofágoch v granulomatóznom zápale (obrázok 9).

Obrázok 9.
Rez zo silne zhrubnutej steny resekovaného hrubého čreva z mačky CT03. Imunoperoxidáza (hnedá farba) sfarbená na mačací antigén vírusu infekčnej peritonitídy je pozorovaná v makrofágoch okolo periférie granulomatóznej lézie. K perzistencii vírusu v hrubom čreve došlo počas liečby a ústupu ďalších príznakov ochorenia (napr. efuzívnej peritonitídy)

Pokusy o liečbu neurologickej choroby zvýšením dávky lieku a predĺžením trvania liečby

Pre zmiernenie neurologických príznakov sme sa pokúsili zvýšiť dávku GC376, čím sa zvýšila jeho hladina v krvi a množstvo liečiva, ktoré prešlo cez hematoencefalickú bariéru. Mačka CT01 vykazovala efúznu FIP a bola pôvodne liečená GC376 (10 mg/kg q12h SC po dobu 9 dní). Mačka reagovala dobre, ale v 9. deň sa horúčka sa vrátila a dávka sa zvýšila na 15mg/kg každých 12 hodín po dobu 5 dní. Horúčka zmizla a liečba bola ukončená v deň 14. O 3 dni neskôr sa horúčka vrátila spolu s neurčitými neurologickými príznakmi pozostávajúcimi zo zášklbu svalov, abnormálneho naťahovania končatín a abnormálnych hltacích pohybov. Mačke bola okamžite znovu nasadená dávka 15 mg/kg každých 12h SC a jej stav sa zlepšil, ale krátko potom sa zhoršil s návratom horúčky a rovnakými neurčitými neurologickými príznakmi s miernou nekoordináciou. Dávka sa potom zvýšila na 50 mg/kg každých 12 hodín SC po dobu 14 dní a jej stav sa zlepšil na takmer normálny stav. Liečba bola zastavená, ale okamžite sa vrátili neurologické príznaky. Mačka bola potom liečená ďalšie štyri dni dávkou 50 mg/kg q12 h SC, počas ktorých sa neurologické príznaky opäť zlepšili. Padlo však rozhodnutie ukončiť liečbu úplne. Stav mačky zostal stabilný 1 týždeň a potom sa u nej rozvinula extrémna nekoordinácia, demencia a tonické/klonické záchvaty. Bola vykonaná eutanázia a pitva preukázala lézie iba v mozgu.

Mačka CT12 dobre reagovala na liečbu dávkou 15 mg/kg q12 h SC; rektálna teplota sa vrátila k normálu do 48 hodín a brušný výpotok zmizol do 2 týždňov. Mačka sa po druhom týždni liečby javila ako normálna, potom však mala pretrvávajúcu horúčku 38,9–40°C. Majitelia cítili, že mačka má inak normálnu aktivitu a chuť k jedlu, takže liečba pokračovala v rovnakom dávkovaní. Horúčka však pretrvávala, boli zaznamenané jemné príznaky zmeny správania a mačka nerástla podľa očakávania. Mačka pokračovala v liečbe ďalších 15 týždňov, počas ktorých sa dávka liečiva prechodne dvakrát znižovala (tj. na 10 mg/kg každých 12 hodín a 15 mg/kg každých 24 hodín) počas niekoľkých dní, horúčka sa však zvýšila a zakaždým sa znížila aktivita. Obnovilo sa dávkovanie 15mg/kg každých 12 hodín. Mačka naďalej vykazovala príznaky premenlivej horúčky a nejasné príznaky správania, ale majitelia boli optimistickí, pokiaľ ide o apetít a úroveň aktivity mačky. Liečba mačky bola potom zastavená, pretože ďalšie použitie lieku na tento účel nebolo možné odôvodniť. Stav mačky zostal nezmenený s pretrvávajúcou horúčkou, samotárskym správaním a zastavením rastu ďalších 5 týždňov. V 22. týždni sa objavili závažné neurologické príznaky pozostávajúce z nekoordinácie, demencie a záchvatov a mačka bola eutanizovaná. Makroskopické i mikroskopické lézie boli obmedzené na mozog.

Testovanie na vznik vírusovej rezistencie

O vzniku vírusu rezistentného na liečivo sa uvažovalo u mačky CT03, u ktorej došlo k relapsu s brušnými léziami po počiatočnej priaznivej reakcii na liečbu granulomatóznej kolitídy a zmiešanej FIP. V čase pitvy boli v brušnej dutine stále prítomné granulomatózne lézie a v mozgu sa nenašli žiadne makroskopické ani mikroskopické lézie (tabuľka 1). Preto recidíva ochorenia nesúvisela s neurologickým ochorením a perzistentný antigén FIPV bol identifikovaný v makrofágoch v granulomatóznych léziách. Uskutočnilo sa sekvenčné porovnanie medzi 3CLpro z efúzie pred liečbou a z omenta odobratým pri pitve o 95 dní neskôr. V 3CLpro sa však nenašla žiadna substitúcia aminokyselín, čo naznačuje, že výskyt vírusu rezistentného na liečivá nebol príčinou opakovaného ochorenia mačky.

Porovnávali sa tiež 3CLpro sekvencie vírusovej RNA pred liečbou s tými, ktoré boli získané o 25 dní (CT16), 139 dní (CT02), 149 dní (CT12) a 231 dní (CT10) neskôr v čase pitvy. V tomto období neboli pozorované žiadne rozdiely v 3CLpro. Sekvencie tiež zostali nezmenené u CT02, CT16 a CT12 od času prijatia až po pitvu. Vírusová 3CLpro z pľúc a sleziny mačky CT10, ktorá relapsovala dvakrát počas 8 mesiacov a bola znovu liečená, vykazovala substitúciu Asp-to-Ser v polohe 25 a substitúciu Lys-to-Asp v polohe 260 v porovnaní s vírusom z abdominálnej kvapaliny získanej pred liečbou. Presné účinky týchto mutácií na funkciu proteázy sa v súčasnosti skúmajú. Uvádza sa, že genetická evolúcia kvázi druhov vírusových proteínov nastáva v priebehu času u pacientov chronicky infikovaných RNA vírusom (HCV) a môže viesť k sporadickým zmenám aminokyselín.

Výskyt trvalých klinických remisií

Sedem z 20 mačiek v štúdii liečby GC376, z ktorých všetky absolvovali najmenej 12 týždňov nepretržitej liečby, bolo kategorizovaných ako potenciálne liečebné úspechy na základe viac ako 12 týždňov trvajúcej remisie choroby po ukončení liečby (Obrázok 2). Šesť z týchto mačiatok malo vo veku 3,3–4,4 mesiaca akútnu efúznu brušnú (CT15, CT17, CT18, CT21, CT23) alebo pleurálnu (CT20) formu ochorenia a boli liečené nepretržite 12 alebo 17 (mačka CT21) týždňov (tabuľka 1, obrázok 2). Siedma mačka (CT04), 6,8-ročný krížený kastrovaný kocúr so suchou FIP obmedzenou na mezenterickú lymfatickú uzlinu, tiež dosiahol dlhodobú remisiu, ale až po štyroch cykloch liečby so zvyšujúcim sa trvaním (Tabuľka 1, Obrázok 2).

Šesť z týchto dlhodobo preživších mačiek malo na začiatku liečby abnormality v CBC, hematokrite a celkových proteínoch, ale v čase ukončenia liečby mali úplne normálne hodnoty v krvi. Avšak mačka CT21 mala aj po 12 týždňoch zvýšené hladiny bielkovín v plazme a zvýšený počet bielych krviniek a v liečbe pokračovala ďalších 5 týždňov. Počty plazmatických bielkovín a bielych krviniek sa zlepšili po ďalších 5 týždňoch liečby, stále však neboli v referenčnom rozsahu. Trinásť týždňov po ukončení liečby sa u mačky vyvinul typický FIP výpotok v hrudnej dutine s horúčkou. Tekutina z hrudníka bola odsatá, aby sa zlepšilo dýchanie, a mačka začala s druhým kolom GC376 a v čase písania článku bola afebrilná, aktívna a po 8 týždňoch liečby jedla normálne. Liečba bude trvať 12 týždňov, ak sa znova neobjavia žiadne známky ochorenia.

Vedľajšie účinky pozorované počas liečby a po liečbe

Počas a po liečbe GC376 boli pozorované dva vedľajšie účinky. Liek pri injekčnej aplikácii často spôsoboval štípanie/pálenie. Subkutánne opuchy sa vyskytli, keď sa v rovnakom mieste aplikovalo príliš veľa injekcií, ale tie rýchlo ustúpili. U jednej mačky (CT12) sa približne v 14. týždni 18-týždňového obdobia liečby vyskytla hlboko lokalizovaná ulcerácia medzi lopatkami. Pri pitve však nebol pozorovaný žiadny dôkaz dermálnej FIP a išlo pravdepodobne o reakciu na nepretržité injekcie v rovnakom mieste. Prieskum siedmich dlhodobo preživších mačiek preukázal citeľné ohniskové podkožné zhrubnutie. U jednej mačky sa na röntgenových snímkach objavili štyri zvápenatené hrčky veľkosti hrášku. Tieto hrčky boli chirurgicky odstránené spolu s okolitým fibrotickým tkanivom. Traja ďalší dlhodobo preživší majú 1–3 malé ohniskové oblasti s trvalou stratou chlpov v miestach vpichu, ktoré sú zakryté okolitým srsťou (obrázok 10). Majitelia a ich veterinári boli požiadaní, aby tieto lézie pravidelne kontrolovali kvôli prípadným zmenám, či výskytu nových lézií.

Obrázok 10.
Ohnisková oblasť permanentného vypadávania chlpov spôsobená nechceným ukladaním GC376 do epidermy mačky CT21. Tieto oblasti boli zvyčajne prekryté chlpmi a neboli zvonka viditeľné

Najvýznamnejším vedľajším účinkom spojeným s dlhodobou liečbou bol juvenilný chrup. Normálna tvorba, rast a prerezanie trvalých zubov sa oneskorili u všetkých štyroch liečených mačiatok vo veku 3,3–4,4 mesiaca. Očné zuby, rezáky, štvrtý premolár a molár boli postihnuté najmenej, zatiaľ čo druhý a tretí premolár boli postihnuté najviac (obrázok 11). Dospelé zuby sa javili menšie ako normlingválne a to spolu s oneskoreným prerezaním viedlo buď k ponechaniu mliečnych špičákov, nevypadnutiu mliečnych zubov alebo k čiastočnému prerezaniu abnormálnych trvalých zubov k súčasne ponechaným mliečnym zubom. U žiadneho z dlhodobo preživších neboli pozorované žiadne iné anatomické alebo fyziologické defekty a neboli zaznamenané ani u pitvaných mačiek.

Obázok 11.
Dospelý chrup mačky CT17, ktorá bola liečená 12 týždňov GC376, počnúc vekom 4,4 mesiaca. Je viditeľný ponechaný horný ľavý mliečny špičák. Zdá sa, že horný druhý a tretí premolár sú mliečne. Malé trvalé tretie premoláre sa čiastočne prerezali lingválne k mliečnym tretím horným premolárom. Gingiva obklopujúca ponechaný špičák a premoláre je zapálená. Dospelé špičáky sa javia tiež menšie ako zvyčajne. Zdá sa, že trvalý pravý špičák a štvrtý horný premolár sa prerezali normálne

Pitevné nálezy

Telá 12/13 mačiek, u ktorých liečba nebola úspešná, boli podrobené pitve vrátane hrubého a histologického vyšetrenia a imunohistochémie postihnutých tkanív pre FIPV antigén. Odobrané a vyšetrené tkanivá zahŕňali reprezentatívne rezy všetkých hlavných brušných a hrudných orgánov, mozgu a očí. Hrubé vyšetrenie identifikovalo tri odlišné prezentácie. Päť mačiek nejavilo výrazné známky aktívnej FIP (CT01, CT02, CT05, CT08, C12), tri mali lézie zodpovedajúce neefúznej FIP (CT07, CT10, CT13) a štyri mali efúznu peritonitídu s multiorgánovým postihnutím (CT03, CT14, CT16, CT22). Histológia piatich mačiek, ktoré nevykazovali dostatočné dôkazy o chorobe, preukázala väčšinou mierne mononukleárne infiltráty, zvyčajne perivaskulárny zápal v oku, pečeni, črevnej stene a obličkách. Tri mačky s neefúznou FIP mali mierny až závažný zápal v mnohých orgánoch s najťažšími léziami v oku, mezenterických lymfatických uzlinách, obličkách a pľúcach. Tri mačky s efúznou FIP mali závažný pyogranulomatózny zápal vo viacerých brušných orgánoch vrátane omenta, pobrušnice, črevnej steny, mezenterických lymfatických uzlín, pečene a sleziny.

Závažný zápal typický pre cerebrálnu FIP bol prítomný v mozgu všetkých okrem jednej (CT07) z ôsmich mačiek, ktoré sa podrobili pitve bez výrazných hrubých známok FIP alebo s neefúznou FIP. Jedna mačka bez charakteristických mozgových lézií mala ťažký mozgový edém. Naproti tomu typické FIP lézie chýbali v mozgu všetkých troch pitvaných mačiek s efúznou FIP. Stereotypné FIP lézie mozgu boli charakterizované stredne ťažkou až ťažkou chronickou meningoencefalitídou a ventrikulitídou spojenou s periventrikulárnou nekrózou parenchýmu (obrázok 12a). Štvrtá komora bola postihnutá najťažšie a meningitída bola najčastejšie pozorovaná ventrálne do malého mozgu a mozgového kmeňa. Často sa pozorovali silné perivaskulárne manžety spojené s vaskulitídou. FIP antigén sa demonštroval imunoperoxidázovým zafarbením v mozgu 6/7 prípadov stereotypnej cerebrálnej FIP (obrázok 12b). Tkanivá z 11 pitvaných mačiek, sa testovali na prítomnosť FIPV RNA pomocou qRT-PCR. Všetky vykázali pozitívny výsledok, čím sa stanovila perzistencia vírusu u mačiek, u ktorých liečba nebola úspešná.

Obrázok 12.
Fotomikrografy lézie v mozgu mačky CT08. U tejto mačky sa počas počiatočnej liečby GC376 vyskytlo závažné neurologické ochorenie. (a) Štvrtá komora obsahuje bielkovinovú tekutinu zmiešanú s početnými neutrofilmi a makrofágmi, ktoré multifokálne zasahujú do okolitého zriedeného neuropilu. Veľké manžety lymfocytov a plazmatických buniek obklopujú krvné cievy (*) (farbenie hematoxylínom, zväčšenie 20x). (b) Viaceré bunky pripomínajúce peritoneálne makrofágy (vyznačená malá oblasť na obrázku 12a) vykazujú pozitívnu imunoreaktivitu pre mačací infekčný antigén peritonitídy (kontrastné farbivo hematoxylín, zväčšenie 600x).

Diskusia

Úspech v liečbe GC376 pri experimentálnej infekcii FIPV nás motivoval k preskúmaniu účinnosti GC376 pri prirodzene vyvinutej FIP. Medzi experimentálnou efúznou brušnou FIP a prirodzene sa vyskytujúcou chorobou existujú významné rozdiely. Experimentálna choroba obchádza kritické počiatočné štádium, ktoré začína u mačiatok vystavením neškodnému mačaciemu enterickému koronavírusu (FECV). Prirodzene sa vyskytujúca FIP je výsledkom špecifických mutantov, ktoré vznikajú po infekcii FECV, a FIP sa vyskytuje za prítomnosti imunity voči FECV. Experimentálna FIP je naopak indukovaná u mačiek, ktoré sa nestretli s koronavírusom intraperitoneálnou injekciou veľkej dávky purifikovaného FIPV získaného od laboratórnej mačky. Prirodzene sa vyskytujúca choroba je často subklinická po mnoho týždňov alebo mesiacov pred pozorovaním vonkajších príznakov choroby, zatiaľ čo experimentálne príznaky choroby sa objavia do 2–4 týždňov a rýchlo progredujú. Prirodzene sa vyskytujúca FIP má rôzne klinické formy, zatiaľ čo experimentálna infekcia má takmer vždy abdominálnu efúznu podobu. FIP v prírode je tiež ovplyvnená prostredím chorobu zvyšujúcich kofaktorov, zatiaľ čo experimentálne ochorenie sa vyskytuje u mačiek bez vonkajších vplyvov. Rozdiely môžu vysvetľovať, prečo sa choroba vyvinie len u malej časti mačiek prirodzene vystavených FIPV, zatiaľ čo 80–100% experimentálne infikovaných mačiek zomiera. Naše predpovede sa ukázali ako správne a prirodzene sa vyskytujúca FIP sa liečila oveľa ťažšie ako experimentálna choroba. Je však potrebné zdôrazniť, že tento pokus by nebol schválený bez informácií získaných z farmakokinetických štúdií, štúdií akútnej a chronickej toxicity a účinnosti uskutočňovaných na laboratórnych mačkách.

Bol to prvý pokus o použitie cieleného antivírusového lieku proti systémovému a vysoko smrteľnému veterinárne významnému ochoreniu. Aj keď zatiaľ nie sú k dispozícii žiadne špecifické antivírusové lieky na koronavírusové infekcie u ľudí alebo zvierat, na liečbu boli vyvinuté antivírusové lieky na iné vírusové infekcie ľudí, ako sú HCV a HIV-1, a použitie týchto liekov poskytlo solídny základ pre ich aplikáciu na choroby zvierat, ako je FIP. HCV infikuje hlavne pečeňové bunky a u väčšiny ľudí spôsobuje pretrvávajúcu vírusovú infekciu. Avšak len asi u 20–30% z nich sa rozvinú ochorenia pečene v časovom horizonte 20–30 rokov. Infekciu HCV je možné eliminovať nešpecifickou antivírusovou liečbou (interferón a ribavirín) po dobu 6–12 mesiacov u približne polovice pacientov a nedávnym zavedením priamo pôsobiacich antivírusových liekov v trvaní 3–6 mesiacov sa počas liečby podstatne zvýšila miera vyliečenia na viac ako 90% . HIV infekcia u ľudí vedie k predĺženému asymptomatickému stavu a nakoniec k pokročilému ochoreniu na HIV. HIV-1 infikuje T lymfocyty a makrofágy a prežíva v latentnom stave. Viac ako 30 antiretrovírusových liekov, z ktorých väčšina sa používa v kombinácii dvoch alebo viacerých liekov, sa úspešne použilo na zníženie vírusovej záťaže na nedetegovateľnú hladinu v krvi pacientov s HIV/AIDS. Vírus sa však po prerušení antivírusovej liečby vracia a vyžaduje tak celoživotnú antivírusovú liečbu. Šírenie vírusu do mozgu, ktoré je sprostredkované hlavne vírusom infikovanými makrofágmi, a následný vývoj neurologického ochorenia sa vyskytuje u viac ako 50% infekcií HIV. Neurologické zhoršenie preto stále zostáva dôležitým problémom aj v tejto dobe antivírusovej liečby. Tieto precedensy antivírusovej liečby infekcií HCV a HIV-1 ukazujú, že výsledok liečby (vírusový klírens vs perzistencia vírusu), trvanie liečby (konečná vs kontinuálna) a prítomnosť neurologických následkov sú výrazne ovplyvnené vírusovou patogenézou.

Táto štúdia bola obmedzená na 20 mačiek s FIP, ktoré predstavovali spektrum veku a foriem choroby. Aj keď bol počet liečených mačiek malý, zhromaždilo sa prekvapivé množstvo informácií, napríklad o tom, ako dlho sa má liečiť, o možných vedľajších účinkoch, o tom, ako identifikovať klinickú formu FIP, ktorá bude s najväčšou pravdepodobnosťou reagovať na liečbu, a potenciálnych ukazovateľoch zlyhania liečby a jej úspešnosti. Klinická štúdia bola založená na skúsenostiach získaných z farmakokinetických štúdií a štúdií účinnosti vykonaných na laboratórnych mačkách. Počiatočné obdobie liečby bolo na základe experimentálnych štúdií stanovené na 2 týždne, nakoniec sa však predĺžilo na 12 týždňov a viac na základe skúseností získaných v priebehu testovania. Toto konečné liečebné obdobie sa blížilo k 3–6 mesiacom používaným na liečbu infekcie HCV u ľudí s priamo pôsobiacimi antivírusovými liekmi. Na základe experimentálnych štúdií boli očakávané ťažkosti s liečením neurologických foriem choroby. Vedľajšie účinky boli prijateľné a zahŕňali pálenie pri aplikácii injekcie a dermálny a podkožný zápal, keď sa na rovnaké miesta podalo príliš veľa liečiva. Tento jav bol už predtým pozorovaný aj u laboratórnych mačiek. Závažnejší vedľajší účinok, ktorý sa predtým u laboratórnych mačiek nepozoroval, sa obmedzil na mačiatka a zahŕňal spomalený vývoj dospelých zubov a retenciu alebo oneskorenú stratu mliečnych zubov.

Liečba GC376 bola úspešná v indukcii významnej remisie príznakov ochorenia a regresie lézií u 19/20 mačiek. Tento výsledok potvrdzuje naše zistenia rýchleho zvratu klinických príznakov u laboratórnych mačiek s experimentálnou FIP liečených GC376, a rozšíril naše znalosti o účinkoch lieku na široké spektrum foriem prirodzene sa vyskytujúcej FIP. Mačky pochádzali z rôznych častí USA a dokonca aj z Peru, čo potvrdzuje, že geograficky rozmanité kmene FIPV boli voči tomuto inhibítoru rovnako citlivé. K výraznému zníženiu transkriptov vírusovej RNA vo výpotkoch došlo v priebehu niekoľkých dní liečby spolu s rýchlym zlepšením zdravotného stavu. Remisia ochorenia však pretrvávala 3 mesiace a dlhšie iba u 7/20 týchto mačiek. Neschopnosť dosiahnuť dlhodobú remisiu ochorenia bola nakoniec spojená s výskytom neurologického ochorenia pri absencii rozsiahlych brušných lézií alebo s opakovaním/pretrvávaním rozsiahlych brušných lézií za prítomnosti histologických lézií v mozgu a/alebo v očiach. Tieto objavy naznačujú, že FIPV má väčšiu tendenciu šíriť sa z telesných dutín do mozgu, ako sa pôvodne predpokladalo, najmä ak sa mu poskytne dostatok času. Toto rozšírenie s najväčšou pravdepodobnosťou zahŕňa infikované makrofágy, ktoré vstupujú do mozgu malými krvnými cievami v mozgových blanách a ependyme.

U mačky, u ktorých sa vyskytlo neurologické ochorenie, sa tak stalo buď počas liečby (CT05, CT08, CT22), alebo 2 (CT01, CT02, CT09), 3 (CT13) alebo 6 (CT10) týždňov po ukončení liečby. Najpravdepodobnejším vysvetlením tohto oneskorenia, ako aj určitej terapeutickej výhody vyšších dávok, bolo to, že časť GC376 bola stále schopná preniknúť do mozgu. Hladiny GC376 v mozgovomiechovom moku predstavovali iba 3% plazmy v mozgu 2 hodiny po subkutánnej injekcii v dávke 10 mg/kg (nezverejnené údaje). Aj keď boli relatívne koncentrácie liečiva v mozgu u týchto mačiek nízke, stále boli 21,4-krát vyššie ako hladiny potrebné na inhibíciu replikácie vírusu v tkanivovej kultúre. Na základe tohto zistenia sa predpokladalo, že vyššie dávky umožňujú prienik vyššieho množstva liečiva do mozgu. Tento predpoklad bol podporený skúsenosťami s dvoma mačkami, ktoré vykazovali neurologické príznaky. Zvýšenie dávky GC376 na 50 mg/kg každých 12 hodín u jednej mačky (CT01) viedlo k znateľnému zlepšeniu, ale neeliminovalo príznaky ochorenia mozgu. Zdá sa, že predĺženie liečby o takmer 3 mesiace v dávke 15mg/kg každých 12 h oddialilo progresiu neurologických príznakov u druhej mačky (CT12), zatiaľ čo pokusy znížiť celkovú dennú dávku u tejto mačky na 10mg/kg každých 12 hodín alebo 15mg/kg každých 24 hodín spôsobili zhoršenie neurologických príznakov. To naznačuje, že dávky 15 mg/kg každých 12 hodín alebo vyššie umožnili dostatočnému množstvu GC376 prekonať hematoencefalickú bariéru, aby spomalil, ale neeliminoval neurologické príznaky.

Vysoký výskyt ochorení centrálneho nervového systému (CNS) v tejto štúdii bol vyšší, ako sa uvádzalo predtým, a bol neočakávaný, pretože mačky so známkami postihnutia mozgu alebo miechy boli zo štúdie vylúčené. Choroby CNS sa ukázala omnoho pravdepodobnejšia u starších mačiek so suchou alebo zmiešanou formou FIP ako u mladých mačiek s vlhkou FIP. To naznačuje, že FIPV môže u mnohých mačiek preniknúť do mozgu, ak je mu poskytnutý dostatok času. Zdá sa, že pri infekcii CNS zohrávajú úlohu makrofágy peritoneálneho typu, pretože FIPV infikované bunky v mozgu mačiek s neurologickou FIP sa viac podobajú skôr peritoneálnym makrofágom ako rezidentným mozgovým makrofágom. To by nemalo byť prekvapujúce, pretože makrofágy migrujú do rôznych tkanív, vrátane mozgu, na vykonávanie imunitného dohľadu a sú tiež cieľmi pre celý rad infekčných agensov, ako sú FIPV a HIV-1. Infikované makrofágy hrajú hlavnú úlohu pri šírení vírusu do mozgu u pacientov s HIV a detekcia vírusu v mozgu je možná v priebehu niekoľkých týždňov po infikovaní. K neurologickému poškodeniu však zvyčajne dôjde v neskoršom štádiu. Lieky proti HIV tiež znižujú frekvenciu závažných neurologických porúch, podobne, ako sa pozorovalo v tejto štúdii o FIPV a GC376. Existujú aj alternatívne vysvetlenia. Je možné, že extra-CNS účasť môže inhibovať rozvoj mozgových ochorení a naopak. Je bežné, že sa ochorenie CNS vyskytuje pri neprítomnosti viscerálneho ochorenia a naopak. Potlačenie replikácie vírusu v neneuronálnych tkanivách môže tiež zvýšiť pozitívnu selekciu mutantov, ktoré sú neurotropnejšie alebo neurovirulentnejšie. Dôkaz druhej možnosti by si však vyžadoval veľké štúdie s použitím laboratórnych mačiek.

Zdalo sa, že určité formy FIP ovplyvňovali úspešnosť liečby. Chovanie GC376 pri liečbe okulárnej FIP bolo paradoxné, pretože táto forma mimoriadne dobre reagovala na GC376. Aj keď očné lézie reagovali na liečbu, všetky tri mačky s postihnutím očí nakoniec podľahli mozgovým ochoreniam, čo podporilo blízky anatomický vzťah oka a CNS. Chronické ileocekálne postihnutie a postihnutie hrubého čreva a spomalený rast u starších mačiek v tejto štúdii taktiež predstavovali zlú prognózu. U mnohých z týchto mačiek sa objavil brušný výpotok iba ako terminálny prejav ich choroby. Hostiteľské faktory tiež spojené so zníženou odpoveďou na antivírusovú liečbu pri iných vírusových infekciách, ako je HCV, zahŕňajú vek, pohlavie, cirhózu alebo fibrózu pečene, rasu alebo telesnú hmotnosť.

Vznik rezistencie je hlavným problémom každého antivírusového lieku, ale FIPV sa zriedka prenáša z mačky na mačku, a rezistencia na liečivo, ak by sa vyskytla, by predstavovala problém iba pre jednotlivé liečené mačky, a nie pre celú populáciu. Aj keď vírusová rezistencia na GC376 nebola pozorovaná až do 20 pasáží in vitro, čo naznačuje, že rezistencia sa nedá získať ľahko, dlhodobá a opakovaná liečba in vivo môže predstavovať silnejší selekčný faktor. Zdá sa však, že vírusová rezistencia nebola zodpovedná za relapsy brušných chorôb u piatich liečených mačiek. Tieto mačky mali granulomatózne útvary, často v hrubom čreve a ileo-cekálno-kolických lymfatických uzlinách, ktoré mohli poskytovať chránené miesto na pretrvanie vírusov. Ochrana patogénov v granulómoch je pre mykobaktérie dobre zdokumentovaným javom a vzťahuje sa na ďalšie patogény, ako sú vírusy. Stav ochorenia pečene (cirhóza) pri infekcii HCV tiež zvyšuje riziko relapsu a vyžaduje dlhšiu liečbu, čo tiež naznačuje, že vírusy môžu byť chránené pred liekmi, keď sa nachádzajú na určitých chránených miestach. Formácia „ochranných granulómov“ zahŕňa veľké množstvo chemokínov a cytokínov a zvyšovanie regulácie chemokínových receptorov, adresínov, selektínov a integrínov. Perzistencia patogénov na týchto chránených miestach môže vyžadovať vyššiu dávka lieku a dlhšiu dobu trvania liečby.

Zlyhania liečby môžu tiež byť výsledkom neschopnosti hostiteľa dosiahnuť ochrannú imunitnú reakciu počas obdobia, keď je potlačená replikácia vírusu. Takéto zlyhanie sa pozorovalo pri infekcii HCV u ľudí. Imunita sprostredkovaná T-lymfocytmi hrá dôležitú úlohu v ochrannej imunite, ktorá sa vyskytuje asi u 20% akútnej infekcie HCV, a pri rovnakom alebo väčšom podiele infekcie FIPV. Je ešte potrebné preskúmať možnú synergiu vírusového klírensu sprostredkovaného T-lymfocytmi a antivírusovej terapie u mačiek s FIP. Prínosom by mohla byť aj kombinácia antivírusových liekov a stimulantov imunity T-lymfocytov pri liečbe FIP, ako je kombinácia interferónov a ribavirínu pri liečbe infekcie HCV.

Trvalá remisia u 6/7 mačiek liečených 12 týždňov alebo dlhšie bola do istej miery predvídateľná. Tieto mačky boli vo veku 3,3–4,4 mesiaca, keď sa u nich prejavili akútne príznaky brušnej (C15, C17, C18, CT21, CT23) alebo hrudnej efúznej FIP (CT20). To ich urobilo mladšími ako všetky ostatné mačky v štúdii okrem troch (CT8, CT16, CT21) a viac sa podobali 16-týždňovým laboratórnym mačkám s akútnym nástupom efúznej FIP, ktoré dobre reagovali na GC376. Choroba, ak je akútna, dáva vírusu na prienik do mozgu alebo očí málo času. Akútnosť ich ochorenia mohla tiež umožniť kratšiu dobu, aby infekcia natrvalo narušila akúkoľvek ochrannú imunitnú odpoveď. Siedma mačka, CT04, bola oproti týmto šiestim mladším mačkám extrémom. CT04 bola so svojimi 6,8 rokmi najstaršou mačkou v štúdii, u ktorej došlo k výraznému úbytku hmotnosti (30%) a ochoreniu obmedzenému na mezenterické lymfatické uzliny. CT04 utrpela relapsy choroby vyžadujúce obnovenie liečby, ale všetky relapsy boli identické so vstupým stavom a nezahŕňali CNS. Je známe, že mačky s touto formou FIP prechádzajú spontánnou remisiou, čo naznačuje, že existuje bod zlomu medzi imunitou a chorobou. Mačky CT04 a CT21 demonštrovali múdre rozhodnutie znovuzahájenia liečby pri relapse, za predpokladu, že relapsy nezahŕňajú oči alebo nervový systém a stále reagujú na lieky.

Stanovenie minimálnej doby trvania liečby bolo založené na postupnom predlžovaní trvania liečby na základe priaznivej reakcie na liečbu. Na základe experimentálnych štúdií sa očakávalo, že môžu byť postačujúce 2 týždne liečby; to sa teda použilo ako východiskový bod. Táto štúdia však naznačila, že minimálna doba liečby sa blížila k 12 týždňom, čo sa prekvapivo blížilo k zvyčajnému 12-týždňovému obdobiu, ktoré je potrebné na liečbu ľudí s HCV pomocou inhibítorov proteázy. Avšak doba liečby HCV sa môže pohybovať od 8 do 24 týždňov u rôznych ľudí. Mačka CT21 bola navonok zdravá, aktívna a po 12 týždňoch liečby rástla, ale celkový počet bielkovín a bielych krviniek sa stále nevrátil do normálu, ako tomu bolo u ostatných šiestich mačiek. Napriek tomu sa rozhodlo o ukončení liečby po 17 týždňoch z dôvodu dlhého obdobia navonok normálneho zdravia. To, či by dlhodobejšia liečba mohla zabrániť relapsu choroby 13 týždňov po ukončení liečby, si môžeme len domýšľať, ale zvyšuje to pochybnosť o tom, aká dlhá má vôbec byť potrebná doba liečby u niektorých mačiek. Nastoľuje sa tiež otázka, ako dlhé musí byť obdobie remisie, aby sme mohli prehlásiť že došlo k uzdraveniu, a nielen k dlhodobej remisii. Najdlhšie obdobie bez choroby bolo v čase písania tohto článku viac ako 11 mesiacov, pričom päť ďalších mačiek bolo bez známok infekcie po dobu 5–9 mesiacov. Na základe klinických a histologických dôkazov neurologického ochorenia v čase smrteľných relapsov sa zdá, že sa vírus nakoniec dostane do mozgu a že to môže byť najdôležitejším obmedzujúcim faktorom pri antivírusovej liečbe FIP.

Aj keď dlhodobo prežila iba jedna tretina mačiek, 20 mačiek v tejto štúdii poskytuje základ pre budúce štúdie s GC376 a ďalšími antivírusovými liekmi, ktoré budú nasledovať. Nie všetky mačky budú liečiteľné, ale to by nemalo zastaviť úsilie. V tejto obmedzenej štúdii sa takmer všetkým liečeným mačkám vrátil normálny zdravotný stav, aj keď iba na niekoľko týždňov alebo mesiacov. Je dôležité si uvedomiť univerzálnosť vírusových patogénov a využiť priekopnícky vývoj liekov, ktoré sa klinicky uplatňujú pri liečbe ľudských chorôb, ako je HIV/AIDS, hepatitída C, MERS, SARS, Ebola a chrípka.

Závery

Inhibícia FIPV 3CLpro s pomocou GC376 sa za podmienok štúdie ukázala ako účinná a viedla k zníženiu replikácie vírusu a k remisii príznakov choroby u mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou FIP mimo CNS. K trvalej remisii v tejto štúdii však dochádzalo skôr u mačiatok vo veku nižšom ako 18 týždňov s akútnou vlhkou FIP alebo u mačiek so suchou FIP obmedzenou na mezenterickú lymfatickú uzlinu a je menej pravdepodobné, že sa vyskytne u mačiek starších ako 18 týždňov so suchou, zmiešanou alebo okulárnou formou FIP. Neschopnosť dosiahnuť trvalú remisiu bola spojená buď s vysokým výskytom neurologických ochorení počas alebo po ukončení liečby alebo s recidívou brušných lézií. Zdá sa, že antivírusová liečba spomalila progresiu neurologického ochorenia, ale nedokázala ju zvrátiť pri dávke použitej v tejto štúdii. Príčina recidívy extra-neurologického ochorenia pri liečbe nebola stanovená, ale nesúvisela s mutáciami v oblasti viažucej proteázu.

Poznámky pod čiarou

Prijaté: 3.8.2017

Doplňujúci materiál: Formulár informovaného súhlasu majiteľa.

Konflikt záujmov: YK, KOC a WCG majú v rukopise patentové nároky na inhibítory proteázy. Ostatní autori neprehlasujú žiadne potenciálne konflikty záujmov v súvislosti s výskumom, autorstvom alebo publikovaním tohto článku.

Financovanie: Hlavná podpora tejto štúdie bola umožnená vďaka grantu od Morris Animal Foundation, Denver, CO, USA. Ďalšie prostriedky na technickú podporu a starostlivosť o zvieratá poskytli Fond Philipa Raskina, Kansas City, SOCK FIP, grant National Institutes of Health R01AI109039 a Centrum pre zdravie spoločenských zvierat, Kalifornská univerzita, Davis, CA, USA.

Literatúra

1.	Prokofjeva, MM, Kochetkov, SN, Prassolov, VS. Therapy of HIV infection: current approaches and prospects. Acta Naturae 2016; 8: 23–32. Google Scholar \| Crossref \| Medline
2.	Carter, W, Connelly, S, Struble, K. Reinventing HCV treatment: past and future perspectives. J Clin Pharmacol 2017; 57: 287–296. Google Scholar \| Crossref \| Medline
3.	Kim, Y, Lovell, S, Tiew, KC. Broad-spectrum antivirals against 3C or 3C-like proteases of picornaviruses, noroviruses, and coronaviruses. J Virol 2012; 86: 11754–11762. Google Scholar \| Crossref \| Medline
4.	Kim, Y, Mandadapu, SR, Groutas, WC. Potent inhibition of feline coronaviruses with peptidyl compounds targeting coronavirus 3C-like protease. Antiviral Res 2013; 97: 161–168. Google Scholar \| Crossref \| Medline
5.	Kim, Y, Shivanna, V, Narayanan, S. Broad-spectrum inhibitors against 3C-like proteases of feline coronaviruses and feline caliciviruses. J Virol 2015; 89: 4942–4950. Google Scholar \| Crossref \| Medline
6.	Kim, Y, Liu, H, Galasiti Kankanamalage, AC. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog 2016; 12: e1005531. Google Scholar \| Crossref \| Medline \| ISI
7.	Miller, FG, Brody, H. What makes placebo-controlled trials unethical? Am J Bioethics 2002; 2: 3–9. Google Scholar \| Crossref \| Medline
8.	Chiodo, GT, Tolle, SW, Bevan, L. Placebo-controlled trials good science or medical neglect? West J Med 2000; 172: 271–273. Google Scholar \| Crossref \| Medline
9.	Van Kruiningen, HJ, Ryan, MJ, Shindel, NM. The classification of feline colitis. J Comp Pathol 1983: 93: 275–294. Google Scholar \| Crossref \| Medline \| ISI
10.	Pedersen, NC, Eckstrand, C, Liu, H. Levels of feline infectious peritonitis virus in blood, effusions, and various tissues and the role of lymphopenia in disease outcome following experimental infection. Vet Microbiol 2015; 175: 157–166. Google Scholar \| Crossref \| Medline \| ISI
11.	Pellerin, M, Lopez-Aquirre, Y, Penin, F. Hepatitis C virus quasispecies variability modulates nonstructural protein 5A transcriptional activation, pointing to cellular compartmentalization of virus-host interactions. J Virol 2004; 78: 4617–4627. Google Scholar \| Crossref \| Medline
12.	Pedersen, NC, Allen, CE, Lyons, LA. Pathogenesis of feline enteric coronavirus infection. J Feline Med Surg 2008; 10: 529–541. Google Scholar \| SAGE Journals \| ISI
13.	Pedersen, NC . A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963–2008. J Feline Med Surg 2009; 11: 225–258. Google Scholar
14.	Pedersen, NC . An update on feline infectious peritonitis: virology and immunopathogenesis. Vet J 2014; 201: 123–132. Google Scholar \| Crossref \| Medline
15.	Pedersen, NC, Liu, H, Durden, M. Natural resistance to experimental feline infectious peritonitis virus infection is decreased rather than increased by positive genetic selection. Vet Immunol Immunopathol 2016; 171: 17–20. Google Scholar \| Crossref \| Medline \| ISI
16.	Pedersen, NC, Liu, H, Gandolfi, B. The influence of age and genetics on natural resistance to experimentally induced feline infectious peritonitis. Vet Immunol Immunopathol 2014; 162: 33–40. Google Scholar \| Crossref \| Medline
17.	Clifford, DB . HIV-associated neurocognitive disease continues in the antiretroviral era. Top HIV Med 2008; 16: 94–98. Google Scholar \| Medline
18.	Foley, JE, Lapointe, JM, Koblik, P. Diagnostic features of clinical neurologic feline infectious peritonitis. J Vet Intern Med 1998; 12: 415–423. Google Scholar \| Crossref \| Medline \| ISI
19.	Mesquita, LP, Hora, AS, de Siqueira, A. Glial response in the central nervous system of cats with feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2016; 18: 1023–1030. Google Scholar \| SAGE Journals \| ISI
20.	Pedersen, NC . Feline infectious peritonitis: something old, something new. Feline Pract 1976; 6: 42–51. Google Scholar
21.	Valcour, V, Sithinamsuwan, P, Letendre, S. Pathogenesis of HIV in the central nervous system. Curr HIV/AIDS Rep 2011; 8: 54–61. Google Scholar \| Crossref \| Medline
22.	Joseph, SB, Arrildt, KT, Sturdevant, CB. HIV-1 target cells in the CNS. J Neurovirol 2015; 21: 276–289. Google Scholar \| Crossref \| Medline
23.	Spudich, S, Gonzalez-Scarano, F. HIV-1-related central nervous system disase: current issues in pathogenesis, diagnosis and treatment. Cold Spring Harb Perspect Med 2012; 2: a007120 Google Scholar \| Crossref \| Medline
24.	Cavalcante, LN, Lyra, AC. Predictive factors associated with hepatitis C antiviral therapy response. World J Hepatology 2015; 7: 1617–1631. Google Scholar \| Crossref \| Medline
25.	Saunders, BM, Cooper, AM. Restraining mycobacteria: role of granulomas in mycobacterial infections. Immunol Cell Biol 2000; 78: 334–334. Google Scholar \| Crossref \| Medline
26.	Smyk-Pearson, S, Tester, IA, Klarquist, J. Spontaneous recovery in acute human hepatitis C virus infection: functional T-cell thresholds and relative importance of CD4 help. J Virol 2008; 82: 1827–1837. Google Scholar \| Crossref \| Medline
27.	Legendre, AM, Bartges, JW. Effect of polyprenyl immunostimulant on the survival times of three cats with the dry form of feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2009; 11: 624–626. Google Scholar \| SAGE Journals \| ISI
28.	Legendre, AM, Kuritz, T, Galyon, G. Polyprenyl immunostimulant treatment of cats with presumptive non-effusive feline infectious peritonitis in a field study. Front Vet Sci 2017; 4: 7. Google Scholar \| Crossref \| Medline

4. 1. 202129. 3. 2023

Farmakokinetický profil perorálnej aplikácie meflochínu u klinicky normálnych mačiek: Predbežná in vivo štúdia potenciálnej liečby mačacej infekčnej peritonitídy (FIP).

Jane Yu, Benjamin Kimble, Jacqueline M. Norris a Merran Govendir
Sydney School of Veterinary Science, Faculty of Science, The University of Sydney, Sydney, NSW 2006, Austrália; jane.yu@sydney.edu.au (J.Y.); benjamin.kimble@sydney.edu.au (B.K. ); jacqui.norris@sydney.edu.au (J.N.); merran.govendir@sydney.edu.au
Pôvodný článok: Pharmacokinetic Profile of Oral Administration of Mefloquine to Clinically Normal Cats: A Preliminary In‐Vivo Study of a Potential Treatment for Feline Infectious Peritonitis (FIP)
8.6.2020

Stručný obsah:

Pri hľadaní antivírusových látok proti mačacím koronavírusom a mačacím kalicivírusom sa preukázalo, že meflochín, ľudský antimalarický liek, znižuje vírusovú nálož mačacích koronavírusov a mačacieho kalicivírusu v infikovaných bunkách. V tejto štúdii sa meflochín podával perorálne siedmim klinicky zdravým mačkám dvakrát týždenne v štyroch dávkach a merali sa koncentrácie meflochínu v krvi, aby sa zistil farmakokinetický profil – pohyb liečiva v tele. Maximálna koncentrácia meflochínu v krvi bola 2,71 ug / ml a dosiahla sa 15 hodín po podaní jednej perorálnej dávky. Medzi vedľajšie účinky meflochínu patrilo u niektorých mačiek zvracanie po podaní bez potravy a mierne zvýšenie symetrického dimetylarginínu (SDMA), ranného biomarkera obličiek. Táto štúdia poskytuje cenné informácie o profile meflochínu u mačiek ako úvodný krok k jeho výskumu ako možnej liečby mačacieho koronavírusu a mačacej kalicivírusovej infekcie u mačiek.

Abstrakt: Farmakokinetický profil meflochínu bol skúmaný za účelom predbežnej štúdie potenciálnej liečby infekcií spôsobených mačacím koronavírusom (ako je infekčná peritonitída mačiek) alebo infekcií spôsobených mačacím kalicivírusom. Meflochín sa podával perorálne v dávke 62,5 mg siedmim klinicky zdravým mačkám dvakrát týždenne v počete štyroch dávok a koncentrácie meflochínu v plazme v priebehu 336 hodín sa merali pomocou vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie (HPLC). Maximálna plazmatická koncentrácia (Cmax) po jednorazovej perorálnej dávke meflochínu bola 2,71 ug/ml a čas do dosiahnutia Cmax (Tmax) bol 15 h. Eliminačný polčas bol 224 h. Plazmatická koncentrácia dosiahla vyššiu úroveň 4,06 ug/ml, keď sa meflochín podával s krmivom. Nežiaduce účinky dávkovania zahŕňali u niektorých mačiek vracanie po podaní bez potravy. Pozorovalo sa mierne zvýšenie sérových koncentrácií symetrického dimetylarginínu (SDMA), ale nie kreatinínu. Meflochín môže poskytnúť bezpečnú účinnú liečbu infekcií spôsobených koronavírusom a kalicivírusom u mačiek.

Kľúčové slová: meflochín; mačacia infekčná peritonitída; farmakokinetika; koronavírus; kalicivírus

Úvod

Mačací koronavírus (FCoV) je alfa koronavírus, ktorý sa vyskytuje v dvoch odlišných patotypoch, ktoré možno rozlíšiť podľa biologického správania, ale nie podľa morfológie [1]. Hoci tieto dva patotypy patria k tomu istému druhu vírusu, používajú sa rôzne názvy – mačací enterický koronavírus (FECV) a vírus mačacej infekčnej peritonitídy (FIPV). FECV je vysoko nákazlivý fekálno-orálnou cestou. Infekcia je väčšinou asymptomatická alebo môže spôsobiť miernu hnačku [1,2]. FIP je smrteľné, imunitne sprostredkované ochorenie vyvolané virulentnými biotypmi FCoV známymi ako vírus mačacej infekčnej peritonitídy (FIPV) u domácich a voľne žijúcich mačiek. Keď sa u mačiek s FIP objavia klinické príznaky, priemerná dĺžka života sa pohybuje od niekoľkých dní do niekoľkých týždňov v prípade efuzívnej formy a od niekoľkých týždňov do niekoľkých mesiacov v prípade neefuzívnej formy [3-6]. Existuje však malý počet mačiek, ktoré môžu prežiť niekoľko rokov [7,8]. Možnosti liečby sú tradične obmedzené, avšak nedávne experimentálne liečby s použitím inhibítorov proteáz a nukleozidových analógov priniesli sľubné výsledky [9-13], hoci tieto možnosti liečby ešte nie sú registrované pre liečbu mačiek. Nedostatok dostupných možností liečby stupňuje potrebu skúmať ďalšie dostupné antivírusové liečby. Okrem toho má terapeutickú hodnotu hľadanie liečby zameranej na rôzne aspekty replikácie FCoV, keďže kombinovaná liečba pri iných vírusových infekciách sa spája s vyššou mierou potlačenia patogénu a minimalizáciou rozvoja antivírusovej rezistencie [14,15].

Kalicivírus mačiek je dôležitou a bežnou príčinou ochorenia horných dýchacích ciest a ulcerácie ústnej dutiny u mačiek, pričom v poslednom čase sa objavujú virulentnejšie formy vírusu, ktoré vedú k prepuknutiu systémového ochorenia, ktoré je často smrteľné a podobne ako FIP nemá účinnú antivírusovú liečbu. [16]

Pri hľadaní antivírusových látok proti mačaciemu koronavírusu a mačaciemu kalicivírusu sa ukázalo, že meflochín, ľudské antimalarikum, inhibuje vírusovú nálož FCoV v infikovaných Crandellových mačacích obličkových bunkách bez cytotoxických účinkov [17]. Jeho inhibícia cytopatických účinkov a vírusovej replikácie pri nízkych koncentráciách podporuje ďalšie skúmanie tohto liečiva ako potenciálneho antivírusového terapeutického prostriedku. V našom predchádzajúcom projekte sme vyvinuli in vitro model na určenie rozsahu a rýchlosti hepatálneho klírensu (Cl) meflochínu [18]. Meflochín u mačky podlieha pečeňovému metabolizmu fázy I, ale nie konjugatívnemu metabolizmu fázy II [18]. Neexistujú dôkazy, že by meflochín vykazoval oneskorenú elimináciu u klinicky zdravých mačiek. Väzba meflochínu na plazmatické bielkoviny je približne 99 % v plazme klinicky normálnych mačiek aj v plazme mačiek s FIP [19].

Keďže meflochín sa v súčasnosti používa na profylaxiu malárie, sú dostupné informácie o jeho dispozícii vrátane absorpcie, distribúcie a rýchlosti a rozsahu eliminácie liečiva u dospelých ľudí a dojčiat, pričom niektoré informácie sú k dispozícii aj u psov [20], ale v tejto fáze nie sú k dispozícii žiadne informácie o farmakokinetickom profile (PK) meflochínu u mačiek okrem väzby na plazmatické bielkoviny [19]. Preto na posúdenie, či má podávanie meflochínu ako antivirotika nejakú terapeutickú výhodu, je potrebné stanoviť farmakokinetický profil meflochínu u klinicky normálnych mačiek, aby bolo možné vypracovať dávkovanie a frekvenciu dávok. Poznanie farmakokinetického profilu meflochínu u klinicky normálnej mačky je prechodným krokom, ktorý premosťuje predklinické pozorovania meflochínu k medikácii mačiek v budúcnosti. Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať farmakokinetický profil meflochínu pri perorálnom podávaní 62,5 mg (10 – 12 mg/kg) dvakrát týždenne. Druhým cieľom bolo zdokumentovať akékoľvek zmeny hematologických a/alebo biochemických analytov a fyziologických reakcií na meflochín pri tomto dávkovacom režime.

Materiály a metódy

Zvieratá

Osem dospelých mačiek (4 samice, 4 kocúri) získala spoločnosť Invetus Pty Ltd. (Casino, Nový Južný Wales, Austrália), zariadenie na výskum zvierat, z jej klinicky normálnych zvierat. Telesná hmotnosť sa pohybovala od 5,0 do 5,8 kg (priemer 5,4 kg). Mačky boli vo veku 3 až 7 rokov (priemer 5,5 roka). Mačky boli vybrané na základe klinicky normálneho fyzického vyšetrenia, normálneho skóre telesnej kondície a telesnej hmotnosti ≥ 5 kg. Medzi vylučovacie kritériá patrili mačky s abnormálnym nálezom pri fyzikálnom vyšetrení, mačky s podváhou alebo mačky, ktoré užívali lieky. Do štúdie bolo pôvodne vybraných sedem mačiek. Mačky boli umiestnené jednotlivo v boxoch v chovateľskej stanici a boli zásobované krmivom a vodou ad libitum. Výber klinicky normálnych mačiek, ich dávkovanie meflochínom, odber krvi a prístrešie realizovala spoločnosť Invetus. Táto štúdia bola schválená Výborom pre etiku zvierat Výskumného centra Wongaburra ako projekt USY F 18120 W dňa 29. augusta 2019 a Výborom pre etiku zvierat Univerzity v Sydney ako protokol 2019/1662.

Podávanie liekov a odber vzoriek

Na odber krvi sa mačkám nasadila maska a anestézia izofluránom v 100 % kyslíku a z krčných žíl sa pomocou ihly s priemerom 22 mm odobrali 2-4 ml krvi. Krv sa odobrala do skúmaviek s lítiovým heparínom, skúmaviek s kyselinou etyléndiamíntetraoctovou (EDTA) a skúmaviek so sérom na kvantifikáciu koncentrácie meflochínu, hematológiu a biochémiu. 250 mg tableta meflochínu (Lariam, Roche, Millers Point, Nový Južný Wales, Austrália) sa rozštvrtila pozdĺž ryhy na tablete. Pre každú mačku bola dávkou štvrtina tablety alebo 62,5 mg meflochínu. Hmotnosť každej štvrtiny tablety sa zaznamenala kvôli dôslednosti dávkovania. Meflochín (62,5 mg) sa podával každej mačke perorálne v dňoch 0, 4 (čo zodpovedá 96 h), 7 (168 h) a 10 (240 h). Mačky boli potom 2 h po podaní dávky monitorované na prípadné nežiaduce reakcie. Na stanovenie plazmatickej koncentrácie meflochínu sa odoberali sériové vzorky krvi do lithiových heparínových skúmaviek v čase 0 (pred liečbou), 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96, 168, 240 a 336 h po podaní lieku. V iné dni podávania meflochínu ako v prvý deň podávania (t = 96, 168 a 240 h) sa vzorky krvi odoberali pred podaním dávky meflochínu, po ktorom nasledovalo podanie mokrého alebo suchého krmiva podávané v trvaní niekoľkých niekoľkých minút. Krv sa tiež odobrala do skúmaviek EDTA a séra na hematologické a biochemické vyšetrenie v 168 a 336 h. Vzorky sa odstredili do 1 h po odbere krvi. Plazma a sérum sa okamžite uskladnili v mrazničke (-20 °C) do 90 minút od odberu krvi. Skúmavky s EDTA boli okamžite odoslané do laboratória Idexx East Brisbane, Qld. Austrália, na hematologickú analýzu. Skúmavky so sérom sa poslali do Veterinary Pathology Diagnostic Services, The University of Sydney a do referenčného laboratória Idexx na biochemickú analýzu. Sérum bolo tiež zaslané do referenčného laboratória Idexx na analýzu sérového symetrického dimetylarginínu (SDMA) a kreatinínu. Na stanovenie koncentrácie meflochínu v plazme sa vzorky analyzovali vo veterinárnom farmakologickom laboratóriu, Sydney School of Veterinary Science, The University of Sydney, do dvoch mesiacov od odberu krvi.

Metóda analýzy liečiv a spracovanie vzoriek

Koncentrácia meflochínu sa vo vzorkách kvantifikovala pomocou vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie (HPLC), pričom vzorky plazmy boli upravené podľa validovanej metódy [19].

Chemikálie

Meflochín, verapamil (ako vnútorný štandard [IS]), fosforečnan sodný, trimetylamín a kyselina fosforečná boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich (Castle Hill, Sydney, Nový Južný Wales, Austrália). Acetonitril a metanol triedy HPLC boli zakúpené od spoločnosti Thermo Fisher Scientific (Macquarie Park, NSW, Austrália).

Podmienky HPLC

Systém HPLC pozostával z podávacej jednotky Shimadzu LC-20AT, podávacej jednotky DGU-20A3 HT na odplynenie rozpúšťadla, automatického injektora SIL-20A, UV detektora SPD-20A a kolónovej pece CTO-20A. Na chromatografické riadenie, zber a spracovanie údajov sa používal softvér Shimadzu LC Solution (Kyoto, Japonsko). Chromatografická separácia sa uskutočnila pomocou kolóny Polaris C18-A (5 μm, 150 × 4,6 mm) s predkolónou Optic-guard C 18 s priemerom 1,0 mm (Choice Analytical, Thornleigh, NSW, Austrália), pričom teplota kolóny bola nastavená na 35 °C. Izokratická mobilná fáza obsahovala zmes 25 mM fosforečnanu sodného s 0,5 % trietylamínu upraveného na pH 6,0 s kyselinou fosforečnou, acetonitrilom a metanolom (50:25:25) pri prietoku 0,8 ml/min. Pre každú vzorku bol objem nástreku 10 μl a celkový čas trvania bol 15 min. Detektor s diódovým poľom bol nastavený na vlnovú dĺžku 220 nm.

Na prípravu vzoriek sa sériovým riedením pripravili plazmatické koncentrácie meflochínu 0,156, 0,313, 0,625, 1,25, 2,50 a 10,0 μg/ml. Roztok IS sa pripravil v 100 % acetonitrile s konečnou koncentráciou 10 ug/ml. Na prípravu štandardnej krivky sa použili vzorky mačacej plazmy pred liečbou.

Na extrakciu proteínov zo vzoriek plazmy sa do 100 μl vzoriek mačacej plazmy pridalo 100 μl acetonitrilu s obsahom 10 μg/ml IS. Vzorky sa potom vortexovali a centrifugovali pri 14 000 g počas 10 minút. Pre potrebu analýzy sa do systému HPLC vstreklo desať mikrolitrov supernatantu.

Farmakokinetická analýza

Údaje sa vyhodnotili pomocou nekompartmentovej analýzy, keďže eliminačná fáza bola zrejmá len v dvoch časových bodoch, t. j. 48 a 96 h. Priemerná maximálna plazmatická koncentrácia (C max) a čas do dosiahnutia C max (T max) prvej dávky sa určili vizuálnou kontrolou krivky plazmatickej koncentrácie jednotlivých mačiek v závislosti od času v priebehu 96 h. Rozdiel prirodzeného logaritmu plazmatických koncentrácií v 24. a 96. h, t. j. sklon krivky od 24. do 96. h dal ke. Polčas eliminácie sa odhadol pomocou ln 2/ke. Plocha pod krivkou (AUC_0‐t) v 96 h sa vypočítala k poslednej merateľnej koncentrácii pomocou lineárnej lichobežníkovej metódy. Zdanlivý distribučný objem sa vypočítal ako:

V/F = (Dávka/AUC) × (1/ke), (1)

kde F je biologická dostupnosť pri perorálnom podávaní, ktorú nie je možné určiť, pretože intravaskulárne (intravenózne) podávanie meflochínu mačkám sa neuskutočnilo. Zdanlivý klírens sa vypočítal ako:

Cl/F = V × ke. (2)

Plocha pod krivkou momentu (AUMC0_0–96h ) sa vypočítala ako súčet AUC, keď sa každý z údajov o koncentrácii vynásobil časom. Priemerný rezidenčný čas sa vypočítal ako 1/ke.

Štatistická analýza

Dve mačky boli zo štatistickej analýzy vylúčené z dôvodu zvracania. Údaje o plazmatickej koncentrácii meflochínu pre päť mačiek (vrátane mačky E) v 24, 96, 168, 240 a 336 h boli podrobené Shapiro-Wilkovmu testu normality a všetky rozdelenia boli normálne. Koncentrácie SDMA však neboli normálne v čase t = 0 h, ale boli normálne v čase 168 a 336 h. Koncentrácie kreatinínu boli normálne v čase 0, 168 a 336 h. Priemerné koncentrácie meflochínu v plazme sa porovnávali v čase 24, 96, 168, 240 a 336 h a prešli opakovaným meraním on-way ANOVA, rovnako ako priemerné koncentrácie SDMA a kreatinínu v čase 0, 168 a 336 h. Tukeyho test viacnásobného porovnávania sa použil na preukázanie, či sa priemerné hodnoty v jednotlivých časových bodoch významne líšia. Štatistická analýza bola prijatá, ak p < 0,05. Štatistická analýza sa vykonala pomocou programu Graphpad Prism 8 (San Diego, California, CA, USA).

Výsledky

Po podaní 62,5 mg meflochínu na mačku bola priemerná dávka 11,8 mg/kg (medián 12,3, rozpätie 10,8-12,5). Zmena plazmatických koncentrácií meflochínu v priebehu 336 h (14 dní) u siedmich mačiek je zobrazená na obrázku 1 a aktuálne plazmatické koncentrácie meflochínu každej mačky v každom časovom bode sú uvedené v tabuľke 1. Na obrázku 2 sú znázornené plazmatické koncentrácie meflochínu (ug/ml) počas prvých 24 h. Jednorazová perorálna dávka meflochínu vedie k Cmax 2,71 μg/ml po prvej dávke, v priemere o 15 h (Tmax). Zvýšenie plazmatických koncentrácií meflochínu sa pozorovalo po 168, 240 a 336 h (obrázok 1), po druhej dávke podanej tesne po 96 h, tretej dávke podanej tesne po 168 h a štvrtej dávke podanej tesne po 240 h, v uvedenom poradí, keď sa meflochín podával s jedlom, pričom vrcholové plazmatické koncentrácie dosiahli 4,06 μg/ml (priemer) po 240 h. Jedna mačka (mačka C) zvracala 15 min po podaní dávky v deň 0 (liečba 1). Tejto mačke bol meflochín opätovne podaný v 4. deň (liečba 2), ale zvracala približne hodinu po podaní dávky, a preto bola zo štúdie vyradená. Ďalšia mačka (mačka F) zvracala 5 minút po podaní dávky v deň 1 (liečba 1). Tejto mačke bola úspešne podaná dávka meflochínu po kŕmení v nasledujúci deň liečby (96 h) a bola znovu zaradená do štúdie. Tentoraz sa po podaní dávky nepozorovalo žiadne zvracanie. Vzorky krvi boli mačke F odobraté o 168, 240 a 336 h, ako je uvedené v tabuľke 1.

**Obrázok 1.** Plazmatické koncentrácie meflochínu (ug/ml) u siedmich mačiek v priebehu 336 hodín (14 dní po prvej dávke). Mačky boli liečené dávkou 62,5 mg na mačku (10 – 12 mg/kg) po t = 0, 96, 168 a 240 h. Krv bola odobratá tesne pred liečbou, ako je vyznačené zvislými bodkovanými čiarami.

**Obrázok 2.** Plazmatické koncentrácie meflochínu (ug/ml) počas prvých 24 hodín po podaní mačkám 62,5 mg (10-12 mg/kg) meflochínu pri t = 0.

	Mačka D	Mačka A	Mačka B	Mačka G	Mačka E	Mačka C	Mačka F
H	Samec kastrovaný	Samec kastrovaný	Samica kastrovaná	Samica kastrovaná	Samec kastrovaný	Samica kastrovaná	Samica kastrovaná
0	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
1	0.54	1.58	0.31	1.97	0.22	0.86	‐
2	0.95	1.95	0.89	2.79	0.40	2.19	‐
4	1.13	2.10	1.84	3.23	0.49	‐	‐
8	1.59	2.23	2.20	2.89	0.64	‐	‐
12	1.77	2.97	2.14	3.22	0.72	‐	‐
24	2.9	3.35	2.9	3.12	0.56	‐	‐
48	1.86	3.34	1.97	2.88	0.56	‐	‐
96	1.51	2.76	1.75	2.50	0.57	‐	‐
168	2.75	4.15	3.36	3.73	3.58	‐	1.39
240	1.85	6.51	2.93	4.94	4.20	‐	1.54
336	3.7	4.19	3.60	4.56	2.9	‐	2.11

Tabuľka 1. Plazmatické koncentrácie meflochínu u jednotlivých mačiek (ug/ml). Mačky C a F boli vylúčené z farmakokinetickej analýzy (PK) z dôvodu neúplných údajov. Mačka C bola zo štúdie vyradená z dôvodu zvracania, zatiaľ čo mačka F zvracala po prvej dávke, ale bola úspešne znovu zaradená do štúdie v druhý deň liečby. Mačka E bola vylúčená z analýzy PK, pretože profil tejto mačky bol odľahlý a skresľoval údaje.

Farmakokinetické (PK) ukazovatele sú uvedené v tabuľke 2. Kočky C a F boli z analýzy PK vylúčené z dôvodu neúplných údajov. Keďže PK profil mačky E skresľuje údaje, indexy pre štyri mačky (mačka A, B, D a G) s konzistentnejšími profilmi boli použité na analýzu.

PK indexy	Jednotky	Priemer	SD	Medián	Min	Max
ke (48-96 h)	1/h	0.003	0.001	0.003	0.003	0.005
t1/2	h	224.18	51.60	233.94	153.24	275.60
Tmax	h	15.00	10.52	16.00	4.00	24.00
Cmax	μg/ml	2.71	0.66	2.71	2.09	3.35
AUC 0-96 h	μg/ml × h	228.30	62.23	228.18	166.59	290.25
AUMC 0-96 h	μg/ml × h ²	10737	2971.7	10576	7826.0	13968
MRT 0-96 h	h	326.50	13.60	337.46	221.17	397.47
V/Fobs (vypočítané za 0-96 h)	L/kg	17.41	4.08	15.74	14.73	23.41
Cl/Fobs (vypočítané za 0-96 h)	L/h/kg	0.06	0.02	0.052	0.04	0.085

Tabuľka 2. Farmakokinetické ukazovatele mačiek A, B, D a G počas prvých 96 hodín.
SD – štandardná odchýlka; ke – konštanta rýchlosti eliminácie; t1/2 – polčas eliminácie; Tmax – čas do dosiahnutia maximálnej plazmatickej koncentrácie; Cmax – maximálna plazmatická koncentrácia; AUC _{0 –96 h}– plocha pod krivkou počas 96 h; AUMC _{0–96 h} – plocha pod krivkou momentu počas 96 h; MRT _{0 –96 h}– stredný rezidenčný čas; V/Fobs – zdanlivý distribučný objem; Cl/Fobs – zdanlivý klírens.

Hematológia a biochémia séra šiestich mačiek (mačky A, B, D, E, F a G) sa vykonali pred liečbou (0 h), po 168 a 336 h. Mačka C bola zo štúdie vyradená po prvých dvoch kontrolných bodoch, a preto sa v odbere krvi nepokračovalo. Hematologické výsledky boli vo všetkých šiestich časových bodoch bez pozoruhodností. Výsledky biochémie sú uvedené v tabuľke 3.

		0h	0h	168h	168h	336h	336h
Biochemický analyt	Jednotky	Priemer	Rozsah	Priemer	Rozsah	Priemer	Rozsah	Referenčný interval (referenčné laboratórium Idexx)
Glukóza	mmol/l	–	–	5.10	3.90-6.30	4.50	3.40-5.40	3.20-7.50
SDMA	ug/dl	6.70	1.00-8.00	11.0	8.00-13.0	13.5	10.0-16.0	0.00-14.0
Kreatinín	umol/l	115	90.0-140.	122	80.0-160.	120.	100.-140.	80.0-200.
Močovina	mmol/l	8.00	6.80-10.2	7.70	6.90-9.10	8.08	6.90-9.20	5.00-15.0
Fosfor	mmol/l	1.70	1.40-2.00	1.40	1.17-1.63	1.32	1.20-1.60	0.00-2.30
Vápnik	mmol/l	2.40	2.30-2.50	2.40	2.40-2.60	2.30	2.20-2.40	2.10-2.80
Sodík	mmol/l	152	149-153	154	152-156	151	148-153	144-158
Draslík	mmol/l	5.10	4.50-5.20	4.50	4.10-5.20	4.40	4.10-4.70	3.70-5.40
Chlorid	mmol/l	115	111-117	123	120-125	118	116-120	106-123
Hydrogénuhličitan	mmol/l	16.0	15.0-18.0	–	–	16,3 (4 mačky)	15.0-18.0	12.0-24.0
Aniónová medzera	mmol/l	25.8	25.2-27.1	–	–	20,6 (4 mačky)	20.1-21.3	15.0-31.0
Celkový proteín	g/L	75.3	67.0-86.0	71.0	65.2-80.7	71.3	65.0-83.7	60.0- 84.0
Albumín	g/l	31.7	29.0-36.0	28.9	27.8-30.0	30.0	28.0-32.0	25.0-38.0
Globulín	g/L	43.7	35.0-37.0	42.3	35.3-52.9	41.2	33.0-55.7	31.0-52.0
ALT	U/L	79.2	43.0-161	47.3	26.0-116	58.7	22.0-166	19.0-100.
AST	U/L	47.8	25.0-83.0	29.7	22.0-53.0	29.8	20.0-42.0	0.00-62.0
ALP	U/L	39.8	21.0-75.0	37.0	24.0-72.0	41.8	27.0-87.0	5.00-50.0
GGT	U/L	0.70	0.00-1.00	–	–	0.50	0.00-2.00	0.00-5.00
Celkový bilirubín	umol/l	3.00	3.00	2.10	0.40-2.70	2.60	2.00-3.00	0.00-7.00
Cholesterol	mmol/l	3.85	2.60-4.90	3.90	3.00-4.80	3.10	0.00-4.70	2.20-5.50
CK	U/L	299	133-735	178	97.0-398	148	17.0-248	64.0-400
TT4	nmol/l	32.5	21.0-39.0	32.6	28.6-36.7		32.4-35.4	10.0-60.0

Tabuľka 3. Biochemické výsledky (priemer a rozsah) v 0, 168 a 336 h. Čísla mimo referenčných intervalov sú zvýraznené tučným písmom. Neboli uvedené všetky biochemické analyty z dôvodu dostupnosti rôznych biochemických analytov v rôznych laboratóriách, preto sú prázdne políčka.
SDMA-symetrický dimetylarginín; ALT-alaníntransamináza; AST-aspartáttransamináza; ALP-alkalínfosfatáza; GGT-gama-glutamyltranspeptidáza; CK-kreatínkináza; TT4-celkový tyroxín. Čísla mimo referenčných intervalov sú zvýraznené tučným písmom.

Biochemické vyšetrenie ukázalo trend zvyšovania koncentrácií SDMA v 168. a 336. hodine u všetkých šiestich mačiek. Jednosmerná ANOVA s opakovaným meraním, porovnávajúca SDMA vo všetkých časových bodoch, bola štatisticky významná p < 0,002. Tukeyho testy viacnásobného porovnávania ukazujú, že priemerná hodnota SDMA v každom časovom bode bola štatisticky odlišná: 0 vs 168 h p = 0,002; 168 vs 336 h p = 0,005. Obrázok 3 zobrazuje medián koncentrácií SDMA v každom časovom bode s horným a dolným rozsahom od šiestich mačiek. Medián SDMA v 0 h bol 8,0 g/dl (rozsah 1,0 – 8,0), medián SDMA v 168 h bol 11,5 g/dl (rozsah 8,0 – 13,0) a v 336 h bol 14,0 g/dl (rozsah 10,0 – 16,0). Koncentrácie kreatinínu sa v 0, 168 a 336 h u šiestich mačiek významne nelíšili. Tri mačky mali pred liečbou zvýšené pečeňové parametre vrátane ALT, AST a ALP. Z týchto troch mačiek mala jedna mačka (mačka G) hodnotu ALT až 161 U/L a ALP bola pred liečbou 75,0 U/L, ALT a ALP zostali zvýšené na 166 U/L a 87,0 U/L v uvedenom poradí v 336 h. Táto mačka nemala počas štúdie žiadne nežiaduce účinky. Jedna mačka s mierne zvýšenou ALT (142 U/L) bola zo štúdie vyradená kvôli zvracaniu (mačka C). Ďalšia mačka s mierne zvýšenou ALT (144 U/L) a AST (83,0 U/L) pred liečbou zostala klinicky zdravá počas celej štúdie a oba pečeňové parametre sa vrátili do normálneho rozsahu po 168 a 336 h. Ostatné biochemické analytické zmeny boli bez pozoruhodností. Glukóza v krvi v 0 h nebola poskytnutá, pretože vo všetkých vzorkách bola pozorovaná arteficiálna hypoglykémia. Bolo podozrenie, že je to dôsledok problematickej metódy odberu vzoriek krvi pre stanovenie glukózy.

**Obrázok 3.** Výsledky SDMA (ug/dl) šiestich mačiek v 0, 168 a 336 h. Medián koncentrácie SDMA v každom časovom bode je zobrazený s horným a dolným rozsahom. Prerušovaná čiara predstavuje referenčný interval (0,00 – 14,0).

Hoci mačky C a F pri prvom podaní meflochínu zvracali, všetky ostatné mačky pri ďalšom podaní, keď sa meflochín podával s potravou, liek dobre tolerovali. Počas dvoch týždňov liečby neboli u žiadnej mačky pozorované ďalšie nežiaduce účinky.

Diskusia

Toto je prvá farmakokinetická štúdia meflochínu u mačiek. Jediné hlásené použitie meflochínu u zvierat je ako antimalarikum pre dravce a tučniaky [21,22]. Okrem použitia ako antimalarikum bola zaznamenaná úspešná liečba týmto liekom u ľudí s progresívnou multifokálnou leukoencefalopatiou spôsobenou vírusom Johna Cunninghama (JCV) [23,24]. Jeho antivírusový účinok sa preukázal in vitro pri FCoV [17], mačacom kalicivíruse [25], víruse dengue typu 2 a víruse Zika u ľudí [26] a nedávno aj pri pangolinskom koronavíruse GX_P2X, ktorý je modelom pre SARS-CoV-2, pôvodcu COVID-19 u ľudí [27]. Presné mechanizmy jeho pôsobenia ako antimalarickej alebo antivírusovej látky nie sú známe [17,28,29].

Keďže meflochín je antimalarická profylaxia a liečba ľudí, bol zdokumentovaný jeho farmakokinetický profil. U zdravých dobrovoľníkov je polčas perorálnej absorpcie meflochínu 1 – 4 h (priemer 2,1 h) [30]. Perorálna biologická dostupnosť meflochínu u mačiek nie je známa, pretože požadovaná IV AUC potrebná na výpočet nebola u mačiek vykonaná. Zistilo sa však, že perorálna biologická dostupnosť meflochínu u psov je približne 67 – 90 % (priemer 78 %) [20]. Meflochín dosahuje maximálne plazmatické koncentrácie približne po 6-24 h (medián 17,6 h) u ľudí [30]. Pri perorálnom podávaní mačkám je čas dosiahnutia maximálnych plazmatických koncentrácií (Tmax) porovnateľný s ľuďmi, v priemere 15 h. Odhadovaný celkový zdanlivý distribučný objem u zdravých ľudí je približne 19,2-22,1 l/kg a systémový klírens je 0,026-0,042 l/h/kg [31], zatiaľ čo zdanlivý priemerný ± SD distribučný objem u mačiek je 17.4 ± 4,08 l/kg a zdanlivý klírens je 0,060 ± 0,020 l/h/kg pri výpočte za 0 až 96 h. Väzba plazmatických bielkovín bola 98 % u zdravých ľudských dobrovoľníkov a pacientov s nekomplikovanou maláriou falciparum [30] a tiež 99 % v plazme mačiek z klinicky normálnych mačiek a plazme mačiek s FIP [19]. U ľudí je eliminačný polčas meflochínu približne 20 dní u zdravých osôb, 10 až 14 dní u pacientov s nekomplikovanou maláriou falciparum [32,33] a 20 dní v prípadoch zahŕňajúcich ťažkú maláriu [33,34]. U ľudí sa odporúča nasycovacia dávka a potom liečba raz týždenne [35,36]. Meflochín sa z tela vylučuje pomaly prostredníctvom stolice a moču [31,37]. V našej štúdii sme odhadli, že eliminačný polčas meflochínu u klinicky zdravých mačiek je približne 224 h alebo približne 9,3 dňa, podobne ako u zdravých ľudí. Výpočet polčasu vylučovania bol založený len na časových úsekoch 24 až 96 h; ďalšie štúdie, s odberom vzoriek pri podávaní jednorazovej dávky meflochínu dlhšie ako 96 h u mačiek, môžu poskytnúť jednoznačnejší výsledok.

Pri podávaní meflochínu s jedlom sa zvýšila perorálna absorpcia. Farmakokinetická analýza ukázala, že priemerná plazmatická koncentrácia bola vyššia (4,06 ug/ml) po 240 h, keď sa meflochín podával s jedlom, v porovnaní s plazmatickou koncentráciou 2,71 ug/ml po 15 h, keď sa meflochín podával bez jedla. Medzi ďalšie faktory ovplyvňujúce vyššiu plazmatickú koncentrácii po 240 h patrí kumulatívny účinok lieku pri viacnásobnom podávaní a možná enterohepatálna cirkulácia lieku. U ľudí ovplyvňuje prítomnosť potravy v gastrointestinálnom trakte farmakokinetické vlastnosti meflochínu tým, že výrazne zvyšuje rýchlosť a rozsah absorpcie [38].

Ukázalo sa, že meflochín v koncentrácii 10 μM vykazoval výraznú inhibíciu voči dvom biotypom FCoV, FIPV WSU 79-1146 (FIPV1146) a FECV WSU 79-1683 (FECV1683), získaným z American Type Culture Collection (Virginia, USA), [17]. Vzhľadom na to, že molekulová hmotnosť meflochínu je 378 g/mol, pri použití 10 μM meflochínu sa dosiahne plazmatická koncentrácia 10 μM = 3,78 μg/ml [17]. Táto štúdia ukázala, že pri podaní jednorazovej perorálnej dávky meflochínu ~12,5 mg/kg sa dosiahne maximálna plazmatická koncentrácia (Cmax) 2,71 μg/ml. Na inhibíciu vírusu FIP môže byť potrebná vyššia dávka meflochínu. Je však možné, že pri podávaní meflochínu s jedlom bude Cmax oveľa vyššia, ako sa uvádza po 12 až 24 h. Posúdenie účinnosti meflochínu voči vírusu FCoV si zasluhuje klinickú štúdiu. Okrem toho sa ukázalo, že meflochín inhibuje cytopatické účinky v bunkách infikovaných koronavírusom príbuzným SARS-CoV-2a (GX_P2X), čo z neho robí potenciálny liek na použitie u mačiek s infekciou SARS-CoV-2 [27].

Chlorochín, 4-aminochinolín s podobným spôsobom účinku ako meflochín [39], preukázal inhibičný účinok proti replikácii FIPV a protizápalový účinok in vitro a zlepšil klinické hodnotenie experimentálne vyvolanej FIP mačiek [40]. Hoci sa preukázalo, že meflochín inhibuje FIPV in vitro [17], jeho klinická účinnosť u mačiek s FIP zostáva neznáma. Chlorochín však spôsobil zvýšenie hladiny ALT, keď sa použil u mačiek infikovaných FIP. V tejto štúdii meflochín nespôsobil zvýšenie hladín ALT. Hoci niektoré mačky mali pred podaním dávky meflochínu zvýšenú hladinu ALT, ďalšie zvýšenie po štyroch dávkach meflochínu dvakrát týždenne nebolo pozorované. Hydroxychlorochín sa skúmal v klinickej štúdii na liečbu COVID-19 u ľudí [41] a nedávno sa skúmali aj jeho antivírusové vlastnosti proti FIPV in vitro [42]. Pri použití s rekombinantným mačacím IFN-ω preukázal hydroxychlorochín zvýšenú antivírusovú aktivitu proti infekcii FIPV [42]. Na overenie jeho klinickej účinnosti a bezpečnosti u mačiek s koronavírusovou alebo kalicivrusovou infekciou sú potrebné ďalšie klinické štúdie. Výskyt nežiaducich účinkov po podaní meflochínu u ľudí je bežný, pričom 47 – 90 % ľudí má nejaké mierne alebo stredne závažné nežiaduce účinky [30,43,44]. Výskyt nežiaducich účinkov sa znižuje pri dlhodobom užívaní, zo 44 % počas prvých 4 mesiacov na 19 % po jednom roku [30,45]. Medzi najčastejšie nežiaduce účinky patria neuropsychiatrické účinky [46-48], gastrointestinálna dysfunkcia [49], dermatologické príznaky [50], hematologické zmeny [51] alebo kardiovaskulárna dysfunkcia [30,33]. U ľudí sú nevoľnosť a vracanie bežnými nežiaducimi účinkami a môžu byť závislé od dávky a veku, pričom najvyššie riziko je u mladších detí [49,52]. V tejto štúdii dve mačky zvracali po prvom podaní meflochínu bez jedla. Jednej mačke (mačka F) bol meflochín po nakŕmení úspešne znovu podaný, a preto bola táto mačka znovu zaradená do štúdie. Mačke C bola tiež opätovne podaná druhá dávka meflochínu (4. deň); táto mačka však pred druhou dávkou odmietla potravu. Meflochín sa preto dávkoval bez potravy. Táto mačka opäť zvracala a bola zo štúdie vyradená. Keď sa meflochín podával s potravou, ďalšie zvracanie sa nepozorovalo. U mačiek v našej štúdii neboli pozorované žiadne iné klinické nežiaduce účinky. Naše mačky však boli pozorované len 14 dní. Akékoľvek oneskorené alebo dlhodobé nežiaduce účinky meflochínu u mačiek zostávajú neznáme. Je tiež možné, že výskyt nežiaducich účinkov by sa mohol znížiť pri dlhodobom podávaní, ako sa pozorovalo u ľudí [30,45].

Príčina nižšej krivky plazmatickej koncentrácie Mačky E počas prvého dávkovacieho intervalu (0-96 h) ostala neznáma (obrázky 1 a 2). Vekový rozdiel môže vysvetľovať nižšiu krivku plazmatickej koncentrácie mačiek D a E, keďže tieto dve mačky sú mladšie ako ostatné (3 roky oproti 6 – 7 rokom). Zníženie hepatálneho klírensu, zvýšenie distribučného objemu liečiv rozpustných v lipidoch s predĺženým polčasom a zvýšená perorálna biologická dostupnosť boli navrhnuté ako vysvetlenie, prečo majú starší ľudia odlišnú farmakokinetiku v porovnaní s mladšími dospelými, a tieto príčiny by potenciálne mohli prispieť k rozdielom v plazmatickej koncentrácii u mačiek D a E [53,54]. Zvýšenie distribučného objemu a predĺžený polčas sa však u starších mačiek (mačky A, B, C a G) nepozorovali. U ľudí sú síce koncentrácie meflochínu v krvi počas gravidity nižšie ako u dospelých bez gravidity, ale vo farmakokinetických profiloch sa nezistili žiadne rozdiely v plazmatických koncentráciách meflochínu v závislosti od veku [55,56]. Zaujímavé je, že maximálne koncentrácie v krvi sú 2 – 3-krát vyššie u ázijských dospelých v porovnaní s neázijskými dobrovoľníkmi, pričom dôvod tohto etnického rozdielu nie je jasný [30,57]. Predpokladá sa, že k vyšším plazmatickým koncentráciám mohol prispieť menší distribučný objem sekundárne spôsobený nižším obsahom telesného tuku alebo rozdiely v enterohepatálnej cirkulácii liečiva u ázijských dobrovoľníkov [58]. V našej štúdii nebolo možné identifikovať rozdiely v plazmatických koncentráciách medzi pohlavím, kastračným stavom a telesnou hmotnosťou. Kocúr E mal tiež normálne biochemické analyty pred liečbou, v 168 a 336 h. Dysfunkcia pečene spôsobujúca zmenený metabolizmus lieku je nepravdepodobná; nemožno ju však úplne vylúčiť bez stanovenia hladiny žlčových kyselín pred a po liečbe na posúdenie funkcie pečene. U ľudí je meflochín metabolizovaný cytochrómom P450 3A (CYP 3A) v pečeni [59]. U mačiek sa zistilo, že aktivita CYP 3A je nižšia u mačiek v porovnaní s kocúrmi [60]. Zvláštnu krivku plazmatickej koncentrácie mačky E však nemožno vysvetliť. Ďalším vysvetlením by mohlo byť, že mačka E mohla po prvom podaní meflochínu zvracať bez toho, aby bola pozorovaná.

Rozdiel vo farmakokinetickom profile sa pozoruje u zdravých ľudí v porovnaní s ľuďmi infikovanými maláriou. U ľudí sú plazmatické koncentrácie meflochínu 2 – 3-krát vyššie u nekomplikovanej malárie falciparum v porovnaní so zdravými dobrovoľníkmi. Nekomplikovaná malária falciparum má tiež skrátený polčas [30,31,33,61]. Príčina nie je úplne objasnená. Jednou z možných príčin skráteného polčasu u pacientov s maláriou je zníženie enterohepatálnej cirkulácie a väčší fekálny klírens. Ďalším vysvetlením rozdielov vo farmakokinetickom profile medzi oboma skupinami je rozdiel vo väzbe meflochínu na plazmatické bielkoviny. Meflochín sa vo veľkej miere viaže na plazmatické bielkoviny, najmä na bielkoviny akútnej fázy, ako je alfa-1-kyslý glykoproteín (AGP) [62]. Predpokladá sa, že zvýšenie AGP pri malárii vedie k zvýšeniu väzby meflochínu na plazmatické bielkoviny, čo ovplyvňuje zdanlivý distribučný objem [61]. Vysoké hladiny AGP sa preukázali u experimentálne vyvolanej FIP [63] a prirodzene infikovaných mačiek s FIP [64,65] a v praxi sa bežne používa ako diagnostický nástroj FIP [66]. Je teda možné, že vysoká hladina AGP a potenciálne aj iných proteínov akútnej fázy u mačiek infikovaných FIP zvyšuje väzbu meflochínu na plazmatické proteíny, čo mení farmakokinetický profil u týchto mačiek. Väzba meflochínu na plazmatické bielkoviny u klinicky normálnych a FIP infikovaných mačiek bola skúmaná in vitro; rozdiel však bol nejednoznačný kvôli neznámej biologickej variabilite testu [19]. U mačiek s FIP sú potrebné ďalšie štúdie farmakodynamiky a farmakokinetiky meflochínu.

Počas tejto štúdie sa u všetkých mačiek pozoroval trend zvyšovania SDMA bez zmeny kreatinínu (obrázok 3). Ukázalo sa, že SDMA je v porovnaní s kreatinínom včasným renálnym biomarkerom [67 – 69] a zvyšuje sa pri akútnom poškodení obličiek a chronickom ochorení obličiek [70]. Zvýšené sérové koncentrácie SDMA boli u mačiek spojené so zníženou funkciou obličiek meranou pomocou rýchlosti glomerulárnej filtrácie (GFR) [71]. Na základe výsledku našej štúdie je možné, že meflochín môže spôsobiť zníženú funkciu obličiek u mačiek. Renálna toxicita z podávania antimalarík je u ľudí zriedkavá [72]. Ďalším vysvetlením zvýšených koncentrácií SDMA je vplyv celkovej anestézie a kumulatívny účinok izofluránu počas štúdie. Ukázalo sa, že sérové hladiny SDMA namerané po úvode do anestézie (17,11 g/dl) sú výrazne vyššie ako hladiny namerané pred úvodom do anestézie (12,39 g/dl) [73]. Keďže mačky boli počas odberov krvi anestézované izofluránom, mohlo to potenciálne prispieť k zvýšeniu koncentrácií SDMA. Metóda odberu krvi, dávkovanie meflochínu a nábor mačiek boli z dôvodu nedostatočnej dostupnosti subjektov zadané externému určenému zariadeniu na výskum zvierat (Invetus Pty, Ltd.,Casino, NSW, Austrália) a táto štúdia sa uskutočnila podľa štandardných pracovných postupov spoločnosti Invetus.

Jedným z obmedzení tejto štúdie bolo, že nie všetky mačky mali pred liečbou normálne pečeňové enzýmy. Tri mačky mali pred liečbou zvýšené hladiny ALT, AST a ALP. Keďže odber krvi, krvné testy pred liečbou a liečba boli vykonané v externom zariadení, vyšetrovatelia nevedeli o zvýšených pečeňových parametroch pred liečbou. Vyšetrovatelia tiež neboli zapojení do procesu náboru týchto mačiek a nebola známa lieková história a predchádzajúce záznamy o ochoreniach týchto mačiek. Napriek tomu sa významné zvýšenie ALT a ALP po liečbe meflochínom nevyskytlo. ALT a ALP zostali nezmenené po 336 hodinách u jednej mačky (mačka G). Krivka plazmatickej koncentrácie meflochínu u mačky G sa podstatne nelíšila od ostatných mačiek (mačky A, B a D).

Ďalším obmedzením je malý počet mačiek v našej štúdii. Len päť mačiek malo kompletné plazmatické koncentrácie meflochínu a do farmakokinetickej analýzy boli zahrnuté len štyri mačky (krivka nízkej koncentrácie mačky E bola vynechaná). Napriek malému počtu mačiek použitých v analýze sa poskytol dôležitý opis profilu liečiva meflochínu u klinicky normálnej mačky. Tieto predbežné informácie sú kľúčové pre všetky ďalšie výskumné projekty, ktoré zahŕňajú použitie meflochínu u mačiek.

Závery

Štúdia poskytuje predbežné údaje o farmakokinetickom profile meflochínu u mačiek a poskytuje užitočné informácie na plánovanie klinických skúšok meflochínu na liečbu mačiek s infekciami mačacím koronavírusom (vrátane FIP) a mačacím kalicivírusom a prípadne, ak to bude potrebné, na COVID-19 na potenciálne zníženie vylučovania vírusov. Na určenie terapeutickej výhody meflochínu u mačiek s týmito ochoreniami sú potrebné ďalšie štúdie o jeho terapeutických účinkoch.

Autorské príspevky: Konceptualizácia, J.M.N. a M.G.; metodika, M.G. a B.K.; softvér, B.K. a M.G.; validácia, M.G. a B.K.; formálna analýza, M.G. a B.K.; vyšetrovanie, M.G., B.K. a J.Y.; zdroje, M.G. a B.K.; kurátori údajov, M.G., J.Y. a B.K.; príprava pôvodného návrhu, J.Y.; písanie – recenzia a editovanie, J.Y., M.G. a J.M.N.; vizualizácia, M.G. a J.Y.; dohľad, J.M.N. a M.G.; administrácia projektu, M.G.; získavanie finančných prostriedkov, J.M.N., M.G. a B.K. Všetci autori si prečítali publikovanú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.

Financovanie: Tento výskum bol financovaný nadáciou Winn Feline Foundation, číslo grantu 2019_027, dar z pozostalosti Christine Gai Atkinsovej a z odkazu Lesley Muir zo Sydney School of Veterinary Science.

Poďakovanie: Autori sú vďační spoločnosti Invetus za podporu pri nábore mačiek, poskytnutie prístrešku, medikácie a odberu krvi mačiek.

Konflikt záujmov: Autori neuvádzajú žiadny konflikt záujmov. Financujúci sa nepodieľali na návrhu štúdie, na zbere, analýzach ani interpretácii údajov, na písaní rukopisu ani na rozhodnutí o uverejnení výsledkov.

Niektorí veterinári vo svete už používajú meflochín ako off-label liečbu FIP, zatiaľ čo formálny výskum a klinické testy pokračujú.

Dávkovanie podľa jedného z týchto výskumníkov: „Použitá dávka je 10 až 12 mg/kg dvakrát týždenne perorálne a musí sa podávať s malým množstvom jedla, aby sa zabránilo zvracaniu. To sa zvyčajne rovná u mnohých mačiek 1/4 250 mg tablety Lariam. Liek vykazuje dobrú penetráciu do centrálneho nervového systému u ľudí, preto dúfame, že môže byť prospešnejší aj pre ťažké neurologické prípady FIP. “

Vedci sa zaujímajú o všetky mačky s FIP v liečbe. Kontaktujte ma prosím súkromne prostredníctvom e-mailu na adrese defeatfip@verizon.net. Ďakujem.

Susan E Gingrich, zakladateľka fondu Bria pre výskum FIP, 12. 12. 2020

Poznámka: Celé balenie lieku Lariam s 8 tabletami (každá s obsahom 250mg meflochínu) stojí v prepočte cca 700 Kč (cca 27€). Jednalo by sa teda u veľmi lacnú formu liečby FIP. Dvojtýždenná liečba jednej mačky je teda lacnejšia ako 100Kč/4 €.

Literatúra

Felten, S.; Hartmann, K. Diagnosis of Feline Infectious Peritonitis: A Review of the Current Literature. Viruses 2019, 11, 1068.
Pedersen, N.C.; Allen, C.E.; Lyons, L.A. Pathogenesis of feline enteric coronavirus infection. J. Feline Med. Surg. 2008, 10, 529–541.
Addie, D.; Belak, S.; Boucraut‐Baralon, C.; Egberink, H.; Frymus, T.; Gruffydd‐Jones, T.; Hartmann, K.; Hosie, M.J.; Lloret, A.; Lutz, H.; et al. Feline infectious peritonitis. ABCD guidelines on prevention and management. J. Feline Med. Surg. 2009, 11, 594–604.
Pedersen, N.C. A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963–2008. J. Feline Med. Surg. 2009, 11, 225–258.
Pedersen, N.C., An update on feline infectious peritonitis: Diagnostics and therapeutics. Vet. J. 2014, 201, 133–141.
Tsai, H.Y.; Chueh, L.L.; Lin, C.N.; Su, B.L. Clinicopathological findings and disease staging of feline infectious peritonitis: 51 cases from 2003 to 2009 in Taiwan. J. Feline Med. Surg. 2011, 13, 74–80.
Hugo, T.B.; Heading, K.L. Prolonged survival of a cat diagnosed with feline infectious peritonitis by immunohistochemistry. Can. Vet. J. 2015, 56, 53–58.
Ishida, T.; Shibanai, A.; Tanaka, S.; Uchida, K.; Mochizuki, M. Use of recombinant feline interferon and glucocorticoid in the treatment of feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2004, 6, 107–109.
Kim, Y.; Liu, H.; Galasiti Kankanamalage, A.C.; Weerasekara, S.; Hua, D.H.; Groutas, W.C.; Chang, K.O.; Pedersen, N.C. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad‐spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog. 2016, 12, e1005531.
Kim, Y.; Mandadapu, S.R.; Groutas, W.C.; Chang, K.O. Potent inhibition of feline coronaviruses with peptidyl compounds targeting coronavirus 3C‐like protease. Antiviral Res. 2013, 97, 161–168.
Murphy, B.G.; Perron, M.; Murakami, E.; Bauer, K.; Park, Y.; Eckstrand, C.; Liepnieks, M.; Pedersen, N.C. The nucleoside analog GS‐441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet. Microbiol. 2018, 219, 226–233.
Pedersen, N.C.; Kim, Y.; Liu, H.; Galasiti Kankanamalage, A.C.; Eckstrand, C.; Groutas, W.C.; Bannasch, M.; Meadows, J.M.; Chang, K.O. Efficacy of a 3C‐like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2018, 20, 378–392.
Pedersen, N.C.; Perron, M.; Bannasch, M.; Montgomery, E.; Murakami, E.; Liepnieks, M.; Liu, H. Efficacy and safety of the nucleoside analog GS‐441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2019, 21, 271–281.
Hsieh, L.E.; Lin, C.N.; Su, B.L.; Jan, T.R.; Chen, C.M.; Wang, C.H.; Lin, D.S.; Lin, C.T.; Chueh, L.L., Synergistic antiviral effect of Galanthus nivalis agglutinin and nelfinavir against feline coronavirus. Antiviral Res. 2010, 88, 25–30.
Strasfeld, L.; Chou, S., Antiviral drug resistance: Mechanisms and clinical implications. Infect. Dis. Clin. North. Am. 2010, 24, 413–437.
Radford, A. D.; Addie, D.; Belak, S.; Boucraut‐Baralon, C.; Egberink, H.; Frymus, T.; Gruffydd‐Jones, T.; Hartmann, K.; Hosie, M. J.; Lloret, A.; Lutz, H.; Marsilio, F.; Pennisi, M. G.; Thiry, E.; Truyen, U.; Horzinek, M. C., Feline calicivirus infection. ABCD guidelines on prevention and management. J. Feline Med. Surg. 2009, 11 (7), 556–564.
McDonagh, P.; Sheehy, P.A.; Norris, J.M. Identification and characterisation of small molecule inhibitors of feline coronavirus replication. Vet. Microbiol. 2014, 174, 438–447.
Izes, A.M.; Kimble, B.; Norris, J.M.; Govendir, M. In vitro hepatic metabolism of mefloquine using microsomes from cats, dogs and the common brush‐tailed possum (Trichosurus vulpecula). PLoS One 2020, 15, e0230975.
Izes, A.M. Comparative studies of in vitro hepatic metabolism of mefloquine by feline microsomes and those of other selected species. PhD Thesis, The University of Sydney, Camperdown, NSW, Australia, November 2019.
Schwartz, D.E.; Weber, W.; Richard‐Lenoble, D.; Gentilini, M., Kinetic studies of mefloquine and of one of its metabolites, Ro 21‐5104, in the dog and in man. Acta. Trop. 1980, 37, 238–242.
Remple, J.D. Intracellular Hematozoa of Raptors: A Review and Update. J. Avian Med. Surg.2004, 18, 75– 88.
Grilo, M.L.; Vanstreels, R.E.; Wallace, R.; Garcia‐Parraga, D.; Braga, E.M.; Chitty, J.; Catao‐Dias, J.L.; Madeira de Carvalho, L.M. Malaria in penguins ‐ current perceptions. Avian Pathol. 2016, 45, 393–407.
Hamaguchi, M.; Suzuki, K.; Fujita, H.; Uzuka, T.; Matsuda, H.; Shishido‐Hara, Y.; Arai, S.; Nakamura, T.; Kikuchi, S.; Nakamichi, K.; et al. Successful treatment of non‐HIV progressive multifocal leukoencephalopathy: Case report and literature review. J. Neurol. 2020, 267, 731–738.
Nambirajan, A.; Suri, V.; Kataria, V.; Sharma, M.C.; Goyal, V. Progressive multifocal leukoencephalopathy in a 44‐year old male with idiopathic CD4+ T‐lymphocytopenia treated with mirtazapine and mefloquine. Neurol. India 2017, 65, 1061–1064.
McDonagh, P.; Sheehy, P.A.; Fawcett, A.; Norris, J.M., Antiviral effect of mefloquine on feline calicivirus in vitro. Vet. Microbiol. 2015, 176, 370–377.
Balasubramanian, A.; Teramoto, T.; Kulkarni, A.A.; Bhattacharjee, A.K.; Padmanabhan, R. Antiviral activities of selected antimalarials against dengue virus type 2 and Zika virus. Antiviral Res. 2017, 137, 141– 150.
Fan, H.H.; Wang, L.Q.; Liu, W.L.; An, X.P.; Liu, Z.D.; He, X.Q.; Song, L.H.; Tong, Y.G. Repurposing of clinically approved drugs for treatment of coronavirus disease 2019 in a 2019‐novel coronavirus (2019nCoV) related coronavirus model. Chin. Med. J. (Engl) 2020, 133 (9), 1051–1056.
Brickelmaier, M.; Lugovskoy, A.; Kartikeyan, R.; Reviriego‐Mendoza, M.M.; Allaire, N.; Simon, K.; Frisque, R.J.; Gorelik, L. Identification and characterization of mefloquine efficacy against JC virus in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 2009, 53, 1840–1849.
Owen, A.; Janneh, O.; Hartkoorn, R.C.; Chandler, B.; Bray, P.G.; Martin, P.; Ward, S.A.; Hart, C.A.; Khoo, S.H.; Back, D.J. In vitro synergy and enhanced murine brain penetration of saquinavir coadministered with mefloquine. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 314, 1202–1209.
Palmer, K.J.; Holliday, S.M.; Brogden, R.N. Mefloquine. A review of its antimalarial activity, pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy. Drugs 1993, 45, 430–475.
Karbwang, J.; White, N.J., Clinical pharmacokinetics of mefloquine. Clin. Pharmacokinet. 1990, 19, 264–279.
Desjardins, R.E.; Pamplin, C.L., 3rd; von Bredow, J.; Barry, K.G.; Canfield, C.J. Kinetics of a new antimalarial, mefloquine. Clin. Pharmacol. Ther. 1979, 26, 372–379.
Karbwang, J.; Na‐Bangchang, K., Clinical application of mefloquine pharmacokinetics in the treatment of P falciparum malaria. Fundam. Clin. Pharmacol. 1994, 8, 491–502.
Juma, F.D.; Ogeto, J.O. Mefloquine disposition in normals and in patients with severe Plasmodium falciparum malaria. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 1989, 14, 15–17.
Tan, K.R.; Arguin, P.M.; Arguin, T. Travel related infectious disease. In Centers for Disease Control and PRevention. CDC Yellow Book 2020: Health information for international travel Available online: https://www.cbc.gov/malaria/travelers/drugs.html (Accessed on 21st April2020)
Centers for Disease Control and Prevention, Malaria, how to choose a drug to prevent Malaria. Available online: https://www.cdc.gov/malaria/travelers/drugs.html (accessed on 21st April 2020).
White, N.J. Clinical pharmacokinetics of antimalarial drugs. Clin. Pharmacokinet. 1985, 10, 187–215.
Crevoisier, C.; Handschin, J.; Barre, J.; Roumenov, D.; Kleinbloesem, C. Food increases the bioavailability of mefloquine. Eur. J. Clin. Pharmacol. 1997, 53, 135–139.
Antony, H.A.; Parija, S.C. Antimalarial drug resistance: An overview. Trop. Parasitol. 2016, 6, 30–41.
Takano, T.; Katoh, Y.; Doki, T.; Hohdatsu, T. Effect of chloroquine on feline infectious peritonitis virus infection in vitro and in vivo. Antiviral Res. 2013, 99, 100–107.
Lundstrom, K. Coronavirus Pandemic‐Therapy and Vaccines. Biomedicines 2020, 8, 109.
Takano, T.; Satoh, K.; Doki, T.; Tanabe, T.; Hohdatsu, T. Antiviral Effects of Hydroxychloroquine and Type I Interferon on In Vitro Fatal Feline Coronavirus Infection. Viruses 2020, 12, 576.
Lobel, H.O.; Bernard, K.W.; Williams, S.L.; Hightower, A.W.; Patchen, L.C.; Campbell, C.C. Effectiveness and tolerance of long‐term malaria prophylaxis with mefloquine. Need for a better dosing regimen. JAMA 1991, 265, 361–364.
Tin, F.; Hlaing, N.; Lasserre, R. Single‐dose treatment of falciparum malaria with mefloquine: Field studies with different doses in semi‐immune adults and children in Burma. Bull. World Health Organ. 1982, 60, 913– 917.
Lobel, H.O.; Miani, M.; Eng, T.; Bernard, K.W.; Hightower, A.W.; Campbell, C.C. Long‐term malaria prophylaxis with weekly mefloquine. Lancet 1993, 341, 848–851.
Gribble, F.M.; Davis, T.M.; Higham, C.E.; Clark, A.; Ashcroft, F.M. The antimalarial agent mefloquine inhibits ATP‐sensitive K‐channels. Br. J. Pharmacol. 2000, 131, 756–760.
Ringqvist, A.; Bech, P.; Glenthoj, B.; Petersen, E. Acute and long‐term psychiatric side effects of mefloquine: A follow‐up on Danish adverse event reports. Travel Med. Infect. Dis. 2015, 13, 80–88.
Ritchie, E.C.; Block, J.; Nevin, R.L. Psychiatric side effects of mefloquine: Applications to forensic psychiatry. J. Am. Acad. Psychiatry Law 2013, 41, 224–235.
Lee, S.J.; Ter Kuile, F.O.; Price, R.N.; Luxemburger, C.; Nosten, F. Adverse effects of mefloquine for the treatment of uncomplicated malaria in Thailand: A pooled analysis of 19, 850 individual patients. PLoS One 2017, 12, e0168780.
Smith, H.R.; Croft, A.M.; Black, M.M. Dermatological adverse effects with the antimalarial drug mefloquine: A review of 74 published case reports. Clin. Exp. Dermatol. 1999, 24, 249–254.
Stracher, A.R.; Stoeckle, M.Y.; Giordano, M.F. Aplastic anemia during malarial prophylaxis with mefloquine. Clin. Infect. Dis. 1994, 18, 263–264.
Magnussen, P.; Bygbjerg, I.C. Treatment of Plasmodium falciparum malaria with mefloquine alone or in combination with i.v. quinine at the Department of Communicable and Tropical Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen 1982–1988. Dan. Med. Bull. 1990, 37, 563–564.
Klotz, U. Pharmacokinetics and drug metabolism in the elderly. Drug Metab. Rev. 2009, 41, 67–76.
Mangoni, A.A.; Jackson, S.H. Age‐related changes in pharmacokinetics and pharmacodynamics: Basic principles and practical applications. Br. J. Clin. Pharmacol. 2004, 57, 6–14.
Singhasivanon, V.; Chongsuphajaisiddhi, T.; Sabcharoen, A.; Attanath, P.; Webster, H.K.; Wernsdorfer, W.H.; Sheth, U.K.; Djaja Lika, I. Pharmacokinetics of mefloquine in children aged 6 to 24 months. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 1992, 17, 275–279.
Vieira, J.L.; Borges, L.M.; Ferreira, M.V.; Rivera, J.G.; Gomes Mdo, S. Patient age does not affect mefloquine concentrations in erythrocytes and plasma during the acute phase of falciparum malaria. Braz. J. Infect. Dis. 2016, 20, 482–486.
Karbwang, J.; Bunnag, D.; Breckenridge, A.M.; Back, D.J. The pharmacokinetics of mefloquine when given alone or in combination with sulphadoxine and pyrimethamine in Thai male and female subjects. Eur. J. Clin. Pharmacol. 1987, 32, 173–177.
Looareesuwan, S.; White, N.J.; Warrell, D.A.; Forgo, I.; Dubach, U.G.; Ranalder, U.B.; Schwartz, D.E. Studies of mefloquine bioavailability and kinetics using a stable isotope technique: A comparison of Thai patients with falciparum malaria and healthy Caucasian volunteers. Br. J. Clin. Pharmacol. 1987, 24, 37–42.
Fontaine, F.; de Sousa, G.; Burcham, P.C.; Duchene, P.; Rahmani, R. Role of cytochrome P450 3A in the metabolism of mefloquine in human and animal hepatocytes. Life Sci. 2000, 66, 2193–2212.
Shah, S.S.; Sanda, S.; Regmi, N.L.; Sasaki, K.; Shimoda, M. Characterization of cytochrome P450‐mediated drug metabolism in cats. J. Vet. Pharmacol. Ther. 2007, 30, 422–428.
Reuter, S.E.; Upton, R.N.; Evans, A.M.; Navaratnam, V.; Olliaro, P.L. Population pharmacokinetics of orally administered mefloquine in healthy volunteers and patients with uncomplicated Plasmodium falciparum malaria. J. Antimicrob. Chemother. 2015, 70, 868–876.
Zsila, F.; Visy, J.; Mady, G.; Fitos, I. Selective plasma protein binding of antimalarial drugs to alpha1‐acid glycoprotein. Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 3759–3772.
Stoddart, M.E.; Whicher, J.T.; Harbour, D.A. Cats inoculated with feline infectious peritonitis virus exhibit a biphasic acute phase plasma protein response. Vet. Rec. 1988, 123, 622–624.
Duthie, S.; Eckersall, P.D.; Addie, D.D.; Lawrence, C.E.; Jarrett, O. Value of alpha 1‐acid glycoprotein in the diagnosis of feline infectious peritonitis. Vet. Rec. 1997, 141, 299–303.
Giordano, A.; Spagnolo, V.; Colombo, A.; Paltrinieri, S. Changes in some acute phase protein and immunoglobulin concentrations in cats affected by feline infectious peritonitis or exposed to feline coronavirus infection. Vet. J. 2004, 167, 38–44.
Paltrinieri, S.; Giordano, A.; Tranquillo, V.; Guazzetti, S. Critical assessment of the diagnostic value of feline alpha1‐acid glycoprotein for feline infectious peritonitis using the likelihood ratios approach. J. Vet. Diagn. Invest. 2007, 19, 266–272.
Hall, J.A.; Yerramilli, M.; Obare, E.; Yerramilli, M.; Jewell, D.E. Comparison of serum concentrations of symmetric dimethylarginine and creatinine as kidney function biomarkers in cats with chronic kidney disease. J. Vet. Intern. Med. 2014, 28, 1676–1683.
Nabity, M.B.; Lees, G.E.; Boggess, M.M.; Yerramilli, M.; Obare, E.; Yerramilli, M.; Rakitin, A.; Aguiar, J.; Relford, R. Symmetric dimethylarginine assay validation, stability, and evaluation as a marker for the early detection of chronic kidney disease in dogs. J. Vet. Intern. Med. 2015, 29, 1036–1044.
Yerramilli, M.; Farace, G.; Quinn, J.; Yerramilli, M. Kidney disease and the nexus of chronic kidney disease and acute kidney injury: the role of novel biomarkers as early and accurate diagnostics. Vet. Clin. North. Am. Small Anim. Pract. 2016, 46, 961–993.
Dahlem, D.P.; Neiger, R.; Schweighauser, A.; Francey, T.; Yerramilli, M.; Obare, E.; Steinbach, S.M.L. Plasma symmetric dimethylarginine concentration in dogs with acute kidney injury and chronic kidney disease. J. Vet. Intern. Med. 2017, 31, 799–804.
Braff, J.; Obare, E.; Yerramilli, M.; Elliott, J.; Yerramilli, M. Relationship between serum symmetric dimethylarginine concentration and glomerular filtration rate in cats. J. Vet. Intern. Med. 2014, 28, 1699– 1701.
Wiwanitkit, V. Antimalarial drug and renal toxicity. J. Nephropharmacol. 2016, 5, 11–12.
Namba, S.; Kitamura, R.; Amaha, T.; Befu, M.; Zama, T.; Moriwaki, T.; Kumono, S.; Shichijo, S. Impact of general anesthesia on serum symmetric dimethylarginine concentration in cats, American Association of Feline Practitioners Conference 2018, Charlotte, NC, USA, 27th–30th September 2018

27. 10. 202029. 3. 2023

Rýchly ústup neefuzívnej FIP uveitídy pri liečbe orálnou formou adenozínového analógu a mačacím omega interferónom

Diane D. Addie, Johanna Covell-Ritchie, Oswald Jarrett, and Mark Fosbery
Originálny článok: Rapid Resolution of Non-Effusive Feline Infectious Peritonitis Uveitis with an Oral Adenosine Nucleoside Analogue and Feline Interferon Omega
27.10.2020; Preklad 23.3.2021

Abstrakt

Toto je prvá správa o úspešnej liečbe prípadu neefuzívnej FIP uveitídy s použitím orálnej formy adenozínového analógu a mačacieho interferónu omega, a alfa-1 kyslého glykoproteínu (AGP) ako indikátora zotavenia. 2-ročný kastrovaný kocúr Nórskej lesnej mačky bol postihnutý uveitídou, keratickými zrazeninami, mezenterickou lymfadenopatiou a úbytkom hmotnosti. Bol hypergamaglobulinemický a mal neregeneratívnu anémiu. RNA mačacieho koronavírusu (FCoV) bola detegovaná pomocou aspiračnej biopsie mezenterických lymfatických uzlín tenkou ihlou s využitím polymerázovej reťazovej reakcie s reverznou transkripciou (RT-PCR) – diagnostikovala sa neefuzívna FIP. Očné kvapky prednisolónacetátu sa podávali trikrát denne počas 2 týždňov. Zahájila sa liečba orálnou formou adenozínového analógu (Mutian). Za 50 dní liečby Mutianom kocúr pribral na hmotnosti viac ako jeden kilogram, hladina globulínu sa znížila zo 77 na 51 g/l a hematokrit sa zvýšil z 22 na 35%; uveitída ustúpila a zlepšil sa zrak. Hladina AGP v sére sa znížila z 3100 na 400 μg/ml (v normálnych medziach). Symetrický dimetylarginín (SDMA) bol nad normálom pri 28 μg/dl, po ukončení liečby sa znížil na 14 μg/dl; či bolo zvýšenie SDMA spôsobené léziami FIP v obličkách alebo Mutianom, nie je známe. Po skončení liečby Mutianom sa začali podávať nízke dávky orálnej formy rekombinantného mačacieho interferónu omega – zotavovanie kocúra pokračovalo.

Kľúčové slová: infekčná peritonitída mačiek, koronavírus, uveitída, Mutian, adenozínový analóg, mačací interferón omega, mezenterické lymfatické uzliny, alfa-1 kyslý glykoproteín, symetrický dimetylarginín

1. Úvod

Mačací koronavírus (FCoV) je vysoko infekčný enterický vírus, ktorý spôsobuje subklinickú infekciu alebo hnačku u väčšiny infikovaných mačiek ^[1], ale asi u 10% spôsobuje potenciálne smrteľnú imunitne sprostredkovanú granulomatóznu vaskulitídu spojenú s monocytmi ^[2], známu ako mačacia infekčná peritonitída (FIP). FCoV je alfa koronavírus s pozitívnou polaritou, člen rodiny Coronaviridae z radu Nidovirales ^[3].

Aj keď už bola v minulosti popísaná liečba FIP injekčným nukleozidovým analógom ^[4] a vyliečenie enterickej infekcie FCoV orálnou formou adenozínového analógu (Mutian, Nantong Biotechnology, Čína) ^[5], toto je prvý popísaný prípad zotavenia mačky so systémovou infekciou FCoV – tj. FIP – s použitím Mutianu.

2. Kazuistika

Skywise bol 2-ročný kastrovaný samec nórskej lesnej mačky z domácnosti s piatimi mačkami; prejavila sa u neho uveitída v zostávajúcom oku (v pravom, o ľavé oko prišiel ako mačiatko) a občasné hnačky. Jeho dúhovka bola neprirodzene zafarbená a boli viditeľné zrnité tukové zrazeniny (obrázok 1a).

**Obrázok 1**
Mačacie oko pred (a) a (b) po liečbe Mutianom a lokálnymi steroidmi. Mačka mala uveitídu a keratické zrazeniny (a). Vpravo (b): to isté oko po 7 dňoch systémového prednizolónu, 2 týždňoch lokálneho prednizolónu a 7 týždňoch liečby liekom Mutian, vykazujúce takmer úplné odznenie uveitídy.

Jeho anamnéza zahŕňala privedenie dvoch 11-mesačných nórskych lesných mačiek (Link a Zelda) do domácnosti pred tromi mesiacmi a nástup uveitídy päť dní po revakcinácii (Leucofeligen, Virbac, Francúzsko). Skywise bol testovaný na protilátky FCoV a zistilo sa, že má veľmi vysoký titer nad 10 240 (Idexx Laboratories, Wetherby, UK) tri týždne pred prezentáciou kvôli tomu, že mačka, s ktorou bol v kontakte (Paddy), bola trvale pyrexická a malátna. Paddy bol negatívny na antigény FeLV p27 a protilátky FIV (Idexx Laboratories, Wetherby, UK), ale zistilo sa, že jeho titer protilátok proti FCoV bol veľmi vysoký (tabuľka 1), preto boli všetky ostatné mačky v domácnosti testované na protilátky FCoV, aby sa rozhodlo, či by sa mali izolovať od Paddyho, ale pretože sa tiež zistilo, že majú vysoké titre protilátok FCoV (tabuľka 1), segregácia nebola nutná.

		Deň −29	Deň −19	Deň 7	Deň 41
Skywise	2 roky – Nórska lesná mačka (NFC) FIP		>10,240	C_T 30	Neg
Paddy	2 roky – NFC, pretrvávajúca pyrexia, letargia	>10,240		C_T 18	Neg
Oliver	8 rokov – Domáca krátkosrstá mačka		>10,240	C_T 20	Neg
Link	1 rok – NFC		>10,240	C_T 20	Neg
Zelda	1 rok – NFC		640	Neg	Neg

Tabuľka 1
Titer protilátok mačacieho koronavírusu (FCoV) a výsledky qRT-PCR C_T.

C_T — Prahová hodnota cyklu pre test FCoV qRT-PCR vykonaný na vzorke stolice. Dni sú relatívne k prvej predpokladanej diagnóze infekčnej peritonitídy mačiek (FIP) u Skywise v deň 0 (18. apríla 2020); tj. jeho titer protilátok FCoV bol testovaný 19 dní pred diagnózou FIP. Liečba Mutianom sa začala pre Skywise 6. deň a pre ďalšie mačky infikované FCoV 18. deň v trvaní 5 dní.

Pri prezentácii bola telesná hmotnosť pacienta 2,89 kg (obrázok 2) a skóre telesnej kondície bolo 2/9. Ultrazvukové vyšetrenie potvrdilo absenciu brušného alebo hrudného výpotku, bola však prítomná mezenterická lymfadenopatia. Aspirát z mezenterickej lymfatickej uzliny (MLN) bol odobratý ultrazvukom vedenou aspiračnou biopsiou s tenkou ihlou (FNA) a bol testovaný na FCoV polymerázovou reťazovou reakciou s reverznou transkripciou (qRT-PCR) (Idexx Laboratories, Wetherby, UK). Test bol pozitívny na mutáciu M1058L a negatívny na mutáciu S1060A ^[6].

**Obrázok 2**
Váha pred, počas a po zotavení z FIP a časová os. Hmotnosť mačky je uvedená na grafe vyššie: Deň 0 predstavuje deň prezentácie s uveitídou na klinike. 5 dní pred objavením sa uveitídy bola vykonaná revakcinácia, ale hmotnosť mačky pred týmto dňom nebola zaznamenávaná, takže nie je známe, či chudla už pred revakcináciou alebo či došlo k zníženiu hmotnosti po revakcinácii; tj. či FIP prebiehala už pred revakcináciou, alebo či FIP bola spôsobená samotnou revakcináciou. Mačka stratila 30g hmotnosti počas systémovej liečby prednizolónom (dni 0 až 6), potom sa podávali iba lokálne steroidy. Liečba Mutianom prebiehala medzi 6. a 56. dňom; po začatí liečby Mutianom sa hmotnosť mačky rýchlo zvýšila a prírastok hmotnosti pokračoval aj potom, čo bol Mutian nahradený mačacím interferónom omega, až kým hmotnosť kocúra dosiahla okolo 4,35 kg.

Výsledky krvi sú uvedené v tabuľke 2. Hematológia odhalila miernu až stredne ťažkú neregeneratívnu anémiu s hematokritom (HCT) 22%, počtom lymfocytov 2,07 × 10⁹/l a eozinopéniou pod detekčnou hladinou (reportovaná ako 0,0 × 10⁹/l). Biochemická analýza krvi ukázala hyperglobulinémiu (77,2 g/l) a pomer albumínu ku globulínu (A:G) 0,31. Bilirubín bol 11 mikromolov na liter (μmol/l) (0,64 mg/dl). Alfa-1 kyslý glygoproteín (AGP) bol zvýšený na 3100 μg/ml (Idexx Laboratories, Wetherby, UK) (normálna hladina je ≤ 500 μg/ml ^[7]).

	AGP	TP	Alb	Glob	A:G	Bilirubin	Hct	Lymfocyty	ALT	AP	GGT	SDMA	Creat	Urea
Ref. rozsah	<500 μg/mL	57–89 g/L	22–40 g/L	28–51 g/L	>0.8 *	0–15 μmol/L	30–52%	0.92–6.88 × 10⁹	12–130 U/L	14–111 U/L	0–4 U/L	0–14 μg/dL	71–212 μmol/L	5.7–12.9 mmol/L
Deň 0	ND	111	20	91	0.22	11	25.7	0.95	64	ND	ND	ND	ND	ND
Deň 2	3100	103	24	77	0.31	ND	22.0	2.07	ND	ND	ND	ND	ND	ND
Deň 18	700	83	26	57	0.46	6	34.4	3.61	27	32	0	ND	88	9.6
Deň 41	400	80	29	51	0.57	5	35.1	3.85	67	40	0	28	93	8.3
Deň 62	400	78	30	48	0.60	5	35.2	2.64	61	40	0	19	106	6.5
Deň 90	300	78	31	47	0.70	6	40.0	4.15	81	40	0	14	113	10.0
Deň 153	400	67	34	33	1.03	1	35.2	4.49	81	46	2	ND **	98	7.8

Tabuľka 2
Laboratórne údaje týkajúce sa monitorovania liečby FIP.

* A: G nad 0,8 má silnú negatívnu prediktívnu hodnotu pre FIP [8]. ** SDMA nebola opakovaná, pretože analýza moču bola normálna. AGP – alfa-1 kyslý glykoproteín; TP — celkový proteín; Alb – albumín; Glob – globulín; A: G — pomer albumínu k globulínu; Hct – hematokrit; ALT – alanínaminotransferáza; AP – alkalická fosfatáza; GGT – gama glutamyltransferáza; SDMA – symetrický dimetylarginín; Creat – kreatinín; ND = neurčené.

V tejto tabuľke sú zobrazené iba parametre, ktoré boli monitorované opakovane; ďalšie, pre ktoré bolo k dispozícii iba málo (alebo vôbec žiadne) výsledkov (napr. aspartátaminotransferáza), alebo ktoré neboli relevantné pre postup v tomto prípade, sú vynechané. Titer protilátok FCoV a výsledky FCoV qRT-PCR v stolici sú uvedené v tabuľke 1. Deň 0 je dňom diagnózy FIP u prvej mačky; Mutian sa podával medzi 6. a 56. dňom, potom sa mačka začala liečiť 100 000 jednotkami orálnej formy mačacieho interferónu omega.

Systémová liečba bola zahájená prednizolónom v dávke 5 mg pre uveitídu (tabuľka 3). Dávka sa znížila na 2,5 mg sid, potom sa po 7 dňoch ukončila a nahradila sa lokálnou prednizolón-acetátovou 1% očnou suspenziou (Pred Forte®, Allergan, Dublin, Írsko), aplikovanou každých 8 hodín počas dvoch týždňov. Šiesty deň po prezentácii začala liečba orálnym adenozínovým analógom (Mutian 200, Nantong Biotechnology, Nantong, Čína) ^[5] v dávke 8 mg/kg každých 24 hodín v rozdelených dávkach: išlo o dvojnásobok normálnej dávky, v úsilí aby sa zabezpečil prienik do očnej gule. Na podporu pečene počas liečby liekom Mutian sa odporúčal doplnok s obdahom S-adenosyl-L-metionínu. Dávka Mutianu sa 25. deň znížila na 6mg/kg, ale dovtedy sa hmotnosť mačky zvýšila, takže bol nutný rovnaký počet kapsúl denne.

Liečba			Deň	Oftalmoskopické nálezy
Systémový prednizolón			0	Deň prezentácie primárnemu veterinárnemu lekárovi.
			1	Oko vyšetrené pomocou štandardného oftalmoskopu. Rohovka bez zmien, predná komora mierne zakalená, na podrobné vyšetrenie by však bola potrebná sedácia. Mačka nevidiaca a vystresovaná.
			2	Vzorky krvi a aspiráty mezenterických lymfatických uzlín tenkou ihlou odobraté pod sedáciou.
	Lokálne prednizolón-acetát 1% tid		4	Na šošovke vyzrážaný keratín (bielkovina), ktorý čiastočne zakrýva fundus. Pupilárny svetelný reflex prítomný, ale znížený.
		Mutian 8mg/kg po dobu 19 dní, potom 6mg/kg	6	Opatrovateľ mačky uviedol, že si myslí, že mačka vidí.
			17	Opatrovateľ mačky uviedol, že mačka prenasledovala vtáka.
			18	Uveitída ustupuje, predná komora číra. Keratické zrazeniny ako predtým.
			41	Uveitída do značnej miery ustúpila, keratické zrazeniny stále prítomné. Fundus viditeľný, chorioretinitída ustúpila, vysoký temperament mačky znemožnil podrobné vyšetrenie. Vynikajúca zraková vnímavosť.

Tabuľka 3
Časová os liečby a ústupu uveitídy.

Pre vyhodnotenie citlivosti kmeňa FCoV na používané antivirotikum boli vzorky trusu podrobené FCoV qRT-PCR testu (Veterinary Diagnostic Services, University of Glasgow, Škótsko) ^[5]; výsledok bol slabo pozitívny v prahovom cykle (CT) 30, potom negatívny, čo ukazuje, že vírus bol citlivý na antivirotikum (tabuľka 1). Trus troch zo štyroch ďalších mačiek v domácnosti bol tiež pozitívny na FCoV RNA (tabuľka 1).

Po začatí liečby Mutianom sa hmotnosť kocúra rýchlo zvýšila, kým počas liečby prednizolónom sa znížila o 30g (2,89-2,86 kg) (obrázok 2). Po 40 dňoch Mutianu kocúr pribral jeden kilogram (obrázok 2). Dávka Mutianu sa upravovala počas liečby v súlade s nárastom hmotnosti.

Krvné testy sa opakovali 13. deň liečby Mutianom (18 dní po diagnostikovaní) (tabuľka 2). Najdôležitejšie je, že anémia sa zvrátila, HCT sa zvýšil z 22,0 na 34,4% a bilirubín klesol z 11 na 6 μmol/l. Globulín klesol na 57 g/l a albumín sa zvýšil o 2 g/l, takže pomer albumín:globulín sa zvýšil z 0,31 na 0,46, čo bolo stále malé, ale predsa len zlepšenie (obrázok 3). Klinické vyšetrenie odhalilo, že farba dúhovky sa vrátila k normálu (obrázok 1, tabuľka 3) a došlo k zlepšeniu zraku; opatrovateľ hlásil zvýšenie aktivity – hranie sa s ostatnými mačkami – a že sa kocúr pokúsil chytiť vtáka. Jeho trus znovu nadobudol normálnu konzistenciu a frekvenciu.

**Obrázok 3**
Časová os liečby vo vzťahu k hladinám albumínu globulínu, ktorá ukazuje zníženie hladín globulínu (a teda celkového proteínu), zvýšenie albumínu a pomeru albumínu ku globulínu. Zlepšenie týchto parametrov pokračovalo aj po ukončení liečby Mutianom a pri liečbe mačacím interferónom omega.

Dávka Mutianu sa od 20. dňa liečby znížila na 6 mg/kg a liečba Mutianom sa ukončila po 7 týždňoch z dvoch dôvodov: hladiny AGP sa vrátili k normálu (400 μg/ml – normálna hodnota je <500 μg/ml), a pretože SDMA stúpol na 28 μg/dl (referenčný rozsah je pod 14μg/dl). Rekombinantný mačací interferón omega (rFeIFN-ω; Virbagen Omega, Virbac, Francúzsko) začínal na 100 000 jednotkách každých 24 hodín per os. SDMA sa znížila na 19μg/dl v 62. deň (jeden týždeň po ukončení liečby Mutianom) a na 14 μg/dl v 90. deň, čo bolo 35 dní po ukončení liečby Mutianom (tabuľka 2). Analýza moči uskutočnená v 62., 90. a 153 deň neodhalila žiadne abnormality a špecifická hmotnosť bola 1 050, 1 055 a > 1 050, v uvedenom poradí. Prírastok hmotnosti pokračoval aj po ukončení liečby Mutianom a nasadení mačacieho interferónu omega (obrázok 1), aj keď pomalšou rýchlosťou (v priemere 9g/deň namiesto 23g/deň).

Spolubývajúce mačky boli úspešne liečené Mutianom v dávke 4 mg/kg po dobu piatich dní, aby sa zabránilo vylučovaniu koronavírusu, a tým aj opakovanej infekcii zotaveného kocúra; trus všetkých piatich mačiek bol potvrdený ako negatívny pomocou RT-PCR (tabuľka 1).

3. Diskusia

Úspešnú liečbu FIP pomocou antivírusových liekov ako prvý publikoval Dr. Pedersen ^[4,9]. Majitelia mačiek môžu získať rôzne anti-FCoV lieky, vrátane Mutianu – orálnej formy adenozínového analógu cez internet. Takéto lieky však nie sú licencované pre veterinárne použitie, čo stavia ošetrujúcich veterinárnych lekárov pred dilemu: nemôžu takúto liečbu predpisovať ani dodávať, ale poskytnutím diagnostickej a bežnej podpornej liečby môžu pomôcť klientom, ktorí sa rozhodnú tieto lieky užívať. Užitočné je najmä stanovenie presnej diagnózy, ktorá zabráni liečbe asi 40% mačiek, u ktorých by inak bola chybne stanovená nesprávna diagnóza (údaje nie sú uvedené). Náš názor je, že vhodnejšie by bolo, keby majitelia mačiek používali takéto lieky pod náležitým veterinárnym dohľadom, aj keď sú tieto výrobky nelicencované. Účelom tejto prípadovej štúdie je podať správu o tom, čo sa nám osvedčilo pri monitorovaní prípadu neefuzívnej FIP liečenej liekom Mutian, po ktorom nasledoval mačací interferón.

Diagnostika neefuzívnej FIP je náročná, pretože príznaky sú rôznorodé a zoznam diferenciálnych diagnóz je často zdĺhavý. Dunbar a kol. 2019 ^[10], uviedli, že detekcia FCoV RNA z mezenteriálnej lymfatickej uzliny (MLN) FNA (Fine Needle Aspiration – Aspiračná biopsia tenkou ihlou) je z hľadiska diagnostiky FIP špecifická na 96%. Laboratórium nanešťastie spočiatku chybne urobilo test FCoV RT-PCR na vzorke krvi z 2. dňa, namiesto MLN FNA podľa požiadaviek – a test vyšiel negatívny. FCoV RT-PCR na krvných vzorkách nie je pri diagnostike FIP užitočná, pretože väčšina mačiek s FIP nie je v čase klinických prejavov viremická ^[11] a tiež preto, že asi 5% mačiek nemá pozitívny test FIP ^[12,13]pretože FCoV infikované mačky prechádzajú prechodnou virémiou ^{[12,13,14,15]}. FCoV RNA sa našla v mačacom MLN FNA a odhalila, že je pozitívna na mutáciu M1058L, čo bolo ďalším dôkazom podporujúcim diagnózu FIP ^[6,11]; aj keď substitúcia metionínom za leucín na pozícii 1058 v FCoV spike proteíne sa našla v 89% vzoriek tkaniva od 14 mačiek bez FIP, čo naznačuje, že mutácia skôr indikuje systémové šírenie FCoV z čreva, ako vírus s potenciálom spôsobiť FIP ^[16].

Napriek oneskoreniu spôsobenému laboratóriom pri potvrdení diagnózy FIP, sme iniciovali liečbu Mutianom na základe anamnézy, klinických príznakov, krvných výsledkov a zvýšeného AGP, o ktorom sa predtým preukázalo, že je veľmi špecifický pre odlíšenie FIP od od iných chorôb s podobnými prejavmi ^[17]. Nastal pocit naliehavosti zahájiť liečbu, pretože kocúrove stagingové skóre FIP bolo 6, čo naznačuje smrť do dvoch týždňov ^[18]. HCT kocura rýchlo klesal (z 25,7 na 22% za dva dni), čo sa ukázalo ako indikátor hroziacej blízkej smrti: Tsai a kol., (2011) ^[18] zistili, že hladiny HCT dramaticky klesajú 2 týždne pred smrťou a bilirubín sa zvyšuje jeden týždeň pred smrťou.

Anamnéza kocúra bola typická pre mnoho prípadov FIP: do domácnosti boli privedené dve nové jedenásťmesačné čistokrvné mačky, ktoré boli pravdepodobne zdrojom nedávnej infekcie koronavírusmi; kocúr bol vakcinovaný päť dní pred prepuknutím uveitídy. Privedenie nových mačiek aj očkovanie sú pre mačku stresujúce – je známe, že stres vyvoláva FIP u mačiek infikovaných FCoV ^[19] a Riemer a kol., (2016) ^[20] zistili, že očkovanie bolo podozrivým stresujúcim faktorom v 6,9 % prípadov FIP. Hmotnosť kocúra medzi privedením nových mačiek a očkovaním bohužiaľ nebola zaznamenávaná, takže nie je známe, či chudol už pri revakcinácii (tj. bola subklinicky chorá na FIP), alebo či sa chudnutie začalo neskôr. Tento prípad napriek tomu ilustruje, že očkovanie mačiek infikovaných FCoV môže predstavovať riziko pre rozvoj FIP, a že optimálne by sa očkovanie malo vykonať potom, čo mačka prestane vylučovať vírus, k čomu dôjde v priebehu niekoľkých mesiacov u väčšiny infekcií FCoV typu 1 ^{[21 ]}.

Klinické príznaky týkajúce sa chudnutia, zlej chuti do jedla, hnačky a uveitídy boli tiež v súlade s diagnózou neefuzívnej FIP. FIP je hlavnou príčinou uveitídy u mladých mačiek – oftalmológovia z Veterinárnej školy v Severnej Karolíne diagnostikovali FIP u 19 zo 120 mačiek (15,8%) s uveitídou ^[22]. Uveitída bola hlásená u 17 z 59 (29%) mačiek s neefuzívnou FIP ^[23].

Aj keď liečba injekčným nukleozidovým analógom už bola pri liečbe FIP zdokumentovaná skôr ^[4], podľa našich poznatkov nebola perorálna liečba FIP analógom adenozínu predtým zaznamenaná, hoci bola použitá pri liečbe infekcie FCoV u asymptomatických alebo hnačujúcich mačiek^[5]. Pacientovi bola podávaná dvojnásobná bežná liečebná dávka FIP (tj. 8 mg/kg oproti 4 mg/kg), aby sa potenciálne zvýšila koncentrácia liečiva v oku a vylúčil akýkoľvek vírus, ktorý by sa mohol nachádzať v mozgu, pretože iba 20% absorbovaného liečiva prechádza hematoencefalickou bariérou (T Xue, osobná komunikácia). Odozva na liečbu bola rýchla, dramatická a mimoriadne pozitívna. Aj keď sme sa v prípade možných vedľajších účinkov snažili čo najskôr znížiť dávku Mutianu, v praxi sa množstvo liekov významne nezmenilo, pretože mačka súčasne rýchlo priberala. Pedersen et al., (2019)^[4] uviedli, že najjednoduchším indikátorom reakcie na liečbu je zvýšenie hmotnosti, ktoré bolo v tomto prípade ohromujúce, keďže kocúr pribral počas prvých 50 dní liečby 1,1 kg. Na rozdiel od toho schudol o 30g v priebehu týždňa na prednisolóne, pred začiatkom liečby Mutianom.

V dvoch štúdiách mačky s FIP liečené kortikosteroidmi mali strednú dobu prežitia 7,5 dňa ^[24] a 8 dní ^[25], čo je podstatne kratšie ako priemer 21 dní uvádzaný Tsai a kol., 2011 ^[18] (aj keď u tých dvoch štúdií je potrebné vziať do úvahy potenciálny nepriaznivý vplyv biopsií na prežitie a mnoho úmrtí bolo spôsobených sekundárnou bakteriálnou infekciou v dôsledku rozsiahlej imunosupresie vyvolanej kortikosteroidmi ^[25]). Okrem toho sa predtým zistilo, že liečba prednizolónom skracuje čas prežitia u mačiek s FIP, ktoré boli súčasne liečené polyprenylovým imunostimulantom ^[23]. Preto boli v našom prípade na liečbu uveitídy systémové kortikosteroidy nahradené lokálnymi kortikosteroidmi.

Nevieme, či to bol Mutian, systémové a lokálne steroidy, alebo kombinácia všetkých liečebných postupov, ktoré ovplyvnili celkové vyliečenie uveitídy. Majiteľ kocúra hlásil čiastočný návrat zraku v 6. deň, čo bol deň, keď začala liečba Mutianom, čo naznačuje, že za návrat zraku boli zodpovedné steroidy (tabuľka 3). Legendre a kol., (2017) ^[23] uviedli pokrok u 3 zo 17 mačiek s okulárnymi prejavmi FIP liečených polyprenylovým imunostimulantom (PI). Ich počiatočné príznaky zahŕňali prednú uveitídu (všetky tri mačky), zrazeniny keratického pôvodu (jedna mačka), zmenu farby dúhovky (jedna mačka) a anizokóriu (jedna mačka). U dvoch mačiek sa predná uveitída významne zlepšila alebo ustúpila po 2 mesiacoch liečby PI bez kortikosteroidov. U tretej mačky sa uveitída nezlepšila; mačka dostávala lokálne očné kortikosteroidy súčasne s PI a oči boli enukleované^[23]. Či samotný Mutian môže alebo nemôže ovplyvňovať liečbu uveitídy spojenej s FIP bez súčasných lokálnych kortikosteroidov, sa ešte len ukáže. Zdá sa, že systémové kortikosteroidy majú v týchto prípadoch malý alebo žiadny význam.

Počas liečby liekom Mutian sa nepozorovali žiadne klinické vedľajšie účinky a biochemické parametre pečene a obličiek boli v referenčnom rozsahu s výnimkou plazmatického symetrického dimetylarginínu (SDMA), ktorý sa zvýšil (tabuľka 2). SDMA je skorým indikátorom ochorenia obličiek ^[26,27]. Existujú tri možné vysvetlenia zvýšeného SDMA: po prvé, môže to byť dôsledok lézií FIP v obličkách. Azotémia je pravdepodobnejšia pri neefuzívnej, ako efuzívnej FIP ^[20], ale pokiaľ vieme, nebola vykonaná žiadna štúdia, ktorá by zisťovala, či SDMA stúpa u mačiek s FIP – veterinárni patológovia predpokladajú, že prechodná FCoV infekcia obličiek môže byť príčinou intersticiálnej nefritídy pozorovanej u mnohých starších mačiek (W Jarrett a S Toth, osobná komunikácia). Po druhé, predispozícia k plemenu môže byť faktorom – zistilo sa, že birmské mačky vykazovali zvýšenú hladinu SDMA ^[28], ale neuskutočnila sa žiadna štúdia o hladinách SDMA u nórskych lesných mačiek a u kocúra hladina SDMA klesla na normálnu úroveň, čo naznačuje, že zvýšená hladina SDMA zrejme nemala súvislosť s jeho príslušnosťou k plemenu. Po tretie, zvýšený SDMA mohol byť vedľajším účinkom liečby Mutianom – SDMA sa znížil do siedmich dní po ukončení liečby Mutianom a vrátil sa do normálu do 35 dní po ukončení liečby Mutianom. Pretože sme ho však v priebehu choroby netestovali skôr, nevieme, či bol zvýšený pred nasadením Mutianu. Počas liečby boli kreatinín a močovina u kocúra vždy v normálnych medziach, aj keď bol pozorovaný progresívny nárast kreatinínu (tabuľka 2), ktorý bude v budúcnosti starostlivo sledovaný.

Pretože odporúčaná doba podávania GS-441524 bola 84 dní ^[4], majitelia mačiek používajúci iné antivirotiká liečili ich mačky s FIP rovnako dlho. Optimálne trvanie liečby FIP orálnym Mutianom nebolo stanovené. Tento prípad však ilustruje, že liečbu je možné ukončiť po oveľa kratšom cykle, pokiaľ sa laboratórne ukazovatele pre FIP vrátia do normálu. Veríme, že v našom prípade došlo k úplnému uzdraveniu už po 50 dňoch liečby z nasledujúcich dôvodov – uveitída ustúpila, kocúr sa zotavil z anémie, lymfopénia sa obrátila, došlo k zníženiu bilirubínu a k trvalému zníženiu AGP. Napriek tomu sme nechceli nechať kocúra úplne bez antivírusového krytia, takže bola nasadená orálna nízka dávka rFeIFN-omega, ako už bolo popísané ^[29]. Tento liek má antivírusové a imunomodulačné vlastnosti a pred nástupom špecifických antivirotík proti FCoV bol pri FIP spolu s meloxicamom voliteľnou liečbou^[30]. Kocúr pokračoval v priberaní aj pri liečbe s rFeIFN-omega, aj keď pomalšie ako predtým, ustálil sa na 4,35 kg po 100. dňoch (obrázok 2) a pokračovalo zlepšovanie hematologických parametrov (tabuľka 2, obrázok 3).

Relaps FIP nenastal v tomto – ani v iných – prípadoch, ktorých liečbu sme sledovali. Náš úspech pripisujeme v prvom rade posúdeniu účinnosti antivirotika proti kmeňu FCoV u infikovenej mačky monitorovaním množstva vírusu vylučovaného do stolice (pomocou qRT-PCR), aby sme sa uistili, že vírusová záťaž sa znížila v reakcii na antivirotikum; po druhé, prevencii opätovnej infekcie mačky vyliečenej z FIP identifikáciou ďalších zdrojov vírusov v tej istej domácnosti a zastavením vylučovania FCoV pomocou Mutianu ^[5]; po tretie, krátkodobej liečbe dávkou, ktorá zabezpečila vylúčenie vírusu z mozgu; po štvrté, po liečbe nukleozidovým analógom (alebo inhibítorom proteázy) nasadením nízkej dávky perorálneho mačacieho interferónu, až kým sa titer protilátok FCoV neznížil – čo je indikátor toho, že v tele nezostáva žiadny koronavírus.

Skywise a jeho spolubývajúci sú nažive a v poriadku 6 mesiacov po diagnostikovaní.

4. Závery

Pokiaľ je nám známe, jedná sa o prvý publikovaný prípad vyliečenia mačky s neefuzívnou FIP s použitím orálneho analógu adenozínu, nasledovanom rekombinantným mačacím interferónom, a AGP použitého ako markera zotavenia z FIP. Na ochranu pečene a sledovanie hladín pečeňových enzýmov odporúčame spolu s Mutianom podávať doplnok SAMe. Úrovne SDMA v budúcich prípadoch po tomto liečebnom protokole FIP vyžadujú ďalšie skúmanie. Navrhujeme, aby boli systémové kortikosteroidy pri liečbe FIP kontraindikované pre iné ako paliatívne účely.

Poďakovanie

Chceme poďakovať recenzentom za čas, ktorý venovali dôkladnému preštudovaniu našej práce, a za ich užitočné pripomienky: Tabuľka 1 a Tabuľka 3 boli pridané vďaka ich pripomienkam.

Autorské príspevky

Konceptualizácia, D.D.A. a J.C.-R .; metodika, M.F., O.J. a D.D.A .; validácia, O.J., D.D.A., J.C.-R. a M.F .; formálna analýza, M.F. a D.D.A .; vyšetrovanie, M.F. a J.C.-R .; zdroje, J.C.-R. a M.F .; správa údajov, D.D.A., J.C.-R. a M.F .; písanie – príprava pôvodného návrhu, D.D.A .; písanie – recenzia a úpravy, O.J., D.D.A., J.C.-R. a M.F .; vizualizácia, D.D.A. a J.C.-R .; dohľad, D.D.A. a J.C.-R .; administrácia projektu, J.C.-R., M.F .; akvizícia financovania, J.C.-R. a D.D.A. Všetci autori si prečítali zverejnenú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.

Financovanie

Liečba mačky a laboratórne testy boli financované J.C.-R. D.D.A. Ďakujeme predplatiteľom www.catvirus.com za podporu počas tejto štúdie a sme veľmi vďační darcom Fondu Angelica za platbu publikačných poplatkov.

Literatúra

Addie D.D., Toth S., Murray G.D., Jarrett O. The risk of feline infectious peritonitis in cats naturally infected with feline coronavirus. Am. J. Vet. Res. 1995;56:429–434. [PubMed] [Google Scholar]
Kipar A., May H., Menger S., Weber M., Leukert W., Reinacher M. Morphologic features and development of granulomatous vasculitis in feline infectious peritonitis. Vet. Pathol. 2005;42:321–330. doi: 10.1354/vp.42-3-321. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
De Groot R.J., Baker S.C., Baric R., Enjuanes L., Gorbalenya A.E., Holmes K.V., Perlman S., Poon L., Rottier P.J.M., Talbot P.J., et al. Family Coronaviridae. In: Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J., editors. Ninth Report International Committee on Taxonomy of Viruses; King AMQ. Elsevier; Amsterdam, The Netherlands: 2012. pp. 806–828. [Google Scholar]
Pedersen N.C., Perron M., Bannasch M., Montgomery E., Murakami E., Liepnieks M., Liu H. Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2019;21:271–281. doi: 10.1177/1098612X19825701. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Addie D.D., Curran S., Bellini F., Crowe B., Sheehan E., Ukrainchuk L., Decaro N. Oral Mutian^® X stopped faecal feline coronavirus shedding by naturally infected cats. Res. Vet. Sci. 2020;130:222–229. doi: 10.1016/j.rvsc.2020.02.012. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Chang H.W., Egberink H.F., Halpin R., Spiro D.J., Rottier P.J. Spike protein fusion peptide and feline coronavirus virulence. Emerg. Infect. Dis. 2012;18:1089–1095. doi: 10.3201/eid1807.120143. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Duthie S., Eckersall P.D., Addie D.D., Lawrence C.E., Jarrett O. Value of alpha1-acid glycoprotein in the diagnosis of feline infectious peritonitis. Vet. Rec. 1997;141:299–303. doi: 10.1136/vr.141.12.299. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Shelly S.M., Scarlett-Kranz J., Blue J.T. Protein electrophoresis on effusions from cats as a diagnostic test for feline infectious peritonitis. J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 1988;24:495–500. [Google Scholar]
Pedersen N.C., Kim Y., Liu H., Galasiti K.A.C., Eckstrand C., Groutas W.C., Bannasch M., Meadows J.M., Chang K.O. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2018;20:378–392. doi: 10.1177/1098612X17729626. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Dunbar D., Kwok W., Graham E., Armitage A., Irvine R., Johnston P., McDonald M., Montgomery D., Nicolson L., Robertson E., et al. Diagnosis of non-effusive feline infectious peritonitis by reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction from mesenteric lymph node fine needle aspirates. J. Feline Med. Surg. 2019;21:910–921. doi: 10.1177/1098612X18809165. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Felten S., Leutenegger C.M., Balzer H.J., Pantchev N., Matiasek K., Wess G., Egberink H., Hartmann K. Sensitivity and specificity of a real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction detecting feline coronavirus mutations in effusion and serum/plasma of cats to diagnose feline infectious peritonitis. BMC Vet. Res. 2017;13:228. doi: 10.1186/s12917-017-1147-8. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Fish E.J., Diniz P.P.V., Juan Y.C., Bossong F., Collisson E.W., Drechsler Y., Kaltenboeck B. Cross-sectional quantitative RT-PCR study of feline coronavirus viremia and replication in peripheral blood of healthy shelter cats in Southern California. J. Feline Med. Surg. 2018;20:295–301. doi: 10.1177/1098612X17705227. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Simons F.A., Vennema H., Rofina J.E., Pol J.M., Horzinek M.C., Rottier P.J., Egberink H.F. A mRNA PCR for the diagnosis of feline infectious peritonitis. J. Virol. Methods. 2005;124:111–116. doi: 10.1016/j.jviromet.2004.11.012. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Herrewegh A.A.P.M., de Groot R.J., Cepica A., Egberink H.F., Horzinek M.C., Rottier P.J.M. Detection of feline coronavirus RNA in feces, tissue, and body fluids of naturally infected cats by reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 1995;33:684–689. doi: 10.1128/JCM.33.3.684-689.1995. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Tasker S. Diagnosis of feline infectious peritonitis: Update on evidence supporting available tests. J. Feline Med. Surg. 2018;20:228–243. doi: 10.1177/1098612X18758592. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Porter E., Tasker S., Day M.J., Harley R., Kipar A., Siddell S.G., Helps C.R. Amino acid changes in the spike protein of feline coronavirus correlate with systemic spread of virus from the intestine and not with feline infectious peritonitis. Vet. Res. 2014;45:49. doi: 10.1186/1297-9716-45-49. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Giori L., Giordano A., Giudice C., Grieco V., Paltrinieri S. Performances of different diagnostic tests for feline infectious peritonitis in challenging clinical cases. J. Small Anim. Pract. 2011;52:152–157. doi: 10.1111/j.1748-5827.2011.01042.x. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Tsai H.Y., Chueh L.L., Lin C.N., Su B.L. Clinicopathological findings and disease staging of feline infectious peritonitis: 51 cases from 2003 to 2009 in Taiwan. J. Feline Med. Surg. 2011;13:74–80. doi: 10.1016/j.jfms.2010.09.014. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Rohrer C., Suter P.F., Lutz H. The diagnosis of feline infectious peritonitis (FIP): A retrospective and prospective study. Kleinterpraxis. 1993;38:379–389. [Google Scholar]
Riemer F., Kuehner K.A., Ritz S., Sauter-Louis C., Hartmann K. Clinical and laboratory features of cats with feline infectious peritonitis–A retrospective study of 231 confirmed cases (2000–2010) J. Feline Med. Surg. 2016;18:348–356. doi: 10.1177/1098612X15586209. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Addie D.D., Jarrett J.O. Use of a reverse-transcriptase polymerase chain reaction for monitoring feline coronavirus shedding by healthy cats. Vet. Rec. 2001;148:649–653. doi: 10.1136/vr.148.21.649. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Jinks M.R., English R.V., Gilger B.C. Causes of endogenous uveitis in cats presented to referral clinics in North Carolina. Vet. Ophthalmol. 2016;19(Suppl. S1):30–37. doi: 10.1111/vop.12324. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Legendre A.M., Kuritz T., Galyon G., Baylor V.M., Heidel R.E. Polyprenyl Immunostimulant Treatment of Cats with Presumptive Non-Effusive Feline Infectious Peritonitis in a Field Study. Front. Vet. Sci. 2017;4:7. doi: 10.3389/fvets.2017.00007. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Fischer Y., Ritz S., Weber K., Sauter-Louis C., Hartmann K. Randomized, placebo controlled study of the effect of propentofylline on survival time and quality of life of cats with feline infectious peritonitis. J. Vet. Intern. Med. 2011;25:1270–1276. doi: 10.1111/j.1939-1676.2011.00806.x. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Ritz S., Egberink H., Hartmann K. Effect of feline interferon-omega on the survival time and quality of life of cats with feline infectious peritonitis. J. Vet. Intern. Med. 2007;21:1193–1197. doi: 10.1111/j.1939-1676.2007.tb01937.x. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Jepson R.E., Syme H.M., Vallance C., Elliott J. Plasma asymmetric dimethylarginine, symmetric dimethylarginine, l-arginine, and nitrite/nitrate concentrations in cats with chronic kidney disease and hypertension. J. Vet. Intern. Med. 2008;22:317–324. doi: 10.1111/j.1939-1676.2008.0075.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Relford R., Robertson J., Clements C. Symmetric Dimethylarginine: Improving the Diagnosis and Staging of Chronic Kidney Disease in Small Animals. Vet. Clin. N. Am. Small Anim. Pract. 2016;46:941–960. doi: 10.1016/j.cvsm.2016.06.010. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Paltrinieri S., Giraldi M., Prolo A., Scarpa P., Piseddu E., Beccati M., Graziani B., Bo S. Serum symmetric dimethylarginine and creatinine in Birman cats compared with cats of other breeds. J. Feline Med. Surg. 2018;20:905–912. doi: 10.1177/1098612X17734066. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Gil S., Leal R.O., McGahie D., Sepúlveda N., Duarte A., Niza M.M., Tavares L. Oral Recombinant Feline Interferon-Omega as an alternative immune modulation therapy in FIV positive cats, clinical and laboratory evaluation. Res. Vet. Sci. 2014;96:79–85. doi: 10.1016/j.rvsc.2013.11.007. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Addie D. Feline coronavirus infections. In: Green C., editor. Infectious Diseases of the Dog and Cat. Elsevier; Maryland Heights, MO, USA: 2012. pp. 92–108. [Google Scholar]

22. 5. 202029. 3. 2023

Antivírusová liečba s použitím adenozínového nukleozidového analógu GS-441524 u mačiek s klinicky diagnostikovanou neurologickou mačacou infekčnou peritonitídou.

Pôvodný článok: Antiviral treatment using the adenosine nucleoside analogue GS‐441524 in cats with clinically diagnosed neurological feline infectious peritonitis; 22.5.2020; Preklad 19.2.2021

Peter J. Dickinson, Michael Bannasch, Sara M. Thomasy, Vishal D. Murthy, Karen M. Vernau, Molly Liepnieks, Elizabeth Montgomery, Kelly E. Knickelbein, Brian Murphy, Niels C. Pedersen

Abstrakt

Infekčná peritonitída mačiek (FIP) je spôsobená mutantným biotypom mačacieho enterického koronavírusu. Výsledný vírus FIP (FIPV) v prípade neefúznej formy bežne spôsobuje patológie centrálneho nervového systému (CNS) a očí. Viac ako 95% mačiek s FIP podľahne chorobe niekoľko dní až mesiacov po diagnostikovaní napriek rôznym historicky používaným liečbam. Nedávno vyvinuté antivírusové lieky sa ukázali nádejné pri liečbe neneurologických FIP, ale údaje o liečbe neurologických prípadov FIP sú obmedzené. Štyri prípady prirodzene sa vyskytujúcej FIP s postihnutím CNS boli liečené antivírusovým nukleozidovým analógom GS-441524 (5-10 mg/kg) najmenej 12 týždňov. Mačky boli priebežne monitorované pomocou fyzikálnych, neurologických a oftalmologických vyšetrení. Jedna mačka absolvovala magnetickú rezonanciu (MRI), analýzu cerebrospinálneho moku (CSF) vrátane titra FCoV, RT-PCR, a oftalmologické vyšetrenie pomocou Fourierovej optickej koherenčnej tomografie a in vivo konfokálnu mikroskopiu (IVCM). Všetky mačky reagovali na liečbu pozitívne. Tri mačky sú stále nažive (528, 516 a 354 dní po začiatku liečby) s normálymi výsledkami fyzikálnych a neurologických vyšetrení. Jedna mačka bola eutanizovaná 216 dní od začiatku liečby po relapsoch po primárnej a sekundárnej liečbe. V 1 prípade bolo vyliečenie ochorenia určené na základe normalizácie nálezov MRI a CSF a vyšetrenia ochorenia kraniálneho a kaudálneho segmentu pomocou očných zobrazovacích metód. Liečba pomocou GS-441524 ukazuje jeho klinickú účinnosť a môže viesť ku klírensu a dlhodobému ústupu neurologickej FIP. Dávky potrebné pre ochorenie CNS môžu byť vyššie ako dávky používané pre neneurologické FIP.

Kľúčové slová: antivírusový, mačka, koronavíru, oftalmológia

Skratky

AG	albuin/globulín
CNS	centrálny nervový systém
CSF	mozgovomiechový mok
ELISA	enzýmový imunoabsorpčný test
FCoV	mačací koronavírus
FD‐OCT	Fourierova optická koherentná tomografia
FeLV	vírus mačacej leukémie
FIP	mačacia infekčná peritonitída
FIPV	vírus mačacej infekčnej peritonitídy
FIV	vírus mačacej imunodeficiencie
HIV	vírus ľudskej imunitnej nedostatočnosti
IFA	nepriamy imunofluorescentný test
IgG	immunoglobulin G

IgM	immunoglobulin M
IVCM	konfokálna mikroskopia in vivo
LM	veľký mononukleár
MRI	zobrazovanie magnetickou rezonanciou
OD	oculus dexter, pravé oko
OS	oculus sinister, ľavé oko
OU	oculus uterque, obidve oči
PLR	pupilárny svetelný reflex
RT‐PCR	polymerázová reťazová reakcia s reverznou transkriptázou
SM	malý mononukleár
TNCC	celkový počet jadrových buniek
TP	celková bielkovina

1. Úvod

Experimentálne liečby boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat a Výborom pre hodnotenie klinických skúšok Komisie pre klinické skúšky veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice na Kalifornskej univerzite v Davise. GS-441524 poskytla spoločnosť Gilead Sciences Inc. (Foster City, Kalifornia), ako už bolo opísané. 1, 2 Klinická diagnóza FIP bola založená na kombinácii charakteristických informácií, anamnézy, príznakov ochorenia, výsledkov laboratórnych testov vrátane hyperglobulinémie, zníženého pomeru albumín:globulín (AG) a titrov protilátok FCoV (nepriamy imunofluorescenčný test [IFA]), Fuller Laboratories , Fullerton, Kalifornia) 3 a reakcia na vírusovo špecifickú liečbu. Status vírusu mačacej leukémie (FeLV) a vírusu mačacej imunodeficiencie (FIV) sa stanovil pre antigén FeLV a protilátku FIV pomocou ELISA (IDEXX, Westbrook, Maine). V jednom prípade sa vykonalo opakované pokročilé diagnostické testovanie vrátane MRI, analýzy CSF, CSF FCoV RT‐PCR (Real-time PCR Research and Diagnostics Core Facility, UC Davis, Davis, Kalifornia) a sérológie, FD‐OCT a IVCM.

2. Prípad 1

Kastrovaný samec domácej 8-mesačnej modrej siamskej mačky získaný ako mačiatko zo záchrannej skupiny. Anamnéza niekoľkomesačnej letargie a zníženej chuti do jedla a mesačná progresívna ataxia panvových končatín potvrdená neurologickým vyšetrením. Mačka vážila 3,0 kg, čo bolo o 1 kg menej ako samica súrodenca. Abnormality biochémie v sére zahŕňali zvýšenú celkovú koncentráciu proteínov (8,9 g/dl; referenčný interval 6,3-8,8 g/dl) s pomerom AG 0,53 (albumín, 3,1 g/dl; referenčný interval 2,6-3,9 g/dl; globulín), 5,8 g/dl; referenčný interval, 3,0-5,9 g/dl). Testy na titre protilátok FeLV a FIV a Toxoplasma gondii IgM a IgG (Protatek, Mesa, Arizona) boli negatívne a titer protilátok FCoV bol pozitívny s hodnotou 1:12 800. Očné vyšetrenie identifikovalo chorioretinálne jazvy v tapetálnom funduse v oboch očiach (oculus uterque, OU). Ultrazvukové vyšetrenie brucha ukázalo obvodové hyperechoické čiary na obličkových kortikomedulárnych spojoch, lineárne hyperechoické čiary paralelné s luminálnym povrchom jejuna a ilea a zväčšené kolické a mezenterické lymfatické uzliny. Mačka bola liečená 5 mg/kg GS-441524 SC raz denne počas 14 týždňov. Chuť do jedla a aktivita vrátane skákania na vyvýšené povrchy sa zlepšili do 4 dní. Celková koncentrácia proteínu v sére po ukončení liečby bola 7,8 g/dl s pomerom AG 0,77. Neurologické vyšetrenie bolo normálne a telesná hmotnosť bola 5,1 kg. Mačka zostáva v čase písania článku 528 dní po začiatku liečby klinicky normálna.

3. Prípad 2

Ročný kastrovaný kocúr domácej krátkosrstej mačky narodený zachránenej divokej mačke mal 3 mesačnú históriu prednej uveitídy a týždňovú históriu letargie, zmeneného správania, šklbania chvosta, generalizovaných záchvatov, zníženej chuti do jedla a dysfágie a ataxie panvových končatín. Mačka vážila 3,7 kg. Na neurologickom vyšetrení bola mačka otupená generalizovanou ataxiou, zníženými posturálnymi reakciami v ľavých hrudných a pravých panvových končatinách, zníženým fyziologickým nystagmom OU a zníženým nazálnym vnemom na pravej strane. Reakcia na priblíženie bola znížená u obidvoch očí, bola prítomná anizokória (mydriáza v ľavom oku [oculus sinister, OS]) so zníženým priamym a konsenzuálnym pupilárnym svetelným reflexom (PLR) s osvetlením OS. Očné vyšetrenie odhalilo prednú uveitídu OU s odlúčením sietnice OS a retinálnu vaskulitídu OU. Mačka vážila 3,7 kg a abnormality biochémie séra zahŕňali zvýšenú celkovú koncentráciu proteínu (8,6 g/dl; referenčný interval, 6,6-8,4 g / dl) s pomerom AG 0,48 (albumín, 2,8 g/dl; referenčný interval, 2,2-4,6) g/dl; globulín, 5,8g/dl; referenčný interval, 2,8-5,4 g/dl), zvýšená koncentrácia celkového bilirubínu (1,8 mg/dl; referenčný interval, 0,0-0,2 mg/dl) a zvýšená aktivita AST (128 IU/dl L; referenčný interval, 17-58 IU/L). Test na vírus mačacej leukémie, FIV a antigén srdcových červov (SNAP Feline Triple Test, IDEXX, Westbrook, Minnesota) bol negatívny. Palpácia brucha ukázala zväčšené mezenterické lymfatické uzliny. Mačka bola liečená 5 mg/kg GS-441524 SC, raz denne počas 14 týždňov. Telesná hmotnosť pri ukončení liečby bola 5,9 kg. Úroveň mentácie a aktivita sa výrazne zlepšili 48 hodín po začiatku liečby. Po 3 týždňoch liečby boli neurologické a oftalmologické príznaky nepozorovateľné okrem miernej intermitentnej anizokórie a chorioetinálnych jaziev OU. Predtým zaznamenané abnormality sérovej biochémie ustúpili s celkovou koncentráciou sérového proteínu 8,1 g/dl a pomerom AG 0,77. Tri týždne po ukončení liečby mačka vážila 6,4 kg, fyzikálne a neurologické vyšetrenia boli bez nálezu a celková koncentrácia proteínu v sére bola 7,0 mg/dl s pomerom AG 0,84. Mačka zostáva v čase písania článku 516 dní po začiatku liečby klinicky normálna.

4. Prípad 3

18-mesačná kastrovaná domáca krátkosrstá mačka získaná z útulku mala 3-mesačnú anamnézu očného ochorenia, 3-týždňovú progresívnu anamnézu letargie a nechutenstva a niekoľkodňovú anamnézu progresívnej parézy končatín. Mačka bola liečená prednizolón-acetátovými 1% očnými kvapkami OU, každých 6 hodín po dobu 5 dní pred prezentáciou. Na neurologickom vyšetrení mačka vykazovala neprimerané správanie a precitlivenosť na kraniálnu palpáciu. Mačka bola neambulanticky paraparetická so zníženými reflexmi panvových končatín. Žmurkací reflex chýbal OU s anizokóriou (zrenica stredného rozsahu v pravom oku [oculus dexter, OD], mydriáza OS). Pupilárny svetelný reflex chýbali OD kvôli zadným synechiám a absentovali OS s priamym alebo nepriamym osvetlením. Boli prítomné reflexy na oslnenie a videnie OU a mačka vykazovala znížené videnie za fotopických podmienok. Očné vyšetrenie ukázalo uveitídu a syndróm hyperviskozity OU. Mačka vážila 2,6 kg. Abnormality biochémie v sére zahŕňali zvýšenú koncentráciu celkového proteínu (11,7 g/dl; referenčný interval 6,3-8,8 g/dl) s pomerom AG 0,2 (albumín, 2,0 g/dl; referenčný interval 2,6-3,9 g/dl; globulín) , 9,7 g/dl; referenčný interval, 3,0-5,9 g/dl). Testy na FeLV a FIV boli negatívne a titer protilátok FCoV bol pozitívny s hodnotou 1: 6400. Ultrazvukové vyšetrenie brucha ukázalo hepatosplenomegáliu, malé obličky s nevýraznými kortikomedulárnymi spojmi a zväčšené mezenterické lymfatické uzliny. Mačka bola liečená 5 mg/kg GS-441524 SC, raz denne počas 15 týždňov. Po 1 mesiaci liečby sa uveitída zlepšila, ale stále je prítomná a mačka bola ambulantne paraparetická s normálnymi segmentovými reflexmi. Mačka vážila 3,3 kg a pomer AG bol 0,55. Po 2 mesiacoch liečby boli prítomné jemné príznaky aktívnej prednej uveitídy OD, ale došlo iba k miernemu zlepšeniu ambulantnej paraparézy. Telesná hmotnosť sa zvýšila na 3,7 kg a pomer AG bol 0,67. Po 15 týždňoch liečby boli iba minimálne známky uveitídy OD a zlepšenla sa ambulantnej paraparéza, ktoré bola statická počas predchádzajúcich 4 týždňov. Mačka vážila 4,0 kg a pomer AG bol 0,76. Po ukončení liečby sa letargia, nechutenstvo a anizokória vrátili do 36 hodín. Liečba bola obnovená dávkou 5 mg/kg GS-441524 SC jedenkrát denne a príznaky ustúpili do 24 hodín. Známky zostali statické počas 12 týždňov druhého kola liečby, ale znížená aktivita sa po ukončení liečby znova objavila. Mačka bola eutanizovaná čiastočne z dôvodu zvýšenej odolnosti voči podávaniu lieku. Histopatologické hodnotenie po pitve preukázalo multifokálnu chronickú nefunkčnú meningitídu, encefalomyelitídu a ventrikulitídu, lymfocytovú, histiocytovú uveitídu a choroiditídu OU a intersticiálnu nefritídu. Pozitívna koronavírusová imunohistochemická imunoreaktivita (protilátka FIP ‐ V3‐70, Custom Monoclonals International, Sacramento, Kalifornia) bola identifikovaná v rámci histiocytov spojených s léziami v mozgu, obličkách a oku.

5. Prípad 4

Sedemmesačná sterilizovaná samica domácej krátkosrstej mačky adoptovaná z útulku mala trojtýždňovú históriu letargie a nechutenstva a dvojtýždňovú históriu ataxie a prikrčenej chôdze. Na neurologickom vyšetrení mala mačka ataxickú chôdzu, ktorá bola horšia v panvových končatinách. Posturálne reakcie boli znížené v panvových končatinách. Anizokória (OD stredného pásma, miotický OS) bola prítomná s neúplnými PLR OU. Žmurkacie reflexy, oslňujúce reflexy a videnie boli prítomné OU. Mačka vážila 2,7 kg. Magnetická rezonancia mozgu preukázala multifokálne T2-váženej hyperintenzity v celom parenchýme, najťažšie v strednom mozgu a talame. Postkontrastné T1-vážené snímky ukázali difúzne zhrubnutie a zosilnenie mozgových blán mozgu a mozgového kmeňa s výraznou ventrikulomegáliou (obrázok 1). Cerebrospinálny mok odobratý z cerebellomedulárnej cisterny bol xantochromický s celkovým počtom nukleovaných buniek (TNCC) 888/μL (referenčný interval, <3 bunky/μL) a celkovou koncentráciou bielkovín v CSF 1790 mg/dl (referenčný interval, <25 mg/dl). Titre séra a CSF FCoV protilátok boli pozitívne pri > 1:20 480 a real-time TaqMan RT‐PCR pre FCoV v CSF bola pozitívna s hodnotou prahového cyklu (Ct) 18,87. Testy na FeLV a FIV boli negatívne. Sérová biochémia a abnormality CBC zahŕňali celkovú koncentráciu proteínu 8,5 g/dl (referenčný interval, 6,6-8,4 g/dl), pomer AG 0,37 (albumín 2,3 g/dl; referenčný interval 2,2-4,6 g/dl; globulín 6,2 g/dl; referenčný interval 2,8-5,4 g/dl), celková koncentrácia bilirubínu 0,5 mg/dl (referenčný interval 0,0-0,2 mg/dl), anémia (hematokrit, 25,8%; referenčný interval, 30 -50%) a lymfopénia (835/μL; referenčný interval, 1000‐7000/μL). Ultrazvukové vyšetrenie brucha ukázalo hyperechoické obličky a retroperitoneálny tuk, niekoľko zväčšených lymfatických uzlín a mierny peritoneálny výpotok. Pri oftalmologickom vyšetrení FD‐OCT a IVCM bola zistená predná uveitída s keratickými zrazeninami prítomnými v OU v zadnej časti; očná hypertenzia (25 mmHg OD, 11 mmHg OS) a chorioretinitída boli tiež identifikované OD (obrázok2). Mačka bola liečená 5 mg/kg GS-441524 SC, raz denne počas 4 týždňov a prednisolónacetátovými 1% očnými kvapkami OU q8h a dorzolamid 2% očnými kvapkami OD q8h počas prvých 3 týždňov liečby GS ‐ 441524. Aktivita a mentácia sa zlepšili do 24 hodín po začiatku liečby. Po 4 týždňoch sa oftalmologické ochorenie výrazne zlepšilo (obrázok 2), ale stále bola prítomná ataxia a mačka stratila 0,2 kg telesnej hmotnosti (obrázok 3). Koncentrácia celkového proteínu v sére bola stále zvýšená (8,6 g/dl) so zlepšeným pomerom AG 0,72; lymfopénia a anémia ustúpili. Z dôvodu nedostatku prírastku hmotnosti a pretrvávajúcich neurologických deficitov sa dávka GS-441524 zvýšila na 8 mg/kg SC, jedenkrát denne počas ďalších 10 týždňov (spolu 14 týždňov). Mačka tiež dostala dvojtýždňovú kúru prednizolónu 1 mg/kg PO každých 24 hodín. Zvýšená aktivita a ochota skákať na vyvýšené povrchy sa pozorovali do 24 hodín a 1 týždeň po ukončení liečby GS-441524 bolo neurologické vyšetrenie ngatívne a nezistilo sa žiadne aktívne oftalmologické ochorenie. Telesná hmotnosť sa zvýšila na 3 kg a celková koncentrácia proteínu v sére bola normálna (7,6 g/dl) s pomerom AG 0,8. Opakovaná magnetická rezonancia (obrázok 1) vykázala minimálne zvýšenie kontrastu meningey, ale ventrikulomegália sa zvýšila. Opakovaná CSF RT‐PCR pre FCoV RNA bola negatívna a TNF v CSF sa znížil oproti predchádzajúcemu počtu, ale stále vysoký pri 224/μL. Vzhľadom na dôkazy z analýzy mozgovomiechového moku, že infekcia bola stále aktívna, sa dávka GS-441524 ďalej zvyšovala na 10 mg/kg SC, jedenkrát denne počas ďalších 5 týždňov (spolu 19 týždňov). Mačka zostala v tomto období klinicky normálna so zvýšenou aktivitou a telesná hmotnosť sa zvýšila na 4,7 kg (obrázok 3). Ihneď po ukončení liečby zostali neurologické a oftalmologické vyšetrenia nezmenené a opakovaná MRI bola okrem perzistentnej ventrikulomegálie bez nálezu. Opakovaná analýza CSF preukázala pokračujúci pokles TNCC (8 buniek/μL) a celkovej koncentrácie proteínov (85 mg/dl), negatívnu RT‐PCR pre FCoV RNA a znížený titer protilátok FCoV o 1:128. Približne 8 mesiacov po začiatku liečby a 3 mesiace po ukončení liečby sa MRI nezmenila oproti predchádzajúcemu zobrazeniu, okrem menej závažnej ventrikulomegálie. Analýza mozgovomiechového moku preukázala TNCC 6 buniek/μL, celkovú koncentráciu proteínu 52 mg/dl, negatívnu RT‐PCR pre FCoV RNA a statický titer protilátok FCoV 1: 128. Koncentrácia celkového proteínu v sére bola 7,1 g/dl s pomerom AG 0,97. Pri oftalmologickom vyšetrení neboli pozorované žiadne príznaky aktívneho zápalu, hoci boli identifikované ohniskové oblasti zriedenia sietnice. Mačka zostáva v čase písania článku 354 dní po začiatku liečby klinicky normálna.

Obrázok 1
Sekvenčné zobrazovanie magnetickou rezonanciou z prípadu 4. Riadky predstavujú vybrané postkontrastné (gadolínium) T1 vážené priečne obrazy mozgu získané v jednej zobrazovacej sekvencii. Rutinná analýza mozgovomiechového moku v čase zobrazovania je pre každý časový bod zobrazenia znázornená bielou farbou: TNCC = celkový počet jadrových buniek v CSF (bunky/ul); TP = celkový proteín CSF (mg/dl); N = neutrofily, SM = malé mononukleáry, LM = veľké mononukleáry. Charakteristická neutrofilná pleocytóza ustúpila v priebehu liečby. Ďalšie analýzy CSF týkajúce sa detekcie FCoV sú pre každý časový bod prezentované žltou farbou: PCR = výsledok FCoV RT ‐ PCR [pozitívny (+) alebo negatívny (-)]; Pomer riedenia = titer protilátok FCoV v mozgovomiechovom moku. Pre každú zobrazovaciu sekvenciu sú opísané časové body a dávky GS-441524 dodané pred zobrazením. Počiatočné výrazné zvýšenie kontrastu meningeálnej bolesti ustúpi po liečbe GS-441524 a po ukončení liečby sa neopakuje. Ventrikulomegália, ktorá je prítomná po počiatočnej odpovedi na liečbu, pomaly ustúpila pri následnom zobrazovaní. Zníženie abnormalít v nálezoch analýzy CSF paralelne zodpovedalo zníženým abnormalitám pri MR zobrazovaní

Obrázok 2
Sekvenčné multimodálne zobrazovanie lebečných a kaudálnych segmentov z prípadu 4. Na prezentácii (A, B) predilatácie a (G, H) postdilatačných fotografií lebečných segmentov, ktoré ukazujú mierny difúzny edém rohovky, pigmentované keratické zrazeniny, rubeosis iridis, detail zakalenej dúhovky so zábleskami v komorovej vode a neúplnej dilatácie OU; pozorovala sa aj dyskória s neúplnou dilatáciou zrenice z dôvodu kaudálnej synechie OS (H). Keratické zrazeniny sa tiež vizualizovali OS biomikroskopiou štrbinovou lampou (V), rohovkovou FD-OCT (M) a IVCM endotelu (X, šípky); zvýšená hrúbka rohovky sa pozorovala aj pri FD ‐ OCT (X). Zobrazenie sietnice a choroidu pomocou FD‐OCT odhalilo bunkový infiltrát v choroide (P, šípka), ktorý bol viditeľný ako hyporeflektívna lézia s infračervenou fotografiou (S). Po 0,8 mesiaci od začiatku liečby GS‐441524 preukázali fotografie pre-(C, D) a postdilatácie (I, J) kraniálneho segmentu číre rohovky a lebečné komory OU, isokóriu, zníženú rubeosis iridis a úplnú dilatáciu zrenice. Výrazný pokles pigmentovaných keramických zrazenín bol zaznamenaný pri biomikroskopii štrbinovou lampou (W), rohovkovej FD‐OCT (N) a IVCM endotelu (Y, šípka). Normálna morfológia sietnice a choroidu sa pozoruje u FD‐OCT (Q), aj keď hyporeflektívne lézie zostávajú pri infračervenom zobrazovaní (T). V 7.6 mesiaci pre- (E, F) a postdilatačné (K, L) fotografie lebečného segmentu preukázali jasné rohovky a lebečné komory OU, izokóriu, normálnu morfológiu dúhovky a pozápalový pigment na kapsule OS šošovky. Pri rohovkovej FD-OCT (O) chýbajú keramické zrazeniny. Pri FD‐OCT a infračervenom zobrazovaní bolo prítomné zriedenie dorzálnej periférnej sietnice (R, šípka) so stratou normálneho vrstvenia, ale bez bunkového infiltrátu alebo odlúčenia sietnice (U)

Obrázok 3
Vývoj telesnej hmotnosti prípadu 4 vynesený s ohľadom na časovú postiniciáciu liečby GS-441524. Zmeny dávky lieku sú označené červenými šípkami. Po zvýšení dávky liečiva nad počiatočnú dávku 5 mg/kg bolo pozorované zvýšenie telesnej hmotnosti a bolo sprevádzané ústupom klinických príznakov

6. Diskusia

Infekčná peritonitída mačiek je hlavnou príčinou úmrtnosti mladých mačiek a častou príčinou neurologických ochorení. Niekoľko experimentálnych liečebných postupov nepreukázalo konzistentnú účinnosť proti FIP a mačky sú eutanizované alebo uhynú niekoľko dní až mesiacov po rozvoji klinického ochorenia, najmä keď FIP ovplyvňuje CNS. Našťastie lieky zamerané na replikáciu RNA vírusov pri dôležitých ľudských chorobách, ako je vírus ľudskej imunitnej nedostatočnosti (HIV), hepatitída C a ebola, poskytli model liečby vírusových chorôb u iných druhov, ako je práve FIP. GS-441524 je 1′-cyano-substituovaný adenín C-nukleozidový ribózový analóg, ktorý inhibuje syntézu vírusovej RNA. GS-441524 a 3C-Like inhibítor vírusovej proteázy preukázali účinnosť proti FIPV pri experimentálne indukovanej a prirodzene získanej FIP. Predbežné štúdie však naznačujú, že liečba očných a CNS foriem FIP môže byť zložitejšia z dôvodu obmedzeného priestupu lieku cez hematookulárnu a hematoencefalickú bariéru. Pri liečbe založenej na inhibítoroch proteáz bola pozorovaná vysoká miera relapsu choroby FIP s postihnutím CNS, zatiaľ čo pri liečbe očnej a neurologickej FIP sa nádejnejším stal GS-441524. Počiatočná klinická štúdia s GS-441524 na prirodzene získanej, neneurologickej FIP používala dávky 2 mg/kg, ktoré sa javili ako nedostatočné pre mačky, u ktorých sa v priebehu liečby vyvinuli neurologické príznaky. Zdá sa však, že 2 mačky, u ktorých sa pri tejto dávke vyskytlo neurologické ochorenie, reagovali na 4 mg/kg. 4 prípady neurologickej FIP z našej štúdie boli liečené dávkou 5 mg/kg, s trvaním liečby a následným zvyšovaním dávky na základe klinických reakcií. Dávka 5 mg/kg, SC, jedenkrát denne po dobu 12 až 14 týždňov bola dostatočná na liečbu 2 menej závažných neurologických prípadov FIP (prípady 1, 2), ale opakované cykly s dávkou 5 mg/kg u najvážnejšie klinicky postihnutej mačky (prípad 3) mali za následok iba zlepšenie klinických príznakov s rýchlou klinickou regresiou po ukončení liečby. Toto terapeutické zlyhanie viedlo v prípade 4 k postupnému zvyšovaniu dávky z 5 na 10 mg/kg. In vitro 50% účinná koncentrácia (EC50) pre GS-441524 na prevenciu vírusových cytopatických účinkov bola reportovaná pri 0,8 μM s úplnou inhibíciou vírusovej replikácie pri 10 μM a čiastočnou inhibícia pri 1 μM. 1 Obmedzené farmakokinetické štúdie u mačiek z tej istej štúdie ukázali, že koncentrácie GS-441524 v CSF boli približne 20% v plazme a dávka 10 mg/kg viedla ku koncentráciám v CSF 0,8 až 2,7 μM. Tieto údaje zodpovedajú obmedzenej účinnosti spojenej s dávkami 5 mg/kg v prípadoch 3 a 4 a zjavnej účinnosti spojenej so zvyšovaním dávky na 8 až 10 mg/kg v prípade 4. Pre ďalšie definovanie optimálnej dávky GS-441524 u mačiek s neurologickou FIP budú nevyhnutné rozšírené farmakokinetické štúdie u zdravých a postihnutých mačiek s intaktnou a narušenou funkciou hematoencefalickou bariérou. Podobne ako v predchádzajúcich správach boli spozorované obmedzené nežiaduce reakcie spojené s dlhodobým používaním GS-441524. Lokálne kožné reakcie a nepríjemné pocity po SC injekcii boli jedinými klinicky relevantnými nežiaducimi reakciami, ale to bol hlavný faktor ovplyvňujúci rozhodnutie o eutanázii prípad č. 3. Aj keď boli reakcie na liečbu merateľné pomocou MRI, analýzy CSF a zobrazenia očí, rovnako užitočné boli aj klinické reakcie na liečbu pri použití vhodnej dávky, s rýchlym zlepšením mentácie, chuti do jedla a aktivity, ktoré sa všeobecne pozorovali do 24 až 36 hodín. Zvýšená telesná hmotnosť a schopnosť skákať na vyvýšené objekty a povrchy sa tiež považovali za konzistentné ukazovatele účinnej liečby. GS-441524 nie je k dispozícii na bežné klinické použitie, ale hlásené prípady naznačujú, že FIP ovplyvňujúca CNS môže byť liečiteľná pomocou vhodných antivírusových liekov. Vývoj podobných antivírusových liekov na klinické použitie by sa mal považovať za prioritu tohto historicky smrteľného ochorenia.

Literatúra

Murphy BG, Perron M, Murakami E, et al. The nucleoside analog GS‐441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol. 2018;219:226‐233. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, et al. Efficacy and safety of the nucleoside analog GS‐441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2019;21:271‐281. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Pedersen NC. An update on feline infectious peritonitis: diagnostics and therapeutics. Vet J. 2014;201:133‐141. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Pedersen NC. A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963‐2008. J Feline Med Surg. 2009;11:225‐258. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Pedersen NC, Kim Y, Liu H, et al. Efficacy of a 3C‐like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2018;20:378‐392. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC, et al. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad‐Spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog. 2016;12:e1005531. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]