Značka: klinická štúdia

Publikované

Účinnosť a bezpečnosť nukleozidového analógu GS-441524 pri liečbe mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou mačacou infekčnou peritonitídou

13.2.2019, Journal of Feline Medicine and Surgery; Preklad 10.2.2021
Pôvodný článok: Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis
Niels C Pedersen, Michel Perron, Michael Bannasch, Elizabeth Montgomery, Eisuke Murakami, Molly Liepnieks, and Hongwei Liu

Abstrakt

Ciele

Cieľom tejto štúdie bolo zistiť bezpečnosť a účinnosť nukleozidového analógu GS-441524 pre mačky trpiace rôznymi formami prirodzene získanej infekčnej peritonitídy mačiek (FIP).

Metódy

Mačky boli vo veku od 3,4 do 73 mesiacov (priemerne 13,6 mesiaca); 26 mačiek malo vlhkú alebo zmiešanú FIP, 5 suchú formu FIP. Mačky so závažnou neurologickou a okulárnou FIP neboli do štúdie prijaté. Skupina začala s GS-441524 v dávke 2,0 mg/kg SC q24h po dobu najmenej 12 týždňov, ktorá sa zvyšovala, keď to bolo indikované, na 4,0 mg/kg SC q24h.

Výsledky

Štyri z 31 mačiek, ktoré mali ťažkú formu ochorenia, uhynuli alebo boli eutanizované do 2-5 dní a piata mačka po 26 dňoch. Zvyšných 26 mačiek dokončilo plánovaných 12 alebo viac týždňov liečby. Osemnásť z týchto 26 mačiek zostáva zdravých v čase publikácie (OnlineFirst, február 2019) po jednom kole liečby, zatiaľ čo osem ďalších utrpelo relapsy choroby v priebehu 3–84 dní. Šesť z relapsov bolo neneurologických a dva neurologické. Tri z ôsmich ralapsujuúcich mačiek boli liečené opäť rovnakou dávkou, zatiaľ čo piatim mačkám bola dávka zvýšená z 2,0 na 4,0 mg/kg každých 24 hodín. Päť mačiek liečených druhýkrát vyššou dávkou, vrátane jednej s neurologickým ochorením, reagovalo dobre a v čase publikácie boli zdravé. Jedna z troch mačiek znovu liečených pôvodnou nižšou dávkou však mala relaps s neurologickým ochorením a bola eutanizovaná, zatiaľ čo dve zostávajúce mačky reagovali priaznivo, ale došlo k druhému relapsu. Tieto dve mačky boli úspešne liečené tretíkrát pri vyššej dávke, čo vo výsledku viedlo k 25 dlhodobo preživším mačkám. Jedna z 25 úspešne liečených mačiek bola následne eutanizovaná z dôvodu pravdepodobného nesúvisiaceho ochorenia srdca, zatiaľ čo 24 zostalo zdravých.

Záver a význam

GS-441524 sa ukázal ako bezpečný a efektívny pri liečbe FIP. Bola stanovená optimálna dávka 4,0 mg/kg SC q24h po dobu najmenej 12 týždňov.

Kľúčové slová: Nukleozidový analóg, GS-441524, infekčná peritonitída mačiek, FIP, klinická štúdia

Úvod

Lieky, ktoré inhibujú replikáciu vírusov, sa stali ústredným bodom zaujmu pri liečbe ľudských akútnych a chronických RNA a DNA infekcií. Vývoj záujmu o antivírusové lieky pre infekcie zvierat bol však oveľa pomalší. To platí najmä pre mačky, ktoré trpia niekoľkými chronickými vírusovými infekciami podobnými tým ľudským. Medzi infekčné činitele patrí vírus mačacej leukémie a imunodeficiencie (FeLV a FIV), mačací herpesvírus (FHV), virulentný systémový kalicivírus a koronavírus spôsobujúci mačaciu infekčnú peritonitídu (FIPV). Infekcie FeLV a FIV sa darí udržiavať pod kontrolou pomocou testovania, izolácie a/alebo očkovania. Ochorenie spojené s FHV bolo prvou mačacou vírusovou infekciou, kde bolo pre liečbu použité antivirotikum. Vysoko smrteľný systémový kalicivírus postihuje iba malý počet mačiek. Infekcia FIPV je najlepším kandidátom pre vývoj antivírusových liekov, pretože vakcíny sú neúčinné, prostredie s mnohými mačkami veľmi komplikuje prevenciu a zabíja 0,3–1,4% mačiek na celom svete.

Výskyt exotických chorôb, ako je ebola, stredovýchodný respiračný syndróm (MERS) a ťažký akútny respiračný syndróm (SARS) u ľudí, podnietil intenzívny výskum liekov, ktoré inhibujú replikáciu vírusu RNA. Jedným z najsľubnejších antivírusových liekov proti vznikajúcim RNA vírusom je proliečivo (prodrug) adenozínový nukleozidový monofosfát GS-5734 (Remdesivir; Gilead Sciences). GS-5734 preukázal účinnosť pri experimentálnej ebole u opíc rhesus a inhiboval epidemické aj zoonotické koronavírusy v tkanivových kultúrach a v myšacích infekčných modeloch. Tieto sľubné zistenia iniciovali výskum GS-5734 a jeho pôvodného nukleozidu GS-441524 proti FIPV infekcii mačiek. GS-441524 a GS-5734 majú porovnateľné hodnoty EC50 (1,0 uM) a CC50 (> 100 uM) proti FIPV v mačacích bunkách. Preto sa rozhodlo pre účely dalších testov s laboratórnymi mačkami zamerať na chemicky menej komplexný GS-441524. Farmakokinetická štúdia na dvoch laboratórnych mačkách preukázala trvalé a účinné plazmatické hladiny GS-441524 vyše 24 hodín po dávke podanej subkutánne (SC) alebo intravenózne (IV). Tieto výsledky sa rozšírili na 10 laboratórnych mačiek s experimentálne indukovanou brušnou efúznou mačacou infekčnou peritonitídou (FIP). Táto štúdia preukázala, že GS-441524 je vysoko účinný proti experimentálnej FIP, a otvorila tak cestu pre túto klinickú štúdiu.

Cieľom tejto štúdie bolo demonštrovať bezpečnosť a účinnosť GS-441524 pri liečbe mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou FIP. Malomolekulárne lieky, ako je GS-441524, majú hmotnosť <900 daltonov a veľkosť približne 1 nm a môžu ľahko prenikať do buniek a interagovať s kľúčovými cieľovými molekulami. Na rozdiel od už publikovaných látok alebo liekov, ktoré inhibujú FIPV brzdením bunkových procesov vírusmi využívaných pre ich replikáciu, malé molekuly, ako je GS-441524, interferujú priamo s vírusom kódovanými replikačnými procesmi.

Materiály a metódy

Príprava lieku

GS-441524 poskytla spoločnosť Gilead Sciences ako čistý a vysoko stabilný prášok, ktorý bol zriedený na koncentráciu 10 alebo 15 mg/ml v 5% etanole, 30% propylénglykole, 45% PEG 400, 20% vode (pH 1,5 s HCI ). Roztok bol umiestnený do sterilných 50 ml sklenených injekčných fľaštičiek, v ktorých sa pretrepal až do rozpustenia a potom sa podrobil sonickej vodnej kúpeli na 5 až 20 minút, kým nebol číry. Zriedený liek bol uložený do chladu a bol použitý v priebehu 3–4 týždňov.

Koncepcia štúdie

Táto štúdia prebiehala podľa protokolov 19336 a 19863 schválených Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat a Výborom pre hodnotenie klinických skúšok Komisie pre klinické skúšky veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice na Kalifornskej univerzite v Davise. Inštitucionálne pravidlá vylučujú použitie chorých mačiek z útulkov alebo z podobných zariadení, kvôli požiadavke legálneho vlastníctva/adopcie a zaobchádzania za špecifických podmienok so súhlasom majiteľa (doplňujúci materiál). Štúdia nezahŕňala kontrolnú skupinu, pretože neexistuje účinná zrovnávacia liečba. Nebola zahrnutá ani placebo skupina, pretože prípravné štúdie in vitro a in vivo naznačovali, že GS-441524 bude bezpečný a účinnejší ako žiadna liečba.

Výber prípadov a potvrdenie diagnózy

Mačky s FIP boli prijaté od majiteľov alebo ich veterinárnych lekárov, ktorí hľadali súčasné možnosti liečby alebo prístup k predchádzajúcej štúdii antivírusových liekov. Počiatočná diagnóza FIP bola založená predovšetkým na charakteristickej signalizácii, klinických anamnézach a príznakoch choroby, výsledkoch bežných laboratórnych testov a vyšetrení brušných alebo hrudných výpotkov. Definitívnejšia diagnóza založená na RT-PCR alebo imunohistochémii bola síce žiaduca, ale nebola nevyhnutnou podmienkou pre zaradenie. Mačky so zjavným očným alebo neurologickým ochorením boli vyradené kvôli pochybnostiam ohľadne schopnosti antivírusových liekov, vrátane GS-441524, preniknúť cez hematoencefalickú alebo hematookulárnu bariéru.

Do štúdie bolo prijatých 31 mačiek a ich majiteľov (tabuľka 1). Majitelia alebo zástupcovia 26 mačiek prišli na úvodnú liečbu priamo do UC Davis a päť majiteľov a ich mačky (CT59, CT73, CT76, CT78, CT80) boli v ošetrení miestneho veterinára. Mačky prítomné na UC Davis boli znovu prehodnotené, ich diagnóza FIP bola znovu potvrdená na základe signalizácie, klinickej anamnézy, fyzikálneho vyšetrenia, výsledkov predchádzajúcich laboratórnych testov a opakovania kompletného krvného obrazu (CBC), sérových bielkovín a analýz výpotkov. Hrudný alebo brušný výpotok u mačiek s vlhkou FIP bol potvrdený ako pozitívny na FIPV 7b RNA pomocou RT-PCR. Mačky so známkami neefúznej FIP boli ďalej testované brušnou a hrudnou ultrasonografiou na primárne lézie. Očné ochorenie bolo potvrdené oftalmologickou službou VMTH, UC Davis. Neurologický stav v prípadoch s možnými príznakmi ochorenia centrálneho nervového systému bol vyhodnocovaný neurologickou službou VMTH.

Tabuľka 1
Zoznam 31 mačiek zaradených do testovania vrátane laboratórneho označenia, mena mačky, plemena, klinickej formy infekčnej peritonitídy (FIP) a dátumu diagnózy

IDMenoDátum narodeniaPlemenoPohlaviePôvodDátum diagnózyForma FIP
CT52Luna9.1.2017SavannahFChovateľ24.4.2017Brušná efúzna
CT53Ice Bear2.8.2016DLHMCZáchranná skupina5.5.2017Brušná efúzna
CT54Charolett11.7.2016SiberianFChovateľ15.4.2017Brušná efúzna
CT55Dempsey26.6.2016DSHMCZáchranná skupina15.4.2017Brušná efúzna
CT56Mudsa1.7.2016DSHMCÚtulok12.5.2017Brušná efúzna
CT57Boone31.10.2016DSHFSZáchranná skupina8.5.2017Brušná efúzna
CT58Justyna17.4.2016RagdollFChovateľ25.5.2017Brušná efúzna
CT59Bubba11.4.2011DLHMCTúlavá10.4.2017Brušná neefúzna
CT60Joey25.7.2016DSHMCZáchranná skupina20.5.2017Brušná efúzna
CT61Hudson1.7.2016DSHMCZáchranná skupina29.5.2017Hrudná efúzna
CT62Luca10.3.2016DSHMCZáchranná skupina30.5.2017Brušná efúzna
CT63Bao Bao6.11.2016DSHMCZáchranná skupina3.6.2017Brušná efúzna
CT64Cedrick27.6.2016DSHMCZáchranná skupina22.5.2017Brušná neefúzna
CT65Mona14.3.2016Exotic SH/PersianFChovateľ11.6.2017Hrudná efúzna
CT66Squeekers7.6.2016DSHFSÚtulok14.6.2017Brušná efúzna
CT67Double2.3.2016RagdollFSChovateľ20.6.2017Brušná efúzna
CT68Tuckerman8.5.2016Maine CoonMCZáchranná skupina22.6.2017Brušná efúzna
CT69Danny16.6.2015SnowshoeMCÚtulok22.6.2017Hrudná efúzna
CT70Tolstoy1.8.2014DSHMCZáchranná skupina25.6.2017Brušná efúzna
CT71Amadeus29.6.2016DSHMCTúlavá20.6.2017Hrudná efúzna
CT72Bella25.2.2017British SHFChovateľ20.6.2017Brušná efúzna
CT73Siersha8.8.2015DSHFSÚtulok21.6.2017Brušná neefúzna
CT74Maive4.3.2017SiberianFSChovateľ7.7.2017Brušná efúzna
CT75Lucy31.3.2017DSHFZáchranná skupina10.7.2017Brušná efúzna
CT76Pie20.7.2016Exotic SHMChovateľ28.6.2017Brušná efúzna
CT77Mila15.3.2017SiberianFSChovateľ3.7.2017Brušná efúzna
CT78Polly1.3.2016DSHMCZáchranná skupina22.7.2017Brušná neefúzna
CT79Oona21.9.2016HimalayanFChovateľ18.7.2017Hrudná neefúzna
CT80Fezzik17.10.2016DLHMCTúlavá25.7.2017Brušná efúzna
CT81Jewelkat8.9.2016PersianFSChovateľ1.8.2017Hrudná efúzna
CT82Tiko8.4.2016DSHMCZáchranná skupina6.8.2017Brušná efúzna
F = samica nekastrovaná; FS = samica kastrovaná; M = samec nekastrovaný; MC = samec kastrovaný; DLH = domáca dlhosrstá; DSH = domáca krátkosrstá; SH = krátkosrstá;

Liečebný režim

Na základe predchádzajúcich experimentov s tkanivovými kultúrami a farmakokinetických štúdií na laboratórnych mačkách bol počiatočný dávkovací režim pre GS-441524 stanovený na 2,0 mg/kg SC q24h. Na základe skúseností s inhibítorom 3CL proteázy GC376 proti prirodzene sa vyskytujúcej FIP bola určená minimálna doba liečby 12 týždňov. Liečba sa predĺžila o jeden alebo viac týždňov u mačiek, ktoré stále mali abnormálne hodnoty sérových bielkovín. V neskorších štádiách štúdie sa dávka zvýšila z 2,0 na 4,0 mg/kg v prípadoch, keď sa liečba musela predĺžiť, alebo keď došlo k relapsu choroby. Majiteľom bola každé 4 týždne zasielaná nová dávka lieku vo forme vopred natiahnutých injekčných striekačiek Luer lock s objemom 1 alebo 3 ml s 1 palcovými ihlami Luer veľkosti 22G (0,7x25mm). Injekčné striekačky sa uložili do chladničky a pred aplikáciou sa zahriali na izbovú teplotu. Injekcie boli aplikované pozdĺž chrbtice od 2 cm za lopatkami do polovice bedrovej oblasti a do polovice vzdialenosti nadol na susedný hrudník a boky.

Monitorovanie počas počiatočného obdobia liečby

V čase vstupu do testovania bola u mačiek vysadená všetka liečba, ktorá nebola nevyhnutná – antibiotiká, kortikosteroidy, interferóny, pentoxifylín, nesteroidné protizápalové lieky, alebo lieky na tlmenie bolesti. Počas pobytu na UC Davis boli mačky každých 12 hodín monitorované z hľadiska teploty, chuti do jedla, aktivity, močenia a defekácie. Krv bola odoberaná v 1–3 denných intervaloch na vyhodnotenie hematokritu, celkového proteínu, bilirubínu, počtu bielych krviniek a diferenciálneho počtu bielych krviniek.

Vzorky ascitu sa odobrali na začiatku a potom sa odoberali v jedno alebo niekoľko denných intervaloch čo najdlhšie, ako to bolo možné, a testovali sa na úrovne prepisov FIPV 7b RNA kvantitatívnou (q) RT-PCR (IDEXX molekulárna diagnostika). Rezy tkaniva fixovaného formalínom od piatich pitvaných mačiek, boli podrobené imunohistochémii na proteín nukleokapsidy FIPV.

Monitorovanie počiatočnej a dlhodobej reakcie na liečbu

Mačky boli prepustené do domáceho ošetrenia, keď bola zaznamenaná významná priaznivá odpoveď na liečbu, zvyčajne do 3–5 dní. Počas tohto obdobia boli majitelia poučení, ako správne podávať subkutánne injekcie, a boli vyzvaní, aby pokračovali v denných záznamoch o telesnej teplote, aktivite, chuti do jedla, defekácii a močení a týždenných meraniach telesnej hmotnosti. CBC a sérový chemický panel boli robené v mesačných intervaloch miestnymi veterinármi alebo počas návštev VMTH. Bolo potrebné zaznamenávať a okamžite hlásiť akékoľvek abnormálne príznaky alebo správanie. Odôvodnená eutanázia bola zvyčajne vykonaná veterinárnym lekárom majiteľa alebo, ak to bolo možné, v UC Davis. Telá boli okamžite ochladené a zapečatené v plastových vreciach, a odoslané do 2 alebo menej dní v kontajneroch chladených ľadom na UC Davis expresnou poštou. Pitvy boli vykonané jedným z autorov (ML) v Anatomic Pathology Service, School of Veterinary Medicine, UC Davis. Bola rešpektovaná žiadosť majiteľa o konečnú dispozíciu tela.

Výsledky

Signalizácia a prezentácia choroby

Do štúdie bolo zaradených 31 mačiek vo veku od 3,4 do 73 mesiacov (priemerne 13,6 mesiacov) (tabuľka 1). Osemnásť mačiek boli domáce krátkosrsté a dlhosrsté , 13 mačiek predstavovalo zástupcov 10 rôznych plemien (tabuľka 1). Domáce mačky boli adoptované z organizácií na záchranu mačiek (n = 13), útulkov (n = 2) alebo to boli túlavé mačky z okolia (n = 3). Štúdia zahŕňala 14 samíc (7 nekastrovaných; 7 kastrovaných) a 17 samcov (1 nekastrovaný; 16 kastrovaných).

Dvadsaťšesť z 31 mačiek malo vlhkú FIP (6 hrudná, 20 brušná). Päť mačiek malo neefúznu FIP; štyri z nich (CT59, CT64, CT73, CT78) s ochorením lokalizovaným do brucha (mezenterické a ileo/cekálne/kolické lymfatické uzliny) a jedna (CT79) do hrudníka (pľúca, hilárne lymfatické uzliny) (tabuľka 1). Štyri ďalšie mačky vykazovali znaky skoršej suchej FIP, ktorá prešla do efúznej formy (CT57, CT65, CT67, CT71) (tabuľka 1). Hrubé príznaky očného ochorenia zodpovedajúce FIP sa potvrdili oftalmoskopickým vyšetrením u troch z 31 mačiek (CT56, CT65, CT71). Dve mačky (CT71, CT80) neochotne alebo už vôbec nedokázali skákať na vyvýšené miesta, čo naznačovalo neurologické postihnutie.

Výsledky liečby

Štyri mačky boli eutanizované (CT62, CT72, CT75) alebo uhynuli (CT56) počas prvých 2–5 dní kvôli závažnému ochoreniu a iným komplikáciám a piata mačka bola eutanizovaná (CT54) po 26 dňoch z dôvodu chýbajúcej reakcie na liečbu (obrázok 1). Liečba prebiehala bez prerušenia, s výnimkou troch mačiek, ktorým bol v 4. (mačka CT80) alebo 8. týždni (mačky CT53, CT71) poskytnutý dvojtýždňový oddych kvôli problémom s podávaním injekcií a kožným reakciám (obrázok 1). Mačka CT53 bola po druhom relapse liečená po dobu 8 a nie 12 týždňov z dôvodu zvýšenia močoviny v krvi a zvýšenia sérových hladín symetrického dimetylarginínu (SDMA).

Obrázok 1.
Časová škála liečby a klinický výsledok 31 mačiek, ktoré boli zaradené do klinickej štúdie GS-441524. Obdobie liečby je označené plnou čiarou (dávka 2 mg/kg) alebo prerušovanou čiarou (dávka 4 mg/kg). Hviezdičky označujú bod relapsu. Dátum ukončenia liečby pre mačky, ktoré dosiahli trvalú klinickú remisiu, je uvedený v zátvorkách. Časový bod a príčina smrti sú označené krížikom

Klinická reakcia 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby, bola dramatická. Horúčka zvyčajne ustúpila do 12–36 hodín (obrázok 2), súčasne s každodenným výrazným zvýšovaním chute do jedla, úrovne aktivity a prírastku hmotnosti. Brušné výpotky rýchlo vymizli počas 1-2 týždňov, počnúc asi 10.-14. dňom po zahájení liečby. Mačky s hrudným výpotkom zvyčajne vykazujúce dýchavičnosť, absolvovali u praktickych súkromných veterinárov odsatie pleurálnych výpotkov ešte pred príchodom na UC Davis. Zbytková dýchavičnosť a hrudný výpotok rýchlo reagovali na liečbu a po 7 dňoch už neboli vôbec viditeľné. Žltačka pomaly odznela v priebehu 2–4 týždňov, súčasne s poklesom hyperbilirubinémie. Známky očného ochorenia začali miznúť do 24-48 hodín a prestali byť zjavné navonok i pre oftalmoskopické vyšetrenie do 7–14 dní. V priebehu liečby začalo dochádzať k zmenšovaniu zväčšených mezenterických a ileo/cekálno/kolických lymfatických uzlín. Všetkých 26 mačiek vyzeralo podľa odhadov majiteľov navonok normálne alebo takmer normálne po 2 týždňoch liečby. Po 2 týždňoch liečby sa kládol dôraz na sledovanie niekoľkých parametrov krvných testov. Kľúčové hodnoty zahŕňali hematokrit, celkový počet bielych krviniek, absolútny počet lymfocytov, celkový sérový proteín, sérový globulín, sérový albumín a pomer albumín: globulín (A:G).

Obrázok 2.
Priemer (plná čiara) a 1 SD (smerodajná odchýlka) (čiarkovane) telesných teplôt počas prvých 5 dní liečby GS-441524. Normálny teplotný rozsah pre mačky je 37,7–39,1 °C (100–102,5 ° F). Teploty klesli do normálneho rozsahu do 12–36 hodín od začiatku liečby

Osemnásť z 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov neprerušenej primárnej liečby, nevyžadovalo žiadnu ďalšiu liečbu. Osem ďalších mačiek však utrpelo relapsy choroby v priebehu 3–84 dní (priemerne 23 dní) (obrázok 1). Táto skupina zahŕňala tri mačky, u ktorých došlo k dočasnému prerušeniu počiatočnej liečby (CT53, CT71, CT80), a päť mačiek (CT53, CT57, CT60, CT68, CT73), ktoré vyžadovali predĺženú primárnu liečbu (obrázok 1). Relapsy choroby u 2/8 mačiek (CT57, CT71) mali zjavne neurologický charakter s vysokou horúčkou a silnou zadnou ataxiou a nekoordináciou, zatiaľ čo relapsy choroby u zvyšných šiestich mačiek pozostávali hlavne z horúčky, anorexie a znízenej aktivity. Iba jedna mačka (CT60) mala pri relapse zjavný brušný výpotok. Jedna mačka (CT57) bola eutanizovaná 2 týždne po relapse s neurologickými príznakmi, ktoré nereagovali na druhé kolo liečby.

U ôsmich mačiek bolo rozhodnuté zvýšiť dávku GS-441524 z 2,0 na 4,0 mg/kg, buď z dôvodu predĺženia liečby (CT77, CT80), alebo z dôvodu jedného (CT60, CT68, CT71, CT73) alebo dvoch relapsov (CT53, CT63), alebo preto, že relaps mal neurologickú formu (CT71). Všetkých osem mačiek reagovalo pozitívne na režim zvýšeného dávkovania.

Celkovo 25/26 mačiek liečených 12 týždňov alebo dlhšie dosiahlo trvalú remisiu FIP, hoci jedna z nich následne zomrela na nesúvisiaci problém so srdcom (pozri „Pitevné nálezy“). Najdlhšie prežívajúce mačky v čase publikácie (OnlineFirst, február 2019) ukončili liečbu v auguste 2017 a najkratšie v máji 2018, všetky po ukončení pozorovacieho obdobia, v ktorom ešte mohlo dôjsť k relapsu (tj. 84 dní po ukončení liečby). 24 preživších mačiek bude starostlivo monitorovaných pre prípadný návrat príznakov ochorenia a budú sa pravidelne testovať na celkový pomer bielkovín, globulínu, albumínu a A:G počas prvého roka. Menej intenzívne monitorovanie sa bude vykonávať po zvyšok života mačiek. Majitelia boli upozornení, aby sa vyhli zbytočnému namáhaniu mačiek počas prvých 3 mesiacov, aj keď štyri mačky (CT52, CT58, CT65, CT79) a jeden kocúr (CT76) absolvovali bezproblémovú kastráciu.

Ukazovatele priaznivej reakcie na liečbu

Najjednoduchším dlhodobým meradlom účinnosti liečby bola telesná hmotnosť. K nárastu hmotnosti o 20–120% došlo počas a po liečbe, dokonca aj u mačiek, ktoré v čase diagnózy mali 1 rok alebo viac. Zdá, že výrazný rast sa prejavil aj u mladších mačiek, ako to nezávisle zaznamenali ich majitelia. Tieto výrazné zrýchlenia rastu po liečbe naznačili, že FIP bola u mnohých mačiek nejaký čas pred diagnózou subklinická a ovplyvnila ich rast. Pri sledovaní neskorších účinkov liečby a pri pozorovaní možných toxicít liekov sa osvedčili aj CBC (hematológia) a chemický profil (biochémia).

CBCs (Hematológia)

Mačky vykazovali zvýšený počet bielych krviniek, ktorý klesol na normálne hodnoty v priebehu prvých 2 týždňov liečby (obrázok 3a). Lymfopénia zaznamenaná v čase prijatia vymizla počas prvého týždňa liečby (obrázok 3b). Pri prijatí sa pozorovala mierna až stredne závažná anémia, čo sa prejavilo v hematokrite (PCV) (obrázok 4). Hematokrit sa vrátil na normálne hodnoty až po 6–8 týždňoch liečby. Absolútny celkový počet bielych krviniek a lymfocytov boli jedinými významnými hodnotami počas prvého týždňa liečby, zatiaľ čo PCV poskytol presnejší obraz postupu liečby počas prvých 8 týždňov.

Obrázok 3.
(a) Priemerný počet bielych krviniek so štandardnou odchýlkou u 26 mačiek, ktoré dokončili primárny liečebný režim 12 alebo viac týždňov. (b) Priemerný absolútny počet lymfocytov v krvi so štandardnou odchýlkou u 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby
Obrázok 4.
Hematokrit (PCV) so štandardnou odchýlkou pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby. Bodkovaná čiara naznačuje trend rastu PCV v priebehu času

Zmeny sérových bielkovín

Mačky s FIP často vykazovali vyššiu ako normálnu celkovú koncentráciu bielkovín v sére, vysokú hladinu sérového globulínu, nízku hladinu sérového albumínu a nízky pomer A:G (obrázky 5–7). Abnormálne hodnoty sérových bielkovín sa progresívne zlepšovali a dosiahli normálne hodnoty po 8–10 týždňoch liečby (obrázky 5–7). Hladina celkového proteínu bola najmenej informatívna, čo naznačuje nízka hodnota R2 (0,1883) trendovej spojnice (obrázok 5). Avšak 3 týždne po zahájení liečby došlo k dramatickému a prechodnému zvýšeniu celkových hladín proteínov (obrázok 5). Tento jav súvisel so zvýšením sérových globulínov (obrázok 6a) v čase rýchleho ústupu brušných výpotkov.

Obrázok 5.
Priemerné hladiny celkového proteínu v sére a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby
Obrázok 6.
(a) Priemerné hladiny sérového globulínu a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby. (b) Priemerné hladiny sérového albumínu a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby
Obrázok 7.
Priemerné pomery albumínu:globulínu (A/G) a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby

Plazmatické hladiny globulínu stúpali počas prvých 3 týždňov liečby, dosiahli vrchol a potom pomaly klesali na maximálnu referenčnú hodnotu 4,5 g/dl alebo nižšiu do 9. týždňa (obrázok 6a). Aj keď sa zdá, že hladiny globulínu v priebehu času reflektovali stav liečby, nízka hodnota R2 (0,3621) ukázala, že sa jedná o menej spoľahlivý ukazovateľ pokroku v liečbe.

Hladiny albumínu v sére 26 mačiek liečených najmenej 12 týždňov boli v čase zahájenia liečby zvyčajne nízke (⩽3,2 g/dl) (obrázok 6b). Hladiny albumínu sa potom pomaly zvyšovali a dosiahli normálnu úroveň po 8 týždňoch. Trendová čiara tohto nárastu albumínu mala vysokú hodnotu R2 (0,79), vďaka čomu boli hladiny sérového albumínu, ako aj PCV, dobrým indikátorom pokroku v liečbe. Ako sa očakávalo, pomer A:G vykazoval v priebehu času rovnako silnú trendovú líniu a okolo 8. týždňa liečby úroveň presiahla hodnotu 0,70 (obrázok 7).

Pokles hladiny vírusovej RNA v bunkách z ascitickej tekutiny v spojitosti s liečbou

Počas prvých 2–9 dní antivírusovej liečby sa odoberali od ôsmich mačiek sekvenčné vzorky ascitu a testovali sa na hladiny vírusovej RNA pomocou qRT-PCR (tabuľka 2). Najspoľahlivejším zdrojom FIPV RNA boli celé výpotky alebo ich bunkové frakcie. U 7/8 mačiek hladiny vírusovej RNA poklesli do 2-5 dní, často na nedetekovateľné hodnoty. U jednej mačky (CT54) sa neprejavil významný pokles hladín vírusovej RNA ani v priebehu 9 dní.

Tabuľka 2
Úrovne prepisov RNA vírusu mačacej infekčnej peritonitídy 7b v celých ascitoch alebo v bunkovej frakcii ascitickej tekutiny počas počiatočnej liečby GS-441524

ID vzorkyDni liečbyTyp vzorkyKópie vírusovej RNA/ml
CT520Ascites9.44 × 104
3AscitesNezistiteľné
CT540Ascites8.49 × 105
2Ascites6.97 × 104
4Ascites2.44 × 103
7Ascites2.07 × 103
9Ascites6.46 × 104
CT620Ascites5.96 × 103
2Ascites1.53 × 103
8AscitesNezistiteľné
CT740Bunky6.51 × 106
2Bunky3.39 × 105
CT750Bunky9.08 × 106
3Bunky4.75 × 105
4Bunky2.50 × 105
CT770Ascites5.47 × 104
2Ascites3.93 × 103
CT800Ascites4.10 × 103
2AscitesNezistiteľné
CT820Ascites1.13 × 104
5AscitesNezistiteľné

Vedľajšie účinky pozorované počas liečby a po liečbe

Ohraničené reakcie v mieste vpichu. Boli pozorované dva typy reakcií v mieste vpichu, a či boli spôsobené liekom, riedidlom alebo obomi, nebolo zistené. Okamžité reakcie na bolesť sa prejavovali vokalizáciou, občasným vrčaním a posturálnymi zmenami trvajúcimi 30–60 s. Tieto počiatočné reakcie sa časom zmierňovali, pretože majitelia sa stávali viac zručnými v podávaní injekcií a mačky sa tejto rutine postupne prispôsobovali. U šestnástich z 26 liečených mačiek sa prejavili reakcie v mieste vpichu (tabuľka 3). Reakcie boli zjavné najčastejšie počas prvých 4 týždňov a progredovali do otvorených rán iba u 7/16 mačiek. Ulcerácie sa zahojili do 2 týždňov zastrihnutím okolitých chlpov a jemným vyčistením rany vatovým tampónom namočeným v jednom diele peroxidu vodíka pre domácnosť a v dvoch dieloch vody dvakrát denne. Iba tri mačky mali znateľné jazvy v miestach vpichu.

Tabuľka 3
Reakcie v mieste vpichu u 16 z 26 mačiek liečených GS-441524 po dobu 12 týždňov alebo dlhšie

ID mačkyPovrchové lézieOtvorené ranyJazvy
CT53310
CT58100
CT60002
CT61500
CT63220
CT64101
CT65911
CT66320
CT68400
CT71510
CT73710
CT74310
CT761000
CT78700
CT79200
CT82200
Väčšina lézií bola povrchová a zahŕňala epidermis a nevyžadovala žiadnu liečbu, zatiaľ čo u niektorých došlo k progresii do otvorených rán, ktoré sa uzdravili do 2 týždňov topickou liečbou. Niektoré reakcie zanechali malé trvalé jazvy

Systémové liekové reakcie. Liečba GS-441524 v celkovom období 12–30 týždňov bola pozoruhodne bezpečná. V hodnotách CBC neboli pozorované žiadne dlhodobé abnormality (obrázky 3 a 4). Testy funkcie pečene a obličiek a hladiny amylázy/lipázy zostali počas liečby a po liečbe normálne (doplňujúce obrázky S1 – S3). Jedinou výnimkou bola mačka CT53, u ktorej došlo k progresívnemu zvýšeniu močoviny v krvi (BUN) na 35 mg/dl (referenčný interval [RI] 16–37 µg/dl) a k náhlemu zvýšeniu SDMA (20 µg/dl) (RI 0-14 µg/dl) po 8 týždňoch v treťom kole liečby v režime zvýšenej dávky 4 mg/kg. Aj keď mali tieto príznaky stále miernu povahu, bolo pre istotu rozhodnuté ukončiť liečbu. Tieto abnormality pri testovaní o 1 mesiac neskôr už neboli prítomné a mačka je momentálne v remisii choroby.

Pitevné nálezy

Štyri mačky (CT56, CT62, CT72, CT75) boli eutanizované alebo uhynuli do 2–5 dní od zaradenia do štúdie a pitvy boli vykonané u všetkých okrem mačky CT75. Piata mačka (mačka CT54) bola eutanizovaná po 26 dňoch liečby. Všetkých päť týchto mačiek malo závažné brušné efúzne ochorenie. U mačky CT54 a CT56 sa pri pitve našli dôkazy o rozšírenej pyogranulomatóznej vaskulitíde zahŕňajúcej brušné vnútornosti, centrálny nervový systém a oči. U mačky CT56 došlo aj kompromitácii ileálnej steny v oblasti hustého infiltrátu a sekundárnej bakteriálnej sepse. Mačka CT72 mala ťažkú ​​pyogranulomatóznu vaskulitídu obmedzenú na brucho so stredne ťažkým až ťažkým periférnym edémom a mineralizáciou kôry nadobličiek. Mačka CT62 trpela ťažkou pyogranulomatóznou a fibrinosuppuratívnou peritonitídou, ktorú komplikovala akútna perforácia žalúdka spojená s rastlinným materiálom a intralezionálnymi baktériami svedčiacimi o sepse. Mačka CT75 vykazovala chronickú formu FIP charakterizovanú silným spomalením rastu, masívne nízkym obsahom bielkovín / nízkym obsahom buniek vo výpotku, zrýchlenou činnosťou srdca svedčiacou o poškodení srdcovej funkcie a stredne závažným periférnym edémom. Echokardiogram ukázal bilaterálne zväčšenie predsiení, ale nijaký náznak primárneho srdcového ochorenia. Zdalo sa, že mačka reagovala na GS-441524 a bola prepustená. Mačka upadla o 2 dni neskôr do šoku a bola eutanizovaná bez pitvy.

V čase pitvy mačiek CT56, CT72 a CT75 pri použití qRT-PCR nebol vírus FIPV detekovaný, hoci vzorky ascitu pred liečbou boli pozitívne. Ascites z mačky CT54 vykazoval pozitívny výsledok qRT-PCR počas celej liečby (tabuľka 2) a tkanivá boli v čase pitvy stále imunohistochemicky pozitívne.

Po úspešnom absolvovaní jedného alebo viacerých kôl liečby boli eutanizované aj ďalšie dve mačky. Mačka CT57 bola po jednom kole liečby normálna, ale o 2 týždne neskôr došlo k relapsu so závažnými neurologickými príznakmi. Mačka nereagovala na opakovanú liečbu a bola usmrtená. Lézie typické pre FIP sa našli v mozgu a bruchu, ale boli negatívne na FIPV určený imunohistochémiou pre nukleokapsidový proteín alebo na 7b RNA pomocou qRT-PCR. Mačka CT80 bola úspešne liečená na efúznu brušnú FIP, ale o 4 týždne neskôr sa u nej objavili silné bolesti zadných nôh a krížov. Zistilo sa, že mačka mala výrazné zhrubnutie steny ľavej komory a septa, ktoré spôsobilo vážne zúženie komory (obrázok 8). Mikroskopický vzhľad steny ľavej srdcovej komory bol typický pre vrodenú mačaciu hypertrofickú kardiomyopatiu (HCM). V brušnej dutine, na hrudníku, v očiach, v mozgu alebo v chrbtici sa nezistili žiadne hrubé ani mikroskopické lézie FIP a qRT-PCR nedetekoval FIPV antigén a ani RNA FIPV.

Obrázok 8.
Prierez srdcom mačky CT80 vykazujúci extrémnu hypertrofiu steny ľavej komory a septa a extrémne zúženie komory

Diskusia

GS-441524 je za posledné 2-3 roky po GC376 druhým testovaným cieleným antivírusovým liekom pre liečbu FIP. Tieto dva lieky inhibujú vírusovú replikáciu dvoma veľmi odlišnými spôsobmi, buď ukončením vírusovej RNA transkripcie alebo blokovaním štiepenia vírusového polyproteínu. Oba procesy sú dobre známym cieľom pre liečbu niektorých ľudských vírusových ochorení. Kľúčovou otázkou je porovnanie liečby nukleozidovým analógom s liečbou inhibítorom vírusovej proteázy. Tieto dva lieky poskytli prakticky identické výsledky v štúdiách na tkanivových kultúrach a experimentálne infikovaných mačkách. Účinnosť proti prirodzene sa vyskytujúcej FIP sa však javila pri GS-441524 vyššia ako pri GC376. Šesť z 20 mačiek liečených GC376 zostáva dodnes v remisii (Pedersen NC, nepublikované údaje, 2018) v porovnaní s 25/31 mačkami liečenými GS-441524. Ochorenia, ktoré nereagovali na opakovanú liečbu, sa vyskytli u 14/20 mačiek s GC376 ale iba u jednej mačky liečenej GS-441524. 8 zo 14 relapsov spojených s GC376 malo neurologický charakter, v porovnaní s 2/8 relapsmi s GS-441524. Jeden z dvoch neurologických relapsov u mačiek liečených GS-441524 reagoval na opakovanú liečbu vyššou dávkou, zatiaľ čo neurologické relapsy s GC376, dokonca ani pri zvýšenej dávke, už neboli liečiteľné. Obidve liečby spôsobovali podobné reakcie v mieste vpichu. Obidva lieky sa javia ako pomerne bezpečné, hoci GC376 interferoval s vývojom trvalých zubov, keď sa podával mladším mačiatkam.

Aj keď sa zdá, že výsledky klinickej štúdie uprednostňujú GS-441524, niektoré rozdiely mohli byť ovplyvnené tým, ako boli tieto dva lieky podávané. Účinnosť GC376 sa mohla zlepšiť, ak by bolo všetkých 20 mačiek liečených bez prerušenia po dobu 12 týždňov, namiesto toho, aby boli liečené progresívne dlhšími obdobiami, začínajúcimi iba na 2 týždňoch. Päť zo šiestich mačiek vyliečených pomocou GC376 patrilo medzi sedem mačiek, ktoré boli liečené nepretržite po dobu 12 týždňov, zatiaľ čo bola vyliečená iba jedna z 13 mačiek liečených jedenkrát alebo viackrát po kratšiu dobu. Tieto kratšie doby trvania liečby boli nevyhnutné na stanovenie 12-týždňového obdobia použitého pre všetky mačky v tejto štúdii. Klinická štúdia GC376 okrem toho zahŕňala menej mačiek a bola limitovaná obmedzeným prísunom lieku, čo sťažilo testovanie ďalších dávkovacích režimov. Preto by sa mal GC376 pred akýmkoľvek konečným porovnaním ďalej študovať s použitím minimálne 12 týždňov s vyššou dávkou a väčším počtom mačiek. Bolo by tiež dôležité niekedy v budúcnosti vyhodnotiť obidva typy liekov v kombinácii, tak ako sa to robí pri HIV/AIDS a hepatitíde C.

V každej štúdii tohto typu treba počítať s predčasnými úmrtiami, ale ako by sa mali posudzovať pri analýze účinnosti? Päť predčasných úmrtí v tejto štúdii bolo zahrnutých do analýzy účinnosti GS-441524, ale boli vyradené v štúdii GC376. Pre zahrnutie úmrtí do štúdie je dôležité zistenie statusu vírusu v čase smrti. Vírusová RNA sa nezistila u troch pitvaných mačiek, ktoré uhynuli po 2–5 dňoch liečby s GS-441524, čo naznačuje, že liek bol účinný, ale choroba bola v príliš pokročilom štádiu. Nebolo to tak v prípade štvrtej pitvanej mačky, ktorá prežila 26 dní; hladiny vírusovej RNA počas celého obdobia liečby neklesli a príznaky choroby sa nezmiernili. Preto je možné, že táto mačka uhynula v dôsledku neúspešného zastavenia replikácie vírusu. Rezistencia na GS-5734 (Remdesivir), proliečivo GS-441524, bola spojená s mutáciami aminokyselín v RNA polymeráze a korekčnou exonukleázou v tkanivovými kultúrami propagovaných koronavírusoch. Či sa u tejto mačky vyskytla podobná rezistencia, bude ešte treba zistiť. Rezistencia na lieky bola pozorovaná u aj u jednej mačky v teste GC376. Našťastie žiadna z ďalších mačiek v súčasnej štúdii nevykazovala príznaky rezistencie na lieky. U budúcich mačiek, ktoré nereagujú vôbec alebo reagujú nedostatočne na primárnu alebo sekundárnu liečbu, je však potrebné túto možnosť vziať do úvahy.

Počiatočná dávka GS-441524 použitá v predloženej štúdii bola stanovená na základe predchádzajúcich farmakokinetických a experimentálnych infekčných štúdií s laboratórnymi mačkami. Tieto štúdie naznačili, že 2,0 a 5,0 mg/kg SC q24h po dobu 14 dní by boli rovnako účinné aj pri klinickej štúdii. Preto bola pre klinické testovanie zvolená dávka 2,0 mg/kg, pretože by to znížilo spotrebu lieku o 60%. Aj keď bolo toto rozhodnutie potvrdené u 18/26 mačiek, osem ďalších mačiek buď utrpelo relapsy choroby (dve dokonca dvarát), alebo si vyžiadali dlhšie trvanie liečby, aby sa kľúčové hodnoty krvi dostali späť do normálu. Preto bolo urobené rozhodnutie zvýšiť dávku GS-441524 z 2,0 mg/kg na 4,0 mg kg SC q24h u mačiek, u ktorých došlo k relapsu alebo vyžadovali predĺženú liečbu. Úspešnosť 4,0 mg/kg SC q24h u najmenej 12 takýchto mačiek, ako aj u jednej mačky s neurologickým ochorením, nás priviedla k záveru, že ide o účinnejšie dávkovanie a malo by sa stať základom pre budúcu liečbu.

Bolo dôležité sledovať jednoduché biologické ukazovatele pokroku v priebehu ⩾ 12 týždňovej liečby. Ako užitočné markery boli identifikované hladiny HCT (PCV), hladiny celkového proteínu v sére, globulínu a albumínu a pomer A:G. Na základe týchto parametrov sa ukázalo, že mačky sa po 6–10 týždňoch liečby ešte celkom nezotavili. Toto zistenie potvrdilo minimálne 12-týždňové trvanie liečby stanovené v predchádzajúcej klinickej štúdii GC376. Chronická anémia (anémia zápalu) postihuje 18–95% ľudí s akútnymi a chronickými infekciami a je normocytová/normochromická a nesúvisí s nedostatkom železa. Dobrým ukazovateľom aktivity ochorenia boli aj plazmatické hladiny albumínu, a je známe, že nízky albumín a nízky HCT (PCV) korešpondujú s výskytom chronického ochorenia. Hyperglobulinémia u mačiek s FIP bola klasifikovaná ako infekčná/zápalová a je spôsobená zvýšením vo všetkých triedach gama globulínov a variabilnými prírastkami vo frakcii alfa-2 globulínov. Výrazná tendencia mačiek s FIP k vysokej sérovej hladine globulínu a nízkej hladine albumínu robí z pomeru A:G obzvlášť dobrý indikátor aktivity ochorenia.

Očakávalo sa, že čistokrvné mačky nebudú rovnako dobre reagovať na liečbu z dôvodu geneticky oslabenej schopnosti imunologicky reagovať na FIPV, a že mladšie mačky s vlhkou FIP budú na liečbu reagovať najlepšie. V tejto štúdii však nakoniec čistokrvné mačky reagovali rovnako dobre ako obyčajné mačky, a plemená zastúpené mačkami v štúdii odrážali najpopulárnejšie súčasné plemená. Staršie mačky a mačky s čistou neefúznou FIP reagovali na liečbu GS-441524 rovnako dobre, ako mladé mačky a mačky s vlhkou FIP. Za predpokladu, že sa dá pomocou GS-441524 liečiť aj časť mačiek s očným a neurologickým ochorením, sa dá povedať, že by sa už žiadne prejavy FIP nemuseli považovať za neliečiteľné.

Bezpečnostný profil GS-441524 bol pôsobivý. Na základe CBC a sérových chemických hodnôt počas celkových liečebných období v trvaní od 12 do 30 týždňov sa až na jednu možnú výnimku nepozorovali žiadne významné systémové príznaky toxicity. Jedna mačka (CT53) mala mierny nárast BUN a SDMA v 8. týždni tretieho kola liečby a v rámci preventívnych opatrení si vynútila pozastavenie liečby. Na základe predchádzajúcich skúseností s GC376 boli obavy z účinku GS-441524 na vývoj trvalého chrupu. Tri mačky (CT52, CT74, CT77) v tejto štúdii boli vo veku 4 mesiacov alebo mladšie a stále mali juvenilný chrup a žiadna z nich nevykazovala žiadne následné zubnej abnormality. U GS-441524 sa pozorovali reakcie v mieste vpichu, ale ich počet bol pozoruhodne nízky a boli ľahko liečiteľné. Nezistilo sa, či je na vine liek, riedidlo alebo oboje. pH riedidla 1,5 bolo hlboko pod minimálnou hraničnou hodnotou 4,5 stanovenou FDA (Food and Drug Administration), avšak liečivá tohto typu sa ťažko rozpúštajú a stabilizujú pri fyziologicky priaznivejšom pH. Napriek tomu by sa malo vyhodnotiť viac fyziologických riedidiel.

Jedna mačka v štúdii (CT80) mala znepokojivé klinické príznaky. Aj keď mačka vykazovala efúznu brušnú FIP, mala aj dlhodobé príznaky nejasného zakrivenia zadnej končatiny, bolesti krížov, pravidelných epizód padania, neochoty skákať na vyššie miesta a nevysvetliteľných a prechodných zmien správania. Tieto príznaky viedli k liečbe mačky ešte dlho po zmiznutí brušného výpotku. Nakoniec sa prijalo rozhodnutie liečbu prerušiť a zistiť, či sa vrátia charakteristické príznaky FIP. Mačka bola nakoniec eutanizovaná a pri pitve bolo zistené, že má vrodený typ HCM a žiadne zvyškové lézie FIP alebo vírusovej RNA v akýchkoľvek tkanivách. Dilatačná kardiomyopatia bola hlásená u 17,6% ľudí infikovaných HIV pri chronickej antiretrovírusovej liečbe. Dospelo sa však k záveru, že príčinou srdcového ochorenia u tejto mačky nebol GS441524. Ochorenie srdca u tejto mačky bolo hypertrofické na rozdiel od dilatačnej formy pozorovanej u pacientov s HIV, a navyše je HCM u útulkových mačiek pomerne bežná.

Závery

Výsledky získané od 31 mačiek liečených GS-441524 prekonali všetky očakávania a naznačujú, že FIP, bez ohľadu na signalizáciu alebo formu ochorenia, je s použitím nukleozidových analógov liečiteľné ochorenie. Koncepcia štúdie a parametre liečby vyplývajúce z tohto obmedzeného klinického testovania budú dôležité pre ďalšie úsilie v komercializácii tohto alebo podobných liekov proti FIP.

Doplnkový materiál

Formulár súhlasu majiteľa

Obrázok S1. Priemerné hladiny pečeňových enzýmov (IU / L) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.
Obrázok S2. Priemerné hladiny lipázy a amylázy v sére (IU/L) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.
Obrázok S3. Priemerné hladiny BUN a kreatinínu u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Poďakovania

Ďakujeme pracovníkom Centra pre zdravie spoločenských zvierat za pomoc pri preprave liekov (Lyra Pineda-Nelson a Nancy Bei) a za prezentáciu údajov (Cynthia Echeverria). Sme vďační najmä mnohým majiteľom a 31 mačkám, ktoré sa zúčastnili emotívnej a náročnej cesty, ktorá predčila všetky očakávania. Sme vďační aj praktickým súkromným veterinárom, ktorí pomáhali s pravidelnými krvnými testami a boli tu pre nás a ich pacientov/majiteľov, keď to bolo potrebné.

Poznámky

Prijaté: 28. decembra 2018

Doplnkový materiál: K dispozícii sú nasledujúce súbory: Formulár súhlasu klienta.

Obrázok S1: Priemerné hladiny pečeňových enzýmov (IU / l) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Obrázok S2: Priemerné hladiny lipázy a amylázy v sére (IU / l) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Obrázok S3: Priemerné hladiny urey a kreatinínu v krvi u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Konflikt záujmov: MP a EM sú zamestnancami spoločnosti Gilead Sciences, Foster City, CA, USA a majú v spoločnosti podiely.

Finančné prostriedky: Finančnú podporu pre túto štúdiu poskytli Centrum pre spoločenské zdravie zvierat UC Davis, Fond Philipa Raskina v Kansas City a početní darcovia organizácii SOCK FIP podľa pokynov pani Carol Horace. GS-441524 použitý v tomto pokuse bol poskytnutý spoločnosťou Gilead Sciences, Foster City, CA.

Literatúra

1.De Clercq, E, Li, G. Approved antiviral drugs over the past 50 years. Clin Microbiol Rev 2016; 29: 695–747.
Google Scholar | Crossref | Medline
2.Hartmann, K. Efficacy of antiviral chemotherapy for retrovirus-infected cats: what does the current literature tell us? J Feline Med Surg 2015; 17: 925–939.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
3.Thomasy, SM, Shull, O, Outerbridge, CA. Oral administration of famciclovir for treatment of spontaneous ocular, respiratory, or dermatologic disease attributed to feline herpesvirus type 1: 59 cases (2006–2013). J Am Vet Med Assoc 2016; 249: 526–538.
Google Scholar | Crossref | Medline
4.Pedersen, NC, Elliott, JB, Glasgow, A. An isolated epizootic of hemorrhagic-like fever in cats caused by a novel and highly virulent strain of feline calicivirus. Vet Microbiol 2000; 73: 281–300.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
5.Kim, Y, Shivanna, V, Narayanan, S. Broad-spectrum inhibitors against 3C-like proteases of feline coronaviruses and feline caliciviruses. J Virol 2015; 89: 4942–4950.
Google Scholar | Crossref | Medline
6.Pedersen, NC, Kim, Y, Liu, H. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2018; 20: 378–392.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
7.Pesteanu-Somogyi, LD, Radzai, C, Pressler, BM. Prevalence of feline infectious peritonitis in specific cat breeds. J Feline Med Surg 2006; 8: 1–5.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
8.Riemer, F, Kuehner, KA, Ritz, S. Clinical and laboratory features of cats with feline infectious peritonitis – a retrospective study of 231 confirmed cases (2000–2010). J Feline Med Surg 2016; 18: 348–356.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
9.Rohrbach, BW, Legendre, AM, Baldwin, CA. Epidemiology of feline infectious peritonitis among cats examined at veterinary medical teaching hospitals. J Am Vet Med Assoc 2001; 218: 1111–1115.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
10.Warren, TK, Jordan, R, Lo, MK. Therapeutic efficacy of the small molecule GS-5734 against Ebola virus in rhesus monkeys. Nature 2016; 531: 381–385.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
11.Sheahan, TP, Sims, AC, Graham, RL. Broad-spectrum antiviral GS-5734 inhibits both epidemic and zoonotic coronaviruses. Sci Transl Med 2017; 9. DOI: 10.1126/scitranslmed.aal3653.
Google Scholar | Crossref
12.Murphy, BG, Perron, M, Murakami, E. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol 2018; 219: 226–233.
Google Scholar | Crossref | Medline
13.Takano, T, Endoh, M, Fukatsu, H. The cholesterol transport inhibitor U18666A inhibits type I feline coronavirus infection. Antiviral Res 2017; 145: 96–102.
Google Scholar | Crossref | Medline
14.Takano, T, Nakano, K, Doki, T. Differential effects of viroporin inhibitors against feline infectious peritonitis virus serotypes I and II. Arch Virol 2015; 160: 1163–1170.
Google Scholar | Crossref | Medline
15.Kim, Y, Liu, H, Galasiti Kankanamalage, AC. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad- spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog 2016; 12: DOI: 10.1371/journal.ppat.1005531.
Google Scholar | Crossref
16.Gut, M, Leutenegger, CM, Huder, JB. One-tube fluorogenic reverse transcription-polymerase chain reaction for the quantitation of feline coronaviruses. J Virol Methods 1999; 77: 37–46.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
17.Agostini, ML, Andres, EL, Sims, AC. Coronavirus susceptibility to the antiviral remdesivir (GS-5734) is mediated by the viral polymerase and the proofreading exoribonuclease. MBio 2018; 9. DOI: 10.1128/mBio.00221-18.
Google Scholar
18.Weiss, G, Goodnough, LT. Anemia of chronic disease. N Engl J Med 2005; 352: 1011–1023.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
19.Kurnick, JE, Ward, HP, Pickett, JC. Mechanism of the anemia of chronic disorders: correlation of hematocrit value with albumin, vitamin B12, transferrin, and iron stores. Arch Intern Med 1972; 130: 323–326.
Google Scholar | Crossref | Medline
20.Taylor, SS, Tappin, SW, Dodkin, SJ. Serum protein electrophoresis in 155 cats. J Feline Med Surg 2010; 12: 643–653.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
21.Hirschberger, J, Hartmann, K, Wilhelm, N. Clinical symptoms and diagnosis of feline infectious peritonitis. Tierarztl Prax 1995; 23: 92–99.
Google Scholar | Medline
22.Pedersen, NC, Liu, H, Gandolfi, B. The influence of age and genetics on natural resistance to experimentally induced feline infectious peritonitis. Vet Immunol Immunopathol 2014; 28: 152–154.
Google Scholar
23.Jain, N, Reddy, DH, Verma, SP. Cardiac abnormalities in HIV-positive patients: results from an observational study in India. J Int Assoc Provid AIDS Care 2014; 13: 40–46.
Google Scholar | SAGE Journals
24.Payne, JR, Brodbelt, DC, Luis Fuentes, V. Cardiomyopathy prevalence in 780 apparently healthy cats in rehoming centres (the CatScan study). J Vet Cardiol 2015; 17 Suppl 1: S244–S257.
Google Scholar | Crossref | Medline
Publikované

Účinnosť inhibítora 3C-Like proteázy pri liečbe rôznych foriem získanej mačacej infekčnej peritonitídy

Pôvodný článok: Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis
Publikovaný: 13.9.2017, SAGE – Journal of Feline Medicine and Surgery

Niels C Pedersen,1 Yunjeong Kim,2 Hongwei Liu,1 Anushka C Galasiti Kankanamalage,3 Chrissy Eckstrand,4 William C Groutas,3 Michael Bannasch,1 Juliana M Meadows,5 and Kyeong-Ok Chang2

Abstrakt

Cieľ

Bezpečnosť a účinnosť inhibítora 3C-Like proteázy GC376 bola testovaná na skupine klientmi vlastnených mačiek s rôznymi formami infekčnej peritonitídy (FIP).

Metódy

Do klinického testu bolo prijatých 20 mačiek vo veku od 3,3 do 82 mesiacov (priemerne 10,4 mesiaca) s rôznymi formami FIP. Štrnásť mačiek malo vlhkú alebo zmiešanú FIP a šesť mačiek malo suchú FIP. GC376 sa podával subkutánne každých 12 hodín v dávke 15 mg/kg. Mačky s neurologickými príznakmi boli zo štúdie vylúčené.

Výsledky

Devätnásť z 20 mačiek liečených GC376 sa uzdravilo do 2 týždňov od začiatku liečby. Príznaky choroby sa však po 1–7 týždňoch od primárnej liečby vrátili, a relapsy a nové prípady sa nakoniec liečili minimálne 12 týždňov. Relapsy, ktoré prestali reagovať na liečbu, sa vyskytli u 13 z týchto 19 mačiek v priebehu 1-7 týždňov od počiatočnej alebo opakovanej liečby. Závažné neurologické ochorenie sa vyskytlo u 8/13 mačiek, u ktorých zlyhala liečba, a u piatich mačiek sa opakovali brušné lézie. V čase písania tohto článku bolo sedem mačiek v remisii choroby. Päť mačiatok vo veku 3,3–4,4 mesiaca s vlhkou FIP bolo liečených 12 týždňov a po ukončení liečby a v čase písania článku boli v remisii ochorenia 5–14 mesiacov (priemerne 11,2 mesiaca). Šieste mačiatko bolo po 12 týždňoch liečby v remisii 10 týždňov, došlo však k relapsu a dobre reaguje na druhé kolo liečby s GC376. Siedma bola 6,8-ročná mačka s postihnutím mezenterických lymfatických uzlín, ktorej sa podarilo dosiahnuť remisiu po troch relapsoch, ktoré si vyžadovali postupne dlhšie opakované liečby počas 10 mesiacov. Vedľajšie účinky liečby zahŕňali pálenie pri aplikácii injekcie a občasné ložiská subkutánnej fibrózy a vypadávanie chlpov. U mačiek liečených pred 16.-18. týždňom došlo k spomalenému vývoju a abnormálnemu rastu trvalých zubov.

Závery a význam

GC376 sa ukázal byť sľubný pri liečbe mačiek s konkrétnymi formami FIP a otvoril tak dvere k cielenej antivírusovej liečbe.

Úvod

Lieky, ktoré priamo inhibujú replikáciu vírusov, sa stali kľúčovými oporami pri liečbe chronických vírusových infekcií, ako je HIV/AIDS, vírusu hepatitídy C (HCV), vírusu hepatitídy B, herpesvírusu a akútnych infekcií, ako je chrípka. RNA vírusy, ako sú HIV-1 a HCV, obsahujú ideálne ciele pre inhibíciu vírusov, ako sú RNA-závislá RNA polymeráza a proteáza. Proteázy sú obzvlášť dobrým cieľom, pretože sa podieľajú na dozrievaní vírusov (HIV) alebo na produkcii funkčných vírusových proteínov (HCV). Inhibítory proteázy sa tiež používajú v kombinácii s inhibítormi reverznej transkripcie pri celoživotnej liečbe HIV/AIDS. Kombinácie rôznych inhibítorov proteázy sú vysoko účinné pri liečbe infekcie HCV u ľudí. Preto nie je prekvapujúce, že vírusová proteáza by mala byť atraktívny cieľ aj pre výskum infekcií zvierat spôsobených RNA vírusom. Kim a kol. syntetizovali peptidylové zlúčeniny, ktoré sú zamerané na 3C-like (3CLpro) proteázy, a hodnotila ich účinnosť proti mačaciemu koronavírusu (FCoV) a mačaciemu kalicivírusu, ako aj proti dôležitým ľudským RNA vírusom, ktoré kódujú 3CLpro alebo príbuznú 3C proteázu. Identifikovali sériu zlúčenín, ktoré vykazovali silnú inhibičnú aktivitu proti rôznym koronavírusom, vrátane FCoV, s vysokým rozsahom bezpečnosti. Účinnosť ich inhibítorov 3CLpro bola predmetom pokusov u myší infikovaných vírusom hepatitídy A59, myšacím koronavírusom, a zistilo sa, že spôsobujú významné zníženie titrov vírusov a patologických lézií.

V súčasnosti neexistujú komerčne dostupné antivírusové lieky na koronavírusové infekcie u ľudí alebo zvierat a štúdie Kim a kol. dokázali, že inhibícia 3CLpro môže viesť k potlačeniu replikácie koronavírusu in vivo. Ukázali, že niektoré z ich inhibítorov 3CLpro sú vhodné ako terapeutické prostriedky proti týmto dôležitým vírusom u domácich a divokých mačiek. Potvrdila to štúdia s využitím experimentálnej infekcie vírusom mačacej infekčnej peritonitídy u laboratórnych mačiek. Aj keď je experimentálna infekcia FIPV vysoko smrteľná, akonáhle infekcia dosiahla definovateľné štádium, 14–20 dní trvajúca liečba pomocou GC376 viedla k rýchlej remisii ochorenia u šiestich mačiek, ktorá v čase publikácie článku trvala už viac ako 12 mesiacov.

Materiály a metódy

Oficiálne protokoly

Táto štúdia prebiehala podľa protokolu 18731 schváleného Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat a Výborom pre hodnotenie klinických skúšok Komisie pre klinické skúšky veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice na Kalifornskej univerzite v Davise. Tento protokol podrobne popisuje podmienky testovania nového inhibítora proteázy GC376 u mačiek vlastnených klientom. Každý vlastník bol povinný prečítať si podmienky štúdie a vyjadriť s nimi súhlas.

Organizácia klinickej štúdie

Predmetom štúdie bolo vyhodnotenie inhibítora 3CLpro GC376 u skupiny mačiek s prirodzene získanou FIP. Štúdia nezahŕňala skupinu s placebom, pretože, ako poznamenali Miller a Brody, “hlavnou etickou zásadou v placebom kontrolovaných klinických skúškach je, že pokiaľ pre daný stav existuje preukázaná účinná liečba, je testovanie proti placebu neetické“. GC376 sa už preukázal ako vysoko účinný pri liečbe mačiek s experimentálne indukovanou FIP pred touto štúdiou, čím vznikol predpoklad existujúcej účinnej liečby. Placebo kontrolu nahradila skupina s prirodzene prebiehajucou chorobou. Žiadna z 20 liečených mačiek nepreukázala pretrvávajúce priaznivé reakcie na liečbu, ktorú dostali pred liečbou GC376.

Inštitucionálne pravidlá vylúčili použitie mačiek získaných z útulkov alebo podobných zariadení na výskum tohto typu, a vyžadovali, aby všetky mačky boli v legálnom vlastníctve/adoptované, a aby sa s nimi zaobchádzalo s výslovným súhlasom majiteľa. Mačky s klinicky zjavným neurologickým ochorením boli vylúčené. Do štúdie bolo nakoniec zahrnutých 20 mačiek z rôznych oblastí USA, rôzneho veku a s rôznymi formami FIP. Táto relatívne malá skupina mačiek poskytla cenné poznatky o koncepcii pokusu, interakcii a súlade s vlastníkom, sledovaní bezpečnosti a účinnosti, stanovení minimálneho dávkovacieho režimu, hodnotení relapsov choroby počas liečby alebo po nej a stanovení klinických foriem FIP, ktoré sú pre liečbu najvhodnejšie. Tieto informácie, dúfajme, pomôžu pri ďalších testoch potrebných na udeľovanie licencií a prípadnú komercializáciu GC376 a na vykonávanie podobných testov budúcich antivírusových liekov na FIPV a iných chronických vírusových infekcií mačiek.

Popis testovacej skupiny

Do pokusu bolo zapojených 20 mačiek a ich majiteľov a príslušné informácie o každej mačke sú uvedené v tabuľke 1 a o celej pokusnej skupine na obrázku 1. Mačky boli do štúdie zaradené s rôznym stupňom predbežného testovania zo strany veterinárnych lekárov primárnej starostlivosti. Toto testovanie zvyčajne zahŕňalo kompletný krvný obraz (CBC) s celkovým plazmatickým proteínom, globulínom (G), albumínom (A), A:G; chemický profil séra a analýzu výpotkov vrátane celkového proteínu, skutočného alebo odhadovaného počtu buniek a typu zápalových buniek. U malého podielu mačiek sa uskutočnilo ďalšie testovanie, ktoré obsahovalo titre protilátok FIPV, ultrazvuk brušnej alebo hrudnej oblasti, biopsie postihnutého tkaniva a kvantitatívnu PCR v reálnom čase (qRT-PCR) z výpotkov.

Tabuľka 1
Základné údaje, pôvod, hlavné klinické príznaky a hlavné zistenia pri pitve po liečbe inhibítorom proteázy GC376

ID/MenoVek (mes.)Hmotnosť
(kg)		PohlaviePlemenoPôvodSymptómyStavPitva
CT01 (Echo)5.61.64FSDSHKRPeritonitída, zakrpatená–B, Int
CT02 (Cate)62.67FSDLHKRPeritonitída, zakrpatená–B, E, Int, L, MLN
CT03 (Pancake)7.863.18MCHimCTSuchá (Col) až vlhká+Int, L, MLN, S, Om, P
CT04 (Kratos)824.8MCDSHKRSuchá (MLN)Remisia
CT05 (Scooter)104.25MCDSHKRSuchá (E, MLN, K)–B, E, L, K, MLN
CT07 (Mac)6.62.6MCDSHKRSuchá (Col)+E, Int, L, MLN, S, K, A, Lu
CT08 (Phoebe)4.22.18FSDSHKRSuchá (E)–B, E, K, MLN, S
CT09 (Sammy)10.52.89MCDSHKRSuchá (MLN, K)?*B*
CT10 (Bandit)17.94.06MCHimCTSuchá (Col) až vlhká+B, E, Int, L, MLN, K, Om, P, Lu
CT12 (Daisy)7.52.5FSDSHKRPeritonitída, zakrpatená–B, Int, L, S
CT13 (Leo)7.41.97MCSphynxCTSuchá (E, K)+B, E, Int, L, MLN, S, K
CT14 (Muffin)82.94FSDSHKRSuchá (Col) až vlhká+E, Int, L, MLN, K, Om, P
CT15 (Flora)4.32.39FDSHFCPeritonitídaRemisia
CT16 (Bean)41.4FSDSHKRPeritonitída, zakrpatená+B,† E, Int, L, MLN, S, Om, P
CT17 (Peanut)4.42.3MDSHKRPeritonitídaRemisia
CT18 (Smokey)41.84MCDSHKRPeritonitídaRemisia
CT20 (Cloud)3.31.55MRMCTPleuritída (MLN)Remisia
CT21 (Phoebe)4.81.92FDSHKRPeritonitídaRemisia/relaps/opakovaná liečba
CT22 (Pepper)3.31.6FSibírskaCTPeritonitída+B, E, Om, MLN, Lu, Dia
CT23 (Oakely)3.93.1FSDSHKRPeritonitídaRemisia
Priemer10.282.59
SD17.220.94
FS = samica kastrovaná; F = samica nekastrovaná; DSH = domáca krátkosrstá; KR = záchranené mačiatko; B = mozog; Int = črevo; DLH = domáca dlhosrstá; E = oko; L = pečeň; MLN = mezenterické lymfatické uzliny; Him = himalájsky; Col = hrubé črevo; S = slezina; Om = omentum; P = pobrušnica; MC = kastrovaný samec; M = nekastrovaný samec; K = oblička; A = nadoblička; Lu = pľúca; FC = mačacia kolónia; RM = ragmuffin; Dia = bránica;SD = Štandardná odchýlka; CT = Chovná stanica

*Neuskutočnila sa žiadna pitva, ale boli prítomné terminálne neurologické príznaky
† Ťažký mozgový edém, neboli zaznamenané žiadne typické zápalové lézie

Obrázok 1.
Demografické údaje o mačkách zaradených do štúdie. (a–c) Koláčové grafy sumarizujúce percento pacientov: (a) vek v mesiacoch, (b) plemeno alebo (c) pôvod. (d) Stĺpcový graf zobrazujúci formy mačacej infekčnej peritonitídy (FIP) zaradených pacientov.
M = mesiace; DSH = domáca krátkosrstá; DLH = domáca dlhosrstá; MD = Maryland; OH = Ohio; Tx = Texas; FL = Florida; IL = Illinois; CT = Connecticut; CA = Kalifornia

Mačky s klinickými príznakmi svedčiacimi o neurologickom postihnutí boli zo štúdie vylúčené na základe skorších nepublikovaných experimentálnych štúdií s GC376. Jedna mačka, ktorá dlhodobo prežila predchádzajúcu štúdiu farmakokinetiky a účinnosti GC376, mala recidívu FIP prejavujúcu sa neurologickými príznakmi 6 mesiacov po tom, čo sa javila ako úspešná liečba akútnej infekcie.6 Táto mačka nereagovala na opakovanú procedúru s GC376, ktorá podnietila štúdiu schopnosti lieku preniknúť do mozgu. Úrovne GC376 v mozgu laboratórnych mačiek predstavovali iba 3% plazmatických koncentrácií liečiva.

Potvrdenie ochorenia

Diagnóza FIP bola potvrdená v čase vstupu do štúdie na základe základných údajov, klinickej anamnézy, vyšetrenia výsledkov predchádzajúcich laboratórnych testov, fyzikálneho vyšetrenia a opakovania základných analýz krvi a výpotku. Ručná palpácia brucha bola zvyčajne dostatočná na identifikáciu ascitu, zväčšených mezenterických lymfatických uzlín, zväčšenia slepého čreva a s nimi spojených ileo-cekálno-kolických lymfatických uzlín, tumorov v obličkách a infiltrácie hrubého čreva. Ručná palpácia sa v prípade potreby doplnila ultrazvukom. Oči sa spočiatku vyšetrovali priamym svetlom na akékoľvek abnormality v sietnici, na zrazeniny v prednej komore alebo na zadnej strane rohovky a záblesky v komorovej vode. Prítomnosť očného ochorenia sa potvrdila úplným oftalmoskopickým vyšetrením vykonaným oftalmologickou službou Veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice (VMTH), UC Davis. Prítomnosť FIPV sa ďalej potvrdila pomocou qRT-PCR, buď z brušných alebo hrudných výpotkov odobratých v čase prijatia, alebo v čase pitvy. Sekvenovanie génu FIPV proteázy sa uskutočňovalo na mačkách, u ktorých došlo k relapsu počas liečby, aby sa určilo, či došlo k potenciálnej mutácii spôsobujúcej rezistenciu na liečivo.

Diagnóza FIP sucho-vlhkej (zmiešanej) FIP u troch mačiek (CT03, CT10 a CT14) bola založená na difúznom zväčšení hrubého čreva a anamnéze riedkej stolice, krvi a hlienu v stolici, napínania na defekáciu a stolice malého kalibru pred výskytom brušných efúzií. FIP hrubého čreva bola opísaná ako špecifická variantná forma neefuzívnej FIP. Podozrenie na zmiešanú FIP bolo aj u mačiek CT01, CT02 a CT12 z dôvodu zastavenia rastu, ktorý o mnoho týždňov predchádzal výskyt brušných výpotkov.

Liečebný režim

GC376 bol syntetizovaný vo vysoko čistej forme a pripravený v koncentrácii 53 mg/ml v 10% etanole a 90% polyetylénglykole 400, ako bolo opísané vyššie. GC376 bol podávaný subkutánne (SC) v dávke 15 mg/kg každých 12 hodín SC, pokiaľ nie je uvedené inak. Účinná dávka pre mačky s experimentálne indukovanou FIP bola 10 mg/kg / q12 h SC, ale dávka sa zvýšila na 15 mg/kg potom, čo prvá mačka (CT01) nereagovala na nižšiu dávku 10 mg/kg stanovenú predchádzajúcimi farmakokinetickými štúdiami. Išlo o klinické rozhodnutie založené na reakcii tejto jednej mačky na liečbu.

Monitorovanie odpovede na liečbu
Mačky s FIP boli na základe predbežného testovania a počiatočného vyhodnotenia v čase prezentácie na UC Davis hospitalizované najmenej 5 dní a okamžite začali liečbu. Najmenej dvakrát denne boli podrobne vyšetrené na rektálnu teplotu, pulz, dýchanie, chuť do jedla a aktivitu. Použila sa hrudkujúca podstielka, ktorá umožňovala denné hodnotenie objemu a konzistencie stolice a močenia. Celá krv sa odoberala do EDTA alebo heparínu venepunkciou pred zahájením liečby, v dvojdňových intervaloch počas hospitalizácie, v čase prepustenia a v dvojtýždňových intervaloch počas prvého mesiaca a potom v mesačných alebo väčších intervaloch. Rutinné vyšetrenie krvi v každom časovom bode zahŕňalo minimálne hematokrit, celkový plazmatický proteín, ikterický index, celkový počet bielych krviniek, diferenciálny rozpočet bielych krviniek a absolútny počet neutrofilov, lymfocytov a monocytov a eozinofilov. Kvôli kontrole potenciálnej toxicity liekov sa pravidelne zaznamenávali hodnoty chemického zloženia krvného séra. Vzorky brušných výpotkov sa získavali paracentézou každý druhý deň, pokiaľ sa dali získať, čo bolo zvyčajne prvých 3–7 dní. Mačky s dýchavičnosťou boli vyšetrené hrudnou ultrasonografiou a vzorka tekutín bola získaná ultrazvukom vedenou paracentézou. Výpotky sa skúmali na prítomnosť fibrínových zrazenín, prímes neutrofilov a malých/veľkých mononukleárnych buniek, intenzitu žltého sfarbenia, viskozitu pôsobením vlákien a celkový obsah bielkovín. Bunkové pelety z peritoneálnych alebo hrudných výpotkov boli tiež skúmané pomocou qRT-PCR na hladinu vírusovej RNA, ako už bolo opísané.

Mačky boli vydané svojim majiteľom, keď bola zaznamenaná pozitívna reakcia na liečbu, zvyčajne do 5 dní. Majiteľ (majitelia) boli buď vedúcim veterinárnym lekárom, alebo veterinárnym lekárom primárnej starostlivosti poučení, ako podať liek dvakrát denne subkutánnou injekciou. Miesta vpichu sa menili tak, aby zahŕňali hornú líniu od zátylku po strednú časť chrbta a po stranách hrudníka a bokov. Dbalo sa na to, aby sa zabránilo ukladaniu liečiva do dermis alebo postupne na rovnakom podkožnom mieste. Majitelia boli vyzvaní, aby udržiavali denné záznamy o rektálnej teplote, aktivite, chuti do jedla, defekácii a močení a týždenné až dvojtýždňové telesné hmotnosti. Periodické vzorky krvi pre CBC a chemické hodnoty séra boli odoberané osobnými veterinárnymi lekármi majiteľov a zaslané do komerčných veterinárnych diagnostických laboratórií. Akékoľvek abnormálne príznaky alebo správanie bolo potrebné zaznamenať a okamžite hlásiť. Eutanázia sa v prípade potreby uskutočňovala buď na UC Davis, alebo veterinárnym lekárom primárnej starostlivosti. Telá mačiek usmrtené veterinárnymi lekármi primárnej starostlivosti boli okamžite schladené a odoslané v obaloch s ľadom expresnou poštou do UC Davis na pitvu. Požiadavky majiteľov o zaobchádzanie a konečnú dispozíciu tela boli rešpektované.

Výsledky

Stanovenie dĺžky liečby

Prvých päť mačiek v štúdii bolo spočiatku liečených 2 týždne (CT01, CT02, CT03, CT04 a CT05). U všetkých mačiek bolo pozorované rýchle zlepšenie zdravotného stavu a liečba bola ukončená. Napriek priaznivej počiatočnej odpovedi sa príznaky ochorenia opakovali 1 (CT01, CT05), 2 (CT03, CT04) alebo 7 (CT02) týždňov po ukončení 2-týždňovej liečby (obrázok 2). Mačky boli potom liečené znova, dôvodom bolo postupné predlžovanie primárnej a sekundárnej doby liečby, kým ich FIP ostávala citlivá na GC376 (pozri CT04, CT22, obrázok 2). Nové mačky, ktoré sa dostali do štúdie, sa ďalej liečili 3 (CT07) alebo 4 týždne (CT08, CT16). Mačky CT08 a CT16 spočiatku reagovali, ale ich príznaky choroby sa počas liečby objavili znova. U mačky CT08 sa vyvinula neurologická choroba, zatiaľ čo u mačky CT16 sa opakovane vyskytli brušné lézie (tabuľka 1). Primárne a sekundárne liečebné doby sa potom predĺžili na 9 týždňov (CT07, CT09, CT10, CT14) (obrázok 2). U mačky CT09 sa vyvinuli neurologické príznaky počas 9-týždňovej základnej liečby a nakoniec bola utratená, keď sa príznaky choroby stali závažnými. U mačky CT07 sa vyskytlo neurologické ochorenie 6 týždňov po začiatku druhej liečby. Od tohto bodu boli všetky nové mačky prijaté to štúdie a staršie mačky, ako napríklad CT10, liečené alebo znovu liečené najmenej 12 týždňov. Prínos 12-týždňovej liečby bol najzrejmejší u mačky CT04, ktorá bola predtým liečená už trikrát s kratšou dobou liečby nasledovanou relapsom (obrázok 2). Liečba bola ukončená u mačiek, ktoré nemali klinické ani laboratórne príznaky choroby po 12 týždňoch primárnej ani sekundárnej liečby. Zistilo sa, že minimálna doba liečby by mala byť okolo 12 týždňov. Mačka CT21 bola liečená 17 týždňov z dôvodu oneskoreného zlepšenia počtu celkových bielkovín a bielych krviniek (obrázok 2). U tejto mačky došlo k relapsu pleurálnej FIP o 13 týždňov neskôr a v čase písania tohto článku bola podrobená ďalšej liečbe.

Orázok 2.
Časová škála liečby a klinický výsledok 20 mačiek, ktoré vstúpili do klinickej štúdie s inhibítorom proteázy GC376. Obdobia, počas ktorých boli mačky liečené, sú označené plnými čiarami. Je uvedený dátum posledného dňa liečby pre šesť mačiek, ktoré dosiahli trvalú klinickú remisiu. Mačka 21 bola v čase písania tohto článku ešte v liečbe. Zvyšných 13 mačiek podľahlo neneurologickej FIP alebo neurologickej FIP po ukončení primárnej alebo sekundárnej liečby do 0-7 týždňov

Odpoveď na počiatočnú liečbu a ukazovatele priaznivej reakcie

Počas prvých 1–4 týždňov liečby sa u 19/20 mačiek prejavilo dramatické a progresívne zlepšovanie zdravotného stavu. Výnimkou bola mačka CT16, ktorá reagovala poklesom teploty v konečníku počas prvých 4 dní liečby. Horúčka sa však vrátila a zdravotný stav sa nasledujúcich 23 dní naďalej zhoršoval a mačka bola eutanizovaná. Horúčka (>38,9 °C) u ďalších 19 mačiek zmizla do 24–48 hodín, so súčasným zlepšením chuti do jedla, aktivity, rastu a prírastku hmotnosti. Brušné výpotky boli zvyčajne nezistiteľné do 2 týždňov. Zvyškový hrudný výpotok zostávajúci po počiatočnej terapeutickej drenáži po 3 dňoch u mačky CT20 takmer zmizol. Renálne tumory u mačiek CT02 a CT13 sa tiež rýchlo zmenšili a po 2 týždňoch už neboli hmatateľné. Zväčšené mezenterické lymfatické uzliny sa k normálnej veľkosti vracali pomalšie. Hmatateľné zhrubnutie hrubého čreva a s ním spojené ileo-cekálno-kolické útvary reagovali najpomalšie a u mačky CT03 pretrvávali aj napriek liečbe a návratu k inak normálnemu zdravotnému stavu. Žltačka, častý nález u mladších mačiek s efuzívnou FIP, pomaly ustupovala počas 2 alebo viac týždňov, súčasne so znižovaním hyperbilirubinémie. Príznaky očnej choroby začali miznút do 48 hodín a zmizli do 1 týždňa bez ohľadu na počiatočnú závažnosť (obrázok 3).

Obrázok 3.
Vzhľad očí mačky CT08 pred zahájením liečby (a) a o týždeň neskôr (b). U tejto mačky sa o 3 týždne po začiatku liečby rozvinuli závažné neurologické príznaky.

Prírastok hmotnosti bol jednoduchým a presným kritériom rastu a zlepšenia zdravia. Ako vzťažná hodnota pre tento parameter bola použitá hmotnosť mačky CT04, najstaršej mačky v teste (obrázok 4a). Mačka CT04 vykazovala signifikantný úbytok hmotnosti o 30%. Po každom kole liečby pribrala, krátko pred každým relapsom choroby začala chudnúť a po každej liečbe opäť pribrala. Po 9,3 mesiacoch bez liečby a po liečbe (4,8 kg až 7,19 kg) znovu získala všetku svoju stratenú váhu. Všetky mačiatka s trvalou remisiou počas a po antivírusovej liečbe ustavične priberali na váhe, čo naznačuje, že pri antivírusovej liečbe pokračoval normálny rast (obrázok 4b). Jedna mačka (CT15) a dvaja kocúri (CT17, 20) boli bez komplikácií kastrovaní počas remisie choroby.

Obrázok 4.
Antivírusová liečba a zmeny telesnej hmotnosti. (a) Mačka CT04, 6,8-ročný kastrovaný samec, ktorý mal suchú mačaciu infekčnú peritonitídu (FIP), absolvoval štyri cykly antivírusovej liečby s narastajúcim trvaním, ako je znázornené bodkovanými políčkami. Pred každou recidívou schudol a po následnej liečbe pribral. (b) Prírastky hmotnosti u štyroch mačiatok vo veku 3,5-4,4 mesiaca počas a po antivírusovej liečbe sú znázornené bodkami. Bodkovaný obdĺžnik označuje dĺžku antivírusovej liečby (12 týždňov)

Lymfopénia bola bežným klinickým príznakom mačiek s vlhkou FIP (obrázok 5) a mala tendenciu priamo korelovať so závažnosťou brušného zápalu, čo naznačovala viskozita, prítomnosť fibrínových vlákien, obsah bielkovín, počet buniek a stupeň žltej farby výpotku. Lymfopénia sa zlepšila pri liečbe všetkých mačiek s vlhkou FIP okrem CT16, ale nepomohla predpovedať relapsy choroby, ktoré sa vyskytli potom (obrázok 5a). U mačiek so suchou FIP lymfopénia nebola tak výrazná, a pre hodnotenie odpovede na liečbu nebola užitočná tak, ako iné parametre (obrázok 5b).

Obrázok 5.
Priemer a smerodajná odchýlka (SD) absolútneho počtu lymfocytov u liečených pacientov s (a) vlhkou alebo (b) suchou mačacou infekčnou peritonitídou (FIP). a) Dvanásť mačiek (prázdny krúžok), u ktorých sa prejavil brušný alebo hrudný výpotok, a ktoré boli liečené až 12 týždňov. Trinásta mačka (CT16, plný krúžok) s brušným výpotkom reagovala na liečbu zle. b) Sedem mačiek so suchou alebo vlhkou formou FIP a s následnou liečbou v trvaní 6 týždňov.

Celkové hladiny bielkovín v plazme ako nepriamy indikátor koncentrácie globulínu boli pri vyšetrení často zvýšené, ale hodnoty boli počas prvých 4 týždňov veľmi variabilné a často prechodne stúpali počas resorpcie výpotkov. Mačky, u ktorých nakoniec liečba nebola úspešná, mali tendenciu mať vyššie celkové koncentrácie plazmatických proteínov na začiatku liečby a mali tendenciu udržiavať si vyššie hladiny počas liečby ako mačky, ktoré úspešne dosiahli trvalú remisiu (obrázok 6).

Obrázok 6.
Priemer a SD celkových hladín bielkovín v plazme u 20 mačiek počas obdobia 12 týždňov. Trinásť mačiek utrpelo v rôznych týždňoch liečby (W) smrteľné relapsy a sedem mačiek dosiahlo trvalú remisiu po 12 týždňoch liečby (W-SV)

Zníženie hladiny vírusovej RNA v bunkách z ascitickej tekutiny v spojitosti s liečbou

Sekvenčné vzorky ascitu boli odobraté niekoľkým tým istým mačkám počas prvých 6–25 dní antivírusovej liečby a boli testované na hladiny vírusovej RNA pomocou qRT-PCR. Hladiny FIPV sú často nízke alebo negatívne v krvi mačiek s FIP a najvyššie sú v bunkách z výpotkov. Preto boli najspoľahlivejším zdrojom FIPV RNA bunky z ascitu alebo pleurálneho výpotku. Mačky CT15, CT16 a CT17 mali 955, 1699 a 2937-krát vyššie hladiny vírusovej RNA, v danom poradí, ako CT02, ktoré mali najnižšiu vírusovú záťaž v efúzii pred liečbou (obrázok 7). Hladiny vírusovej RNA sa v priebehu 2 týždňov znížili až 1567463-násobne v porovnaní s hodnotami pred liečbou, s výnimkou mačky CT16 (obrázok 8), ktorá mala druhú najvyššiu hladinu vírusovej RNA pred antivírusovou liečbou medzi 12 mačkami so vzorkami výpotkov dostupnými na testovanie ( Obrázok 7). Absencia rýchleho poklesu hladín vírusovej RNA u mačky CT16 spolu s ťažkou lymfopéniou môže vysvetľovať, prečo nereagovala na liečbu. CT10 tiež mala o niečo pomalší pokles hladiny vírusu a po antivírusovej liečbe dvakrát relapsovala. Je pozoruhodné, že hladiny vírusovej RNA v bunkách ascitu u mačiek CT15, CT17 a CT18 klesali najrýchlejšie a boli tiež medzi piatimi mačkami, u ktorých došlo k trvalej remisii ochorenia. Či príčinou bola vlastnosť jednotlivých izolátov FIPV, alebo forma a závažnosť choroby hostiteľa nebolo zistené.

Obrázok 7.
Relatívne počiatočné hladiny RNA vírusu infekčnej peritonitídy mačiek (FIPV) vo výpotkových vzorkách pacientov pred antivírusovou liečbou. Na vzorkách efúzií pacientov pred zahájením liečby sa uskutočnila kvantitatívna PCR v reálnom čase. Relatívne základné hladiny vírusovej RNA ako násobné rozdiely v porovnaní s úrovňou vírusu pred liečbou CT02, mačka s najnižšími hladinami RNA. Úroveň transkriptov RNA bola vypočítaná pre každého pacienta pomocou metódy ∆Ct s referenčným génom pre beta-aktín
Obrázok 8.
Zníženie RNA vírusu mačacej infekčnej peritonitídy zo sekvenčných vzoriek výpotku počas liečby GC376 u mačiek CT10, CT12, CT15, CT16, CT17, CT18 a CT23. Každý bod označuje násobné zníženie hladiny vírusovej RNA oproti hladine nameranej pred liečbou (deň 0). Hladiny vírusovej RNA sa stanovili pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase metódou ∆Ct a beta-aktín referenčným génom

Zlyhanie liečby v dôsledku recidívy brušnej FIP alebo výskytu neurologického ochorenia

Trinásť z 20 mačiek v teste nakoniec podľahlo recidíve choroby. Jedna mačka (CT16) nevykázala významné zlepšenie a bola eutanizovaná 3 týždne po začiatku 4-týždňového liečebného režimu (obrázky 2 a 8), 8), zatiaľ čo u ostatných 12 došlo k variabilnému obdobiu remisie ochorenia po primárnej alebo sekundárnej liečbe trvajúcej 3–17 týždňov (priemerne 7,8 týždňa) (obrázok 2). Všetky z týchto 13 mačiek okrem jednej (CT09) boli pitvané (tabuľka 1). Osem z týchto mačiek bolo eutanizovaných kvôli závažným neurologickým príznakom a päť z dôvodu recidívy brušnej choroby (obrázok 2). Pri vyšetrení boli sekundárne detekované tri mačky, ktoré podľahli neurologickému ochoreniu (CT05, CT08, CT13) v dôsledku okulárnej FIP (tabuľka 1). Medzi najskoršie príznaky neurologického ochorenia patrili horúčka, ktorá pretrvávala aj napriek pokračujúcej liečbe, apatia, občasné svalové zášklby uší a svalov, neobvyklé pohyby pri prehĺtaní, nutkavé naťahovanie končatín a strata normálnej mentality, ktorá sa prejavila krátkymi epizódami strnulých pohľadov alebo chradnutím. Tieto príznaky pretrvávali pri liečbe niekoľko dní alebo týždňov, ale nakoniec došlo k nekoordinácii a tonickým/klonickým záchvatom. Výskyt a rýchla progresia neurologických príznakov po prerušení liečby boli výraznejšie, ako počas liečby (obrázok 2).

Päť mačiek (CT03, CT07, CT10, CT14 a CT16) malo recidívu typických intraabdominálnych lézií pri absencii neurologických príznakov počas alebo po liečbe (tabuľka 1). U štyroch z nich sa vyskytli ileocekálne útvary (CT03, CT07 a CT14) alebo zväčšená lymfatická uzlina hrubého čreva (CT10), ktorá sa po primárnej liečbe zmenšila (CT03, CT10 a CT14) alebo už nebola hmatateľná (CT07). Avšak CT03 naďalej trpela ťažkou zápchou, napínaním a stolicou podobajúcou sa zubnej paste. Závažnosť obštrukcie hrubého čreva si vyžiadala resekciu hrubého čreva, ktorá zmiernila klinické príznaky, ale nezabránila prípadnému opätovnému výskytu brušných choroby. Všetky tri mačky, u ktorých sa vyskytli silné ileo-cekálno-kolické infiltráty, stále vykazovali dôkazy o tejto forme FIP pri pitve a imunohistochémia preukázala antigén FIPV v makrofágoch v granulomatóznom zápale (obrázok 9).

Obrázok 9.
Rez zo silne zhrubnutej steny resekovaného hrubého čreva z mačky CT03. Imunoperoxidáza (hnedá farba) sfarbená na mačací antigén vírusu infekčnej peritonitídy je pozorovaná v makrofágoch okolo periférie granulomatóznej lézie. K perzistencii vírusu v hrubom čreve došlo počas liečby a ústupu ďalších príznakov ochorenia (napr. efuzívnej peritonitídy)

Pokusy o liečbu neurologickej choroby zvýšením dávky lieku a predĺžením trvania liečby

Pre zmiernenie neurologických príznakov sme sa pokúsili zvýšiť dávku GC376, čím sa zvýšila jeho hladina v krvi a množstvo liečiva, ktoré prešlo cez hematoencefalickú bariéru. Mačka CT01 vykazovala efúznu FIP a bola pôvodne liečená GC376 (10 mg/kg q12h SC po dobu 9 dní). Mačka reagovala dobre, ale v 9. deň sa horúčka sa vrátila a dávka sa zvýšila na 15mg/kg každých 12 hodín po dobu 5 dní. Horúčka zmizla a liečba bola ukončená v deň 14. O 3 dni neskôr sa horúčka vrátila spolu s neurčitými neurologickými príznakmi pozostávajúcimi zo zášklbu svalov, abnormálneho naťahovania končatín a abnormálnych hltacích pohybov. Mačke bola okamžite znovu nasadená dávka 15 mg/kg každých 12h SC a jej stav sa zlepšil, ale krátko potom sa zhoršil s návratom horúčky a rovnakými neurčitými neurologickými príznakmi s miernou nekoordináciou. Dávka sa potom zvýšila na 50 mg/kg každých 12 hodín SC po dobu 14 dní a jej stav sa zlepšil na takmer normálny stav. Liečba bola zastavená, ale okamžite sa vrátili neurologické príznaky. Mačka bola potom liečená ďalšie štyri dni dávkou 50 mg/kg q12 h SC, počas ktorých sa neurologické príznaky opäť zlepšili. Padlo však rozhodnutie ukončiť liečbu úplne. Stav mačky zostal stabilný 1 týždeň a potom sa u nej rozvinula extrémna nekoordinácia, demencia a tonické/klonické záchvaty. Bola vykonaná eutanázia a pitva preukázala lézie iba v mozgu.

Mačka CT12 dobre reagovala na liečbu dávkou 15 mg/kg q12 h SC; rektálna teplota sa vrátila k normálu do 48 hodín a brušný výpotok zmizol do 2 týždňov. Mačka sa po druhom týždni liečby javila ako normálna, potom však mala pretrvávajúcu horúčku 38,9–40°C. Majitelia cítili, že mačka má inak normálnu aktivitu a chuť k jedlu, takže liečba pokračovala v rovnakom dávkovaní. Horúčka však pretrvávala, boli zaznamenané jemné príznaky zmeny správania a mačka nerástla podľa očakávania. Mačka pokračovala v liečbe ďalších 15 týždňov, počas ktorých sa dávka liečiva prechodne dvakrát znižovala (tj. na 10 mg/kg každých 12 hodín a 15 mg/kg každých 24 hodín) počas niekoľkých dní, horúčka sa však zvýšila a zakaždým sa znížila aktivita. Obnovilo sa dávkovanie 15mg/kg každých 12 hodín. Mačka naďalej vykazovala príznaky premenlivej horúčky a nejasné príznaky správania, ale majitelia boli optimistickí, pokiaľ ide o apetít a úroveň aktivity mačky. Liečba mačky bola potom zastavená, pretože ďalšie použitie lieku na tento účel nebolo možné odôvodniť. Stav mačky zostal nezmenený s pretrvávajúcou horúčkou, samotárskym správaním a zastavením rastu ďalších 5 týždňov. V 22. týždni sa objavili závažné neurologické príznaky pozostávajúce z nekoordinácie, demencie a záchvatov a mačka bola eutanizovaná. Makroskopické i mikroskopické lézie boli obmedzené na mozog.

Testovanie na vznik vírusovej rezistencie

O vzniku vírusu rezistentného na liečivo sa uvažovalo u mačky CT03, u ktorej došlo k relapsu s brušnými léziami po počiatočnej priaznivej reakcii na liečbu granulomatóznej kolitídy a zmiešanej FIP. V čase pitvy boli v brušnej dutine stále prítomné granulomatózne lézie a v mozgu sa nenašli žiadne makroskopické ani mikroskopické lézie (tabuľka 1). Preto recidíva ochorenia nesúvisela s neurologickým ochorením a perzistentný antigén FIPV bol identifikovaný v makrofágoch v granulomatóznych léziách. Uskutočnilo sa sekvenčné porovnanie medzi 3CLpro z efúzie pred liečbou a z omenta odobratým pri pitve o 95 dní neskôr. V 3CLpro sa však nenašla žiadna substitúcia aminokyselín, čo naznačuje, že výskyt vírusu rezistentného na liečivá nebol príčinou opakovaného ochorenia mačky.

Porovnávali sa tiež 3CLpro sekvencie vírusovej RNA pred liečbou s tými, ktoré boli získané o 25 dní (CT16), 139 dní (CT02), 149 dní (CT12) a 231 dní (CT10) neskôr v čase pitvy. V tomto období neboli pozorované žiadne rozdiely v 3CLpro. Sekvencie tiež zostali nezmenené u CT02, CT16 a CT12 od času prijatia až po pitvu. Vírusová 3CLpro z pľúc a sleziny mačky CT10, ktorá relapsovala dvakrát počas 8 mesiacov a bola znovu liečená, vykazovala substitúciu Asp-to-Ser v polohe 25 a substitúciu Lys-to-Asp v polohe 260 v porovnaní s vírusom z abdominálnej kvapaliny získanej pred liečbou. Presné účinky týchto mutácií na funkciu proteázy sa v súčasnosti skúmajú. Uvádza sa, že genetická evolúcia kvázi druhov vírusových proteínov nastáva v priebehu času u pacientov chronicky infikovaných RNA vírusom (HCV) a môže viesť k sporadickým zmenám aminokyselín.

Výskyt trvalých klinických remisií

Sedem z 20 mačiek v štúdii liečby GC376, z ktorých všetky absolvovali najmenej 12 týždňov nepretržitej liečby, bolo kategorizovaných ako potenciálne liečebné úspechy na základe viac ako 12 týždňov trvajúcej remisie choroby po ukončení liečby (Obrázok 2). Šesť z týchto mačiatok malo vo veku 3,3–4,4 mesiaca akútnu efúznu brušnú (CT15, CT17, CT18, CT21, CT23) alebo pleurálnu (CT20) formu ochorenia a boli liečené nepretržite 12 alebo 17 (mačka CT21) týždňov (tabuľka 1, obrázok 2). Siedma mačka (CT04), 6,8-ročný krížený kastrovaný kocúr so suchou FIP obmedzenou na mezenterickú lymfatickú uzlinu, tiež dosiahol dlhodobú remisiu, ale až po štyroch cykloch liečby so zvyšujúcim sa trvaním (Tabuľka 1, Obrázok 2).

Šesť z týchto dlhodobo preživších mačiek malo na začiatku liečby abnormality v CBC, hematokrite a celkových proteínoch, ale v čase ukončenia liečby mali úplne normálne hodnoty v krvi. Avšak mačka CT21 mala aj po 12 týždňoch zvýšené hladiny bielkovín v plazme a zvýšený počet bielych krviniek a v liečbe pokračovala ďalších 5 týždňov. Počty plazmatických bielkovín a bielych krviniek sa zlepšili po ďalších 5 týždňoch liečby, stále však neboli v referenčnom rozsahu. Trinásť týždňov po ukončení liečby sa u mačky vyvinul typický FIP výpotok v hrudnej dutine s horúčkou. Tekutina z hrudníka bola odsatá, aby sa zlepšilo dýchanie, a mačka začala s druhým kolom GC376 a v čase písania článku bola afebrilná, aktívna a po 8 týždňoch liečby jedla normálne. Liečba bude trvať 12 týždňov, ak sa znova neobjavia žiadne známky ochorenia.

Vedľajšie účinky pozorované počas liečby a po liečbe

Počas a po liečbe GC376 boli pozorované dva vedľajšie účinky. Liek pri injekčnej aplikácii často spôsoboval štípanie/pálenie. Subkutánne opuchy sa vyskytli, keď sa v rovnakom mieste aplikovalo príliš veľa injekcií, ale tie rýchlo ustúpili. U jednej mačky (CT12) sa približne v 14. týždni 18-týždňového obdobia liečby vyskytla hlboko lokalizovaná ulcerácia medzi lopatkami. Pri pitve však nebol pozorovaný žiadny dôkaz dermálnej FIP a išlo pravdepodobne o reakciu na nepretržité injekcie v rovnakom mieste. Prieskum siedmich dlhodobo preživších mačiek preukázal citeľné ohniskové podkožné zhrubnutie. U jednej mačky sa na röntgenových snímkach objavili štyri zvápenatené hrčky veľkosti hrášku. Tieto hrčky boli chirurgicky odstránené spolu s okolitým fibrotickým tkanivom. Traja ďalší dlhodobo preživší majú 1–3 malé ohniskové oblasti s trvalou stratou chlpov v miestach vpichu, ktoré sú zakryté okolitým srsťou (obrázok 10). Majitelia a ich veterinári boli požiadaní, aby tieto lézie pravidelne kontrolovali kvôli prípadným zmenám, či výskytu nových lézií.

Obrázok 10.
Ohnisková oblasť permanentného vypadávania chlpov spôsobená nechceným ukladaním GC376 do epidermy mačky CT21. Tieto oblasti boli zvyčajne prekryté chlpmi a neboli zvonka viditeľné

Najvýznamnejším vedľajším účinkom spojeným s dlhodobou liečbou bol juvenilný chrup. Normálna tvorba, rast a prerezanie trvalých zubov sa oneskorili u všetkých štyroch liečených mačiatok vo veku 3,3–4,4 mesiaca. Očné zuby, rezáky, štvrtý premolár a molár boli postihnuté najmenej, zatiaľ čo druhý a tretí premolár boli postihnuté najviac (obrázok 11). Dospelé zuby sa javili menšie ako normlingválne a to spolu s oneskoreným prerezaním viedlo buď k ponechaniu mliečnych špičákov, nevypadnutiu mliečnych zubov alebo k čiastočnému prerezaniu abnormálnych trvalých zubov k súčasne ponechaným mliečnym zubom. U žiadneho z dlhodobo preživších neboli pozorované žiadne iné anatomické alebo fyziologické defekty a neboli zaznamenané ani u pitvaných mačiek.

Obázok 11.
Dospelý chrup mačky CT17, ktorá bola liečená 12 týždňov GC376, počnúc vekom 4,4 mesiaca. Je viditeľný ponechaný horný ľavý mliečny špičák. Zdá sa, že horný druhý a tretí premolár sú mliečne. Malé trvalé tretie premoláre sa čiastočne prerezali lingválne k mliečnym tretím horným premolárom. Gingiva obklopujúca ponechaný špičák a premoláre je zapálená. Dospelé špičáky sa javia tiež menšie ako zvyčajne. Zdá sa, že trvalý pravý špičák a štvrtý horný premolár sa prerezali normálne

Pitevné nálezy

Telá 12/13 mačiek, u ktorých liečba nebola úspešná, boli podrobené pitve vrátane hrubého a histologického vyšetrenia a imunohistochémie postihnutých tkanív pre FIPV antigén. Odobrané a vyšetrené tkanivá zahŕňali reprezentatívne rezy všetkých hlavných brušných a hrudných orgánov, mozgu a očí. Hrubé vyšetrenie identifikovalo tri odlišné prezentácie. Päť mačiek nejavilo výrazné známky aktívnej FIP (CT01, CT02, CT05, CT08, C12), tri mali lézie zodpovedajúce neefúznej FIP (CT07, CT10, CT13) a štyri mali efúznu peritonitídu s multiorgánovým postihnutím (CT03, CT14, CT16, CT22). Histológia piatich mačiek, ktoré nevykazovali dostatočné dôkazy o chorobe, preukázala väčšinou mierne mononukleárne infiltráty, zvyčajne perivaskulárny zápal v oku, pečeni, črevnej stene a obličkách. Tri mačky s neefúznou FIP mali mierny až závažný zápal v mnohých orgánoch s najťažšími léziami v oku, mezenterických lymfatických uzlinách, obličkách a pľúcach. Tri mačky s efúznou FIP mali závažný pyogranulomatózny zápal vo viacerých brušných orgánoch vrátane omenta, pobrušnice, črevnej steny, mezenterických lymfatických uzlín, pečene a sleziny.

Závažný zápal typický pre cerebrálnu FIP bol prítomný v mozgu všetkých okrem jednej (CT07) z ôsmich mačiek, ktoré sa podrobili pitve bez výrazných hrubých známok FIP alebo s neefúznou FIP. Jedna mačka bez charakteristických mozgových lézií mala ťažký mozgový edém. Naproti tomu typické FIP lézie chýbali v mozgu všetkých troch pitvaných mačiek s efúznou FIP. Stereotypné FIP lézie mozgu boli charakterizované stredne ťažkou až ťažkou chronickou meningoencefalitídou a ventrikulitídou spojenou s periventrikulárnou nekrózou parenchýmu (obrázok 12a). Štvrtá komora bola postihnutá najťažšie a meningitída bola najčastejšie pozorovaná ventrálne do malého mozgu a mozgového kmeňa. Často sa pozorovali silné perivaskulárne manžety spojené s vaskulitídou. FIP antigén sa demonštroval imunoperoxidázovým zafarbením v mozgu 6/7 prípadov stereotypnej cerebrálnej FIP (obrázok 12b). Tkanivá z 11 pitvaných mačiek, sa testovali na prítomnosť FIPV RNA pomocou qRT-PCR. Všetky vykázali pozitívny výsledok, čím sa stanovila perzistencia vírusu u mačiek, u ktorých liečba nebola úspešná.

Obrázok 12.
Fotomikrografy lézie v mozgu mačky CT08. U tejto mačky sa počas počiatočnej liečby GC376 vyskytlo závažné neurologické ochorenie. (a) Štvrtá komora obsahuje bielkovinovú tekutinu zmiešanú s početnými neutrofilmi a makrofágmi, ktoré multifokálne zasahujú do okolitého zriedeného neuropilu. Veľké manžety lymfocytov a plazmatických buniek obklopujú krvné cievy (*) (farbenie hematoxylínom, zväčšenie 20x). (b) Viaceré bunky pripomínajúce peritoneálne makrofágy (vyznačená malá oblasť na obrázku 12a) vykazujú pozitívnu imunoreaktivitu pre mačací infekčný antigén peritonitídy (kontrastné farbivo hematoxylín, zväčšenie 600x).

Diskusia

Úspech v liečbe GC376 pri experimentálnej infekcii FIPV nás motivoval k preskúmaniu účinnosti GC376 pri prirodzene vyvinutej FIP. Medzi experimentálnou efúznou brušnou FIP a prirodzene sa vyskytujúcou chorobou existujú významné rozdiely. Experimentálna choroba obchádza kritické počiatočné štádium, ktoré začína u mačiatok vystavením neškodnému mačaciemu enterickému koronavírusu (FECV). Prirodzene sa vyskytujúca FIP je výsledkom špecifických mutantov, ktoré vznikajú po infekcii FECV, a FIP sa vyskytuje za prítomnosti imunity voči FECV. Experimentálna FIP je naopak indukovaná u mačiek, ktoré sa nestretli s koronavírusom intraperitoneálnou injekciou veľkej dávky purifikovaného FIPV získaného od laboratórnej mačky. Prirodzene sa vyskytujúca choroba je často subklinická po mnoho týždňov alebo mesiacov pred pozorovaním vonkajších príznakov choroby, zatiaľ čo experimentálne príznaky choroby sa objavia do 2–4 týždňov a rýchlo progredujú. Prirodzene sa vyskytujúca FIP má rôzne klinické formy, zatiaľ čo experimentálna infekcia má takmer vždy abdominálnu efúznu podobu. FIP v prírode je tiež ovplyvnená prostredím chorobu zvyšujúcich kofaktorov, zatiaľ čo experimentálne ochorenie sa vyskytuje u mačiek bez vonkajších vplyvov. Rozdiely môžu vysvetľovať, prečo sa choroba vyvinie len u malej časti mačiek prirodzene vystavených FIPV, zatiaľ čo 80–100% experimentálne infikovaných mačiek zomiera. Naše predpovede sa ukázali ako správne a prirodzene sa vyskytujúca FIP sa liečila oveľa ťažšie ako experimentálna choroba. Je však potrebné zdôrazniť, že tento pokus by nebol schválený bez informácií získaných z farmakokinetických štúdií, štúdií akútnej a chronickej toxicity a účinnosti uskutočňovaných na laboratórnych mačkách.

Bol to prvý pokus o použitie cieleného antivírusového lieku proti systémovému a vysoko smrteľnému veterinárne významnému ochoreniu. Aj keď zatiaľ nie sú k dispozícii žiadne špecifické antivírusové lieky na koronavírusové infekcie u ľudí alebo zvierat, na liečbu boli vyvinuté antivírusové lieky na iné vírusové infekcie ľudí, ako sú HCV a HIV-1, a použitie týchto liekov poskytlo solídny základ pre ich aplikáciu na choroby zvierat, ako je FIP. HCV infikuje hlavne pečeňové bunky a u väčšiny ľudí spôsobuje pretrvávajúcu vírusovú infekciu. Avšak len asi u 20–30% z nich sa rozvinú ochorenia pečene v časovom horizonte 20–30 rokov. Infekciu HCV je možné eliminovať nešpecifickou antivírusovou liečbou (interferón a ribavirín) po dobu 6–12 mesiacov u približne polovice pacientov a nedávnym zavedením priamo pôsobiacich antivírusových liekov v trvaní 3–6 mesiacov sa počas liečby podstatne zvýšila miera vyliečenia na viac ako 90% . HIV infekcia u ľudí vedie k predĺženému asymptomatickému stavu a nakoniec k pokročilému ochoreniu na HIV. HIV-1 infikuje T lymfocyty a makrofágy a prežíva v latentnom stave. Viac ako 30 antiretrovírusových liekov, z ktorých väčšina sa používa v kombinácii dvoch alebo viacerých liekov, sa úspešne použilo na zníženie vírusovej záťaže na nedetegovateľnú hladinu v krvi pacientov s HIV/AIDS. Vírus sa však po prerušení antivírusovej liečby vracia a vyžaduje tak celoživotnú antivírusovú liečbu. Šírenie vírusu do mozgu, ktoré je sprostredkované hlavne vírusom infikovanými makrofágmi, a následný vývoj neurologického ochorenia sa vyskytuje u viac ako 50% infekcií HIV. Neurologické zhoršenie preto stále zostáva dôležitým problémom aj v tejto dobe antivírusovej liečby. Tieto precedensy antivírusovej liečby infekcií HCV a HIV-1 ukazujú, že výsledok liečby (vírusový klírens vs perzistencia vírusu), trvanie liečby (konečná vs kontinuálna) a prítomnosť neurologických následkov sú výrazne ovplyvnené vírusovou patogenézou.

Táto štúdia bola obmedzená na 20 mačiek s FIP, ktoré predstavovali spektrum veku a foriem choroby. Aj keď bol počet liečených mačiek malý, zhromaždilo sa prekvapivé množstvo informácií, napríklad o tom, ako dlho sa má liečiť, o možných vedľajších účinkoch, o tom, ako identifikovať klinickú formu FIP, ktorá bude s najväčšou pravdepodobnosťou reagovať na liečbu, a potenciálnych ukazovateľoch zlyhania liečby a jej úspešnosti. Klinická štúdia bola založená na skúsenostiach získaných z farmakokinetických štúdií a štúdií účinnosti vykonaných na laboratórnych mačkách. Počiatočné obdobie liečby bolo na základe experimentálnych štúdií stanovené na 2 týždne, nakoniec sa však predĺžilo na 12 týždňov a viac na základe skúseností získaných v priebehu testovania. Toto konečné liečebné obdobie sa blížilo k 3–6 mesiacom používaným na liečbu infekcie HCV u ľudí s priamo pôsobiacimi antivírusovými liekmi. Na základe experimentálnych štúdií boli očakávané ťažkosti s liečením neurologických foriem choroby. Vedľajšie účinky boli prijateľné a zahŕňali pálenie pri aplikácii injekcie a dermálny a podkožný zápal, keď sa na rovnaké miesta podalo príliš veľa liečiva. Tento jav bol už predtým pozorovaný aj u laboratórnych mačiek. Závažnejší vedľajší účinok, ktorý sa predtým u laboratórnych mačiek nepozoroval, sa obmedzil na mačiatka a zahŕňal spomalený vývoj dospelých zubov a retenciu alebo oneskorenú stratu mliečnych zubov.

Liečba GC376 bola úspešná v indukcii významnej remisie príznakov ochorenia a regresie lézií u 19/20 mačiek. Tento výsledok potvrdzuje naše zistenia rýchleho zvratu klinických príznakov u laboratórnych mačiek s experimentálnou FIP liečených GC376, a rozšíril naše znalosti o účinkoch lieku na široké spektrum foriem prirodzene sa vyskytujúcej FIP. Mačky pochádzali z rôznych častí USA a dokonca aj z Peru, čo potvrdzuje, že geograficky rozmanité kmene FIPV boli voči tomuto inhibítoru rovnako citlivé. K výraznému zníženiu transkriptov vírusovej RNA vo výpotkoch došlo v priebehu niekoľkých dní liečby spolu s rýchlym zlepšením zdravotného stavu. Remisia ochorenia však pretrvávala 3 mesiace a dlhšie iba u 7/20 týchto mačiek. Neschopnosť dosiahnuť dlhodobú remisiu ochorenia bola nakoniec spojená s výskytom neurologického ochorenia pri absencii rozsiahlych brušných lézií alebo s opakovaním/pretrvávaním rozsiahlych brušných lézií za prítomnosti histologických lézií v mozgu a/alebo v očiach. Tieto objavy naznačujú, že FIPV má väčšiu tendenciu šíriť sa z telesných dutín do mozgu, ako sa pôvodne predpokladalo, najmä ak sa mu poskytne dostatok času. Toto rozšírenie s najväčšou pravdepodobnosťou zahŕňa infikované makrofágy, ktoré vstupujú do mozgu malými krvnými cievami v mozgových blanách a ependyme.

U mačky, u ktorých sa vyskytlo neurologické ochorenie, sa tak stalo buď počas liečby (CT05, CT08, CT22), alebo 2 (CT01, CT02, CT09), 3 (CT13) alebo 6 (CT10) týždňov po ukončení liečby. Najpravdepodobnejším vysvetlením tohto oneskorenia, ako aj určitej terapeutickej výhody vyšších dávok, bolo to, že časť GC376 bola stále schopná preniknúť do mozgu. Hladiny GC376 v mozgovomiechovom moku predstavovali iba 3% plazmy v mozgu 2 hodiny po subkutánnej injekcii v dávke 10 mg/kg (nezverejnené údaje). Aj keď boli relatívne koncentrácie liečiva v mozgu u týchto mačiek nízke, stále boli 21,4-krát vyššie ako hladiny potrebné na inhibíciu replikácie vírusu v tkanivovej kultúre. Na základe tohto zistenia sa predpokladalo, že vyššie dávky umožňujú prienik vyššieho množstva liečiva do mozgu. Tento predpoklad bol podporený skúsenosťami s dvoma mačkami, ktoré vykazovali neurologické príznaky. Zvýšenie dávky GC376 na 50 mg/kg každých 12 hodín u jednej mačky (CT01) viedlo k znateľnému zlepšeniu, ale neeliminovalo príznaky ochorenia mozgu. Zdá sa, že predĺženie liečby o takmer 3 mesiace v dávke 15mg/kg každých 12 h oddialilo progresiu neurologických príznakov u druhej mačky (CT12), zatiaľ čo pokusy znížiť celkovú dennú dávku u tejto mačky na 10mg/kg každých 12 hodín alebo 15mg/kg každých 24 hodín spôsobili zhoršenie neurologických príznakov. To naznačuje, že dávky 15 mg/kg každých 12 hodín alebo vyššie umožnili dostatočnému množstvu GC376 prekonať hematoencefalickú bariéru, aby spomalil, ale neeliminoval neurologické príznaky.

Vysoký výskyt ochorení centrálneho nervového systému (CNS) v tejto štúdii bol vyšší, ako sa uvádzalo predtým, a bol neočakávaný, pretože mačky so známkami postihnutia mozgu alebo miechy boli zo štúdie vylúčené. Choroby CNS sa ukázala omnoho pravdepodobnejšia u starších mačiek so suchou alebo zmiešanou formou FIP ako u mladých mačiek s vlhkou FIP. To naznačuje, že FIPV môže u mnohých mačiek preniknúť do mozgu, ak je mu poskytnutý dostatok času. Zdá sa, že pri infekcii CNS zohrávajú úlohu makrofágy peritoneálneho typu, pretože FIPV infikované bunky v mozgu mačiek s neurologickou FIP sa viac podobajú skôr peritoneálnym makrofágom ako rezidentným mozgovým makrofágom. To by nemalo byť prekvapujúce, pretože makrofágy migrujú do rôznych tkanív, vrátane mozgu, na vykonávanie imunitného dohľadu a sú tiež cieľmi pre celý rad infekčných agensov, ako sú FIPV a HIV-1. Infikované makrofágy hrajú hlavnú úlohu pri šírení vírusu do mozgu u pacientov s HIV a detekcia vírusu v mozgu je možná v priebehu niekoľkých týždňov po infikovaní. K neurologickému poškodeniu však zvyčajne dôjde v neskoršom štádiu. Lieky proti HIV tiež znižujú frekvenciu závažných neurologických porúch, podobne, ako sa pozorovalo v tejto štúdii o FIPV a GC376. Existujú aj alternatívne vysvetlenia. Je možné, že extra-CNS účasť môže inhibovať rozvoj mozgových ochorení a naopak. Je bežné, že sa ochorenie CNS vyskytuje pri neprítomnosti viscerálneho ochorenia a naopak. Potlačenie replikácie vírusu v neneuronálnych tkanivách môže tiež zvýšiť pozitívnu selekciu mutantov, ktoré sú neurotropnejšie alebo neurovirulentnejšie. Dôkaz druhej možnosti by si však vyžadoval veľké štúdie s použitím laboratórnych mačiek.

Zdalo sa, že určité formy FIP ovplyvňovali úspešnosť liečby. Chovanie GC376 pri liečbe okulárnej FIP bolo paradoxné, pretože táto forma mimoriadne dobre reagovala na GC376. Aj keď očné lézie reagovali na liečbu, všetky tri mačky s postihnutím očí nakoniec podľahli mozgovým ochoreniam, čo podporilo blízky anatomický vzťah oka a CNS. Chronické ileocekálne postihnutie a postihnutie hrubého čreva a spomalený rast u starších mačiek v tejto štúdii taktiež predstavovali zlú prognózu. U mnohých z týchto mačiek sa objavil brušný výpotok iba ako terminálny prejav ich choroby. Hostiteľské faktory tiež spojené so zníženou odpoveďou na antivírusovú liečbu pri iných vírusových infekciách, ako je HCV, zahŕňajú vek, pohlavie, cirhózu alebo fibrózu pečene, rasu alebo telesnú hmotnosť.

Vznik rezistencie je hlavným problémom každého antivírusového lieku, ale FIPV sa zriedka prenáša z mačky na mačku, a rezistencia na liečivo, ak by sa vyskytla, by predstavovala problém iba pre jednotlivé liečené mačky, a nie pre celú populáciu. Aj keď vírusová rezistencia na GC376 nebola pozorovaná až do 20 pasáží in vitro, čo naznačuje, že rezistencia sa nedá získať ľahko, dlhodobá a opakovaná liečba in vivo môže predstavovať silnejší selekčný faktor. Zdá sa však, že vírusová rezistencia nebola zodpovedná za relapsy brušných chorôb u piatich liečených mačiek. Tieto mačky mali granulomatózne útvary, často v hrubom čreve a ileo-cekálno-kolických lymfatických uzlinách, ktoré mohli poskytovať chránené miesto na pretrvanie vírusov. Ochrana patogénov v granulómoch je pre mykobaktérie dobre zdokumentovaným javom a vzťahuje sa na ďalšie patogény, ako sú vírusy. Stav ochorenia pečene (cirhóza) pri infekcii HCV tiež zvyšuje riziko relapsu a vyžaduje dlhšiu liečbu, čo tiež naznačuje, že vírusy môžu byť chránené pred liekmi, keď sa nachádzajú na určitých chránených miestach. Formácia „ochranných granulómov“ zahŕňa veľké množstvo chemokínov a cytokínov a zvyšovanie regulácie chemokínových receptorov, adresínov, selektínov a integrínov. Perzistencia patogénov na týchto chránených miestach môže vyžadovať vyššiu dávka lieku a dlhšiu dobu trvania liečby.

Zlyhania liečby môžu tiež byť výsledkom neschopnosti hostiteľa dosiahnuť ochrannú imunitnú reakciu počas obdobia, keď je potlačená replikácia vírusu. Takéto zlyhanie sa pozorovalo pri infekcii HCV u ľudí. Imunita sprostredkovaná T-lymfocytmi hrá dôležitú úlohu v ochrannej imunite, ktorá sa vyskytuje asi u 20% akútnej infekcie HCV, a pri rovnakom alebo väčšom podiele infekcie FIPV. Je ešte potrebné preskúmať možnú synergiu vírusového klírensu sprostredkovaného T-lymfocytmi a antivírusovej terapie u mačiek s FIP. Prínosom by mohla byť aj kombinácia antivírusových liekov a stimulantov imunity T-lymfocytov pri liečbe FIP, ako je kombinácia interferónov a ribavirínu pri liečbe infekcie HCV.

Trvalá remisia u 6/7 mačiek liečených 12 týždňov alebo dlhšie bola do istej miery predvídateľná. Tieto mačky boli vo veku 3,3–4,4 mesiaca, keď sa u nich prejavili akútne príznaky brušnej (C15, C17, C18, CT21, CT23) alebo hrudnej efúznej FIP (CT20). To ich urobilo mladšími ako všetky ostatné mačky v štúdii okrem troch (CT8, CT16, CT21) a viac sa podobali 16-týždňovým laboratórnym mačkám s akútnym nástupom efúznej FIP, ktoré dobre reagovali na GC376. Choroba, ak je akútna, dáva vírusu na prienik do mozgu alebo očí málo času. Akútnosť ich ochorenia mohla tiež umožniť kratšiu dobu, aby infekcia natrvalo narušila akúkoľvek ochrannú imunitnú odpoveď. Siedma mačka, CT04, bola oproti týmto šiestim mladším mačkám extrémom. CT04 bola so svojimi 6,8 rokmi najstaršou mačkou v štúdii, u ktorej došlo k výraznému úbytku hmotnosti (30%) a ochoreniu obmedzenému na mezenterické lymfatické uzliny. CT04 utrpela relapsy choroby vyžadujúce obnovenie liečby, ale všetky relapsy boli identické so vstupým stavom a nezahŕňali CNS. Je známe, že mačky s touto formou FIP prechádzajú spontánnou remisiou, čo naznačuje, že existuje bod zlomu medzi imunitou a chorobou. Mačky CT04 a CT21 demonštrovali múdre rozhodnutie znovuzahájenia liečby pri relapse, za predpokladu, že relapsy nezahŕňajú oči alebo nervový systém a stále reagujú na lieky.

Stanovenie minimálnej doby trvania liečby bolo založené na postupnom predlžovaní trvania liečby na základe priaznivej reakcie na liečbu. Na základe experimentálnych štúdií sa očakávalo, že môžu byť postačujúce 2 týždne liečby; to sa teda použilo ako východiskový bod. Táto štúdia však naznačila, že minimálna doba liečby sa blížila k 12 týždňom, čo sa prekvapivo blížilo k zvyčajnému 12-týždňovému obdobiu, ktoré je potrebné na liečbu ľudí s HCV pomocou inhibítorov proteázy. Avšak doba liečby HCV sa môže pohybovať od 8 do 24 týždňov u rôznych ľudí. Mačka CT21 bola navonok zdravá, aktívna a po 12 týždňoch liečby rástla, ale celkový počet bielkovín a bielych krviniek sa stále nevrátil do normálu, ako tomu bolo u ostatných šiestich mačiek. Napriek tomu sa rozhodlo o ukončení liečby po 17 týždňoch z dôvodu dlhého obdobia navonok normálneho zdravia. To, či by dlhodobejšia liečba mohla zabrániť relapsu choroby 13 týždňov po ukončení liečby, si môžeme len domýšľať, ale zvyšuje to pochybnosť o tom, aká dlhá má vôbec byť potrebná doba liečby u niektorých mačiek. Nastoľuje sa tiež otázka, ako dlhé musí byť obdobie remisie, aby sme mohli prehlásiť že došlo k uzdraveniu, a nielen k dlhodobej remisii. Najdlhšie obdobie bez choroby bolo v čase písania tohto článku viac ako 11 mesiacov, pričom päť ďalších mačiek bolo bez známok infekcie po dobu 5–9 mesiacov. Na základe klinických a histologických dôkazov neurologického ochorenia v čase smrteľných relapsov sa zdá, že sa vírus nakoniec dostane do mozgu a že to môže byť najdôležitejším obmedzujúcim faktorom pri antivírusovej liečbe FIP.

Aj keď dlhodobo prežila iba jedna tretina mačiek, 20 mačiek v tejto štúdii poskytuje základ pre budúce štúdie s GC376 a ďalšími antivírusovými liekmi, ktoré budú nasledovať. Nie všetky mačky budú liečiteľné, ale to by nemalo zastaviť úsilie. V tejto obmedzenej štúdii sa takmer všetkým liečeným mačkám vrátil normálny zdravotný stav, aj keď iba na niekoľko týždňov alebo mesiacov. Je dôležité si uvedomiť univerzálnosť vírusových patogénov a využiť priekopnícky vývoj liekov, ktoré sa klinicky uplatňujú pri liečbe ľudských chorôb, ako je HIV/AIDS, hepatitída C, MERS, SARS, Ebola a chrípka.

Závery

Inhibícia FIPV 3CLpro s pomocou GC376 sa za podmienok štúdie ukázala ako účinná a viedla k zníženiu replikácie vírusu a k remisii príznakov choroby u mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou FIP mimo CNS. K trvalej remisii v tejto štúdii však dochádzalo skôr u mačiatok vo veku nižšom ako 18 týždňov s akútnou vlhkou FIP alebo u mačiek so suchou FIP obmedzenou na mezenterickú lymfatickú uzlinu a je menej pravdepodobné, že sa vyskytne u mačiek starších ako 18 týždňov so suchou, zmiešanou alebo okulárnou formou FIP. Neschopnosť dosiahnuť trvalú remisiu bola spojená buď s vysokým výskytom neurologických ochorení počas alebo po ukončení liečby alebo s recidívou brušných lézií. Zdá sa, že antivírusová liečba spomalila progresiu neurologického ochorenia, ale nedokázala ju zvrátiť pri dávke použitej v tejto štúdii. Príčina recidívy extra-neurologického ochorenia pri liečbe nebola stanovená, ale nesúvisela s mutáciami v oblasti viažucej proteázu.

Poznámky pod čiarou

Prijaté: 3.8.2017

Doplňujúci materiál: Formulár informovaného súhlasu majiteľa.

Konflikt záujmov: YK, KOC a WCG majú v rukopise patentové nároky na inhibítory proteázy. Ostatní autori neprehlasujú žiadne potenciálne konflikty záujmov v súvislosti s výskumom, autorstvom alebo publikovaním tohto článku.

Financovanie: Hlavná podpora tejto štúdie bola umožnená vďaka grantu od Morris Animal Foundation, Denver, CO, USA. Ďalšie prostriedky na technickú podporu a starostlivosť o zvieratá poskytli Fond Philipa Raskina, Kansas City, SOCK FIP, grant National Institutes of Health R01AI109039 a Centrum pre zdravie spoločenských zvierat, Kalifornská univerzita, Davis, CA, USA.

Literatúra

1.Prokofjeva, MM, Kochetkov, SN, Prassolov, VS. Therapy of HIV infection: current approaches and prospects. Acta Naturae 2016; 8: 23–32.
Google Scholar | Crossref | Medline
2.Carter, W, Connelly, S, Struble, K. Reinventing HCV treatment: past and future perspectives. J Clin Pharmacol 2017; 57: 287–296.
Google Scholar | Crossref | Medline
3.Kim, Y, Lovell, S, Tiew, KC. Broad-spectrum antivirals against 3C or 3C-like proteases of picornaviruses, noroviruses, and coronaviruses. J Virol 2012; 86: 11754–11762.
Google Scholar | Crossref | Medline
4.Kim, Y, Mandadapu, SR, Groutas, WC. Potent inhibition of feline coronaviruses with peptidyl compounds targeting coronavirus 3C-like protease. Antiviral Res 2013; 97: 161–168.
Google Scholar | Crossref | Medline
5.Kim, Y, Shivanna, V, Narayanan, S. Broad-spectrum inhibitors against 3C-like proteases of feline coronaviruses and feline caliciviruses. J Virol 2015; 89: 4942–4950.
Google Scholar | Crossref | Medline
6.Kim, Y, Liu, H, Galasiti Kankanamalage, AC. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog 2016; 12: e1005531.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
7.Miller, FG, Brody, H. What makes placebo-controlled trials unethical? Am J Bioethics 2002; 2: 3–9.
Google Scholar | Crossref | Medline
8.Chiodo, GT, Tolle, SW, Bevan, L. Placebo-controlled trials good science or medical neglect? West J Med 2000; 172: 271–273.
Google Scholar | Crossref | Medline
9.Van Kruiningen, HJ, Ryan, MJ, Shindel, NM. The classification of feline colitis. J Comp Pathol 1983: 93: 275–294.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
10.Pedersen, NC, Eckstrand, C, Liu, H. Levels of feline infectious peritonitis virus in blood, effusions, and various tissues and the role of lymphopenia in disease outcome following experimental infection. Vet Microbiol 2015; 175: 157–166.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
11.Pellerin, M, Lopez-Aquirre, Y, Penin, F. Hepatitis C virus quasispecies variability modulates nonstructural protein 5A transcriptional activation, pointing to cellular compartmentalization of virus-host interactions. J Virol 2004; 78: 4617–4627.
Google Scholar | Crossref | Medline
12.Pedersen, NC, Allen, CE, Lyons, LA. Pathogenesis of feline enteric coronavirus infection. J Feline Med Surg 2008; 10: 529–541.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
13.Pedersen, NC . A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963–2008. J Feline Med Surg 2009; 11: 225–258.
Google Scholar
14.Pedersen, NC . An update on feline infectious peritonitis: virology and immunopathogenesis. Vet J 2014; 201: 123–132.
Google Scholar | Crossref | Medline
15.Pedersen, NC, Liu, H, Durden, M. Natural resistance to experimental feline infectious peritonitis virus infection is decreased rather than increased by positive genetic selection. Vet Immunol Immunopathol 2016; 171: 17–20.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
16.Pedersen, NC, Liu, H, Gandolfi, B. The influence of age and genetics on natural resistance to experimentally induced feline infectious peritonitis. Vet Immunol Immunopathol 2014; 162: 33–40.
Google Scholar | Crossref | Medline
17.Clifford, DB . HIV-associated neurocognitive disease continues in the antiretroviral era. Top HIV Med 2008; 16: 94–98.
Google Scholar | Medline
18.Foley, JE, Lapointe, JM, Koblik, P. Diagnostic features of clinical neurologic feline infectious peritonitis. J Vet Intern Med 1998; 12: 415–423.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
19.Mesquita, LP, Hora, AS, de Siqueira, A. Glial response in the central nervous system of cats with feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2016; 18: 1023–1030.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
20.Pedersen, NC . Feline infectious peritonitis: something old, something new. Feline Pract 1976; 6: 42–51.
Google Scholar
21.Valcour, V, Sithinamsuwan, P, Letendre, S. Pathogenesis of HIV in the central nervous system. Curr HIV/AIDS Rep 2011; 8: 54–61.
Google Scholar | Crossref | Medline
22.Joseph, SB, Arrildt, KT, Sturdevant, CB. HIV-1 target cells in the CNS. J Neurovirol 2015; 21: 276–289.
Google Scholar | Crossref | Medline
23.Spudich, S, Gonzalez-Scarano, F. HIV-1-related central nervous system disase: current issues in pathogenesis, diagnosis and treatment. Cold Spring Harb Perspect Med 2012; 2: a007120
Google Scholar | Crossref | Medline
24.Cavalcante, LN, Lyra, AC. Predictive factors associated with hepatitis C antiviral therapy response. World J Hepatology 2015; 7: 1617–1631.
Google Scholar | Crossref | Medline
25.Saunders, BM, Cooper, AM. Restraining mycobacteria: role of granulomas in mycobacterial infections. Immunol Cell Biol 2000; 78: 334–334.
Google Scholar | Crossref | Medline
26.Smyk-Pearson, S, Tester, IA, Klarquist, J. Spontaneous recovery in acute human hepatitis C virus infection: functional T-cell thresholds and relative importance of CD4 help. J Virol 2008; 82: 1827–1837.
Google Scholar | Crossref | Medline
27.Legendre, AM, Bartges, JW. Effect of polyprenyl immunostimulant on the survival times of three cats with the dry form of feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2009; 11: 624–626.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
28.Legendre, AM, Kuritz, T, Galyon, G. Polyprenyl immunostimulant treatment of cats with presumptive non-effusive feline infectious peritonitis in a field study. Front Vet Sci 2017; 4: 7.
Google Scholar | Crossref | Medline
Publikované

Rýchly ústup neefuzívnej FIP uveitídy pri liečbe orálnou formou adenozínového analógu a mačacím omega interferónom

Diane D. Addie, Johanna Covell-Ritchie, Oswald Jarrett, and Mark Fosbery
Originálny článok: Rapid Resolution of Non-Effusive Feline Infectious Peritonitis Uveitis with an Oral Adenosine Nucleoside Analogue and Feline Interferon Omega
27.10.2020; Preklad 23.3.2021

Abstrakt

Toto je prvá správa o úspešnej liečbe prípadu neefuzívnej FIP uveitídy s použitím orálnej formy adenozínového analógu a mačacieho interferónu omega, a alfa-1 kyslého glykoproteínu (AGP) ako indikátora zotavenia. 2-ročný kastrovaný kocúr Nórskej lesnej mačky bol postihnutý uveitídou, keratickými zrazeninami, mezenterickou lymfadenopatiou a úbytkom hmotnosti. Bol hypergamaglobulinemický a mal neregeneratívnu anémiu. RNA mačacieho koronavírusu (FCoV) bola detegovaná pomocou aspiračnej biopsie mezenterických lymfatických uzlín tenkou ihlou s využitím polymerázovej reťazovej reakcie s reverznou transkripciou (RT-PCR) – diagnostikovala sa neefuzívna FIP. Očné kvapky prednisolónacetátu sa podávali trikrát denne počas 2 týždňov. Zahájila sa liečba orálnou formou adenozínového analógu (Mutian). Za 50 dní liečby Mutianom kocúr pribral na hmotnosti viac ako jeden kilogram, hladina globulínu sa znížila zo 77 na 51 g/l a hematokrit sa zvýšil z 22 na 35%; uveitída ustúpila a zlepšil sa zrak. Hladina AGP v sére sa znížila z 3100 na 400 μg/ml (v normálnych medziach). Symetrický dimetylarginín (SDMA) bol nad normálom pri 28 μg/dl, po ukončení liečby sa znížil na 14 μg/dl; či bolo zvýšenie SDMA spôsobené léziami FIP v obličkách alebo Mutianom, nie je známe. Po skončení liečby Mutianom sa začali podávať nízke dávky orálnej formy rekombinantného mačacieho interferónu omega – zotavovanie kocúra pokračovalo.

Kľúčové slová: infekčná peritonitída mačiek, koronavírus, uveitída, Mutian, adenozínový analóg, mačací interferón omega, mezenterické lymfatické uzliny, alfa-1 kyslý glykoproteín, symetrický dimetylarginín

1. Úvod

Mačací koronavírus (FCoV) je vysoko infekčný enterický vírus, ktorý spôsobuje subklinickú infekciu alebo hnačku u väčšiny infikovaných mačiek [1], ale asi u 10% spôsobuje potenciálne smrteľnú imunitne sprostredkovanú granulomatóznu vaskulitídu spojenú s monocytmi [2], známu ako mačacia infekčná peritonitída (FIP). FCoV je alfa koronavírus s pozitívnou polaritou, člen rodiny Coronaviridae z radu Nidovirales [3].

Aj keď už bola v minulosti popísaná liečba FIP injekčným nukleozidovým analógom [4] a vyliečenie enterickej infekcie FCoV orálnou formou adenozínového analógu (Mutian, Nantong Biotechnology, Čína) [5], toto je prvý popísaný prípad zotavenia mačky so systémovou infekciou FCoV – tj. FIP – s použitím Mutianu.

2. Kazuistika

Skywise bol 2-ročný kastrovaný samec nórskej lesnej mačky z domácnosti s piatimi mačkami; prejavila sa u neho uveitída v zostávajúcom oku (v pravom, o ľavé oko prišiel ako mačiatko) a občasné hnačky. Jeho dúhovka bola neprirodzene zafarbená a boli viditeľné zrnité tukové zrazeniny (obrázok 1a).

Obrázok 1
Mačacie oko pred (a) a (b) po liečbe Mutianom a lokálnymi steroidmi. Mačka mala uveitídu a keratické zrazeniny (a). Vpravo (b): to isté oko po 7 dňoch systémového prednizolónu, 2 týždňoch lokálneho prednizolónu a 7 týždňoch liečby liekom Mutian, vykazujúce takmer úplné odznenie uveitídy.

Jeho anamnéza zahŕňala privedenie dvoch 11-mesačných nórskych lesných mačiek (Link a Zelda) do domácnosti pred tromi mesiacmi a nástup uveitídy päť dní po revakcinácii (Leucofeligen, Virbac, Francúzsko). Skywise bol testovaný na protilátky FCoV a zistilo sa, že má veľmi vysoký titer nad 10 240 (Idexx Laboratories, Wetherby, UK) tri týždne pred prezentáciou kvôli tomu, že mačka, s ktorou bol v kontakte (Paddy), bola trvale pyrexická a malátna. Paddy bol negatívny na antigény FeLV p27 a protilátky FIV (Idexx Laboratories, Wetherby, UK), ale zistilo sa, že jeho titer protilátok proti FCoV bol veľmi vysoký (tabuľka 1), preto boli všetky ostatné mačky v domácnosti testované na protilátky FCoV, aby sa rozhodlo, či by sa mali izolovať od Paddyho, ale pretože sa tiež zistilo, že majú vysoké titre protilátok FCoV (tabuľka 1), segregácia nebola nutná.

Deň −29Deň −19Deň 7Deň 41
Skywise2 roky – Nórska lesná mačka (NFC) FIP >10,240CT 30Neg
Paddy2 roky – NFC, pretrvávajúca pyrexia, letargia>10,240 CT 18Neg
Oliver8 rokov – Domáca krátkosrstá mačka >10,240CT 20Neg
Link1 rok – NFC >10,240CT 20Neg
Zelda1 rok – NFC 640NegNeg
Tabuľka 1
Titer protilátok mačacieho koronavírusu (FCoV) a výsledky qRT-PCR CT.
CT — Prahová hodnota cyklu pre test FCoV qRT-PCR vykonaný na vzorke stolice. Dni sú relatívne k prvej predpokladanej diagnóze infekčnej peritonitídy mačiek (FIP) u Skywise v deň 0 (18. apríla 2020); tj. jeho titer protilátok FCoV bol testovaný 19 dní pred diagnózou FIP. Liečba Mutianom sa začala pre Skywise 6. deň a pre ďalšie mačky infikované FCoV 18. deň v trvaní 5 dní.

Pri prezentácii bola telesná hmotnosť pacienta 2,89 kg (obrázok 2) a skóre telesnej kondície bolo 2/9. Ultrazvukové vyšetrenie potvrdilo absenciu brušného alebo hrudného výpotku, bola však prítomná mezenterická lymfadenopatia. Aspirát z mezenterickej lymfatickej uzliny (MLN) bol odobratý ultrazvukom vedenou aspiračnou biopsiou s tenkou ihlou (FNA) a bol testovaný na FCoV polymerázovou reťazovou reakciou s reverznou transkripciou (qRT-PCR) (Idexx Laboratories, Wetherby, UK). Test bol pozitívny na mutáciu M1058L a negatívny na mutáciu S1060A [6].

Obrázok 2
Váha pred, počas a po zotavení z FIP a časová os. Hmotnosť mačky je uvedená na grafe vyššie: Deň 0 predstavuje deň prezentácie s uveitídou na klinike. 5 dní pred objavením sa uveitídy bola vykonaná revakcinácia, ale hmotnosť mačky pred týmto dňom nebola zaznamenávaná, takže nie je známe, či chudla už pred revakcináciou alebo či došlo k zníženiu hmotnosti po revakcinácii; tj. či FIP prebiehala už pred revakcináciou, alebo či FIP bola spôsobená samotnou revakcináciou. Mačka stratila 30g hmotnosti počas systémovej liečby prednizolónom (dni 0 až 6), potom sa podávali iba lokálne steroidy. Liečba Mutianom prebiehala medzi 6. a 56. dňom; po začatí liečby Mutianom sa hmotnosť mačky rýchlo zvýšila a prírastok hmotnosti pokračoval aj potom, čo bol Mutian nahradený mačacím interferónom omega, až kým hmotnosť kocúra dosiahla okolo 4,35 kg.

Výsledky krvi sú uvedené v tabuľke 2. Hematológia odhalila miernu až stredne ťažkú neregeneratívnu anémiu s hematokritom (HCT) 22%, počtom lymfocytov 2,07 × 109/l a eozinopéniou pod detekčnou hladinou (reportovaná ako 0,0 × 109/l). Biochemická analýza krvi ukázala hyperglobulinémiu (77,2 g/l) a pomer albumínu ku globulínu (A:G) 0,31. Bilirubín bol 11 mikromolov na liter (μmol/l) (0,64 mg/dl). Alfa-1 kyslý glygoproteín (AGP) bol zvýšený na 3100 μg/ml (Idexx Laboratories, Wetherby, UK) (normálna hladina je ≤ 500 μg/ml [7]).

AGPTPAlbGlobA:GBilirubinHctLymfocytyALTAPGGTSDMACreatUrea
Ref. rozsah<500 μg/mL57–89 g/L22–40 g/L28–51 g/L>0.8 *0–15 μmol/L30–52%0.92–6.88 × 10912–130 U/L14–111 U/L0–4 U/L0–14 μg/dL71–212 μmol/L5.7–12.9 mmol/L
Deň 0 ND11120910.221125.70.9564NDNDNDNDND
Deň 2 310010324770.31ND22.02.07NDNDNDNDNDND
Deň 18 7008326570.46634.43.6127320ND889.6
Deň 41 4008029510.57535.13.856740028938.3
Deň 62 4007830480.60535.22.6461400191066.5
Deň 90 3007831470.70640.04.15814001411310.0
Deň 153 4006734331.03135.24.4981462ND **987.8
Tabuľka 2
Laboratórne údaje týkajúce sa monitorovania liečby FIP.
* A: G nad 0,8 má silnú negatívnu prediktívnu hodnotu pre FIP [8]. ** SDMA nebola opakovaná, pretože analýza moču bola normálna. AGP – alfa-1 kyslý glykoproteín; TP — celkový proteín; Alb – albumín; Glob – globulín; A: G — pomer albumínu k globulínu; Hct – hematokrit; ALT – alanínaminotransferáza; AP – alkalická fosfatáza; GGT – gama glutamyltransferáza; SDMA – symetrický dimetylarginín; Creat – kreatinín; ND = neurčené.

V tejto tabuľke sú zobrazené iba parametre, ktoré boli monitorované opakovane; ďalšie, pre ktoré bolo k dispozícii iba málo (alebo vôbec žiadne) výsledkov (napr. aspartátaminotransferáza), alebo ktoré neboli relevantné pre postup v tomto prípade, sú vynechané. Titer protilátok FCoV a výsledky FCoV qRT-PCR v stolici sú uvedené v tabuľke 1. Deň 0 je dňom diagnózy FIP u prvej mačky; Mutian sa podával medzi 6. a 56. dňom, potom sa mačka začala liečiť 100 000 jednotkami orálnej formy mačacieho interferónu omega.

Systémová liečba bola zahájená prednizolónom v dávke 5 mg pre uveitídu (tabuľka 3). Dávka sa znížila na 2,5 mg sid, potom sa po 7 dňoch ukončila a nahradila sa lokálnou prednizolón-acetátovou 1% očnou suspenziou (Pred Forte®, Allergan, Dublin, Írsko), aplikovanou každých 8 hodín počas dvoch týždňov. Šiesty deň po prezentácii začala liečba orálnym adenozínovým analógom (Mutian 200, Nantong Biotechnology, Nantong, Čína) [5] v dávke 8 mg/kg každých 24 hodín v rozdelených dávkach: išlo o dvojnásobok normálnej dávky, v úsilí aby sa zabezpečil prienik do očnej gule. Na podporu pečene počas liečby liekom Mutian sa odporúčal doplnok s obdahom S-adenosyl-L-metionínu. Dávka Mutianu sa 25. deň znížila na 6mg/kg, ale dovtedy sa hmotnosť mačky zvýšila, takže bol nutný rovnaký počet kapsúl denne.

LiečbaDeňOftalmoskopické nálezy
Systémový prednizolón 0Deň prezentácie primárnemu veterinárnemu lekárovi.
1Oko vyšetrené pomocou štandardného oftalmoskopu. Rohovka bez zmien, predná komora mierne zakalená, na podrobné vyšetrenie by však bola potrebná sedácia. Mačka nevidiaca a vystresovaná.
2Vzorky krvi a aspiráty mezenterických lymfatických uzlín tenkou ihlou odobraté pod sedáciou.
Lokálne prednizolón-acetát 1% tid 4 Na šošovke vyzrážaný keratín (bielkovina), ktorý čiastočne zakrýva fundus. Pupilárny svetelný reflex prítomný, ale znížený.
Mutian 8mg/kg po dobu 19 dní, potom 6mg/kg 6Opatrovateľ mačky uviedol, že si myslí, že mačka vidí.
17Opatrovateľ mačky uviedol, že mačka prenasledovala vtáka.
18Uveitída ustupuje, predná komora číra. Keratické zrazeniny ako predtým.
41Uveitída do značnej miery ustúpila, keratické zrazeniny stále prítomné. Fundus viditeľný, chorioretinitída ustúpila, vysoký temperament mačky znemožnil podrobné vyšetrenie. Vynikajúca zraková vnímavosť.

Tabuľka 3
Časová os liečby a ústupu uveitídy.

Pre vyhodnotenie citlivosti kmeňa FCoV na používané antivirotikum boli vzorky trusu podrobené FCoV qRT-PCR testu (Veterinary Diagnostic Services, University of Glasgow, Škótsko) [5]; výsledok bol slabo pozitívny v prahovom cykle (CT) 30, potom negatívny, čo ukazuje, že vírus bol citlivý na antivirotikum (tabuľka 1). Trus troch zo štyroch ďalších mačiek v domácnosti bol tiež pozitívny na FCoV RNA (tabuľka 1).

Po začatí liečby Mutianom sa hmotnosť kocúra rýchlo zvýšila, kým počas liečby prednizolónom sa znížila o 30g (2,89-2,86 kg) (obrázok 2). Po 40 dňoch Mutianu kocúr pribral jeden kilogram (obrázok 2). Dávka Mutianu sa upravovala počas liečby v súlade s nárastom hmotnosti.

Krvné testy sa opakovali 13. deň liečby Mutianom (18 dní po diagnostikovaní) (tabuľka 2). Najdôležitejšie je, že anémia sa zvrátila, HCT sa zvýšil z 22,0 na 34,4% a bilirubín klesol z 11 na 6 μmol/l. Globulín klesol na 57 g/l a albumín sa zvýšil o 2 g/l, takže pomer albumín:globulín sa zvýšil z 0,31 na 0,46, čo bolo stále malé, ale predsa len zlepšenie (obrázok 3). Klinické vyšetrenie odhalilo, že farba dúhovky sa vrátila k normálu (obrázok 1, tabuľka 3) a došlo k zlepšeniu zraku; opatrovateľ hlásil zvýšenie aktivity – hranie sa s ostatnými mačkami – a že sa kocúr pokúsil chytiť vtáka. Jeho trus znovu nadobudol normálnu konzistenciu a frekvenciu.

Obrázok 3
Časová os liečby vo vzťahu k hladinám albumínu globulínu, ktorá ukazuje zníženie hladín globulínu (a teda celkového proteínu), zvýšenie albumínu a pomeru albumínu ku globulínu. Zlepšenie týchto parametrov pokračovalo aj po ukončení liečby Mutianom a pri liečbe mačacím interferónom omega.

Dávka Mutianu sa od 20. dňa liečby znížila na 6 mg/kg a liečba Mutianom sa ukončila po 7 týždňoch z dvoch dôvodov: hladiny AGP sa vrátili k normálu (400 μg/ml – normálna hodnota je <500 μg/ml), a pretože SDMA stúpol na 28 μg/dl (referenčný rozsah je pod 14μg/dl). Rekombinantný mačací interferón omega (rFeIFN-ω; Virbagen Omega, Virbac, Francúzsko) začínal na 100 000 jednotkách každých 24 hodín per os. SDMA sa znížila na 19μg/dl v 62. deň (jeden týždeň po ukončení liečby Mutianom) a na 14 μg/dl v 90. deň, čo bolo 35 dní po ukončení liečby Mutianom (tabuľka 2). Analýza moči uskutočnená v 62., 90. a 153 deň neodhalila žiadne abnormality a špecifická hmotnosť bola 1 050, 1 055 a > 1 050, v uvedenom poradí. Prírastok hmotnosti pokračoval aj po ukončení liečby Mutianom a nasadení mačacieho interferónu omega (obrázok 1), aj keď pomalšou rýchlosťou (v priemere 9g/deň namiesto 23g/deň).

Spolubývajúce mačky boli úspešne liečené Mutianom v dávke 4 mg/kg po dobu piatich dní, aby sa zabránilo vylučovaniu koronavírusu, a tým aj opakovanej infekcii zotaveného kocúra; trus všetkých piatich mačiek bol potvrdený ako negatívny pomocou RT-PCR (tabuľka 1).

3. Diskusia

Úspešnú liečbu FIP pomocou antivírusových liekov ako prvý publikoval Dr. Pedersen [4,9]. Majitelia mačiek môžu získať rôzne anti-FCoV lieky, vrátane Mutianu – orálnej formy adenozínového analógu cez internet. Takéto lieky však nie sú licencované pre veterinárne použitie, čo stavia ošetrujúcich veterinárnych lekárov pred dilemu: nemôžu takúto liečbu predpisovať ani dodávať, ale poskytnutím diagnostickej a bežnej podpornej liečby môžu pomôcť klientom, ktorí sa rozhodnú tieto lieky užívať. Užitočné je najmä stanovenie presnej diagnózy, ktorá zabráni liečbe asi 40% mačiek, u ktorých by inak bola chybne stanovená nesprávna diagnóza (údaje nie sú uvedené). Náš názor je, že vhodnejšie by bolo, keby majitelia mačiek používali takéto lieky pod náležitým veterinárnym dohľadom, aj keď sú tieto výrobky nelicencované. Účelom tejto prípadovej štúdie je podať správu o tom, čo sa nám osvedčilo pri monitorovaní prípadu neefuzívnej FIP liečenej liekom Mutian, po ktorom nasledoval mačací interferón.

Diagnostika neefuzívnej FIP je náročná, pretože príznaky sú rôznorodé a zoznam diferenciálnych diagnóz je často zdĺhavý. Dunbar a kol. 2019 [10], uviedli, že detekcia FCoV RNA z mezenteriálnej lymfatickej uzliny (MLN) FNA (Fine Needle Aspiration – Aspiračná biopsia tenkou ihlou) je z hľadiska diagnostiky FIP špecifická na 96%. Laboratórium nanešťastie spočiatku chybne urobilo test FCoV RT-PCR na vzorke krvi z 2. dňa, namiesto MLN FNA podľa požiadaviek – a test vyšiel negatívny. FCoV RT-PCR na krvných vzorkách nie je pri diagnostike FIP užitočná, pretože väčšina mačiek s FIP nie je v čase klinických prejavov viremická [11] a tiež preto, že asi 5% mačiek nemá pozitívny test FIP [12,13] pretože FCoV infikované mačky prechádzajú prechodnou virémiou [12,13,14,15]. FCoV RNA sa našla v mačacom MLN FNA a odhalila, že je pozitívna na mutáciu M1058L, čo bolo ďalším dôkazom podporujúcim diagnózu FIP [6,11]; aj keď substitúcia metionínom za leucín na pozícii 1058 v FCoV spike proteíne sa našla v 89% vzoriek tkaniva od 14 mačiek bez FIP, čo naznačuje, že mutácia skôr indikuje systémové šírenie FCoV z čreva, ako vírus s potenciálom spôsobiť FIP [16].

Napriek oneskoreniu spôsobenému laboratóriom pri potvrdení diagnózy FIP, sme iniciovali liečbu Mutianom na základe anamnézy, klinických príznakov, krvných výsledkov a zvýšeného AGP, o ktorom sa predtým preukázalo, že je veľmi špecifický pre odlíšenie FIP od od iných chorôb s podobnými prejavmi [17]. Nastal pocit naliehavosti zahájiť liečbu, pretože kocúrove stagingové skóre FIP bolo 6, čo naznačuje smrť do dvoch týždňov [18]. HCT kocura rýchlo klesal (z 25,7 na 22% za dva dni), čo sa ukázalo ako indikátor hroziacej blízkej smrti: Tsai a kol., (2011) [18] zistili, že hladiny HCT dramaticky klesajú 2 týždne pred smrťou a bilirubín sa zvyšuje jeden týždeň pred smrťou.

Anamnéza kocúra bola typická pre mnoho prípadov FIP: do domácnosti boli privedené dve nové jedenásťmesačné čistokrvné mačky, ktoré boli pravdepodobne zdrojom nedávnej infekcie koronavírusmi; kocúr bol vakcinovaný päť dní pred prepuknutím uveitídy. Privedenie nových mačiek aj očkovanie sú pre mačku stresujúce – je známe, že stres vyvoláva FIP u mačiek infikovaných FCoV [19] a Riemer a kol., (2016) [20] zistili, že očkovanie bolo podozrivým stresujúcim faktorom v 6,9 % prípadov FIP. Hmotnosť kocúra medzi privedením nových mačiek a očkovaním bohužiaľ nebola zaznamenávaná, takže nie je známe, či chudol už pri revakcinácii (tj. bola subklinicky chorá na FIP), alebo či sa chudnutie začalo neskôr. Tento prípad napriek tomu ilustruje, že očkovanie mačiek infikovaných FCoV môže predstavovať riziko pre rozvoj FIP, a že optimálne by sa očkovanie malo vykonať potom, čo mačka prestane vylučovať vírus, k čomu dôjde v priebehu niekoľkých mesiacov u väčšiny infekcií FCoV typu 1 [21 ].

Klinické príznaky týkajúce sa chudnutia, zlej chuti do jedla, hnačky a uveitídy boli tiež v súlade s diagnózou neefuzívnej FIP. FIP je hlavnou príčinou uveitídy u mladých mačiek – oftalmológovia z Veterinárnej školy v Severnej Karolíne diagnostikovali FIP u 19 zo 120 mačiek (15,8%) s uveitídou [22]. Uveitída bola hlásená u 17 z 59 (29%) mačiek s neefuzívnou FIP [23].

Aj keď liečba injekčným nukleozidovým analógom už bola pri liečbe FIP zdokumentovaná skôr [4], podľa našich poznatkov nebola perorálna liečba FIP analógom adenozínu predtým zaznamenaná, hoci bola použitá pri liečbe infekcie FCoV u asymptomatických alebo hnačujúcich mačiek [5]. Pacientovi bola podávaná dvojnásobná bežná liečebná dávka FIP (tj. 8 mg/kg oproti 4 mg/kg), aby sa potenciálne zvýšila koncentrácia liečiva v oku a vylúčil akýkoľvek vírus, ktorý by sa mohol nachádzať v mozgu, pretože iba 20% absorbovaného liečiva prechádza hematoencefalickou bariérou (T Xue, osobná komunikácia). Odozva na liečbu bola rýchla, dramatická a mimoriadne pozitívna. Aj keď sme sa v prípade možných vedľajších účinkov snažili čo najskôr znížiť dávku Mutianu, v praxi sa množstvo liekov významne nezmenilo, pretože mačka súčasne rýchlo priberala. Pedersen et al., (2019) [4] uviedli, že najjednoduchším indikátorom reakcie na liečbu je zvýšenie hmotnosti, ktoré bolo v tomto prípade ohromujúce, keďže kocúr pribral počas prvých 50 dní liečby 1,1 kg. Na rozdiel od toho schudol o 30g v priebehu týždňa na prednisolóne, pred začiatkom liečby Mutianom.

V dvoch štúdiách mačky s FIP liečené kortikosteroidmi mali strednú dobu prežitia 7,5 dňa [24] a 8 dní [25], čo je podstatne kratšie ako priemer 21 dní uvádzaný Tsai a kol., 2011 [18] (aj keď u tých dvoch štúdií je potrebné vziať do úvahy potenciálny nepriaznivý vplyv biopsií na prežitie a mnoho úmrtí bolo spôsobených sekundárnou bakteriálnou infekciou v dôsledku rozsiahlej imunosupresie vyvolanej kortikosteroidmi [25]). Okrem toho sa predtým zistilo, že liečba prednizolónom skracuje čas prežitia u mačiek s FIP, ktoré boli súčasne liečené polyprenylovým imunostimulantom [23]. Preto boli v našom prípade na liečbu uveitídy systémové kortikosteroidy nahradené lokálnymi kortikosteroidmi.

Nevieme, či to bol Mutian, systémové a lokálne steroidy, alebo kombinácia všetkých liečebných postupov, ktoré ovplyvnili celkové vyliečenie uveitídy. Majiteľ kocúra hlásil čiastočný návrat zraku v 6. deň, čo bol deň, keď začala liečba Mutianom, čo naznačuje, že za návrat zraku boli zodpovedné steroidy (tabuľka 3). Legendre a kol., (2017) [23] uviedli pokrok u 3 zo 17 mačiek s okulárnymi prejavmi FIP liečených polyprenylovým imunostimulantom (PI). Ich počiatočné príznaky zahŕňali prednú uveitídu (všetky tri mačky), zrazeniny keratického pôvodu (jedna mačka), zmenu farby dúhovky (jedna mačka) a anizokóriu (jedna mačka). U dvoch mačiek sa predná uveitída významne zlepšila alebo ustúpila po 2 mesiacoch liečby PI bez kortikosteroidov. U tretej mačky sa uveitída nezlepšila; mačka dostávala lokálne očné kortikosteroidy súčasne s PI a oči boli enukleované [23]. Či samotný Mutian môže alebo nemôže ovplyvňovať liečbu uveitídy spojenej s FIP bez súčasných lokálnych kortikosteroidov, sa ešte len ukáže. Zdá sa, že systémové kortikosteroidy majú v týchto prípadoch malý alebo žiadny význam.

Počas liečby liekom Mutian sa nepozorovali žiadne klinické vedľajšie účinky a biochemické parametre pečene a obličiek boli v referenčnom rozsahu s výnimkou plazmatického symetrického dimetylarginínu (SDMA), ktorý sa zvýšil (tabuľka 2). SDMA je skorým indikátorom ochorenia obličiek [26,27]. Existujú tri možné vysvetlenia zvýšeného SDMA: po prvé, môže to byť dôsledok lézií FIP v obličkách. Azotémia je pravdepodobnejšia pri neefuzívnej, ako efuzívnej FIP [20], ale pokiaľ vieme, nebola vykonaná žiadna štúdia, ktorá by zisťovala, či SDMA stúpa u mačiek s FIP – veterinárni patológovia predpokladajú, že prechodná FCoV infekcia obličiek môže byť príčinou intersticiálnej nefritídy pozorovanej u mnohých starších mačiek (W Jarrett a S Toth, osobná komunikácia). Po druhé, predispozícia k plemenu môže byť faktorom – zistilo sa, že birmské mačky vykazovali zvýšenú hladinu SDMA [28], ale neuskutočnila sa žiadna štúdia o hladinách SDMA u nórskych lesných mačiek a u kocúra hladina SDMA klesla na normálnu úroveň, čo naznačuje, že zvýšená hladina SDMA zrejme nemala súvislosť s jeho príslušnosťou k plemenu. Po tretie, zvýšený SDMA mohol byť vedľajším účinkom liečby Mutianom – SDMA sa znížil do siedmich dní po ukončení liečby Mutianom a vrátil sa do normálu do 35 dní po ukončení liečby Mutianom. Pretože sme ho však v priebehu choroby netestovali skôr, nevieme, či bol zvýšený pred nasadením Mutianu. Počas liečby boli kreatinín a močovina u kocúra vždy v normálnych medziach, aj keď bol pozorovaný progresívny nárast kreatinínu (tabuľka 2), ktorý bude v budúcnosti starostlivo sledovaný.

Pretože odporúčaná doba podávania GS-441524 bola 84 dní [4], majitelia mačiek používajúci iné antivirotiká liečili ich mačky s FIP rovnako dlho. Optimálne trvanie liečby FIP orálnym Mutianom nebolo stanovené. Tento prípad však ilustruje, že liečbu je možné ukončiť po oveľa kratšom cykle, pokiaľ sa laboratórne ukazovatele pre FIP vrátia do normálu. Veríme, že v našom prípade došlo k úplnému uzdraveniu už po 50 dňoch liečby z nasledujúcich dôvodov – uveitída ustúpila, kocúr sa zotavil z anémie, lymfopénia sa obrátila, došlo k zníženiu bilirubínu a k trvalému zníženiu AGP. Napriek tomu sme nechceli nechať kocúra úplne bez antivírusového krytia, takže bola nasadená orálna nízka dávka rFeIFN-omega, ako už bolo popísané [29]. Tento liek má antivírusové a imunomodulačné vlastnosti a pred nástupom špecifických antivirotík proti FCoV bol pri FIP spolu s meloxicamom voliteľnou liečbou [30]. Kocúr pokračoval v priberaní aj pri liečbe s rFeIFN-omega, aj keď pomalšie ako predtým, ustálil sa na 4,35 kg po 100. dňoch (obrázok 2) a pokračovalo zlepšovanie hematologických parametrov (tabuľka 2, obrázok 3).

Relaps FIP nenastal v tomto – ani v iných – prípadoch, ktorých liečbu sme sledovali. Náš úspech pripisujeme v prvom rade posúdeniu účinnosti antivirotika proti kmeňu FCoV u infikovenej mačky monitorovaním množstva vírusu vylučovaného do stolice (pomocou qRT-PCR), aby sme sa uistili, že vírusová záťaž sa znížila v reakcii na antivirotikum; po druhé, prevencii opätovnej infekcie mačky vyliečenej z FIP identifikáciou ďalších zdrojov vírusov v tej istej domácnosti a zastavením vylučovania FCoV pomocou Mutianu [5]; po tretie, krátkodobej liečbe dávkou, ktorá zabezpečila vylúčenie vírusu z mozgu; po štvrté, po liečbe nukleozidovým analógom (alebo inhibítorom proteázy) nasadením nízkej dávky perorálneho mačacieho interferónu, až kým sa titer protilátok FCoV neznížil – čo je indikátor toho, že v tele nezostáva žiadny koronavírus.

Skywise a jeho spolubývajúci sú nažive a v poriadku 6 mesiacov po diagnostikovaní.

4. Závery

Pokiaľ je nám známe, jedná sa o prvý publikovaný prípad vyliečenia mačky s neefuzívnou FIP s použitím orálneho analógu adenozínu, nasledovanom rekombinantným mačacím interferónom, a AGP použitého ako markera zotavenia z FIP. Na ochranu pečene a sledovanie hladín pečeňových enzýmov odporúčame spolu s Mutianom podávať doplnok SAMe. Úrovne SDMA v budúcich prípadoch po tomto liečebnom protokole FIP vyžadujú ďalšie skúmanie. Navrhujeme, aby boli systémové kortikosteroidy pri liečbe FIP kontraindikované pre iné ako paliatívne účely.

Poďakovanie

Chceme poďakovať recenzentom za čas, ktorý venovali dôkladnému preštudovaniu našej práce, a za ich užitočné pripomienky: Tabuľka 1 a Tabuľka 3 boli pridané vďaka ich pripomienkam.

Autorské príspevky

Konceptualizácia, D.D.A. a J.C.-R .; metodika, M.F., O.J. a D.D.A .; validácia, O.J., D.D.A., J.C.-R. a M.F .; formálna analýza, M.F. a D.D.A .; vyšetrovanie, M.F. a J.C.-R .; zdroje, J.C.-R. a M.F .; správa údajov, D.D.A., J.C.-R. a M.F .; písanie – príprava pôvodného návrhu, D.D.A .; písanie – recenzia a úpravy, O.J., D.D.A., J.C.-R. a M.F .; vizualizácia, D.D.A. a J.C.-R .; dohľad, D.D.A. a J.C.-R .; administrácia projektu, J.C.-R., M.F .; akvizícia financovania, J.C.-R. a D.D.A. Všetci autori si prečítali zverejnenú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.

Financovanie

Liečba mačky a laboratórne testy boli financované J.C.-R. D.D.A. Ďakujeme predplatiteľom www.catvirus.com za podporu počas tejto štúdie a sme veľmi vďační darcom Fondu Angelica za platbu publikačných poplatkov.

Literatúra

  1. Addie D.D., Toth S., Murray G.D., Jarrett O. The risk of feline infectious peritonitis in cats naturally infected with feline coronavirus. Am. J. Vet. Res. 1995;56:429–434. [PubMed] [Google Scholar]
  2. Kipar A., May H., Menger S., Weber M., Leukert W., Reinacher M. Morphologic features and development of granulomatous vasculitis in feline infectious peritonitis. Vet. Pathol. 2005;42:321–330. doi: 10.1354/vp.42-3-321. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  3. De Groot R.J., Baker S.C., Baric R., Enjuanes L., Gorbalenya A.E., Holmes K.V., Perlman S., Poon L., Rottier P.J.M., Talbot P.J., et al. Family Coronaviridae. In: Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J., editors. Ninth Report International Committee on Taxonomy of Viruses; King AMQ. Elsevier; Amsterdam, The Netherlands: 2012. pp. 806–828. [Google Scholar]
  4. Pedersen N.C., Perron M., Bannasch M., Montgomery E., Murakami E., Liepnieks M., Liu H. Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2019;21:271–281. doi: 10.1177/1098612X19825701. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  5. Addie D.D., Curran S., Bellini F., Crowe B., Sheehan E., Ukrainchuk L., Decaro N. Oral Mutian® X stopped faecal feline coronavirus shedding by naturally infected cats. Res. Vet. Sci. 2020;130:222–229. doi: 10.1016/j.rvsc.2020.02.012. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  6. Chang H.W., Egberink H.F., Halpin R., Spiro D.J., Rottier P.J. Spike protein fusion peptide and feline coronavirus virulence. Emerg. Infect. Dis. 2012;18:1089–1095. doi: 10.3201/eid1807.120143. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  7. Duthie S., Eckersall P.D., Addie D.D., Lawrence C.E., Jarrett O. Value of alpha1-acid glycoprotein in the diagnosis of feline infectious peritonitis. Vet. Rec. 1997;141:299–303. doi: 10.1136/vr.141.12.299. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  8. Shelly S.M., Scarlett-Kranz J., Blue J.T. Protein electrophoresis on effusions from cats as a diagnostic test for feline infectious peritonitis. J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 1988;24:495–500. [Google Scholar]
  9. Pedersen N.C., Kim Y., Liu H., Galasiti K.A.C., Eckstrand C., Groutas W.C., Bannasch M., Meadows J.M., Chang K.O. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2018;20:378–392. doi: 10.1177/1098612X17729626. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  10. Dunbar D., Kwok W., Graham E., Armitage A., Irvine R., Johnston P., McDonald M., Montgomery D., Nicolson L., Robertson E., et al. Diagnosis of non-effusive feline infectious peritonitis by reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction from mesenteric lymph node fine needle aspirates. J. Feline Med. Surg. 2019;21:910–921. doi: 10.1177/1098612X18809165. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  11. Felten S., Leutenegger C.M., Balzer H.J., Pantchev N., Matiasek K., Wess G., Egberink H., Hartmann K. Sensitivity and specificity of a real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction detecting feline coronavirus mutations in effusion and serum/plasma of cats to diagnose feline infectious peritonitis. BMC Vet. Res. 2017;13:228. doi: 10.1186/s12917-017-1147-8. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  12. Fish E.J., Diniz P.P.V., Juan Y.C., Bossong F., Collisson E.W., Drechsler Y., Kaltenboeck B. Cross-sectional quantitative RT-PCR study of feline coronavirus viremia and replication in peripheral blood of healthy shelter cats in Southern California. J. Feline Med. Surg. 2018;20:295–301. doi: 10.1177/1098612X17705227. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  13. Simons F.A., Vennema H., Rofina J.E., Pol J.M., Horzinek M.C., Rottier P.J., Egberink H.F. A mRNA PCR for the diagnosis of feline infectious peritonitis. J. Virol. Methods. 2005;124:111–116. doi: 10.1016/j.jviromet.2004.11.012. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  14. Herrewegh A.A.P.M., de Groot R.J., Cepica A., Egberink H.F., Horzinek M.C., Rottier P.J.M. Detection of feline coronavirus RNA in feces, tissue, and body fluids of naturally infected cats by reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 1995;33:684–689. doi: 10.1128/JCM.33.3.684-689.1995. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  15. Tasker S. Diagnosis of feline infectious peritonitis: Update on evidence supporting available tests. J. Feline Med. Surg. 2018;20:228–243. doi: 10.1177/1098612X18758592. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  16. Porter E., Tasker S., Day M.J., Harley R., Kipar A., Siddell S.G., Helps C.R. Amino acid changes in the spike protein of feline coronavirus correlate with systemic spread of virus from the intestine and not with feline infectious peritonitis. Vet. Res. 2014;45:49. doi: 10.1186/1297-9716-45-49. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  17. Giori L., Giordano A., Giudice C., Grieco V., Paltrinieri S. Performances of different diagnostic tests for feline infectious peritonitis in challenging clinical cases. J. Small Anim. Pract. 2011;52:152–157. doi: 10.1111/j.1748-5827.2011.01042.x. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  18. Tsai H.Y., Chueh L.L., Lin C.N., Su B.L. Clinicopathological findings and disease staging of feline infectious peritonitis: 51 cases from 2003 to 2009 in Taiwan. J. Feline Med. Surg. 2011;13:74–80. doi: 10.1016/j.jfms.2010.09.014. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  19. Rohrer C., Suter P.F., Lutz H. The diagnosis of feline infectious peritonitis (FIP): A retrospective and prospective study. Kleinterpraxis. 1993;38:379–389. [Google Scholar]
  20. Riemer F., Kuehner K.A., Ritz S., Sauter-Louis C., Hartmann K. Clinical and laboratory features of cats with feline infectious peritonitis–A retrospective study of 231 confirmed cases (2000–2010) J. Feline Med. Surg. 2016;18:348–356. doi: 10.1177/1098612X15586209. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  21. Addie D.D., Jarrett J.O. Use of a reverse-transcriptase polymerase chain reaction for monitoring feline coronavirus shedding by healthy cats. Vet. Rec. 2001;148:649–653. doi: 10.1136/vr.148.21.649. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  22. Jinks M.R., English R.V., Gilger B.C. Causes of endogenous uveitis in cats presented to referral clinics in North Carolina. Vet. Ophthalmol. 2016;19(Suppl. S1):30–37. doi: 10.1111/vop.12324. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  23. Legendre A.M., Kuritz T., Galyon G., Baylor V.M., Heidel R.E. Polyprenyl Immunostimulant Treatment of Cats with Presumptive Non-Effusive Feline Infectious Peritonitis in a Field Study. Front. Vet. Sci. 2017;4:7. doi: 10.3389/fvets.2017.00007. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  24. Fischer Y., Ritz S., Weber K., Sauter-Louis C., Hartmann K. Randomized, placebo controlled study of the effect of propentofylline on survival time and quality of life of cats with feline infectious peritonitis. J. Vet. Intern. Med. 2011;25:1270–1276. doi: 10.1111/j.1939-1676.2011.00806.x. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  25. Ritz S., Egberink H., Hartmann K. Effect of feline interferon-omega on the survival time and quality of life of cats with feline infectious peritonitis. J. Vet. Intern. Med. 2007;21:1193–1197. doi: 10.1111/j.1939-1676.2007.tb01937.x. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  26. Jepson R.E., Syme H.M., Vallance C., Elliott J. Plasma asymmetric dimethylarginine, symmetric dimethylarginine, l-arginine, and nitrite/nitrate concentrations in cats with chronic kidney disease and hypertension. J. Vet. Intern. Med. 2008;22:317–324. doi: 10.1111/j.1939-1676.2008.0075.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  27. Relford R., Robertson J., Clements C. Symmetric Dimethylarginine: Improving the Diagnosis and Staging of Chronic Kidney Disease in Small Animals. Vet. Clin. N. Am. Small Anim. Pract. 2016;46:941–960. doi: 10.1016/j.cvsm.2016.06.010. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  28. Paltrinieri S., Giraldi M., Prolo A., Scarpa P., Piseddu E., Beccati M., Graziani B., Bo S. Serum symmetric dimethylarginine and creatinine in Birman cats compared with cats of other breeds. J. Feline Med. Surg. 2018;20:905–912. doi: 10.1177/1098612X17734066. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  29. Gil S., Leal R.O., McGahie D., Sepúlveda N., Duarte A., Niza M.M., Tavares L. Oral Recombinant Feline Interferon-Omega as an alternative immune modulation therapy in FIV positive cats, clinical and laboratory evaluation. Res. Vet. Sci. 2014;96:79–85. doi: 10.1016/j.rvsc.2013.11.007. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  30. Addie D. Feline coronavirus infections. In: Green C., editor. Infectious Diseases of the Dog and Cat. Elsevier; Maryland Heights, MO, USA: 2012. pp. 92–108. [Google Scholar]
sk_SKSK
en_GBEN sk_SKSK