Autor L. M.

Publikované

Štyri dekády Save Our Cats and Kittens a čo bude ďalej

Niels C. Pedersen, DVM, PhD
December 2021
Pôvodný článok: The history of Save Our Cats and Kittens over four decades and where we go from here

Niels C. Pedersen

Tí, ktorí sledujú moju kariéru, vedia, že okrem infekčných chorôb mačiek mám mnoho ďalších záujmov. Najviac ma však preslávila medicína mačiek a choroby, ktoré trápia prostredia s mnohopočetnými mačkami. Tento záujem o infekčné choroby sa začal v roku 1965 ako u študenta druhého ročníka veterinárnej medicíny, ale rozvinul sa po mojom nástupe na fakultu veterinárnej medicíny Kalifornskej univerzity v Davise v roku 1972. Mojím prvým zadaním bolo pomôcť vyhrať vojnu prezidenta Nixona proti rakovine. Táto vojna kládla dôraz na potenciálne vírusové príčiny rakoviny, najmä na retrovírusy a ľudské leukémie. To bol môj vstup späť do sveta vírusu leukémie mačiek (FeLV). Samozrejme, môj záujem sa sústredil viac na infekciu FeLV, ktorá sa týkala mačiek, než na akékoľvek uplatnenie v prípade rakoviny u ľudí. Rýchlo sa ukázalo, že infekcia FeLV je závažnou panzootickou (pandemickou) chorobou mačiek, ktorá sa v predchádzajúcich desaťročiach nebadane rozšírila z divokých na domáce mačky a v 60. a 70. rokoch 20. storočia bola zodpovedná za jednu tretinu úmrtnosti mačiek. Milovníci mačiek sa po objavení vírusu rýchlo zmobilizovali a začali zbierať peniaze na podporu výskumu FeLV. Pôvodnú organizáciu SOCK (Save Our Cats and Kittens – Zachráňte naše mačky a mačiatka) vytvorila skupina úžasných milovníkov mačiek pod vedením Vincea, Connie a Dorothy Campanileových a ich priateľov. SOCK it to leukemia sa stal mobilizujúcim pokrikom skupiny a ja som mal tú česť spojiť s nimi sily od ich začiatku až do konca. Dary od milovníkov mačiek bez podpory federálnych výskumných fondov umožnili väčšinu nášho výskumu infekcie FeLV na Kalifornskej univerzite v Davise. Tento výskum viedol k pochopeniu toho, ako sa FeLV stala pandémiou domácich mačiek, ako spôsobuje širokú škálu ochorení a ako by sa dala kontrolovať. FeLV infekcia domácich mačiek sa dostala pod kontrolu v 70. a 80. rokoch 20. storočia vďaka rýchlym diagnostickým testom a očkovaniu. Zvládnutie infekcie FeLV bolo jedným z vrcholov veterinárneho výskumu tohto obdobia a možno jedným z najdôležitejších prínosov modernej medicíny mačiek v 20. storočí. SOCK it to leukemia sa nakoniec vypracovala na organizáciu s viac ako 1 miliónom dolárov získaných na konečné zdolanie infekcie FeLV. Infekcia FeLV stále existuje v prírode, kde zostáva problémom pre malý počet mladých mačiek prichádzajúcich do náhradných/záchranných zariadení a útulkov z terénu.

V tom istom čase sa objavila ďalšia veľmi smrteľná choroba. V roku 1963 veterinári z nemocnice Angell Memorial Animal Hospital v Bostone prvýkrát zaznamenali mačací infekčný zápal pobrušnice (FIP). Neskôr sa zistilo, že úzko súvisí s infekciou FeLV, a dúfalo sa, že s kontrolou FeLV do veľkej miery vymizne. To sa nepotvrdilo a FIP čoskoro nahradila FeLV ako hlavnú infekčnú príčinu úmrtí mačiek. V dôsledku toho došlo k predaniu pochodne „SOCK it to leukemia“ k „SOCK it to FIP“. To bol aj prirodzený vývoj môjho výskumu. FIP bola mojou prvou „láskou“ od čias, keď som ako študent veterinárnej medicíny v roku 1965 pomáhal skúmať prvé prípady FIP na Kalifornskej univerzite v Davise. Môj záujem o FIP sa na krátky čas dostal na druhú koľaj v 80. rokoch 20. storočia, keď som sa venoval HIV/AIDS a následne som objavil vírus imunodeficiencie mačiek (FIV). FIP sa stala hlavným predmetom môjho výskumu počas posledných troch desaťročí.

Som rád, že som mal v týchto rokoch podporu SOCK FIP. Jedným z našich najväčších objavov na Kalifornskej univerzite v Davise bolo, ako neškodný a všadeprítomný mačací enterický koronavírus (FECV) nakoniec spôsobí také smrteľné ochorenie, akým je FIP. Naša teória, že vírus FIP vznikol vnútornou mutáciou vírusu FECV, sa najprv stretla s veľkým skepticizmom, ale teraz je všeobecne prijímaná. Teória vnútornej mutácie viedla k oveľa lepšiemu pochopeniu podmienok, za ktorých sa FIP vyskytuje, a spôsobu, akým vírus FIP vyvoláva ochorenie. Žiaľ, nikomu, vrátane nás, sa nepodarilo nájsť úspešnú vakcínu proti FIP. Tento neúspech viedol k môjmu záujmu o liečenie, a nie o prevenciu FIP pomocou moderných antivirotík, s ktorými som sa zoznámil počas pandémie HIV/AIDS. Vrcholom mojich takmer 50-ročných skúseností s FIP bol objav dvoch antivirotík, ktoré boli schopné vyliečiť FIP. Tisíce mačiek z celého sveta sa za posledné 3 roky vyliečili z FIP pomocou antivírusových liekov, ktoré boli skúmané na UC Davis. Naše objavy na UC Davis by neboli možné bez významnej dlhodobej finančnej a morálnej podpory SOCK FIP a majiteľov mačiek, ktorí nás finančne podporili.

Objavenie lieku na FIP opäť vedie k logickému ukončeniu SOCK FIP, rovnako ako víťazstvo nad infekciou FeLV ukončilo potrebu pôvodného SOCK. Hoci som na dôchodku, naďalej spolupracujem s majiteľmi mačiek a opatrovateľmi na tom, ako používať antivirotiká na liečbu FIP, a budem naďalej spolupracovať so SOCK FIP ako konzultant pre liečbu FIP a doživotný člen. Treba priznať, že v oblasti FIP je stále čo skúmať, hlavne v oblasti prevencie ochorenia. Dúfam, že sa tejto a ďalších oblastí výskumu FIP ujmú aj iní. Otázkou teraz je, ako môže SOCK čo najlepšie zlepšiť zdravie našich mačiek a mačiatok. SOCK FIP je v procese vyhodnocovania širšieho poslania ako len FIP. Toto poslanie môže, ale nemusí zahŕňať získavanie finančných prostriedkov na výskum a mohlo by mať viac informačný charakter. Uvítame návrhy, ako by sa dlhá história SOCK-u dala využiť na zlepšenie zdravia našich mačiek a mačiatok.

Publikované

Dve očkovacie platformy na prevenciu ochorenia spôsobeného mačacím koronavírusom

Pôvodný článok: Two Vaccine Platforms to Prevent Feline Coronavirus Disease

Vedúci projektu: Hector Aguilar-Carreno

Department of Microbiology and Immunology
Email: ha363@cornell.edu
Sponzor: Cornell Feline Health Center Research Grants Program
Názov: Two Vaccine Platforms to Prevent Feline Coronavirus Disease
Rozpočet projektu: $69,920
Trvanie projektu: Júl 2021 – Jún 2022

Popis (poskytnutý žiadateľom): 

Zatiaľ čo u väčšiny mačiek infikovaných mačacím koronavírusom (FCoV) sa vyvinie mierne až nevýrazné hnačkové ochorenie, u časti z nich sa vyvinie ničivá a smrteľná mačacia infekčná peritonitída (FIP). FCoV sa môže šíriť fekálno-orálnou alebo respiračnou cestou, najmä v prostredí mačacích útulkov. Koronavírusy majú tri obalové glykoproteíny, S, E a M, ale povrchový proteín (S) je zodpovedný za vstup vírusu. S proteín sa viaže na povrchový receptor bunky a vedie k spojeniu vírusovej membrány s plazmatickou alebo endozomálnou membránou bunky, čo umožnuje vstup vírusu do bunky. S proteín tiež spôsobuje fúziu buniek (syncytózu) po infekcii. Proteín S väčšiny koronavírusov je tiež vysoko imunogénny. Ničivé ochorenie FIP si vyžaduje vývoj ochranných vakcín. Identifikovali sme malú molekulu XM-01, ktorá sa usadzuje vo vírusových membránach a inhibuje fúziu membrán. Dôležité je, že táto nová metóda inhibície spôsobuje, že virióny nie sú infekčné, pričom sa zachováva prirodzená konformácia povrchových glykoproteínov, čo je ideálne na vyvolanie účinnej imunitnej odpovede proti takýmto vírusovým glykoproteínom. Je pozoruhodné, že očkovanie chrípkovými viriónmi ošetrenými XM-01 prinieslo zvýšenie neutralizačných protilátok a miery prežitia a zníženie chorobnosti a úmrtnosti pri vírusovej záťaži na modeli myší v porovnaní s tradičnou formalínom inaktivovanou chrípkovou vakcínou. Naším cieľom 1 bude teda určiť, či sa XM-01 môže použiť na vývoj inaktivovanej vakcíny proti FeCoV. Dôležité je, že naše nedávne predbežné údaje obsahujú už stanovené podmienky pre úplnú inaktiváciu FCoV. Budeme optimalizovať inaktiváciu FCoV pomocou XM-01 aby sme zistili, či táto vakcína môže viesť k ráznej imunitnej odpovedi proti FCoV. Okrem toho naše laboratórium úspešne použilo replikačne nekompetentné pseudotypizované virióny vírusu vezikulárnej stomatitídy (VSV) na očkovanie a ochranu škrečkov proti ochoreniam spôsobeným vírusmi Nipah, Hendra a Ebola so 100 % bezpečnosťou a 100 % účinnosťou (rukopis v konečnej revízii pre Nature Publishing Journals Vaccines). V rámci nášho cieľa 2 sa použije replikačne nekompetentný systém VSV na vývoj vakcíny proti FCoV. Budeme optimalizovať inkorporáciu FCoV-S do viriónov VSV aby sme zistili, či táto vakcína môže vyvolať dostatočnú imunitnú odpoveď proti tomuto vírusu. Keďže vakcinačné platformy s inaktivovanými aj replikačne nekompetentnými viriónmi boli úspešne použité na prevenciu iných vírusových ochorení, dokončenie našich Cieľov umožní našim vakcinačným platformám ľahko postúpiť do klinických skúšok/licencovania vakcinácie.

Publikované

Propuknutí infekční peritonitidy koček v útulku na Taiwanu: epidemiologický a molekulární důkaz horizontálního přenosu kočičího koronaviru nového typu II

Ying-Ting Wang,1 Bi-Ling Su,2 Li-En Hsieh,1 a Ling-Ling Chueh1
Pôvodný článok: An outbreak of feline infectious peritonitis in a Taiwanese shelter: epidemiologic and molecular evidence for horizontal transmission of a novel type II feline coronavirus
Český preklad čiastočne prevzatý z : Výsledky Potvrzení propuknutí FIP v útulku koček – Sevaron
13.7.2013

Abstrakt

Infekční peritonitida koček (FIP) je fatální onemocnění, způsobené infekcí kočičího koranaviru (FCoV). FCoV je možné rozdělit na sérotypy I a II. Tvrdí se, že virus, který způsobuje FIP (FIPV), se vyskytuje sporadicky a nešíří se často z jedné kočky na druhou. Nedávno bylo potvrzeno propuknutí onemocnění na Taiwanu z jednoho zvířecího útulku. Byl analyzován FCoV ze všech koček v tomto útulku, aby se stanovila epidemiologie tohoto propuknutí. Bylo identifikováno třináct ze 46 (28,2%) koček s typickými příznaky FIP. Z nich byla FIP u sedmi koček potvrzena nekropsií nebo histopatologickým vyšetřením. I přes skutečnost, že v tomto prostředí s větším množstvím koček byl identifikován vice jak jeden FCoV, u osmi koček s příznaky FIP bylo spolehlivě zjištěno, že jsou infikovány FCoV typu II. Sekvenční analýza odhalila, že FIPV typu II, nalezený ze vzorků kočičího trusu, tělesných výpotků a homogenátu granulomatózní tkáně od koček, které podlehly FIP, obsahoval ve všech případech identickou rekombinaci v jejich S genu. U dvou koček, které podlehly FIP, bylo zjištěno, že mají identickou nesmyslnou mutaci v 3c genu. Vylučování viru tohoto typu II v trusu u efuzivní formy FIP je možné zjistit až šest dní před uhynutím zvířete. Obecně vzato, naše údaje prokazují, že horizontální přenos FIPV je možný a že FIP kočky mohou představovat potenciální riziko pro ostatní kočky, žijící v tomtéž prostředí.

Úvod

Infekční peritonitida koček (FIP) je fatální onemocnění koček, způsobené infekcí kočičího koranaviru (FCoV). FCoV je obalený RNA virus, který patří do druhu Alphacoronavirus, čeledi Coronaviridae a do řádu Nidovirales. Velikost genomu FCoV činí přibližně 28,9 kb, včetně nestrukturního replikačního genu; čtyř strukturních genů, které kódují spike (S), obálku, membránu a nukleokapsidní proteiny; a pěti pomocných /nestrukturních genů 3abc a 7ab[1].

Kočičí koronaviry způsobují mírné, málo zjevné a přechodné infekce střev a jsou všudypřítomné mezi populací koček na celém světě [2]. Vyskytují se ve dvou sérotypech, I a II [3]. Typ I FCoV zde převažuje, kdežto virus typu II představuje jen 2-30% infekcí [4–8]. Po nahromadění genetických důkazů je zjevné, že  FCoV typu II vznikl dvěma homologními rekombinacemi mezi FCoV typu I a psího koronaviru CoV (CCoV) [9,10]. Oba sérotypy mohou zmutovat v hostiteli, dojde k makrofágnímu tropismu a ke vzniku systemického onemocnění, které nazýváme infekční peritonitidou koček [2,11,12]. Vzhledem ke slabému vylučování viru ve studiích FIP u koček jsou mutantní FIP viry (FIP vyvolávající FCoV, FIPV) podle všeho obsaženy pouze v nemocných tkáních a nejsou za přirozených podmínek přenášeny při kontaktu z kočky na kočku [2,11,13,14].

V tomto článku podáváme zprávu o epizootické FIP v jednom útulku na Taiwanu, která byla způsobena novým typem II FCoV. Epidemiologické a molekulární vyšetření izolátů z různých zdravých i nemocných koček z tohoto útulku velmi silně naznačuje, že tento virus byl vnesen přesunutím koťat z jiného útulku s následným horizontálním rozšířením na dospělé kočky, se kterými nová koťata sdílela útulek.

Materiály a metody

Zvířata a sběr vzorků

Do této studie, která probíhala od září 2011 do srpna 2012, bylo zařazeno celkem 46 koček ze soukromého útulku.V tomto útulku jsou umístěny dospělé kočky a čas od času i pár koťat.   Všechny kočky byly buď zatoulané anebo byly zachráněny a některé z nich byly získány z domů různých soukromých záchranářských stanic, kde byly zachráněné kočky dočasně umístěny. Před propuknutím tohoto onemocnění žily všechny kočky společně ve vnitřním prostředí bez klecí, dělily se o potravu, pití a o toalety. Některé kočky byly sourozenci, jiné s nimi spřízněné nebyly (Tabulka 1).

Tabulka 1
Informace o všech kočkách z tohoto útulku, u kterých bylo podezření na FIP a u kterých bylo toto onemocnění potvrzeno

KočkaVěk 1 Datum přijetí do útulku Datum nástupu horečky Datum úmrtí Klinické nálezy Nekroptické nálezy Efuzivní/neefuzivní
13m16. června 201117. srpna 201101. září 2011Horečka, anorexie, ascites, neurologické příznaky  
2a4m06. srpna 2011NA 221. září 2011Klinické příznaky nejsou k dispozici  
3b3m11. července 201118. srpna 201125. září 2011Horečka, anorexie, úbytek hmotnosti, neurologické příznaky  
42.5mJun. 08, 201116. srpna 201128. září 2011Horečka, ascites, neurologické příznaky  
5a4m06. srpna 201115. srpna 201120. října 2011Horečka, pleurální výpotek, průjem  
67m24. dubna 2011NA22. října 2011Anorexie, úbytek hmotnosti, neurologické příznaky  
73y6mRezidentNA27. října 2011 Ascites, žloutenka, granulomatózní léze v ledvině, fibrinózní peritonitidaEfuzivní
86m11. července 2011NA14. prosince 2011 Granulomatózní změny v ledvinách, játrech, plicích, mozku a očích Neefuzivní
92yRezidentNA28. prosince 2011 Ascites, pleurální výpotek a perikardiální výpotek, granulomatózní změny v ledvinách, játrech a střevě.Efuzivní/neefuzivní
10 b3m11. července 2011NA05. listopadu 2011 Granulomatózní změny v ledvinách, játrech a omentu Neefuzivní
11 c1y6mRezidentNA14. února 2012 Ascites a pleurální výpotek, žloutenka, fibrinózní peritonitida, granulomatózní změny v ledvinách, játrech, plicích a slezině.Efuzivní/neefuzivní
12 c1y6mRezidentNA19. března 2012 Žloutenka, fibrinózní peritonitida, granulomatózní změny hrudní a břišní stěny, ledvin, jater, plic, sleziny omenta a očí.Efuzivní/neefuzivní
131y7mRezidentNA13. dubna 2012 Žloutenka, zvětšení jater a mezenterických lymfatických uzlin, granulomatózní změny v ledvinách a plicích.Neefuzivní

1 Věk koček v době, kdy se objevily klinické příznaky FIP.
2 Není k dispozici. 
a, b, c : sourozenci.

Od všech asymptomatických koček byl minimálně jednou odebrán trus nebo rektální vzorky pro sledování výskytu FCoV. Od koček, které již vykazovaly příznaky onemocnění anebo u nichž bylo podezření na FIP, se standardně odebíraly tělesné výpotky, vzorky krve, vzorky výtěrů, včetně rektálních, nazálních, orálních a konjunktiválních. Kromě podpůrné péče byly kočky s podezřením na FIP léčeny prednisolonem (Prelon®, YF Chemical Corp., New Taipei City, Taiwan), benazeprilem (Cibacen®, Novartis, Barbera del Valles, Španělsko) a rekombinačním lidským interferonem alfa (Roferon®-A, Roche, Basilej, Švýcarsko). Kočky, které podlehly nemoci, byly podrobeny nekropsii za účelem patologického potvrzení. Při nekropsii byly nejprve jehlou a injekční stříkačkou odebrány tělesné výpotky, pak následovaly stěry, odběr krve, moči a granulomatózních lézí na vnitřních orgánech. Všechny vzorky byly zmraženy při -20 °C až do okamžiku použití. Všechny vzorky byly vyšetřeny na FCoV polymerázovou řetězovou reakcí nested s reverzní transkripcí (RT-nPCR) [15]. Vzorky s pozitivními výsledky byly následně podrobeny další analýze.

Příprava vzorků a reverzní transkripce

Vzorky stěrů byly suspendovány v 1 ml vody, ošetřené 0,1% diethyl pyrokarbonátem (DEPC). Vzorky trusu byly suspendovány s 9x upravenou vodou 0,1% DEPC vortexováním. Suspenze byla centrifugována a supernatant byl přenesen do nové zkumavky. Cca 0,5 g tkání bylo zmraženo a potom rozdrceno paličkou v hmoždíři za přítomnosti 2 ml Trizolu [16]. Celková RNA byla extrahována ze 300 μl suspenze stěru, celé krve, suspenze trusu, homogenátu tkáně a tělesného výpotku pomocí Trizolu. Dvacet jedna mikrolitrů izolované RNA bylo podrobeno reverzní transkripci se specifickým primerem N1 (5′-gctacaattgtatcctcaac-3′) nebo P211 [15] s reverzní transkripcí Moloneyho virusu myší leukémie (Invitrogen, CA, USA). Reakce byla inkubovaná při 37°C po dobu 60 min, při 72°C po dobu 15 min a nakonec při 94°C po dobu 5 minut.

Určení typu FCoV pomocí nested PCR

Pro stanovení typu FCoV byla provedena nested PCR v souladu s postupy, uváděnými Addie a kol. [5] s mírnou modifikací. Po reverzní transkripci bylo přidáno 5 μl komplementární DNA k 25 μl směsi PCR (Invitrogen, CA, USA), a to podle pokynů výrobce pro následující sady primerů: S1 a Iffs pro určení FCoV typu I a S1 a Icfs pro určení FCoV typu II. Nested PCR byl provedena na 2 μl prvního PCR produktu pomocí nested primerů. Očekávaná velikost druhé PCR, dosažená pro typ I a pro typ II FCoV činila 360 a 218 bp. Produkty RT-nPCR byly podrobeny elektroforéze a potom byly cílové fragmenty DNA čištěny (Geneaid Biotech, Ltd, Taipei) a sekvenovány (Mission Biotech, Taipei, Taiwan) – z obou orientací.

Amplifikace, sekvenování a analýza genu 3a a 3c  z FCoV typu II

Pro amplifikaci 3a genu FCoV typu II z FIP koček byla navržena sada specifických primerů, které je schopna amplifikovat z S genu typu II na gen 3a. Komplementární DNA, amplifikovaná sadou primerů, zaměřila 3′ konec S genu (Icfs) FCoV typu II a 5′ konec 3a genu FCoVe (3aR2: 5′-caccaaaacctatacacacaag-3′). Teplotní cyklus byl následující: 5 minut předehřátí při 94°C; 35 cyklů denaturace při 94°C po dobu 20 s, žíhání při 50°C po dobu 20 a prodloužení při 72°C po dobu 30 s; a konečné prodloužení při 72°C po dobu 5 minut. Následovala druhé série amplifikace pomocí primerů nIcfs a 3aR2; očekávaná velikost produktu činila cca 600 bp. Amplikony byly podrobeny elektroforéze, čištěny a sekvenovány z obou orientací, aby se potvrdily nukleotidové sekvence.

Pro amplifikaci 3c genu FCoV typu II z FIP koček byla navržena sada specifických primerů, které je schopna amplifikovat z S genu typu II na gen 3c. Komplementární DNA byla amplifikovaná forward primerem (Icfs) a reverzním primerem (E68R: 5′-aatatcaatataattatctgctgga-3′ případně N21R: 5′-gttcatctccccagttgacg-3′). Teplotní cyklus byl následující: 5 minut předehřátí při 94°C; 40 cyklů denaturace při 94°C po dobu 30 s, žíhání při 46°C po dobu 30 s a prodloužení při 72°C po dobu 90 s; a konečné prodloužení při 72°C po dobu 7 minut. Následovala druhé série amplifikace pomocí primerů nIcfs a E68R, produkty byly podrobeny elektroforéze, čištěny a sekvenovány z obou orientací, aby se potvrdily nukleotidové sekvence.

Fylogenetická analýza a rekombinační analýza FCoV typu II

Bylo provedeno několik sekvenčních vyrovnání pomocí ClustalW 2.0 s ruční editací v EditSeq (DNASTAR, Madison, USA). Byly provedeny fylogenetické analýzy pomocí MegAlign, verze 7.2.1 (DNASTAR, Madison, USA). Byly sestaveny bootscan a podobné grafy s využitím software SimPlot 3.5.1 (SCRoftware, Baltimore, USA).

Výsledky

Potvrzení propuknutí FIP v útulku koček

Útulek funguje tři a půl roku. Před srpnem 2011 neexistují žádné záznamy o výskytu FIP. Koťata (kočky 1, 3, 4, 8 a 10) byly přesunuty do tohoto útulku v období mezi červnem a červencem 2011. Po přivezení si tato koťata společně hrála a bydlela společně s dospělými kočkami, které tu žily již dříve. Před vypuknutím nemoci byla koťata jednotlivě brána k veterináři za účelem vakcinace a návštěv s cílem adopce. Horečka byla poprvé zjištěna u čtyř koťat (kočky 1, 3, 4, 5) během několika dní (od 15. do 18. srpna) (Tabulka 1). Klinické příznaky, např. horečka, anorexie, neurologické příznaky, těžké oddechování a rozšíření břicha bylo pozorováno během následujících dvou měsíců a koťata postupně uhynula v rozmezí od 1. září do 22. října (Tabulka 1). Pečovatelé z útulku požádali o naši pomoc 27. září. Všechny kočky, dlouhodobě umístěné v útulku, byly okamžitě vyšetřeny na FCoV pomocí metody RT-nPCR. Všechny FCoV pozitivní kočky byly izolovány a drženy odděleně.Přesto počínaje zářím se u dospělých koček s FIP (kočky 7-13) objevily klinické příznaky obdobné jako u koťat a všechny tyto kočky později uhynuly.

U šesti koťat (kočky 1-6) s tělesnými výpotky případně neurologickými příznaky, které podlehly v prvních dvou měsících, nebylo provedeno potvrzení nekropsií (Tabulka 1). Kočka 1 byla jednou přivezena do naší fakultní nemocnice a byl u ní odebrán ascites (volná tekutina v dutině břišní). U koček 7-13 byly zjištěny typické příznaky, konkrétně ascites nebo pleurální výpotky v dutině těla (efuzivní FIP) a granulomatózní léze v některých orgánech, zejména v ledvinách, jádrech, plicích, omentum (předstěra) a očích (neefuzivní FIP). U koček 9, 11 a 12 byla při nekropsii prokázána smíšená forma nemoci (Tabulka 1).

Celkem 13 ze 46 koček (28,3%) zemřelo v období od září 2011 do dubna 2012 na FIP. V této době 33 koček (71,7%) vypadalo, že jsou klinicky zdravé a 26 z těchto asymptomatických koček (78,7%) bylo pozitivních minimálně jednou na FCoV – zjištěno z trusu pomocí metody RT-nPCR. Ostatních sedm z těchto asymptomatických koček bylo negativních při zjišťování výskytu FCoV (Tabulka 2).

Tabulka 2
Zjištění výskytu a typu FCoV ze vzorků trusu u zdravých koček z téhož útulku

Kočka
FCoV
Typ
Oct. 2011Feb. 2012Jun. 2012 Jul. 2012
14+++++++netypizovatelný
15–+– netypizovatelný
16++–– netypizovatelný
17+++++++I
18++++++++I
19– –+netypizovatelný
20– –+netypizovatelný
21– –– 
22++++– netypizovatelný
23+++–+I
24–+– netypizovatelný
25++++++I
26– +–netypizovatelný
27++++++I
28+++++++I
29– –– 
30–++++–I
31–  – 
32+++––I
33– ++–netypizovatelný
34++   I
35– ++netypizovatelný
36+++++–I
37  –  
38  + netypizovatelný
39 ++++I
40 –+–netypizovatelný
41 +–+netypizovatelný
42  +–netypizovatelný
43  –  
44   – 
45   – 
46  + netypizovatelný

++: FCoV detekován v prvním kole PCR.
+: FCoV detekován pouze v nested PCR.

FIPV typu II byl zjištěn u všech koček, které podlehly FIP

Aby bylo možné dále prošetřit vztah mezi těmito sedmi histopatologicky potvrzenými FIP kočkami, byla amplifikovaná DNA typována, sekvenována a analyzována. FIPV typu II byl zjištěn u všech osmi zvířat, které podlehly FIP, a to ze stěrů, trusu, moči, tělesných výpotků, cerebrospinální tekutiny a homogenátů tkání (Tabulka 3). Viry typu II, které způsobují FIP, byly nalezeny  nejen v nemocné tkáni, ale také ve vzorcích trusu (kočky 7, 11, 12 a 13), ve vzorcích nazálního/orálního/konjunktiválního stěru (kočky 7, 8, 9, 11 a 12) a v moči, odebrané cystocentézou (kočka 11) (Tabulka 3). I když nebyla provedena nekropsie, ascites od kočky 1 – první kočka, která v útulku zemřela na FIP, byly k dispozici pro analýzu.U této kočky bylo potvrzeno, že byla infikována virem typu II. U zdravých zvířat byl ze vzorků trusu zjištěn pouze typ I anebo FCoV bez určení typu (Tabulka 2). Kočky 8, 9 a 13 byly infikovány oběma typy FCoV (Tabulka 3). I když bylo zjištěno, že v tomto prostředí s mnoha kočkami se vyskytuje více jak jeden typ FCoV, tj. typ I, II nebo viry bez určení typu, u všech osmi FIP koček byla nalezena infekce FCoV typu II, kdežto u zdravých zvířat tomu tak nebylo (Tabulky 2 a​ 33).

Tabulka 3
Charakteristika 3c genů FCoV získaných z různých vzorků FIP koček

KočkaGenotyp FCoVS místo genového kříženíIntegrita 3c genub
NOCR/FUA/PCSFLiLuKiBrSpIntR/FA/PLiLuKiBrSp
1   II       4250a neporušený     
7IIII II IIIIIIIIII 4250neporušený neporušenýneporušenýneporušený neporušený
8III   +IIII+––        
9III II +II IIII+4250 G210*   G210*G210*
10     ++IIII II4250    neporušený  
11IIIIIIII+IIIIII + 4250   E47*   
12IIII IIII+IIII II+4250G210*G210*     
13 I/II  +++IIII+ 4250     Q218* 

NOC, výtěry z nosu/úst/konjunktivu; R/F, výtěry z konečníku nebo vzorky stolice; A/P, ascites nebo pleurální výpotek; CSF, mozkomíšní mok; Li, játra; Lu, plíce; Ki, ledviny; Br, mozek; Sp, slezina; Int, střevo.
+: FCoV pozitivní, ale typ viru nelze určit. -: FCoV negativní.
a: FCoV/NTU2/R/2003; GenBank: DQ160294.
b : E47*, G210* a Q218*: byly nalezeny zkrácené proteiny 3c s předčasnými stop kodony na aminokyselinách 47, 210 a 218.

FIPV typu II téhož původu byl objeven u koček, které podlehly FIP

Za účelem dalšího prošetření vztahu těchto virů typu II, které způsobují nemoc a které byly izolovány od koček, které podlehly FIP, byly k analýze virálních sekvencí použity sady specifických primerů, které jsou schopny specificky amplifikovat z 3′ konce S gene typu II ma následný gen. Identita 620 bp amplikonů, odvozených ze sedmi FIPV typu II, činila přibližně 98,7% až 99,8%. Fylogenetická analýza zjistila, že FCoV typu II, vyvozené z výše popisovaného vypuknutí nemoci, byly všechny seskupeny do samostatného clusteru, který se odlišuje od ostatních čtyř FCoV typu II, které jsou momentálně k dispozici v GenBank, tj. FIPV 79-1146 (GenBank: {„type“:“entrez-nucleotide“,“attrs“:{„text“:“DQ010921″,“term_id“:“63098796″}}DQ010921), FCoV 79-1683 (GenBank: {„type“:“entrez-nucleotide“,“attrs“:{„text“:“JN634064″,“term_id“:“384038902″}}JN634064), FCoV DF-2 (GenBank: {„type“:“entrez-nucleotide“,“attrs“:{„text“:“DQ286389″,“term_id“:“87242672″}}DQ286389) a FCoV NTU156 (GenBank: {„type“:“entrez-nucleotide“,“attrs“:{„text“:“GQ152141″,“term_id“:“240015188″}}GQ152141) (údaje nejsou uvedeny).

Rekombinace na 3′ konci S genu s domnělým místem rekombinace na nukleotidu 4250 byla stanovena u všech FCoV typu II, získaných z tělesných výpotků a tkáňového homogenátu u koček 1, 7, 9, 10, 11, 12 a 13 (Dodatečný soubor 1) (Tabulka 3). Sekvence nad tímto místem vykazují vyšší podobnost s CCoV, kdežto sekvence za tímto místem se podobaly spíše na FCoV typu I (Obr. 1). Tyto nálezy skutečně naznačují, že FCoV typu II, zjištěný u všech FIP koček, má společný původ.

Obrázek 1
Rekombinace FIPV od koček 1, 7, 9, 10, 11, 12 a 13 na genu S. Zarovnání 3′ konce genu S s následnými geny FCoV izolovanými od sedmi koček FIP s FCoV typu I a CCoV. Světle a tmavě stínované oblasti zahrnují vyšší podobnost s CCoV a FCoV typu I. Předpokládaná rekombinační událost nastala na nukleotidu 4250 na základě srovnání s FCoV NTU2 a je označena šipkou. Sekvence byly získány z FIPV nalezených v jednotlivých vzorcích a tkáních a jsou uvedeny souhrnně. NOC: výtěry z nosu/úst/konjunktivu; RS: výtěry z konečníku; As: ascites; PE: pleurální výpotek; Li: játra; Lu: plíce; Ki: ledviny; Br: mozek; Sp: slezina; dbd: dny před smrtí. Přístupové číslo GenBank: FCoV C1Je (GenBank: DQ848678), FCoV Black (GenBank: EU186072), FCoV NTU2 (GenBank: DQ160294) a CCoV NTU336 (GenBank: GQ477367).

Identická nesmyslná mutace na 3c genu byla zjištěna u dvou koček, které podlehly FIP

Za účelem další analýzy vztahu těchto FIPV, byly 3c geny, navrhovaný faktor FIP spojený s virulencí, amplifikovány z FCoV typu II, který způsobuje onemocnění. Zmutované 3c geny s identickým předčasným stop codonem na nukleotidech 628-630 (aminokyselina 210, G210*) byly nalezeny u dvou FIP koček, kočka 9 (ascites, slezina a mozek) a 12 (ascites a rektální stěry ze dne, kdy kočka uhynula a čtyři dny předtím) (Obr. 2A). Stojí za zmínku, že FIPV, získaný z kočky 12, vykazoval identickou nesmyslnou mutaci jako virus v jejích ascites. Intaktní 3c geny byly objeveny u koček 1, 7 a 10, které dříve podlehly FIP. Dvě další jasné/rozdílné nesmyslné mutace byly objeveny u koček 11 (E47*) a 13 (Q218*) (Obr. 2A-B, Tabulka 3).

Obrázek 2:
Zarovnání kompletních genů 3c FIPV z koček 1, 7, 9, 10, 11, 12 a 13. (A) Plné délky genů 3c analyzované v této studii byly zarovnány s FCoV typu I, FCoV NTU2. Sekvence byly získány z FIPV nalezených v jednotlivých vzorcích a tkáních a jsou uvedeny společně. Rámeček představuje identifikované předčasné stop kodony. (B) Schéma ukazuje umístění předčasných stop kodonů (PT) genu 3c různých vzorků z různých FIP koček.

Vylučování FIPV typu II je možné zjistit v terminální fázi u FIP koček

Výskyt FCoV byl průběžně analyzován, aby bylo možné objasnit možnou cestu vylučování a přenosu FIPV. Bylo zjištěno, že FCoV typu II, spojený s onemocněním, se vylučoval nazální/orální/konjunktivální cestou a trusem (Tabulka 4). Fekální a nazální/orální / konjunktivální vylučování viru typu II je možné zjistit od 6. dne (kočka 11) a od 4. dne (kočka 12) před uhynutím. Virémii je možné zjistit během terminálního stádia u koček trpících FIP až do 18 dní před uhynutím, a současné vylučování trusem bylo zjištěno u jedné kočky (kočka 12) (Tabulka 4).

Tabulka 4
Vylučování a sérotypy kočičího koronaviru, zjištěné u FIP koček v kočičím útulku

KočkaVzorkaDni před smrtí
−80−66−60−57−50−43−36−29−25−23−20−18−14−12−8−6−40*
9Výkaly I            I  II
 NOC tampony                 II
 Viremie              II  +
 Efuze              IIII II
11Výkaly     – –    –  II II
 NOC tampony            –  – II
 Viremie       –    –– – –
 Efuze     +           II
12Výkaly–+– –––––––––+  IIII
 NOC tampony    ––––––––––  IIII
 Viremie– – –––––––II++  – 
 EfuzeII                II

+: FCoV pozitivní; -: FCoV negativní.
I, II: FCoV typu I nebo typu II.
*: Vzorky byly odebrány bezprostředně před eutanazií, s výjimkou kočky 12, které byly vzorky odebrány až po smrti.

Diskuse

Možnost horizontálního přenosu  je u FIP obecně zpochybňována, protože (i) výskyt FIP je sporadický a je běžné, že se v prostředí s velkým množstvím koček vyvine FIP u jediné z nich [2]; (ii) teorie interní mutace, která popisuje, že FIPV je mutant, generovaný z enterického FCoV u jedné kočky [12,17]; (iii) neexistuje dostatek důkazů, že se mutantní FIPV vylučuje z FIP koček; a (iv) mutace 3c genu je unikátní pro každou FIP kočku [11,13,18]. Současné přesvědčení je takové, že kočky, které podlehly FIP, nevylučují a nepřenášejí FIPV na jiné kočky [11,13,14,18–20]. Naše údaji signalizují, že toto vypuknutí FIP bylo způsobeno viry téhož původu. Za prvé, všechny kočky, uhynulé na FIP, měly infekci typu II a rekombinace těchto sedmi virů typu II byla lokalizována na témže místě. Rekombinace virů typu II, které jsou v současné době k dispozici v genetické bance, tj. FIPV 79-1146, FCoV 79-1683 a FCoV NTU156, byly všechny unikátní, specifické a vyskytovaly se nezávisle [9,10]. Zadruhé, FIPV, zjištěný u tří koťat, která uhynula během prvních dvou měsíců po vzniku horečky, měl intaktní 3c gen, kdežto viry od koček, které přežily déle (uhynuly o čtyři až osm měsíců později) všechny obsahovaly nesmyslnou mutaci, tj. G210* (kočky 9 a 12), E47* (kočka 11) a Q218* (kočka 13). Protože tři nesmyslné mutace, zjištěné ve FIPV u těchto zvířat, byly všechny umístěny na různých místech,viry, které původně infikovaly tyto kočky, by měly mít intaktní 3c gen – obdobně jako virus, objevený u koťat, která uhynula dříve. Po infikování došlo k místním mutacím během replikace viru u jednotlivých koček, což dalo vzniknout FIPV s 3c genem, který nese nesmyslné mutace na různých místech. Zjištění, že viry, které byly identifikovány  nejen ve tkáních, ale také ve vzorcích trusu u dvou koček (kočky 9 a 12), měly identickou mutaci ve 3c genu, dále potvrdilo, že došlo k horizontálnímu přenosu (Tabulka 3). Souhrnně řečeno, všechny tyto nálezy prokázaly, že vysoce virulentní FIPV se šířil od jednoho zvířete ke druhému horizontálně.

Toto je první zpráva vypuknutí FIPV typu II s důkazem horizontálního přenosu FCoV, vyvolávajícího onemocnění. K propuknutí FIP došlo poté, co se v rozmezí od června a července 2011 dostalo do tohoto útulku pět koťat (kočky  1, 3, 4, 8 a 10). Protože kauzativní viry typu II se specifickým genetickým markerem v S genu byly potvrzeny jako rekombinace kočičího a psího koronaviru a u některých z koťat, které uhynuly dříve, bylo zjištěno, že žila společně nebo vedle psů v době mezi jejich zachráněním a převezením do tohoto útulku, některé z těchto koťat mohlo být zdrojem tohoto viru typu II. Psi a zejména mladí psi často v útulcích vylučují velká množství psího koronaviru ve výkalech a rekombinace mezi kočičím– psím a psím-kočičím koronavirem je již dobře zdokumentovaná [21–23]. A kromě toho tytp kauzativní viry typu II byly zjištěny v řade exkretů a sekretů u koček, které uhynuly na FIP (Tabulka 3), čímž se prokazuje, že je možné šíření mezi jednotlivými kočkami.

I když bezprostředně po prvním vyšetření všech zvířat z tohoto útulku na FCoV byly kočky, které vylučovaly FCoV, umístěny v samostatných klecích a přenos následně ustal, úmrtnost při vypuknutí této nemoci byla vysoká (28%, 13/46). Výsledky tří studií, které se zabývaly propuknutím FIP, byly uvedeny již dříve. Výsledky čtyřleté studie, prováděné v blízké chovatelské stanici koček, prokázaly průměrnou úmrtnost 17,3% [24]; úmrtnost, plynoucí z desetileté studie, prováděné v blízké chovatelské stanici, činila 29,4% (5/17) [25]. Další studie epidemií, která se prováděla v sedmi chovatelských stanicích /útulcích odhalila >10% úmrtnost [20]. Vysoký výskyt FIP v těchto uzavřených chovatelských stanicích by mohl být ovlivněn geneticky predisponovanými chovnými zvířaty. V naší studii pouze několik FIP koček v tomto útulku byly sourozenci a ostatní kočky nebyly geneticky spřízněné.  Naše studie prokazuje, že i bez vlivu genetických predispozičních faktorů může být úmrtnost na FIP vysoká v uzavřeném prostředí s velkým množstvím koček, pokud zůstane neodhaleno šíření FCoV, který způsobuje onemocnění.

V tomto prostředí s velkým počtem koček byly tři FIP kočky infikovány nejen FCoV typu II, ale také koinfikovány FCoV typu I (Tabulka 3). FCoV typu I byl nalezen pouze ve vzorcích trusu, kdežto FCoV typu II byl nalezen v různých vzorcích, včetně tělesných výpotků, homogenátů granulomatózní tkáně a v cerebrospinální tekutině. Tento nález ukazuje, že u těchto dvojnásobně infikovaných zvířat byl FCoV typu II hlavní příčinou FIP. Tento nález odpovídá našemu dřívějšímu nálezu, že se infekce FCoV typu II je významně spojena s FIP [4].

Výskyt FCoV v plné krvi v terminální fázi byl zjištěn již dříve [26,27]; ovšem pokud je nám známo, výskyt FIPV v trusu před konečnou fází onemocnění nebyl až do naší studie nikde publikován. Vylučování viru tohoto typu II trusem a nazální/orální/konjunktivální cestou je možné zjistit u efuzivní formy FIP až šest dní před uhynutím zvířete. Další experimentální studie infekce prokázala, že inokulované viry bylo možné odhalit až cca dva týdny po inokulaci, dříve než se rozvinuly klinické příznaky onemocnění [14]. Souhrnně řečeno, k přenosu FIPV by mohlo dojít na počátku, před projevy nemoci a v terminální fázi. Při propuknutí onemocnění v našem případě byly všechny kočky zpočátku umístěny společně v otevřené místnosti. Poté, co sedm koček postupně tomuto onemocnění podlehlo, byly všechny kočky pozitivní na FCoV umístěny samostatně v klecích a drženy odděleně. Izolace pravděpodobně zabrzdila přenos onemocnění. Toto propuknutí nemoci, které usmrtilo 13 koček, nám umožnilo jednoznačně stanovit, že FIPV může být přenášen horizontálně a ukázat, že izolace nemocných koček by měla být zohledněna v prostředí, kde se nachází větší množství koček.

Konkurenční zájmy

Autoři prohlašují, že nemají žádné konkurenční zájmy.

Příspěvky a vklady autorů

YTW provedl odběr vzorků a přípravu, detekování FCoV, určení typu, amplifikaci 3c genu a další analýzy a sestavil rukopis. BLS prováděl dozor nad odběrem vzorků a ošetřováním všech FIP zvířat a přispěl k sestavení rukopisu. LEH se účastnil amplifikace 3c genu, genetické analýzy a přípravy rukopisu. LLC vymyslel studii, účastnil se koncipování studie, koordinace a podílel se na přípravě rukopisu. Všichni autoři přečetli a schválili konečnou verzi rukopisu.

Přídavný materiál

Dodatečný soubor 1:

Analýza místa rekombinace FIPV u koček 1, 7, 9, 10, 11, 12 a 13 na S genu. Analýza vynesené podobnosti s využitím Kimurova (dvouparametrového) distančního modelu, modelu sousedních propojených stromů a 100 replikátů bootstrap ukázala, že došlo k rekombinaci a domnělé místo křížení (přechodu) je uvedeno šipkou. 

Poděkování

Autoři by rádi vyslovili poděkování ošetřovatelům v uváděném kočičím útulku, bez jejichž pomoci by tuto studii nebylo možné dokončit.

Literatura

  1. Lai MMC, Perlman S, Anderson LJ. In: Fields virology. Knipe DM, Howley PM, Griffin DE, Lamb RA, Martin MA, Roizman B, Straus SE, editor. Philadelphia: Lippincott Wiilliams & Wikins; 2007. Coronaviridae; pp. 1305–1335.
  2. Pedersen NC. A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963-2008. J Feline Med Surg. 2009;44:225–258. doi: 10.1016/j.jfms.2008.09.008. [PubMed] [Cross Ref]
  3. Pedersen NC, Black JW, Boyle JF, Evermann JF, McKeirnan AJ, Ott RL. Pathogenic differences between various feline coronavirus isolates. Adv Exp Med Biol. 1984;44:365–380. doi: 10.1007/978-1-4615-9373-7_36. [PubMed] [Cross Ref]
  4. Lin CN, Su BL, Wang CH, Hsieh MW, Chueh TJ, Chueh LL. Genetic diversity and correlation with feline infectious peritonitis of feline coronavirus type I and II: a 5-year study in Taiwan. Vet Microbiol. 2009;44:233–239. doi: 10.1016/j.vetmic.2008.11.010. [PubMed] [Cross Ref]
  5. Addie DD, Schaap IA, Nicolson L, Jarrett O. Persistence and transmission of natural type I feline coronavirus infection. J Gen Virol. 2003;44:2735–2744. doi: 10.1099/vir.0.19129-0. [PubMed] [Cross Ref]
  6. Benetka V, Kubber-Heiss A, Kolodziejek J, Nowotny N, Hofmann-Parisot M, Mostl K. Prevalence of feline coronavirus types I and II in cats with histopathologically verified feline infectious peritonitis. Vet Microbiol. 2004;44:31–42. doi: 10.1016/j.vetmic.2003.07.010. [PubMed] [Cross Ref]
  7. Hohdatsu T, Okada S, Ishizuka Y, Yamada H, Koyama H. The prevalence of types I and II feline coronavirus infections in cats. J Vet Med Sci. 1992;44:557–562. doi: 10.1292/jvms.54.557. [PubMed] [Cross Ref]
  8. Kummrow M, Meli ML, Haessig M, Goenczi E, Poland A, Pedersen NC, Hofmann-Lehmann R, Lutz H. Feline coronavirus serotypes 1 and 2: seroprevalence and association with disease in Switzerland. Clin Diagn Lab Immunol. 2005;44:1209–1215. [PMC free article] [PubMed]
  9. Lin CN, Chang RY, Su BL, Chueh LL. Full genome analysis of a novel type II feline coronavirus NTU156. Virus Genes. 2013;44:316–322. doi: 10.1007/s11262-012-0864-0. [PubMed] [Cross Ref]
  10. Herrewegh AA, Smeenk I, Horzinek MC, Rottier PJ, de Groot RJ. Feline coronavirus type II strains 79-1683 and 79-1146 originate from a double recombination between feline coronavirus type I and canine coronavirus. J Virol. 1998;44:4508–4514. [PMC free article] [PubMed]
  11. Vennema H, Poland A, Foley J, Pedersen NC. Feline infectious peritonitis viruses arise by mutation from endemic feline enteric coronaviruses. Virology. 1998;44:150–157. doi: 10.1006/viro.1998.9045. [PubMed] [Cross Ref]
  12. Rottier PJ, Nakamura K, Schellen P, Volders H, Haijema BJ. Acquisition of macrophage tropism during the pathogenesis of feline infectious peritonitis is determined by mutations in the feline coronavirus spike protein. J Virol. 2005;44:14122–14130. doi: 10.1128/JVI.79.22.14122-14130.2005. [PMC free article] [PubMed] [Cross Ref]
  13. Chang HW, de Groot RJ, Egberink HF, Rottier PJ. Feline infectious peritonitis: insights into feline coronavirus pathobiogenesis and epidemiology based on genetic analysis of the viral 3c gene. J Gen Virol. 2010;44:415–420. doi: 10.1099/vir.0.016485-0. [PubMed] [Cross Ref]
  14. Stoddart ME, Gaskell RM, Harbour DA, Gaskell CJ. Virus shedding and immune responses in cats inoculated with cell culture-adapted feline infectious peritonitis virus. Vet Microbiol. 1988;44:145–158. doi: 10.1016/0378-1135(88)90039-9. [PubMed] [Cross Ref]
  15. Herrewegh AA, de Groot RJ, Cepica A, Egberink HF, Horzinek MC, Rottier PJ. Detection of feline coronavirus RNA in feces, tissues, and body fluids of naturally infected cats by reverse transcriptase PCR. J Clin Microbiol. 1995;44:684–689. [PMC free article] [PubMed]
  16. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987;44:156–159. [PubMed]
  17. Poland AM, Vennema H, Foley JE, Pedersen NC. Two related strains of feline infectious peritonitis virus isolated from immunocompromised cats infected with a feline enteric coronavirus. J Clin Microbiol. 1996;44:3180–3184. [PMC free article] [PubMed]
  18. Pedersen NC, Liu H, Scarlett J, Leutenegger CM, Golovko L, Kennedy H, Kamal FM. Feline infectious peritonitis: role of the feline coronavirus 3c gene in intestinal tropism and pathogenicity based upon isolates from resident and adopted shelter cats. Virus Res. 2012;44:17–28. doi: 10.1016/j.virusres.2011.12.020. [PubMed] [Cross Ref]
  19. Foley JE, Poland A, Carlson J, Pedersen NC. Patterns of feline coronavirus infection and fecal shedding from cats in multiple-cat environments. J Am Vet Med Assoc. 1997;44:1307–1312. [PubMed]
  20. Foley JE, Poland A, Carlson J, Pedersen NC. Risk factors for feline infectious peritonitis among cats in multiple-cat environments with endemic feline enteric coronavirus. J Am Vet Med Assoc. 1997;44:1313–1318. [PubMed]
  21. Stavisky J, Pinchbeck G, Gaskell RM, Dawson S, German AJ, Radford AD. Cross sectional and longitudinal surveys of canine enteric coronavirus infection in kennelled dogs: a molecular marker for biosecurity. Infect Genet Evol. 2012;44:1419–1426. doi: 10.1016/j.meegid.2012.04.010. [PubMed] [Cross Ref]
  22. Decaro N, Mari V, Elia G, Addie DD, Camero M, Lucente MS, Martella V, Buonavoglia C. Recombinant canine coronaviruses in dogs, Europe. Emerg Infect Dis. 2010;44:41–47. doi: 10.3201/eid1601.090726. [PMC free article] [PubMed] [Cross Ref]
  23. Decaro N, Buonavoglia C. An update on canine coronaviruses: viral evolution and pathobiology. Vet Microbiol. 2008;44:221–234. doi: 10.1016/j.vetmic.2008.06.007. [PubMed] [Cross Ref]
  24. Potkay S, Bacher JD, Pitts TW. Feline infectious peritonitis in a closed breeding colony. Lab Anim Sci. 1974;44:279–289. [PubMed]
  25. Watt NJ, MacIntyre NJ, McOrist S. An extended outbreak of infectious peritonitis in a closed colony of European wildcats (Felis silvestris) J Comp Pathol. 1993;44:73–79. doi: 10.1016/S0021-9975(08)80229-0. [PubMed] [Cross Ref]
  26. de Groot-Mijnes JD, van Dun JM, van der Most RG, de Groot RJ. Natural history of a recurrent feline coronavirus infection and the role of cellular immunity in survival and disease. J Virol. 2005;44:1036–1044. doi: 10.1128/JVI.79.2.1036-1044.2005. [PMC free article] [PubMed] [Cross Ref]
  27. Tsai HY, Chueh LL, Lin CN, Su BL. Clinicopathological findings and disease staging of feline infectious peritonitis: 51 cases from 2003 to 2009 in Taiwan. J Feline Med Surg. 2011;44:74–80. doi: 10.1016/j.jfms.2010.09.014. [PubMed] [Cross Ref]
Publikované

Pôvod brušných alebo hrudných výpotkov u mačiek s vlhkou FIP a príčiny ich pretrvávania počas liečby

Niels C. Pedersen, DVM, PhD
Centrum pre zdravie spoločenských zvierat
Kalifornská univerzita, Davis
24.9.2021

Pôvodný článok: Origin of abdominal or thoracic effusions in cats with wet FIP and reasons for their persistence during treatment


Pôvod FIP výpotkov. Výpotky pri vlhkej FIP pochádzajú z malých ciev (venúl), ktoré lemujú povrch brušných a hrudných orgánov (viscerálne) a stien (parietálne), mezentéria/mediastína a omenta. Priestory okolo týchto ciev obsahujú špecifický typ makrofágov, ktoré pochádzajú z progenitorov monocytov, ktoré neustále recirkulujú medzi krvným obehom, intersticiálnymi priestormi okolo venúl, aferentnou lymfou, regionálnymi lymfatickými uzlinami a späť do krvného obehu. Ďalšie miesta tejto recirkulácie sa nachádzajú v meningách, ependyme mozgu a uveálnom trakte očí. Malá časť týchto monocytov sa vyvinie na nezrelé makrofágy (monocyt/makrofág) a nakoniec na rezidentné makrofágy. Makrofágy nepretržite vyhľadávajú infekcie.

FIPV vzniká mutáciou z mačacieho enterického koronavírusu (FECV) prítomného v lymfoidných tkanivách a lymfatických uzlinách v dolnej časti čreva. Mutácia mení bunkový tropizmus FECV z enterocytov na makrofágy peritoneálneho typu. Monocyty/makrofágy sa zdajú byť prvým typom buniek, ktoré sú infikované. Táto infekcia spôsobí, že viac monocytov opustí krvný obeh a začne sa ich premena na makrofágy, ktoré pokračujú v cykle infekcie [2]. Monocyty/makrofágy nepodliehajú programovanej bunkovej smrti, ako sa zvyčajne očakáva, ale pokračujú vo svojom dozrievaní na veľké makrofágy naložené vírusom. Tieto veľké makrofágy nakoniec podliehajú programovanej bunkovej smrti (apoptóze) a uvoľňujú veľké množstvo vírusu, ktorý potom infikuje nové monocyty/makrofágy [1]. Infikované monocyty/makrofágy a makrofágy produkujú niekoľko látok (cytokínov), ktoré sprostredkúvajú intenzitu zápalu (ochorenie) aj imunitu (rezistenciu) [1,2].

Zápal spojený s FIP vedie k trom typom zmien vo venulách. Prvým je strata integrity cievnej steny, mikrokrvácanie a únik plazmatického proteínu bohatého na aktivované faktory zrážania a aktivácie komplementu a ďalšie zápalové proteíny. Druhý typ poškodenia zahŕňa trombózu a zablokovanie prietoku krvi. Tretie poškodenie sa vyskytuje v chronickejších prípadoch a zahŕňa fibrózu (zjazvenie) okolo ciev. Variácie v týchto troch udalostiach určujú množstvo a zloženie výpotkov podľa štyroch Starlingových síl, ktoré určujú pohyb tekutín medzi krvným obehom a intersticiálnymi priestormi [3].

Klasický výpotok pri vlhkej FIP vzniká najmä v dôsledku akútneho poškodenia cievnych stien a úniku plazmy do intersticiálnych priestorov a nakoniec do telesných dutín. Proteín uniknutý do intersticiálnych priestorov priťahuje ďalšie tekutiny, čo sa môže zhoršiť zablokovaním venózneho prietoku krvi a zvýšením kapilárneho tlaku. Tento typ výpotku, známy ako exsudát, obsahuje aj vysoké hladiny proteínov, ktoré sa podieľajú na zápale, imunitných reakciách a zrážaní krvi.

Táto tekutina obsahuje aj veľký počet neutrofilov, makrofágov/monocytov, makrofágov, eozinofilov a nižší počet lymfocytov a červených krviniek. Tento klasický typ tekutiny má konzistenciu vaječného bielka a tvorí slabé zrazeniny obsahuje vysoké množstvo bilirubínu. Bilirubín nepochádza z ochorenia pečene, ale skôr z deštrukcie červených krviniek uniknutých do buniek intersticiálneho tkaniva a pohltených monocytmi/makrofágmi a makrofágmi. Červené krvinky sa rozkladajú a hemoglobín sa štiepi na hem a globín. Globín sa ďalej metabolizuje na biliverdín (zelenkastá farba) a nakoniec na bilirubín (žltkastá farba), ktorý sa potom vylučuje pečeňou. Mačky však majú nedostatok enzýmov používaných na konjugáciu, a preto sú neúčinné pri odstraňovaní bilirubínu z tela [4]. To vedie k hromadeniu bilirubínu v krvnom obehu a dáva výpotku žltý nádych. Čím tmavší je žltý odtieň, tým viac bilirubínu je vo výpotku, tým závažnejšia je iniciujúca zápalová reakcia a tým závažnejšia je výsledná bilirubinémia, bilirubinúria a žltačka.

Opačným extrémom klasického a akútnejšieho výpotku pri FIP sú výpotky vznikajúce prevažne pri chronických infekciách a blokáde venózneho prietoku krvi a následnom zvýšení kapilárneho tlaku. Vysoký kapilárny tlak vedie k výpotku, ktorý sa vzdialenejšie podobá intersticiálnej tekutine ako plazme, má nižší obsah bielkovín, je skôr vodnatý ako lepkavý, číry alebo mierne žlto sfarbený, nie je náchylný na zrážanie a má nižší počet akútnych zápalových buniek, ako sú neutrofily. Existujú aj výpotky FIP, ktoré sú medzi týmito extrémami, v závislosti od relatívneho stupňa akútneho zápalu a chronickej fibrózy. Tieto prechodné typy tekutín sa vo veterinárnej literatúre bežne označujú ako modifikovaný transsudát, čo je však nesprávne pomenovanie. Modifikovaný transsudát začína ako transsudát a mení sa, keď pretrváva a vyvoláva mierny zápal. Výpotky s nízkym obsahom bielkovín a buniek pri FIP vznikajú ako exsudáty a nie ako transsudáty a nezodpovedajú tomuto opisu. Správnejší termín je „modifikovaný exsudát“ alebo „variantný exsudatívny výpotok“.

Ako dlho zvyčajne pretrvávajú výpotky u mačiek liečených liekom GS-441524 alebo GC376? Prítomnosť brušných výpotkov často vedie k veľkému roztiahnutiu brucha a potvrdí sa palpáciou, aspiráciou dutou ihlou, röntgenom alebo ultrazvukom. Mačky s hrudnými výpotkami sa najčastejšie prezentujú závažnou dýchavičnosťou a potvrdzujú sa rádiologickým vyšetrením a aspiráciou. Hrudné výpotky sa takmer vždy odstraňujú, aby sa zmiernila dýchavičnosť, a v porovnaní s brušnými výpotkami sa opakujú pomaly. Preto sa brušné výpotky zvyčajne neodstraňujú, pokiaľ nie sú masívne a nezasahujú do dýchania, pretože sa rýchlo nahradia. Opakovaná drenáž brušných výpotkov môže tiež vyčerpať bielkoviny a spôsobiť škodlivé zmeny v rovnováhe tekutín a elektrolytov u ťažko chorých mačiek.

Hrudné výpotky pri liečbe liekom GS-441524 miznú rýchlejšie, so zlepšením dýchania do 24-72 hodín a vymiznutím zvyčajne za menej ako 7 dní. Abdominálne výpotky sa zvyčajne výrazne zmenšia do 7-14 dní a vymiznú do 21-28 dní. Detekcia výpotkov, ktoré pretrvávajú po tomto čase, závisí od ich množstva a metódy detekcie. Malé množstvá pretrvávajúcej tekutiny sú zistiteľné len ultrazvukom.

Pretrvávanie výpotkov počas antivírusovej liečby alebo po nej. Existujú tri základné dôvody pretrvávania výpotkov. Prvým je pretrvávanie infekcie a z nej vyplývajúceho zápalu na určitej úrovni, čo môže byť spôsobené nevhodnou liečbou, zlým liekom alebo rezistenciou na liek. Neadekvátna liečba môže byť dôsledkom nesprávneho dávkovania zlého lieku alebo získania rezistencie vírusu na liek. Druhým dôvodom pretrvávania tekutín je chronické poškodenie venúl a zvýšený kapilárny tlak. Môže to byť spôsobené infekciou nízkeho stupňa alebo reziduálnou fibrózou z infekcie, ktorá bola odstránená. Tretím dôvodom perzistencie je existencia iných ochorení, ktoré sa tiež môžu prejavovať výpotkami. Patria k nim vrodené srdcové choroby, najmä kardiomyopatia, chronické ochorenie pečene (získané alebo vrodené), hypoproteinémia (získaná alebo vrodená) a rakovina. Vrodené ochorenia spôsobujúce výpotky sa častejšie vyskytujú u mladých mačiek, zatiaľ čo získané príčiny a rakovina sa častejšie diagnostikujú u starších mačiek.

Diagnostika a liečba pretrvávajúcich výpotkov. Predpokladom diagnózy a liečby je dôkladné vyšetrenie tekutiny, ako je opísané vyššie. Ak má tekutina zápalový alebo polozápalový charakter a bunkový pelet je pozitívny pomocou PCR alebo IHC, musí sa určiť dôvod pretrvávania infekcie. Bola antivírusová liečba správne vedená, bolo antivírusové liečivo aktívne a jeho koncentrácia správna, existovali dôkazy o získanej rezistencii na liečivo? Ak má tekutina zápalový charakter a PCR a IHC sú negatívne, aké iné ochorenia pripadajú do úvahy? Tekutiny s nízkym obsahom bielkovín a buniek, ktoré nenaznačujú prítomnosť zápalu a ktorých test PCR a IHC je negatívny, poukazujú na diagnózu reziduálnej fibrózy malých ciev a/alebo na iné prispievajúce príčiny, ako je ochorenie srdca, chronické ochorenie pečene, hypoproteinémia (ochorenie čriev alebo obličiek). Niektoré z porúch spôsobujúcich tento typ výpotku si môžu vyžadovať exploratívnu laparotómiu s dôkladnou prehliadkou brušných orgánov a selektívnou biopsiou na určenie pôvodu tekutiny. Liečba pretrvávajúcich výpotkov sa bude veľmi líšiť v závislosti od konečnej príčiny. Pretrvávajúce výpotky spôsobené reziduálnou fibrózou malých ciev u mačiek vyliečených z infekcie často ustúpia až po mnohých týždňoch alebo mesiacoch. Pretrvávajúce výtoky spôsobené úplne alebo čiastočne inými ochoreniami si vyžadujú liečbu zameranú na tieto ochorenia.

Identifikácia a charakteristika pretrvávajúcich výpotkov. Prítomnosť tekutiny po 4 týždňoch liečby GS je nepríjemná a zvyčajne sa zisťuje niekoľkými spôsobmi v závislosti od množstva tekutiny a jej lokalizácie. Veľké množstvo tekutiny sa zvyčajne zistí podľa stupňa roztiahnutia brucha, palpáciou, röntgenom a aspiráciou brucha, zatiaľ čo menšie množstvo tekutiny sa najlepšie zistí ultrazvukom. Pretrvávajúci pleurálny výpotok sa zvyčajne zisťuje pomocou röntgenových snímok alebo ultrazvuku. Celkovo je ultrazvuk najpresnejším prostriedkom na detekciu a semikvantitatívne stanovenie výpotkov v hrudnej a brušnej dutine. Ultrazvuk sa môže použiť aj v kombinácii s aspiráciou tenkou ihlou na odber malých a lokalizovaných množstiev tekutiny.

Druhým krokom pri skúmaní pretrvávajúcich výpotkov je ich analýza na základe farby, obsahu bielkovín, počtu bielych a červených krviniek a typov prítomných bielych krviniek. Tekutiny vzniknuté primárne zápalom budú mať hladinu bielkovín blízku alebo rovnakú ako plazma a veľký počet bielych krviniek (neutrofily, lymfocyty, monocyty/makrofágy a veľké vakuolizované makrofágy). Tekutiny vytvorené zvýšeným kapilárnym tlakom sa viac podobajú intersticiálnej tekutine s proteínmi bližšie k 2,0 g/dl a počtom buniek < 200. Na diagnostiku výpotkov spojených s FIP sa často používa Rivaltova skúška. Nie je to však špecifický test pre FIP, ale skôr pre výpotky zápalového charakteru. Zvyčajne je pozitívny pri výpotkoch s FIP, ktoré majú vysoký obsah bielkovín a buniek, ale často je negatívny pri výpotkoch s veľmi nízkym obsahom bielkovín a buniek. Výpotky, ktoré sú na pomedzí týchto dvoch typov výpotkov, budú testované buď pozitívne, alebo negatívne, v závislosti od toho, kde sa v spektre nachádzajú.

Tretím krokom je analýza výpotkov na prítomnosť vírusu FIP. Na to je zvyčajne potrebných 5 až 25 ml alebo viac tekutiny. Pri tekutinách s vyšším počtom bielkovín a buniek môže stačiť menšie množstvo, zatiaľ čo pri tekutinách s nízkym počtom bielkovín a buniek je potrebné väčšie množstvo. Čerstvo odobratá vzorka by sa mala centrifugovať a bunkový pelet analyzovať na prítomnosť vírusovej RNA metódou PCR alebo cytocentrifugovať na imunohistochemické vyšetrenie (IHC). Test PCR by mal byť na RNA FIPV 7b a nie na špecifické mutácie FIPV, pretože test na mutácie nemá dostatočnú citlivosť a neposkytuje žiadne výhody pre diagnostiku [5]. Vzorky, ktoré sú pozitívne na základe PCR alebo IHC, poskytujú definitívny dôkaz FIP. Avšak až 30 % vzoriek zo známych prípadov FIP môže mať falošne negatívny test buď z dôvodu nevhodnej vzorky a jej prípravy, alebo preto, že hladina RNA vírusu FIP je pod úrovňou detekcie. Taktiež platí, že čím je tekutina menej zápalová, tým sú hladiny vírusu nižšie. Preto je pravdepodobnejšie, že výpotky s nižšími hladinami bielkovín a bielych krviniek budú testované negatívne, pretože vírusová RNA je pod detekčným limitom testu.

Literatúra

[1] Watanabe R, Eckstrand C, Liu H, Pedersen NC. Characterization of peritoneal cells from cats with experimentally-induced feline infectious peritonitis (FIP) using RNA-seq. Vet Res. 2018 49(1):81. doi: 10.1186/s13567-018-0578-y.

[2]. Kipar A, Meli ML, Failing K, Euler T, Gomes-Keller MA, Schwartz D, Lutz H, Reinacher M. Natural feline coronavirus infection: differences in cytokine patterns in association with the outcome of infection. Vet Immunol Immunopathol. 2006 Aug 15;112(3-4):141-55. doi:10.1016/j.vetimm.2006.02.004. Epub

[3] Brandis K.  Starling’s Hypothesis, LibreTexts. https://med.libretexts.org/Bookshelves/Anatomy_and_Physiology/Book%3A_Fluid_Physiology _(Brandis)/04%3A_Capillary_Fluid_Dynamics/4.02%3A_Starling%27s_Hypothesis

[4]. Court MH. Feline drug metabolism and disposition: pharmacokinetic evidence for species differences and molecular mechanisms. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2013;43(5):10391054. doi:10.1016/j.cvsm.2013.05.002

[5]. Barker, EN, Stranieri, A, Helps, CR. Limitations of using feline coronavirus spike protein gene mutations to diagnose feline infectious peritonitis. Vet Res 2017; 48: 60.

Publikované

Proteíny akútnej fázy u mačiek

April 2019
Rita Mourão Rosa, Lisa Alexandra Pereira Mestrinho
Pôvodný článok: Acute phase proteins in cats

ABSTRAKT: Proteíny akútnej fázy (APP) sú proteíny syntetizované a uvoľňované prevažne hepatocytmi pri poškodení buniek alebo invázii mikroorganizmov. Tento článok obsahuje prehľad použitia APP pri ochoreniach mačiek, identifikuje ich užitočnosť v klinickom prostredí a analyzuje 55 publikovaných prác. Sérový amyloid A (SAA), alfa-1 kyslý glykoproteín (AGP) a haptoglobín sú ukazovatele, ktoré autori považujú za užitočné pri monitorovaní akútnej zápalovej reakcie u mačiek. Hoci sa meranie APP stále vo veterinárnej medicíne rutinne nepoužíva, spolu s klinickými príznakmi a ďalšími krvnými parametrami sú klinicky zaujímavé a použiteľné pri ochoreniach, ako sú infekčná peritonitída mačiek, pankreatitída, zlyhanie obličiek, retrovírusové a kalicivírusové infekcie. Hoci existujú komerčne dostupné súpravy na meranie mačacích APP, štandardizácia testov zameraná na technickú jednoduchosť, väčšiu druhovú špecifickosť a s menšími súvisiacimi nákladmi umožní rutinné používanie v mačacej praxi, tak ako sa to robí v humánnej oblasti.
Kľúčové slová: zápal, proteíny akútnej fázy, mačka.

Úvod

Reakcia akútnej fázy (APR) je včasná nešpecifická systémová vrodená imunitná reakcia na lokálny alebo systémový podnet, ktorá pomáha liečiť a obnoviť homeostázu a minimalizovať poškodenie tkaniva, keď je organizmus zasiahnutý traumou, infekciou, stresom, operáciou, neopláziou alebo zápalom (GRUYS a kol., 2005; CRAY a kol., 2009; ECKERSALL A BELL, 2010). Pri tejto reakcii pozorujeme niekoľko rôznych systémových účinkov: horúčku, leukocytózu, hormonálne zmeny – hlavne koncentrácie kortizolu a tyroxínu, so sekundárnym katabolickým stavom a úbytkom svalových bielkovín, železa a zinku v sére (CERÓN et al. 2005, JAVARD et al. 2017).
Vplyvom cytokínov IL-1β, TNF-α a najmä IL-6 a približne 90 minút po poranení sa zvyšuje syntéza bielkovín v hepatocytoch, lymfatických uzlinách, tonzilách a slezine, ako aj v leukocytoch krvi. Tieto novovytvárané proteíny sa nazývajú proteíny akútnej fázy (APP) (TIZARD, 2013b).

Proteíny akútnej fázy

Koncentrácie APP sa môžu v reakcii na zápal zvýšiť (pozitívne APP) alebo znížiť (negatívne APP) (PALTRINIERI et al., 2008) (JOHNSTON & TOBIAS, 2018). Môžu aktivovať leukocytózu a komplement, spôsobiť inhibíciu proteáz, viesť k zrážaniu krvi a opsonizácii – obrannému mechanizmu, ktorý vedie k eliminácii infekčných agensov, obnove tkanív a obnoveniu zdravého stavu (CRAY et al., 2009). APP môžu mať dve funkcie, pro- a/alebo protizápalový účinok, ktoré musia byť jemne vyvážené na podporu homeostázy (HOCHEPIED et al., 2003).

Podľa veľkosti a trvania reakcie nasledujúcej po podnete sa rozlišujú tri hlavné skupiny APP (MURATA a kol., 2004; PETERSEN a kol., 2004; CERÓN a kol.), Pozitívne APP možno rozdeliť do dvoch skupín: prvá skupina zahŕňa APP so zvýšením 10 až 1000-násobným u ľudí alebo 10 až 100-násobným u domácich zvierat počas prítomnosti zápalu – napr. c-reaktívny proteín (CRP) a sérový amyloid A (SAA). Druhá skupina sú APP, ktoré sa pri zápalovej reakcii zvýšia 2 až 10-násobne – napr. haptoglobín a alfa-globulíny. Posledná skupina zahŕňala negatívne APP, pri ktorých koncentrácia klesá v reakcii na zápal – napr. albumín (KANN et al., 2012).

Pozitívne proteíny akútnej fázy


Pozitívne APP sú glykoproteíny, ktorých sérové koncentrácie sa pri stimulácii prozápalovými cytokínmi počas procesu ochorenia zvyšujú o 25 % a uvoľňujú sa do krvného obehu. Tieto koncentrácie sa môžu merať a používať pri diagnostike, prognóze, na monitorovanie odpovede na liečbu, ako aj na všeobecný zdravotný skríning. Možno ich tiež považovať za kvantitatívne biomarkery ochorenia, vysoko citlivé na zápal, ale málo špecifické, pretože zvýšenie APP sa môže vyskytnúť aj pri nezápalových ochoreniach (CERÓN a kol., 2005; ECKERSALL a BELL, 2010).

Pozitívne APP reagujú na cytokíny rôzne, pričom tieto skupiny sa delia do dvoch hlavných tried. Typ 1 APP, ktorý zahŕňa AGP, zložku komplementu 3, SAA, CRP, haptoglobín a hemopexín, je regulovaný IL-1, IL-6 a TNF-α a tiež glukokortikoidmi. Typ 2, ktorý zahŕňa tri reťazce fibrinogénu (α-, β- a γ-fibrinogén) a rôzne inhibičné proteázy, je regulovaný cytokínmi IL-6 a glukokortikoidmi (BAUMANN et al., 1990; BAUMANN & GAULDIE, 1994).

U mačiek je najdôležitejším APP SAA (Sérový amyloid A) alebo alfa-1-kyslý glykoproteín (AGP). Hladina SAA v krvi môže indikovať zápalové stavy, ako je infekčná peritonitída mačiek (FIP) a iné infekčné ochorenia, ako je kalicivírusová infekcia, chlamýdióza, leukémia a infekčná imunodeficiencia, pretože sa zvyšuje 10- až 50-násobne(TIZARD, 2013b). SAA môže byť zvýšený aj pri iných ochoreniach, ako je diabetes mellitus a rakovina. Haptoglobín sa zvyčajne zvyšuje 2- až 10-násobne a je obzvlášť vysoký pri FIP (TIZARD, 2013b). V tabuľke 1 sú zhrnuté jednotlivé pozitívne APP v kontexte ochorenia mačiek.

Negatívne proteíny akútnej fázy

Najvýznamnejším negatívnym APP je albumín, ktorého koncentrácia v krvi počas APR klesá v dôsledku odchýlky aminokyselín smerom k syntéze pozitívnych APP (CRAY et al., 2009; PALTRINIERI, 2007a). Ďalšími negatívnymi APP sú transferín, transtyretin, retinol ligand a proteín viažuci kortizol, proteíny podieľajúce sa na transporte vitamínov a hormónov (JAIN et al., 2011).

Proteíny akútnej fázy pri ochorení mačiek

Na rozdiel od cytokínov, ktoré majú malú veľkosť a sú rýchlo filtrované obličkami, proteíny akútnej fázy majú vyššiu molekulovú hmotnosť (viac ako 45 kDa) a následne dlhšie zotrvávajú v plazme (SALGADO et al., 2011).

Hladiny APP môžu vypovedať iba o zápale a následne ich koncentrácie môžu pomôcť pri diagnostike a monitorovaní ochorenia. APP môže pomôcť odhaliť subklinický zápal, odlíšiť akútne ochorenie od chronického a predpovedať jeho priebeh (VILHENA et al, 2018; JAVARD et al., 2017). Keďže APR sa začína pred vznikom špecifických imunologických zmien, môžu sa použiť ako včasný marker ochorenia, skôr ako nastanú zmeny leukogramu, pričom ich magnitúda súvisí so závažnosťou ochorenia (PETERSEN et al., 2004; CÉRON et al., 2005; VILHENA et al., 2018). Z tohto dôvodu možno monitorovanie ochorení považovať za jednu z najzaujímavejších a najsľubnejších aplikácií APP.

Hladiny APP spolu s klinickými príznakmi a krvnými testami sa hodnotili pri rôznych ochoreniach zvierat (t. j. FIP, zápalové ochorenie čriev psov, leishmanióza, ehrlichióza a pyometra psov) a ukázali sa ako užitočné pri diagnostike, monitorovaní odpovede na liečbu a prognóze (ECKERSALL a kol.), 2001; MARTINEZ- SUBIELA et al., 2005; SHIMADA et al., 2002; JERGENS et al., 2003; GIORDANO et al., 2004; PETERSEN et al., 2004; DABROWSKI et al., 2009; VILHENA et al., 2018).

Na získanie úplných informácií o APR by sa mal súčasne vyhodnotiť jeden hlavný a jeden stredne veľký pozitívny, ako aj jeden negatívny APP (CERÓN a kol., 2008). Vysoké koncentrácie hlavného APP zvyčajne súvisia s infekčnými ochoreniami, zvyčajne systémovou bakteriálnou infekciou alebo imunitne sprostredkovaným ochorením (CERÓN et al., 2008; TROÌA et al., 2017). Aj keď by sa APP mali analyzovať spolu s počtom bielych krviniek a neutrofilov, sú najcitlivejšie pri včasnom odhalení zápalu a infekcie (CERÓN et al., 2008; ALVES et al., 2010). Špecifickosť týchto proteínov je však pri zisťovaní príčiny procesu nízka, pričom sa zvyšuje aj pri fyziologických stavoch, ako je napríklad tehotenstvo (PALTRINIERI et al., 2008).

APPChoroba
SAAFIP
Indukovaný zápal a chirurgický zákrok
Rôzne ochorenia (pankreatitída, zlyhanie obličiek, FLUTD, nádory, diabetes mellitus; ochorenie obličiek, poranenie atď.)
Sepsa
FeLV; infekcie hemotropnými mykoplazmami
Infekcia Hepatozoonfelis a Babesia vogeli
Dirofilariaimmitis
Mačky s FIV liečené rekombinantným mačacím interferónom
AGPInfekcia spôsobená Chlamydophila psittaci;
Pankreatitída a nádory pankreasu
FIP
Lymfóm a iné nádory
Indukovaný zápal a chirurgický zákrok
Mačky s FIV liečené rekombinantným mačacím interferónom
Abscesy, pyotorax, nekróza tukového tkaniva
Rôzne ochorenia (FLUTD, nádory, diabetes mellitus, ochorenia obličiek, poranenia atď.)
HaptoglobínFIP
Indukovaný zápal a chirurgický zákrok
Abscesy, pyotorax, nekróza tukového tkaniva
Rôzne ochorenia (FLUTD, nádory, diabetes mellitus, ochorenia obličiek, poranenia atď.)
Infekcia Hepatozoonfelis a Babesia vogeli
FeLV, hemotropné mykoplazmy
Dirofilariaimmitis
CRPMačky s FIV liečené rekombinantným mačacím interferónom
Indukovaný zápal a chirurgický zákrok
Tabuľka 1 – Proteíny akútnej fázy skúmané v súvislosti s chorobami mačiek.
Legenda: Sérový amyloid A (SAA), α1-kyslý glykoproteín (AGP), syndróm systémovej zápalovej reakcie (SIRS), ochorenie dolných močových ciest mačiek (FLUTD), mačacia infekčná peritonitída (FIP), vírus leukémie mačiek (FeLV), vírus imunodeficiencie mačiek (FIV); mačací kalicivírus (FCV).

Obrázok 1 znázorňuje očakávané správanie pozitívnych proteínov akútnej fázy na základe revidovaných štúdií. AGP, SAA a haptoglobín boli označené za užitočné indikátory na monitorovanie akútnej zápalovej reakcie u mačiek (WINKEL et al., 2015; PALTRINIERI et al., 2007a,b; KAJIKAWA et al., 1999). APP u mačiek boli prvýkrát identifikované po porovnávacích meraniach v sére klinicky normálnych a chorých zvierat, v štúdiách experimentálne vyvolaného zápalu a v pooperačných štúdiách (KAJIKAWA et al., 1999). Koncentrácia SAA sa údajne zvýšila ako prvá, následne sa zvýšila koncentrácia AGP a haptoglobínu, čo bolo v protiklade s menej výrazným zvýšením CRP (KAJIKAWA et al., 1999). Jedna štúdia ukázala, že CRP sa pri zápale u mačiek správa podobne ako SAA a AGP (LEAL et al., 2014).

Sérový amyloid A

SAA je u viacerých druhov jedným z hlavných APP, dôležitý u ľudí aj mačiek (KAJIKAWA et al., 1999). Moduluje imunitnú odpoveď tým, že priťahuje zápalové bunky do tkanív a vedie k produkcii viacerých zápalových cytokínov (GRUYS et al., 2005; TIZARD, 2013a). Jeho koncentrácia sa môže pri zápalovom stave zvýšiť viac ako 1 000-krát, čo následne chápeme ako zápal (TAMAMOTO a kol., 2013). Takéto zvýšenie sa však môže pozorovať pri nezápalových i zápalových ochoreniach a pri neopláziách (TAMAMOTO a kol., 2013). Podľa štúdie vykonanej u mačiek, ktoré podstúpili operáciu, sa koncentrácia SAA začína zvyšovať približne po 3 až 6 hodinách, pričom najvyššiu hodnotu dosahuje 21 až 24 hodín po operácii (SASAKI et al.,2003).

Obrázok 1 – Idealizované správanie sa proteínov akútnej fázy u mačky po zápalovom podnete. Hodnoty znázorňujúce zmeny nemožno považovať za absolútne. Zvýšenie sérového amyloidu A (SAA) 3 až 6 h po podnete, vrchol po 21 až 24 h, veľkosť pri vrchole 10 až 50-násobok jeho bazálnej plazmatickej koncentrácie. Alfa 1 kyslý glykoproteín (AGP) zvýšenie 8 h po podnete, vrchol v 36 h, veľkosť v čase vrcholu 2 až 10-násobok jeho základnej plazmatickej koncentrácie. Zvýšenie haptoglobulínu (Hp) 24 h po podnete, vrchol o 36 až 48 h, veľkosť na vrchole 2 až 10-násobok jeho bazálnej hodnoty plazmatickej koncentrácie. C-reaktívny proteín (CRP) zvýšenie 8 h po podnete, vrchol v 36 h, veľkosť pri vrchole 1,5-násobok jeho bazálnych hodnôt.

Alfa 1-kyslý glykoproteín

Alfa 1-kyslý glykoproteín (AGP) je proteín reagujúci s akútnou fázou, ktorý sa nachádza v séromukoidovej časti séra (SELTING et al., 2000; WINKEL et al., 2015). Ako väčšina pozitívnych APP je AGP glykoproteín syntetizovaný prevažne hepatocytmi pri APR a uvoľňovaný do krvného obehu (CÉRON et al., 2005).

AGP možno použiť na monitorovanie včasnej liečby interferónom u mačiek infikovaných vírusom imunodeficiencie mačiek (FIV) (GIL et al., 2014). AGP, ako aj haptoglobín (Hp) sa zvyšuje u anemických mačiek trpiacich pyotoraxom, abscesmi alebo tukovou nekrózou (OTTENJANN a kol., 2006).

Zdá sa, že zmeny AGP pri neoplázii mačiek nie sú v jednotlivých štúdiách konzistentné. Niektoré z nich nepopisujú žiadne zmeny u mačiek s lymfómom (CORREA a kol., 2001). Iné naopak poukazujú na zvýšenie AGP aj SAA u mačiek so sarkómami, karcinómami alebo inými okrúhlo-bunkovými nádormi (SELTING et al., 2000; TAMAMOTO et al., 2013; MEACHEN et al., 2015; HAZUCHOVA et al., 2017).

AGP má význam ako indikátorový test pre FIP, ktorý sa používa špeciálne v Európe (CECILIANI et al., 2004). GIORI et al. skúmali špecifickosť a citlivosť viacerých testov u 12 mačiek, pričom 33,33 % mačiek bolo FIP negatívnych na základe histopatológie a imunohistochémie a 66,66 % mačiek bolo FIP pozitívnych potvrdených histopatológiou a imunohistochémiou. Tento autor dospel k záveru, že na potvrdenie FIP sa musí vždy vykonať imunohistochémia, ale vysoké koncentrácie AGP môžu pomôcť podporiť diagnózu FIP v prípade, že imunohistochémiu nie je možné vykonať a histopatológia nie je presvedčivá.

Haptoglobín

Haptoglobín (Hp) je jedným z najdôležitejších proteínov akútnej fázy u hovädzieho dobytka, oviec, kôz, koní a mačiek (TIZARD, 2013a), syntetizovaný najmä hepatocytmi, ale aj inými tkanivami, ako sú koža, pľúca a obličky (JAIN et al, 2011). Hp sa viaže na molekuly železa a zneprístupňuje ich pre invázne baktérie, čím následne inhibuje bakteriálnu proliferáciu a inváziu. Následne sa viaže aj na voľný hemoglobín, čím zabraňuje jeho oxidácii s lipidmi a proteínmi (TIZARD, 2013a), čo odôvodňuje zníženie Hp v prípade hemolýzy.

U mačiek sa Hp zvyčajne zvyšuje 2- až 10-násobne pri zápalových stavoch, pričom je obzvlášť vysoký pri FIP (TIZARD, 2013a). Hp aj SAA však neposkytli dostatočnú oporu na odlíšenie FIP od iných príčin efúzie v porovnaní s AGP (HAZUCHOVÁ et at., 2017).

Meranie APP

Sérum je zložené z veľkého počtu jednotlivých proteínov, v ktorých môže detekcia zmien v jeho frakciách poskytnúť dôležité diagnostické informácie (ECKERSALL, 2008).

V ideálnom prípade by malo byť k dispozícii meranie všetkých sérových proteínov, aby sa dali použiť ako diagnostický nástroj v súvislosti so zápalovými ochoreniami.
V súčasnosti sa APP (tabuľka 2) môžu stanoviť pomocou enzýmovej imunosorbentovej analýzy (ELISA), rádioimunoanalýzy, nefelometrie, imunoturbidimetrie (IT), Western blotu a analýzy messengerovej ribonukleovej kyseliny (mRNA) (CÉRON et al., 2005;PALTRINIERI et al., 2008; SCHREIBER et. al, 1989). Hoci niektoré testy APP pre ľudí boli automatizované aj pre veterinárnu medicínu, testy špecifické pre jednotlivé druhy sú stále obmedzené. Medzidruhové rozdiely APP a obmedzená dostupnosť skrížene reagujúcich činidiel zatiaľ prispeli k nízkej rutinnej úrovni stanovenia APP vo veterinárnych laboratóriách, najmä u mačiek. Bez ohľadu na to sa technológia vyvíja a v blízkej budúcnosti je možné predpokladať rutinné monitorovanie klinicky relevantných APP u mačiek.

Záver

Proteíny akútnej fázy u mačiek sú biomarkery vhodné na monitorovanie zápalu spolu s ďalšími klinickými a laboratórnymi nálezmi, ktoré sú užitočné pri diagnostike subklinických zmien, monitorovaní vývoja a účinku ochorenia v organizme, ako aj pri hodnotení odpovede na liečbu.

U mačky je SAA APP, ktorý sa najviac prejavuje v reakcii na zápal, nasledovaný AGP a haptoglobínom, na rozdiel od CRP, ktorý sa používa u iných druhov.

Hoci existujú komerčne dostupné sety na určovanie mačacích APP, štandardizácia testov zameraná na technickú jednoduchosť, vyššiu druhovú špecifickosť s nižšími súvisiacimi nákladmi umožní rutinné používanie v mačacej praxi, ako sa to robí v humánnej medicíne.

AnalýzyVýhodyNevýhody
Rádioimunoanalýza24 až 48 hodín na získanie výsledkov, nutné špecifické zručnosti operátora
ELISAKomerčne dostupné súpravy, špecifické pre daný druhNedostatok automatizácie, drahé, určitá „between-run“ nepresnosť
Imunoturbidimetria30 minút na získanie výsledkov, prispôsobiteľné biochemickým analyzátorom
Western BlotDlhé doba na spracovanie imunoblotov
Nefelometrické imunotestyZávisia od skríženej reaktivity zvýšeného antiséra
Tabuľka 2 – Výhody a nevýhody možných techník merania APP.

Dodatok: APP a ich pozícia v elektroforetograme

Aj keď existujú testy priamo na konkrétne APP, je užitočné vedieť, v ktorom regióne elektroforetogramu sa nachádzajú.

Ukážka elektroforetogramu (Výstup elektroforézy sérových bielkovín)
Sérový proteínElektroforetický región
α1-kyslý glykoproteínα1 (alfa-1)
Sérový amyloid Aα (alfa)
Haptoglobínα2 (alfa-2)
Ceruloplazmín α2 (alfa-2)
Transferínβ1 (beta-1)
C-reaktívny proteínγ (gama)
Pozícia sérových proteínov v elektroforetograme

Literatúra

  • ALVES, A.E. et al. Leucogram and serum acute phase protein concentrations in queens submitted to conventional or videolapa- roscopic ovariectomy. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterina- ria e Zootecnia, v.62, n.1, p.86-91, 2010. Available from: . Accessed: Oct. 10, 2018. doi: 10.1590/S0102-09352010000100012.
  • BAUMANN, H. & GAULDIE, J. The acute phase response.
    Immunol Today, v.15, n.2, p.74-80, 1994. Available from:
    https://doi.org/10.1016/0167-5699(94)90137-6. Accessed: Aug. 21, 2018. doi: 10.1016/0167-5699(94)90137-6.
  • BAUMANN, H. et al. Distinct regulation of the interleukin-1 and interleukin-6 response elements of the rat haptoglobin gene in rat and human hepatoma cells. Molecular and Cellular Biology, v.10, n.11, p.5967–5976, 1990. Available from: Accessed: Aug. 21, 2018. doi: 10.1128/ MCB.10.11.5967.
  • BENCE, L. et al. An immunoturbidimetric assay for rapid quantitative measurement of feline alpha-1-acid glycoprotein in serum and peritoneal fluid. Veterinary Clinical Pathology, v.34, n.4, p335-341, 2005. Available from: . Accessed: Jan. 13, 2019. doi: 10.1111/j.1939-165X.2005.tb00058.x.
  • CALLAHAN, G. & YATES, R. Veterinary Clinical Laboratory Immunology. In Warren, A. Basic Veterinary Immunology, pp. 295-317, 2014. Boulder, Colorado: University Press of Colorado.
  • CECILIANI, F. et al. Decreased sialylation of the acute phase protein α1-acid glycoprotein in feline infectious peritonitis (FIP). Veterinary Immunology and Immunopathology, v.99, n.3- 4, p.229-236, 2004. Available from: . Accessed: Aug. 24, 2018. doi: 10.1016/j. vetimm.2004.02.003.
  • CERÓN, J. et al. Acute phase proteins in dogs and cats: current
    knowledge and future perspectives. Veterinary Clinical
  • Pathology, v.34, n.2, p.85-99, 2005. Available from: . Accessed: Aug. 20, 2018. doi: 10.1111/j.1939-165X.2005.tb00019.x.
  • CERÓN, J.J. A seven-point plan for acute phase protein interpretation in companion animals. Veterinary Journal, v.177, n.1, p.6-7, 2008. Available from: . Accessed: Aug. 20, 2018. doi: 10.1016/j. tvjl.2007.12.001.
  • CORREA, S.S et al. Serum alpha 1-acid glycoprotein concentration in cats with lymphoma. Journal of the American Animal Hospital Association, v.37, n.2, p.153-158, 2001. Available from:
    https://doi.org/10.5326/15473317-37-2-153. Accessed: Aug. 24, 2018. doi: 10.5326/15473317-37-2-153.
  • CRAY, C. et al. AcutePhase Response in Animals: A Review. Comparative Medicine, v.59, n.6, p.517–526, 2009. Available from: . Accessed: Aug. 21, 2018.
  • DABROWSKI, R. et al. Usefulness of C-reactive protein, serum amyloid A component and haptoglobin determinations in bitches with pyometra for monitoring early postovariohysterectomy complications. Theriogenology, v.72, n.4, p.471–476, 2009. Available from: . Accessed: Aug. 23, 2018. doi: 10.1016/j.theriogenology.2009.03.017.
  • DUTHIE, S. et al. Value of α1-acid glycoprotein in the diagnosis of feline infectious peritonitis. The Veterinary Record, v.141, n.12, p.299–303, 1997. Available from: . Accessed: Aug. 11, 2018. doi: 10.1136/ vr.141.12.299.
  • ECKERSALL, P. Proteins, Proteomics, and the Dysproteinemias. In Kaneko, J., Harvey, J. & Bruss, M. In Clinical Biochemistry of Domestic Animals. 6. ed. USA: Elsevier, 2008, Chap. 5, p.117-155.
  • ECKERSALL, P.D. & BELL, R. Acute phase proteins: Biomarkers of infection and inflammation in veterinary medicine. The Veteri- nary Journal, v.185, n.1, p.23-27, 2010. Available from: . Accessed: Aug. 20, 2018. doi: 10.1016/j.tvjl.2010.04.009.
  • ECKERSALL, P.D. et al. Acute phase protein response in an experimental model of ovine caseous lymphadenitis. BMC Veterinary Research, v.19, p.3-35, 2007. Available from: . Accessed: Aug. 24, 2018. doi: 10.1016/j.tvjl.2010.04.009.
  • ECKERSALL, P.D. et al. Acute phase proteins in serum and milk from dairy cows with clinical mastitis. Veterinary Record, v.148, n.2, p.35–41, 2001. Available from: . Accessed: Aug. 22, 2018. doi: 10.1136/ vr.148.2.35.
  • GIL, S. et al. Oral recombinant feline interferon-omega as an alternative immune modulation therapy in FIV positive cats: Clinical and laboratory evaluation. Research in Veterinary Science, v.96, n.1, p.79–85, 2014. Available from: . Accessed: Oct. 10, 2018. doi: 10.1016/j.rvsc.2013.11.007.
  • GIORDANO, A. et al. Changes in some acute phase protein and immunoglobulin concentrations in cats affected by feline infectious peritonitis or exposed to feline coronavirus infection. The Veterinary Journal, v.167, n.1, p.38-44, 2004. Available from:
    https://doi.org/10.1016/S1090-0233(03)00055-8. Accessed:
    Aug. 9, 2018. doi: 10.1016/S1090-0233(03)00055-8.
  • GIORI, L. et al. Performances of different diagnostic tests for feline infectious peritonitis in challenging clinical cases. Journal of Small Animal Practice, v.52, n.3, p.152-157, 2011. Available from:
    https://doi.org/10.1111/j.1748-5827.2011.01042.x. Accessed:
    Aug. 24, 2018. doi: 10.1111/j.1748-5827.2011.01042.x.
  • GRUYS, E. et al. Acute phase reaction and acute phase proteins. Journal of Zhejiang University. Science B, v.6, n.11, p.1045- 1056, 2005. Available from: . Accessed: Aug. 21, 2018.
    doi: 10.1631/jzus.2005.B1045.
  • HAZUCHOVA, K. et al. Usefulness of acute phase proteins in differentiating between feline infectious peritonitis and other diseases in cats with body cavity effusions. Journal of Feline Medicine and Surgery, v.19, n.8, p.809-816, 2017. Available from: https://doi.org/10.1177/1098612X16658925. Accessed: Aug. 11, 2018. doi: 10.1177/1098612X16658925.
  • HOCHEPIED, T. et al. α1-Acid glycoprotein: an acute phase protein with inflammatory and immunomodulating properties. Cytokine Growth Factor Rev, v.14, n.1, p.25–34, 2003. Available from:
    https://doi.org/10.1016/S1359-6101(02)00054-0. Accessed: Aug. 21, 2018. doi: 10.1016/S1359-6101(02)00054-0.
  • JACOBSEN, S. et al. Evaluation of a commercially available human serum amyloid A (SAA) turbidometric immunoassay for determination of equine SAA concentrations. Veterinary Journal, v.172, n.2, p.315–319, 2006. Available from: . Accessed: Aug. 24, 2018. doi: 10.1016/j.tvjl.2005.04.021.
  • JAIN, S. et al. Acute-phase proteins: As diagnostic tool. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences, v.3 v.1, p.118–127, 2011. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3053509/. Accessed: Aug. 21, 2018. doi: 10.4103/0975-7406.76489.
  • JAVARD R. et al. Acute phase proteins and iron status in cats with chronic kidney Disease. Journal of Veterinary Internal Medicine, v.31, n.2, p.457-464, 2017. Available from: . Accessed: Oct. 10, 2018. doi: 10.1111/jvim.14661.
  • JERGENS, A.E. et al. A scoring index for disease activity in canine inflammatory bowel disease. Journal of Veterinary Internal Medicine, v.17, n.3, p.291–297, 2003. Available from: . Accessed: Aug. 22, 2018. doi: 10.1111/j.1939-1676.2003.tb02450.x.
  • KAJIKAWA, T. et al. Changes in concentrations of serum amyloid A protein, alpha 1-acid glycoprotein, haptoglobin, and C-reactive protein in feline sera due to induced inflammation and surgery. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.68, n.1, p. 91-98, 1999. Available from: Accessed: Aug. 10, 2018. doi: 10.1016/S0165-2427(99)00012-4.
  • KANN, R. et al. Acute phase proteins in healthy and sick cats. Research in Veterinay Science, v.93, n.2. p.649-654, 2012. Available from: https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2011.11.007. Accessed: Aug. 20, 2018. doi: 10.1016/j.rvsc.2011.11.007.
  • KURIBAYASHI, T. et al. Alpha 1-acid glycoprotein (AAG) levels
    in healthy and pregnant beagle dogs. Experimental Animals, v.52,
    n. 5, p.377–381, 2003. Available from: . Accessed: Jan. 13, 2019. doi: 10.1538/expanim.52.377.
  • LEAL, R. et al. Monitoring acute phase proteins in retrovirus infected cats undergoing feline interferon-ω therapy. Journal of Small Animal Practice, v.55, n.1, p.39-45, 2014. Available from:
    https://doi.org/10.1111/jsap.12160. Accessed: Jan. 6, 2019. doi: 10.1111/jsap.12160.
  • MARTÍNEZ-SUBIELA, S. et al. Validación analítica de técnicas comerciales para la determinación de haptoglobina, proteína C reactiva y amiloide A sérico en caninos [Analytical validation of comercial techniques for haptoglobin, C reactive protein and sérum amyloid A determinations in dogs]. Archivos de Medicina Veterinaria, v.37, n.1, 2005. Available from: . Accessed: Jan. 13, 2019. doi: 10.4067/S0301-732X2005000100009.
  • MEACHEM, M.D. et al. A comparative proteomic study of plasma in feline pancreatitis and pancreatic carcinoma using 2-dimensional gel electrophoresis to identify diagnostic biomarkers: A pilot study. Canadian Journal of Veterinary Research, v.79, n.3, p.184-189, 2015. Available from: . Accessed: Oct. 10, 2018.
  • MURATA, H. et al. Current research on acute phase proteins in veterinary diagnosis: An overview. The Veterinary Journal, v.168, n.1, p.28–40, 2004. Available from: . Accessed: Aug. 20, 2018. doi: 10.1016/ S1090-0233(03)00119-9.
  • OTTENJANN, M. et al. Characterization of the anemia of inflammatory disease in cats with abscesses, pyothorax, or fat necrosis. Journal of Veterinary Internal Medicine, v.2, n.5, p. 1143-1150, 2006. Available from: . Accessed: Aug. 24, 2018. doi: 10.1111/j.1939-1676.2006.tb00713.x.
  • PALTRINIERI, S. Early biomarkers of inflammation in dogs and cats: The acute phase protein. Veterinary Research Communications, v.31, n.1, p.125-129, 2007a. Available from:
    . Accessed: Aug. 21, 2018. doi: 10.1007/s11259-007- 0107-3.
  • PALTRINIERI, S. et al. Serum alpha1-acid glycoprotein (AGP) concentration in non-symptomatic cats with feline coronavirus (FCoV) infection. Journal of Feline Medicine and Surgery, v.9, n.4, p.271-277, 2007b. Available from: . Accessed: Aug. 11, 2018. doi: 10.1016/j. jfms.2007.01.002.
  • PALTRINIERI, S. The feline acute phase reaction. Review. The Veterinary Journal, v.111, n.1, p.26-35, 2008. Available from:
    https://doi.org/10.1016/j.tvjl.2007.06.005. Accessed: Aug. 24, 2018. doi: 10.1016/j.tvjl.2007.06.005.
  • PETERSEN, H. et al. Application of acute phase protein measurements in veterinary clinical chemistry. Veterinary Research, v.35, n.2, p.163–187, 2004. Available from: . Accessed: Aug. 20, 2018. doi: 10.1051/vetres:2004002.
  • SALGADO, F. J., et al. (2011). Acute phase proteins as biomarkers of disease: from Bench to Clinical Practice. In Veas, F. Acute Phase Proteins as Early Non-Specific Biomarkers of Human and Veterinary Diseases. Rijeka, Croatia: InTech. Available from:
    http://www.documentation.ird.fr/hor/fdi:010060045. Accessed:
    Aug. 21, 2018. doi: 10.5772/1045.
  • SASAKI, K. et al. Evaluation of feline serum amyloid A (SAA) as an inflammatory marker. Journal of Veterinary Medical Science, v.65, n.4, p.545-8, 2003. Available from: . Accessed: Aug. 10, 2018.
  • SCHREIBER, G. et al. The acute phase response in the rodent. Annals of the New York Academy of Science, v.557, p.61–85, 1989. Available from: . Accessed: Aug. 24, 2018. doi: 10.1111/j.1749- 6632.1989.tb24000.x.
  • SELTING, K. et al. Serum alpha 1-acid glycoprotein concentrations in healthy and tumor-bearing cats. Journal of Veterinary Internal Medicine, v.14, n.5, p.503-506, 2000. Available from: . Accessed: Aug. 9, 2018. doi: 10.1111/j.1939-1676.2000.tb02267.x.
  • SHIMADA, T. et al. Monitoring C-reactive protein in beagle dogs experimentally inoculated with Ehrlichiacanis. Veterinary Research Communications, v.26, n.3, p.171– 177, 2002. Available from: . Accessed: Aug. 22, 2018. doi:
    10.1023/A:1015290903332.
  • SILVESTRE-FERREIRA, A.C. et al. Serum acute phase proteins in Dirofilariaimmitis and Wolbachia seropositive cats. Journal of Feline Medicine and Surgery, v.19, n.6, p.693–696, 2017. Available from: https://doi.org/10.1177/1098612X15625435. Accessed: Sep. 16, 2018. doi: 10.1177/1098612X15625435.
  • TAMAMOTO, T. et al. Serum amyloid A as a prognostic marker in cats with various diseases. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.25, n.3, p.428–432, 2013. Available from: . Accessed: Jan. 27, 2019.
  • TECLES, F. et al. Validation of a commercially available human immunoturbidimetric assay for haptoglobin determination in canine serum samples. Veterinary Research Communications, v.31, n.1, p.23–36, 2007. Available from: . Accessed: Jan. 13, 2019. doi: 10.1007/s11259-006-3397-y.
  • TERWEE, J. et al. Characterization of the systemic disease and ocular signs induced by experimental infection with Chlamydia psittaci in cats. Veterinary Microbiology, v.59,
    259-281, 1998. Available from: . Accessed: Aug. 20, 2018. doi: 10.1016/ S0378-1135(97)00185-5.
  • TIZARD, I. Innate immunity:proinflammatory and antimicrobial mediators/systemic responses to inflammation. In Veterinary Immunology. 9.ed. St. Louis, Missouri: Saunders, Elsevier, 2013a. Chap. 6, p.52-58.
  • TIZARD, I. Innate immunity: proinflammatory and Atimicrobial mediators/systemic responses to Inflammation. In Veterinary Immunology. 9.ed. St. Louis, Missouri: Saunders, Elsevier, 2013b. Chap. 4, p.31-40.
  • TROÌA, R. et al. Serum amyloid A in the diagnosis of feline sepsis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.29, n.6, p.856-859, 2017. Available from: . Accessed: Aug. 11, 2018. doi: 10.1177/1040638717722815.
  • VILHENA, H. et al. Acute phase proteins response in cats naturally infected by hemotropic mycoplasmas. Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases, v.56, p.1-5, 2018. Available from: https://doi.org/10.1016/j.cimid.2017.11.001. Accessed: Aug. 11, 2018. doi: 10.1016/j.cimid.2017.11.001.
  • VILHENA, H. et al. Acute phase proteins response in cats naturally infected with Hepatozoonfelis and Babesia vogeli. Veterinary Clinical Pathology, v.48, n.1, p.72-76, 2017. Available from:
    https://doi.org/10.1111/vcp.12451. Accessed: Aug. 10, 2018. doi: 10.1111/vcp.12451.
  • WEIDMEYER, C. & SOLTER, P. Validation of human haptoglobin immunoturbidimetric detection of haptoglobin in equine and canine serum and plasma. Veterinary Clinical Pathology, v.24, n.4, p.141–146, 1996. Available from: . Accessed: Jan. 13, 2019. doi: 10.1111/j.1939-165X.1996.tb00988.x.
  • WHICHER, T. et al. Immunonephelometric and immunoturbidi- metric assays for proteins. Critical Reviews in Clinical Labo- ratory Sciences, v.18, n.3, p.213–260, 1983. Available from:
    https://doi.org/10.3109/10408368209085072. Accessed: Aug. 13, 2019. doi: 10.3109/10408368209085072.
  • WINKEL, V. et al. Serum α-1 acid glycoprotein and serum amyloid A concentrations in cats receiving antineoplastic treatment for lymphoma. American Journal Veterinary Research, n.76, v.11, p.983-988, 2015. Available from: . Accessed: Aug. 22, 2018. doi: 10.2460/ ajvr.76.11.983.
Publikované

Alternatívna liečba mačiek s FIP a prirodzenou alebo získanou rezistenciou voči GS-441524

Niels C. Pedersen, Nicole Jacque, 3.11. 2021
Pôvodný článok: Alternative treatments for cats with FIP and natural or acquired resistance to GS-441524

Skratky:
SC – subcutaneous – podkožne
IV – intravenózne
IM – do svalu
PO – per os – perorálne
SID – raz denne
BID – 2x denne
q24h – raz za 24 hodín
q12h – raz za 12 hodín

Úvod

Rezistencia na antivirotiká je dobre zdokumentovaná v prípade chorôb, ako sú HIV/AIDS a hepatitída C. V niektorých prípadoch je táto rezistencia prítomná v infikujúcom víruse, ale častejšie je dôsledkom dlhodobej expozície lieku. Rezistencia na GC376 [1] a GS-441524 [2] bola zdokumentovaná aj u mačiek s prirodzene získanou FIP. Rezistencia sa vyvíja na základe mutácií v oblastiach vírusového genómu, ktoré obsahujú ciele pre antivírusové liečivo. Napríklad v proteáze (3CLpro) izolátu FIPV od mačky s rezistenciou na GC376 sa zistilo niekoľko zmien aminokyselín (N25S, A252S alebo K260N) [3]. Zistilo sa, že zmena N25S v 3CLpro spôsobuje 1,68-násobné zvýšenie 50 % inhibičnej koncentrácie GC376 v tkanivových kultúrach [3]. Rezistencia voči GC376, hoci bola rozpoznaná v počiatočných terénnych testoch, nebola doteraz opísaná. GC376 nie je tak populárny pri liečbe FIP a neodporúča sa pre mačky s okulárnou alebo neurologickou FIP [1].

Prirodzená rezistencia na GS-441524 bola pozorovaná u jednej z 31 mačiek liečených na prirodzene získanú FIP [2]. Jedna z 31 mačiek v pôvodnej terénnej štúdii GS-441524 sa tiež javila ako rezistentná, keďže hladiny vírusovej RNA sa počas celého obdobia liečby neznížili a príznaky ochorenia sa nezmiernili. Hoci sa tento vírus neštudoval, rezistencia na GS-5734 (Remdesivir), proliečivo GS-441524, bola vytvorená v tkanivovej kultúre pomocou aminokyselinových mutácií v RNA polymeráze a korektívnej exonukleáze [4].

Rezistencia voči GS-441524 bola potvrdená u časti mačiek, ktoré boli liečené na FIP pomocou GS-441524 za posledné 3 roky, najmä medzi mačkami s neurologickou FIP [5]. Rezistencia na GS441524 je zvyčajne čiastočná a vyššie dávky často vyliečia infekciu alebo výrazne znížia príznaky ochorenia počas trvania liečby. Zaujímavé je, že rezistencia na GS-441524 sa zisťuje aj u pacientov s Covid19 liečených Remdesivirom [12]. U imunokompromitovaného pacienta sa vyvinul zdĺhavý priebeh infekcie SARS-CoV-2. Liečba Remdesivirom spočiatku zmiernila príznaky a výrazne znížila hladiny vírusu, ale ochorenie sa vrátilo spolu s veľkým nárastom replikácie vírusu. Sekvenovaním celého genómu sa identifikovala mutácia E802D v nsp12 RNA-dependentnej RNA polymeráze, ktorá nebola prítomná vo vzorkách pred liečbou a spôsobovala 6-násobné zvýšenie rezistencie.

Aj keď už bola opísaná história molnupiraviru a jeho nedávne použitie na liečbu FIP [6], v súčasnosti nie sú k dispozícii žiadne štúdie, ktoré by dokumentovali prirodzenú alebo získanú rezistenciu na molnupiravir. Ukázalo sa, že molnupiravir funguje ako mutagén RNA vyvolávajúci viaceré defekty vo vírusovom genóme [7], zatiaľ čo remdesivir/GS-441524 je neobligátny terminátor reťazca RNA [8], čo naznačuje, že jeho profil rezistencie bude odlišný.

Prekonanie rezistencie voči GS-441524

Rezistenciu na lieky možno prekonať len dvomi spôsobmi: 1) postupným zvyšovaním dávky antivirotika, aby sa dosiahli hladiny liečiva v telesných tekutinách, ktoré presahujú úroveň rezistencie, alebo 2) použitím iného antivirotika, ktoré má iný mechanizmus rezistencie, buď samostatne, alebo v kombinácii. Doteraz sa volila prvá možnosť, ktorá sa v mnohých prípadoch ukázala ako účinná. Rezistencia na GS-441524 však môže byť úplná alebo taká vysoká, že zvyšovanie dávky už nie je účelné. V takýchto prípadoch sa čoraz viac využíva druhá možnosť. V súčasnosti dostupnými alternatívami k lieku GS-441524, aj keď stále z neschváleného trhu, sú GC376 a molnupiravir.

Režimy liečby antivírusovými liekmi pri rezistencii na GS-441524

GC376/GS-441524


Kombinovaný režim GS/GC sa osvedčil u mačiek liečených GS-441524 v dávkach až 40 mg/kg bez vyliečenia v dôsledku rezistencie na GS-441524. Je vhodnejšie zasiahnuť hneď, ako sa zistí rezistencia na GS-441524, čo umožní vyliečiť mačku skôr a s menšími finančnými nákladmi majiteľa.

Spoločnosť Rainman je súčasným dodávateľom GC376, ktorý sa dodáva v 4 ml injekčných vialkách s koncentráciou 53 mg/ml.

Dávkovanie GS/GC: Dávka GS (SC alebo PO ekvivalent) pri kombinovanej liečbe antivirotikami je rovnaká ako dávka potrebná na primeranú kontrolu príznakov ochorenia. Zvyčajne je to posledná dávka použitá pred ukončením liečby a vznikom relapsu. K tejto dávke GS-441524 sa pridáva GC376 v dávke 20 mg/kg SC q24h bez ohľadu na formu FIP. Toto je dostatočné pre väčšinu mačiek, vrátane mnohých mačiek s neuro FIP, ale niektoré budú potrebovať vyššie dávky. Ak sa nedosiahne remisia klinických príznakov alebo sú krvné testy znepokojujúce, dávka GC376 sa zvyšuje o 10 mg/kg až na 50 mg/kg SC q24h.

Dĺžka liečby: Odporúča sa osemtýždňová kombinovaná liečba GC/GS, ktorá sa pridáva k predchádzajúcej monoterapii GS. Niektoré mačky boli vyliečené pri 6 týždňoch kombinovanej liečby, ale recidíva je pravdepodobnejšia ako po 8 týždňoch.

Vedľajšie účinky: U väčšiny mačiek sa nevyskytujú žiadne závažné vedľajšie účinky. Približne jedna z piatich mačiek však môže pociťovať nevoľnosť alebo nepríjemné pocity na začiatku liečby a občas aj dlhšie. Zdá sa, že tieto vedľajšie účinky nie sú závislé od dávky a možno ich liečiť liekmi proti nevoľnosti, ako sú Cerenia, Ondansetron alebo Famotidín. Zdá sa, že u niektorých mačiek lepšie účinkoval ondansetrón.

Molnupiravir

Molnupiravir bol hlásený ako účinný v monoterapii mačiek s FIP najmenej jedným čínskym predajcom GS-441524 [9], ale nie sú žiadne správy o jeho použití u mačiek s rezistenciou na GS-441524. Je však nepravdepodobné, že by sa rezistencia na GS-441524 rozšírila aj na molnupiravir. Skutočnosť, že sa zistilo, že je účinný ako perorálny liek, ho robí atraktívnym aj pre samostatnú liečbu, keďže mnohé mačky s rezistenciou na GS-441524 trpeli injekciami veľmi dlhé obdobie.

Terénna štúdia molnupiraviru údajne pozostávala z 286 mačiek s rôznymi formami prirodzene sa vyskytujúcej FIP, ktoré boli vyšetrené na klinikách pre spoločenské zvieratá v USA, Spojenom kráľovstve, Taliansku, Nemecku, Francúzsku, Japonsku, Rumunsku, Turecku a Číne. Medzi 286 mačkami, ktoré sa zúčastnili na skúške, nedošlo k žiadnemu úmrtiu, vrátane siedmich mačiek s očnou (n=2) a neurologickou (n=5) FIP. Dvadsaťosem z týchto mačiek bolo vyliečených po 4 – 6 týždňoch liečby a 258 po 8 týždňoch. Všetky liečené mačky zostali zdravé o 3 – 5 mesiacov neskôr, čo je obdobie, počas ktorého by sa u mačiek, ktoré neboli úspešne vyliečené, očakávali recidívy. Tieto údaje poskytujú presvedčivé dôkazy o bezpečnosti a účinnosti molnupiraviru pre mačky s rôznymi formami FIP. Dúfame však, že táto terénna štúdia bude napísaná vo forme rukopisu, predložená na recenzné konanie a publikovaná. Napriek tomu sa teraz predáva majiteľom mačiek s FIP. Minimálne jeden ďalší veľký predajca lieku GS-441524 má tiež záujem o používanie molnupiraviru na FIP, čo naznačuje dopyt po ďalšej liečbe mačiek s FIP antivirotikami.

Dávkovanie molnupiraviru: Bezpečné a účinné dávkovanie molnupiraviru u mačiek s FIP nebolo stanovené na základe dôkladne kontrolovaných a monitorovaných terénnych štúdií, aké boli vykonané napríklad pre GC376 [1] a GS-441524 [2]. Najmenej jeden predajca z Číny však vo svojom reklamnom letáku na produkt s názvom Hero-2801 [9] poskytol niektoré farmakokinetické údaje a údaje z terénnych testov Molnupariviru u mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou FIP. V týchto informáciách nie je jasne uvedené množstvo molnupiraviru v jednej z ich „50 mg tabliet“ a skutočný dávkovací interval (q12h alebo q24h?). Dávka použitá v tejto štúdii sa tiež zdala byť príliš vysoká. Odhadovanú počiatočnú dávku molnupiraviru u mačiek s FIP možno našťastie získať z publikovaných štúdií o EIDD-1931 a EIDD-2801 [15] in vitro na bunkových kultúrach a laboratórnych a terénnych štúdií GS-441524 [14,18]. Molnupiravir (EIDD-2801) má EC50 0,4 uM/ul proti FIPV v bunkovej kultúre, zatiaľ čo EC50 GS-441524 je približne 1,0 uM/ul [18]. Oba majú podobnú perorálnu absorpciu približne 40 – 50 %, takže účinná subkutánna (SC) dávka molnupiraviru by bola približne polovica odporúčanej začiatočnej dávky 4 mg/kg SC q24h pre GS441524 [14] alebo 2 mg/kg SC q24h. Perorálna (PO) dávka by sa zdvojnásobila, aby sa zohľadnila menej účinná perorálna absorpcia na dávku 4 mg/kg PO q24h. Odhadovanú počiatočná účinnú perorálnu dávku molnupiraviru u mačiek s FIP možno vypočítať aj z dostupných údajov o liečbe Covid-19. Pacientom liečeným Covidom-19 sa podáva 200 mg molnupiraviru PO q12h počas 5 dní. Táto dávka bola samozrejme vypočítaná na základe farmakokinetickej štúdie vykonanej na ľuďoch, a ak priemerný človek váži 60 – 80 kg (70 kg), účinná inhibičná dávka je ~ 3,0 mg/kg PO q12h. Mačka má bazálnu rýchlosť metabolizmu 1,5-krát vyššiu ako človek a za predpokladu rovnakej perorálnej absorpcie u ľudí aj mačiek by minimálna dávka pre mačky podľa tohto výpočtu bola 4,5 mg/kg PO q12h pri neokulárnych a neneurologických formách FIP. Ak molnupiravir prechádza cez hematookulárnu a hematoencefalickú bariéru s rovnakou účinnosťou ako GS-441524 [3,18], dávka by sa mala zvýšiť na ~1,5 a ~2,0-násobok., aby došlo k adekvátnemu prieniku do komorovej vody a mozgovomiechového moku pre mačky s očnou (~8 mg/kg PO, q12 h), resp. neurologickou FIP (~10 mg/kg PO, q12 h). Tieto dávky sú porovnateľné s dávkami používanými u fretiek , kde 7 mg/kg q12h udržiava sterilizujúce hladiny liečiva v krvi proti vírusu chrípky (1,86 uM) počas 24 hodín [10]. Dávky u fretiek 128 mg/kg PO q12h spôsobili takmer toxické hladiny v krvi, zatiaľ čo dávka 20 mg/kg PO q12h spôsobila len nepatrne vyššie hladiny v krvi [10].

Molnupiravir/GC376 alebo Molnupiravir/GS-441524

Kombinácie molnupiraviru s GC376 alebo GS-441524 sa budú používať čoraz častejšie, a to nielen kvôli synergii alebo doplnení ich individuálnych antivírusových účinkov, ale aj ako spôsob prevencie liekovej rezistencie. Liečivé koktaily boli veľmi účinné pri prevencii liekovej rezistencie u pacientov s HIV/AIDS [11]. V súčasnosti však nie sú k dispozícii dostatočné dôkazy o bezpečnosti a účinnosti kombinácie molnupiraviru s GC376 alebo GS-441524 ako počiatočnej liečby FIP.

Prípadové štúdie


Rocky – DSH MN Neuro FIP


9-mesačný kastrovaný kocúr domácej krátkosrstej mačky získaný ako mačiatko zo záchrannej skupiny mal niekoľko týždňov trvajúce záchvaty so zvyšujúcou sa frekvenciou, ataxiou a progresívnou parézou. Krvné testy boli bez pozoruhodností. Liečba FIP sa začala dávkou 15 mg/kg BID GS-441524, ktorá sa približne týždeň znižovala na SID. U mačky sa do 24 hodín od začiatku liečby prejavilo zlepšenie, záchvaty ustali a zvýšila sa jej pohyblivosť. Do 5 dní liečby bola mačka opäť schopná pohybu. Približne 2 týždne od začiatku liečby sa však u mačky objavila strata zraku, znížená pohyblivosť, obnovenie záchvatov a ťažkosti s prehĺtaním. Bola vykonaná úprava dávky levetiracetamu a prednizolónu, ako aj zmena zloženia lieku GS-441524, po ktorej nasledovalo prechodné zlepšenie pohyblivosti a prehĺtania a zníženie výskytu záchvatov, celkovo sa však stav mačky zhoršil. Dávka lieku GS-441524 sa postupne zvyšovala až na 25 mg/kg, pričom zlepšenie bolo malé alebo žiadne. V tomto bode sa prešlo na perorálne podávanie GS v dávke 25 mg/kg (odhaduje sa, že zodpovedá približne 12,5 mg/kg) a do 3 dní sa mačka začala pohybovať, zlepšilo sa jej videnie a prestali záchvaty spolu so zvýšením energie a chuti do jedla. Zlepšovanie u mačky pokračovalo približne 4 týždne pri perorálnom podávaní GS-441524, potom ustalo približne 3 týždne pred rýchlo postupujúcou parézou. Boli skúšané perorálne dávky až do výšky 30 mg/kg SC ekvivalentu avšak bez účinku. Potom sa prešlo na injekčné podávanie GS-441524 v dávke 20 mg/kg a mačka bola do 4 dní opäť schopná pohybu s dobrou chuťou do jedla a energiou. Po 2 týždňoch sa do dávkovacieho režimu pridala dávka GC376 20 mg/kg BID. Mačka ukončila 6 týždňov kombinovanej liečby GS441524 a GC376 a potom liečbu ukončila. Hoci mačka má určité trvalé neurologické deficity, jej stav je stabilný, má dobrú pohyblivosť, chuť do jedla a aktivitu už 9 mesiacov od ukončenia antivírusovej liečby.

Video Rockyho: https://www.youtube.com/watch?v=RXB_NnfcMOY

Bucky – DSH MN Neuro/okulárna FIP


Štvormesačný kastrovaný kocúr domácej krátkosrstej mačky získaný ako mačiatko zo záchrannej skupiny bol prezentovaný s mesačnou anamnézou letargie a progresívnou anamnézou ataxie, parézou zadných končatín, pikou, uveitídou, anizokóriou a inkontinenciou moču a stolice. Krvné testy boli väčšinou bez pozoruhodností s výnimkou miernej hyperglobulinémie. Pomer A/G bol 0,6. Mačka bola liečená dávkou 10 mg/kg GS-441524 SC SID počas 3 týždňov. Aktivita, mentácia a uveitída sa zlepšili do 72 hodín od začiatku liečby. Počas prvých 2 týždňov sa pozorovalo pomalé zlepšenie pohyblivosti a očných symptómov, ale potom sa dosiahlo plató. Po 3 týždňoch sa dávka GS-441524 zvýšila na 15 mg/kg GS-441524 SC SID z dôvodu pretrvávajúceho neurologického a očného deficitu. Okrem toho sa v tomto čase zaznamenalo zväčšenie ľavého oka v dôsledku glaukómu a oko naďalej opúchalo až do jeho odstránenia v 8. týždni liečby.
Vzhľadom na pretrvávajúcu slabosť/nedostatok koordinácie v panvovej oblasti a narastajúcu letargiu sa v 9. týždni dávka GS-441524 zvýšila na 20 mg/kg SC SID [alebo ekvivalentnú perorálnu dávku] a o niekoľko dní neskôr sa do režimu pridalo 20 mg/kg SC BID GC376. Výrazne zvýšená aktivita a ochota skákať na vyvýšené povrchy sa prejavila do 48 hodín od začiatku liečby liekom GS376. Kombinovaná liečba GS-441524 a GC376 sa udržiavala počas 8 týždňov. Mačka má po liečbe reziduálne problémy s inkontinenciou, ale inak je 6 mesiacov po liečbe klinicky normálna.

Boris – Mainská mývalia MI vlhká očná FIP


Päťmesačný intaktný (nekastrovaný) kocúr mainskej mývalej mačky, získaný od chovateľa, mal letargiu, nechutenstvo, brušný ascites, kašeľ, anémiu a neutrofíliu. Pri stanovení diagnózy nebol vykonaný žiadny biochemický rozbor. Mačka bola liečená 6 mg/kg GS-441524 SC SID počas 8 týždňov. Po šiestich týždňoch liečby röntgen odhalil uzlíky v pľúcach a po 8 týždňoch pretrvávala hyperglobulinémia. Dávka GS-441524 sa potom zvýšila na 8 mg/kg SC SID počas 4 týždňov. V krvných testoch a na röntgenových snímkach sa zaznamenalo len malé zlepšenie a dávka GS-441524 sa zvýšila na 12 mg/kg SC SID počas 4 týždňov, potom nasledovalo zvýšenie na 17 mg/kg počas 11 týždňov, 25 mg/kg počas 4 týždňov a 30 mg/kg počas 4 týždňov. Po 25 týždňoch liečby sa ultrazvukom zaznamenali pleurálne odchýlky na ľavej strane a röntgenové snímky nepreukázali žiadne zlepšenie pľúcnych uzlín. Okrem toho sa na pravom oku zaznamenala uveitída a odchlípenie sietnice. Boli odobraté aspiráty pľúc, ktoré preukázali zápal zodpovedajúci FIP. Po 33 týždňoch liečby sa do režimu pridalo 20 mg/kg SC BID GC376 a kombinovaná liečba GS-441524 a GC376 pokračovala 12 týždňov. Zvýšená aktivita sa zaznamenala v priebehu niekoľkých dní. V priebehu 5 týždňov sa zrýchlilo priberanie na hmotnosti, zmiernil sa kašeľ a zvýšila sa uroveň energie. Krvné testy ukázali zlepšenie pomeru A/G a röntgenové snímky hrudníka preukázali zmenšenie uzlín v pľúcach. Po 84 dňoch kombinovanej antivírusovej liečby bol pomer A/G 0,85 a mačka sa javila klinicky normálne. Mačka je v súčasnosti 3 mesiace po liečbe.

Literatúra

  1. Pedersen NC, Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC, Eckstrand C, Groutas WC, Bannasch M, Meadows JM, Chang KO. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2018; 20(4):378-392.
  2. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, Montgomery E, Murakami E, Liepnieks M, Liu H. efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2019; 21(4):271-281.
  3. Perera KD, Rathnayake AD, Liu H, et al. Characterization of amino acid substitutions in feline coronavirus 3C-like protease from a cat with feline infectious peritonitis treated with a protease inhibitor. J. Vet Microbiol. 2019;237:108398. doi:10.1016/j.vetmic.2019.108398
  4. Agostini ML, Andres EL, Sims AC, et al. Coronavirus susceptibility to the antiviral remdesivir (GS5734) is mediated by the viral polymerase and the proofreading exoribonuclease. MBio 2018; 9. DOI:10.1128/mBio.00221-18.
  5. Pedersen NC. 2021. The neurological form of FIP and GS-441524 treatment.
    https://sockfip.org/the-neurological-form-of-fip-and-gs-441524-treatment/
  6. Pedersen NC. The long history of beta-d-n4-hyroxycytidine and its modern application to treatment of covid019 in people and FIP in cats. https://sockfip.org/the-long-history-of-beta-d-n4-hydroxycytidineand-its-modern-application-to-treatment-of-covid-19-in-people-and-fip-in-cats/.
  7. Agostini, M. L. et al. Small-molecule antiviral beta-d-N (4)-hydroxycytidine inhibits a proofreading-intact coronavirus with a high genetic barrier to resistance. J. Virol. 2019; 93, e01348.
  8. Warren, T. K. et al. Therapeutic efficacy of the small molecule GS-5734 against Ebola virus in rhesus monkeys. Nature 2016; 531, 381–385.
  9. FIP Warriors CZ/SK – EIDD-2801 (Molnupiravir) https://www.fipwarriors.eu/en/eidd-2801-molnupiravir/
  10. Toots M, Yoon JJ, Cox RM, Hart M, Sticher ZM, Makhsous N, Plesker R, Barrena AH, Reddy PG, Mitchell DG, Shean RC, Bluemling GR, Kolykhalov AA, Greninger AL, Natchus MG, Painter GR, Plemper RK. Characterization of orally efficacious influenza drug with high resistance barrier in ferrets and human airway epithelia. Sci Transl Med. 2019;11(515):eaax5866.
  11. Zdanowicz MM. The pharmacology of HIV drug resistance. Am J Pharm Educ. 2006;70(5):100.doi:10.5688/aj7005100
  12. Gandhi, S, Klein J, Robertson A, et al. De novo emergence of a remdesivir resistance mutation during treatment of persistent SARS-CoV-2 infection in an immunocompromised patient: A case report. medRxiv, 2021.11.08.21266069AID
Publikované

Liečba FIP subkutánnym remdesivirom nasledovaným perorálnymi tabletami GS-441524

Richard Malik DVSc PhD FACVS Centrum FASM pre Veterinárne vzdelávanie, Univerzita v Sydney
Pôvodný článok: Treatment of FIP in cats with subcutaneous remdesivir followed by oral GS-441524 tablets

Poznámka prekladateľa: Článok obsahuje informácie o reálnom obsahu GS-441524 v tabletách. Tento obsah ale nemusí zodpovedať „ekvivalentnému“ množstvu GS-441524 v tabletách od iných výrobcov, kde je reálny obsah GS-441524 vždy o niečo vyšší kvôli známej zníženej biologickej dostupnosti perorálne používaného liečiva. Preto nie je možné jednoducho a jednoznačne porovnávať doporučene dávkovanie GS-441524 od firmy BOVA v Austrálii a u nás.

Úvod

Infekčná peritonitída mačiek (FIP) je infekčné ochorenie, najmä mladých mačiek. Dochádza k nemu, keď mačací enterický koronavírus množiaci sa v črevách prechádza kritickou mutáciou, ktorá zmení jeho tkanivový tropizmus z enterocytov na makrofágy. Vírus FIP potom cirkuluje po tele v makrofágoch – jedná sa o ultimátny mechanizmus trójskeho koňa. To vedie k diseminovanej infekcii a rozvoju fibrinoidnej nekrotizujúcej vaskulitídy a serozitídy v dôsledku ukladania imunitných komplexov pozostávajúcich z mačacích protilátok a FIP vírusových antigénov.

Vo všeobecnosti existujú dve formy FIP – efuzívna („vlhká“) FIP a neefuzívna („suchá“) FIP. Vlastný chorobný proces sa môže vyskytnúť v brušnej dutine, hrudnej dutine, osrdcovníku, očiach alebo centrálnom nervovom systéme. Kombinácie suchej a vlhkej FIP s postihnutím rôznych tkanív nie sú ničím nezvyčajným.

Až donedávna bola diagnóza infekčnej peritonitídy mačiek (FIP) pre mačacieho pacienta rozudkom smrti. V posledných rokoch však táto predstava bola postavená na hlavu ako výsledok priekopníckej práce profesora Nielsa C. Pedersena a kolegov z UC Davis.

Za posledných 12 mesiacov mnohí veterinári v Austrálii tiež úspešne zvládli mnoho prípadov FIP pomocou remdesiviru a GS-441524.

Omega-interferón (Virbagen) a polyprenyl imunostimulant (PPI) boli prvé lieky používané na liečbu FIP a obe mali u niektorých pacientov isté účinky. Omega interferón bol užitočný v prípadoch efuzívnej („vlhkej“) FIP, často kombinovanej s nízkou dávkou prednizolónu podľa Ishidovho protokolu, zatiaľ čo PPI, ktorého priekopníkom bol Al Legendre, bol užitočnejší v prípadoch neefuzívnej FIP. V niektorých prípadoch boli oba lieky použité súčasne. Problém bol v tom, že obe formy terapie boli často drahé, najmä keď sa používali oba lieky, takže aj keď sa pacienti zlepšili a mohli mať prechodné klinické remisie počas liečby, trvalé klinické vyliečenia boli zriedkavé. V dôsledku toho väčšina veterinárov stále považovala diagnózu FIP za predohru eutanázie.

To všetko sa zmenilo pred niekoľkými rokmi vďaka vyvrcholeniu celoživotneho výskumu FIP Dr. Nielsa Pedersena. Niels je úžasný veterinár, Severoameričan s dánskym pôvodom. Vyrastal na slepačej farme a pôvodne chcel byť klinickým lekárom pre veľké zvieratá, ale s veľkou predvídavosťou sa rozhodol pre vedeckú dráhu. Krátko po promócii odcestoval do Canberry na John Curtin School of Medical Research na ANU, kde koncom 60-tych rokov získal doktorát z imunológie o odmietaní obličkového transplantátu u profesora Bede Morrisa, pričom použil ovce ako experimentálny model na štúdium kinetiky lymfocytov.

Keď sa Niels vrátil na UC Davis, zameral sa na štúdium infekcií a imunity. Aj keď prispel k veľkému množstvu tém z internej medicíny a genomiky psov a mačiek, FIP sa stala jeho obľúbenou chorobou pre svoju obyčajnosť a súčasnú zložitosť. Jeho štúdium siaha od 80. rokov 20. storočia, keď sa špecializoval na diagnostiku, virológiu a patogenézu, až po súčasnosť, s čoraz väčším zameraním na terapiu.

Niels v spolupráci s kolegami z Kansas State University ukázal, že účelovo navrhnutý inhibítor proteázy GC-376 by mohol zabrániť a vyliečiť experimentálne indukovanú FIP u laboratórnych mačiek.1,2 Klinické štúdie v teréne s mačkami s prirodzene sa vyskytujúcou chorobou boli sklamaním, najmä keď mačky mali okulárnu formu FIP alebo ochorenie CNS. Nevzdal sa, a tak prešiel na iný liek – GS-4415243,4 – nukleozidový analóg vyvinutý severoamerickou farmaceutickou spoločnosťou Gilead. Ukázalo sa, že táto molekula je oveľa účinnejšia ako GC-376 na liečbu FIP, a to ako pri experimentálnych infekciách, tak aj v spontánnych prípadoch FIP. Počnúc farmakokinetikou a štúdiami s eskaláciou dávky s použitím širokého spektra klinických prípadov, Niels a kolegovia zistili, že potrebná dávka závisí od toho, či mal pacient suchú alebo vlhkú FIP, a či došlo k postihnutiu očí alebo centrálneho nervového systému (CNS).5

Prekvapivo, Gilead, výrobca, ktorý vyvinul GS441524, doteraz neprejavil záujem o vývoj tejto molekuly pre liečbu mačiek. Aby sa vyplnila prázdno pre účinnú terapiu FIP na celom svete, rôzne laboratóriá v Číne a východnej Európe začali vyrábať GS-441524 a predávať ho na čiernom trhu.

Široká dostupnosť GS-441524, často vysokej kvality a spočiatku veľmi vysokej ceny, poskytla oddaným majiteľom spôsob, ako zachrániť ich mačky s FIP. Štúdie klinickej patologičky Samanthy Evansovej z Ohio State University naznačili mieru vyliečenia približne 80 % v teréne. Obstarávanie lieku bolo donedávna komplikované a plné problémov, ktoré sa na určitej úrovni obchádzali pomocou rôznych „FIP Warriors“ skupín na Facebooku. Nanešťastie pre austrálskych milovníkov mačiek, APVMA a Vet Boards nakoniec pochopili, čo sa deje a Border Force značne sťažila získavanie GS-441524 a jeho bezpečný dovoz pre veterinárne použitie. Varovania regulačných orgánov a veterinárnych výborov pred trestným stíhaním boli namierené proti veterinárom, ktorí umožňovali liečbu mačiek s FIP pomocou liekov z čierneho trhu.

Je iróniou, že nové riešenie tohto problému priniesla pandémia COVID 19. Gilead vyvinul remdesivir (GS-5734) ako liek na liečbu hepatitídy C, Eboly a ľudského koronavírusového ochorenia. Remdesivir je proliečivo GS-441524, ktoré obsahuje dodatočný chemický bočný reťazec (vrátane fosfátovej skupiny), ktorý má zlepšiť intracelulárnu penetráciu (obrázok 1B). Remdesivir (ako produkt Veklury) získal dočasnú registráciu (na dva roky) od TGA v júli 2020 na liečbu infekcií SARS-CoV-2 u ľudských pacientov s COVID-19. Tento proces registrácie by za normálnych okolností trval niekoľko rokov, ale závažnosť pandémie urýchlila tento proces s prihladnutím na predbežné dáta z klinických testov. Keďže sa remdesivir stal licencovaným ľudským liekom a Gilead licencoval výrobu po celom svete, znamenalo to viac možností prístupu ku kvalitnej surovine. Tým sa obišli problémy s užívaním lieku zakúpeného na čiernom trhu, ako aj problémy neznámej čistoty a konzistencie produktu v priebehu času.

V roku 2020 spoločnosť na výrobu veterinárnych zmesí BOVA Australia zabezpečila spoľahlivé dodávky remdesiviru vo vhodnom formáte na IV a subkutánnu aplikáciu. Štúdie v Austrálii určili, že doba použiteľnosti po rekonštitúcii presahuje 12 dní a potvrdili účinnosť in vitro proti koronavírusom v tkanivových kultúrach. Analytická čistota liečiva sa pravidelne kontroluje pomocou HPLC. Za posledný rok veterinári v každom štáte Austrálie používali remdesivir na liečbu mačiek s FIP. Vyskytlo sa množstvo efuzívnych a neefuzívnych prípadov, vrátane niektorých mačiek s postihnutím oka (uveitída) a iných s multifokálnym ochorením CNS. Na základe liečby približne 500 mačiek liečených medzi októbrom 2020 a novembrom 2021 sa remdesivir ukazuje ako vysoko účinný pri zvládaní infekcií FIP. Umožnuje o niečo jednoduchšiu subkutánnu aplikáciu a zdá sa, že injekcia je o niečo menej bolestivá v porovnaní s GS-441524 a nespôsobuje lokálne reakcie v mieste vpichu, ktoré sa pozorujú pri injekčnom podaní GS-441524. Pôvodne sa remdesivir používal výhradne v Austrálii, hoci posledné 2 mesiace je dostupný aj v Británii od BOVA UK.

Molekulová hmotnosť remdesiviru je 603 g/mol, zatiaľ čo molekulová hmotnosť GS-441524 je 291 g/mol. To by mohlo naznačovať, že liečba mačiek remdesivirom vyžaduje približne dvojnásobné dávkovanie v porovnaní s GS-441524, aj keď to nezohľadňuje možné zlepšenie intracelulárnej penetrácie remdesiviru do určitých tkanív v porovnaní s GS-441524. Navrhovaná dávka remdesiviru u ľudských pacientov s COVID19 je 200 mg intravenózne (IV), po ktorej nasleduje 100 mg IV denne. Pre 70 kg ľudského pacienta to predstavuje dennú dávku 1,3 mg/kg, takže pri použití alometrického škálovania bola dávka 5-10 mg/kg denne pre mačku považovaná za správnu. Naša skúsenosť z prvých 500 prípadov však bola taká, že veľa mačiek nakoniec pre trvalé vyliečenie potrebovalo vyššiu dávku remdesiviru, a preto sme upravili naše odporúčané dávkovanie smerom nahor (pozri nižsie). Remdesivir poskytuje BOVA ako sterilný roztok s koncentráciou 10 mg/ml pripravený na použitie v 10 ml injekčnej vialke.

Obrázok 1. (A) BOVA Remdesivir rekonštituovaný a pripravený na liečbu. Po rekonštitúcii je obsah injekčnej vialky stabilný najmenej 120 dní pri teplote 5°C – a zvyčajne sa injekčná vialka spotrebuje za 3-7 dní. Vialku je najlepšie uchovávať v chladničke. (B) Dráha, ktorú remdesivir absolvuje intracelulárne, aby sa aktivoval ako GS-441524.

V súčasnosti sú Austrália a Spojené kráľovstvo jedinými krajinami, kde je remdesivir ľahko dostupný na predpis pre veterinárne použitie. Veterinári v Indii, na Novom Zélande, v Južnej Afrike a v niektorých častiach Európy však tiež začali pre prístup k lieku využívat dodávateľov humánnych liečiv.

Diagnostika

Obrázok 2: Úžasne komplexný a praktický prehľad diagnostiky FIP od Severine Tasker .

Úplná diferenciálna diagnostika FIP presahuje rámec tohto článku, ale čitateľom dôrazne odporúčame prečítať si vynikajúci článok od Séverine Tasker v Journal of Feline Medicine & Surgery. 6

Hoci sa FIP môže vyskytnúť u mačiek v akomkoľvek veku, väčšina prípadov sa vyskytuje u mačiatok a mačiek mladších ako 3 roky. Pretrvávajúca a často vysoká horúčka, ktorá nereaguje na antibiotickú liečbu (a často ani NSAID), je bežným nálezom, rovnako ako zvýšená hladina celkového proteínu v plazme v dôsledku zvýšených koncentrácií globulínu (difúzna gamapatia pri elektroforéze séra). Pri efuzívnej alebo „vlhkej“ FIP môže pomer albumínu ku globulínu klesnúť na < 0,45. Reaktanty akútnej fázy, ako je sérový amyloid A a α1-kyslý glykoproteín, majú tendenciu byť výrazne zvýšené. Mnoho mačiek s FIP vykazuje tiež sekundárnu imunitne sprostredkovanú hemolytickú anémiu, zvýšené aktivity AST a ALT a ikterus.

Pre včasnú diagnózu je rozhodujúce diagnostické zobrazovanie, čo bolo značne uľahčené zavedením digitálnej rádiológie a rozšírenou dostupnosťou diagnostického ultrazvuku v praxi malých zvierat. Pleurálny výpotok je ľahko rozpoznateľný z röntgenových snímok hrudníka, zatiaľ čo brušný výpotok je najlepšie detekovaný pomocou ultrazvuku (obrázok 3), najmä ak sú k dispozícii vysokofrekvenčné sondy. Za zmienku stojí, že v niektorých prípadoch môžu byť kapsy s tekutinou ohniskové a lokalizované. Často je okolo obličky pod obličkovým puzdrom nejaká tekutina, mačiatka môžu mať edém skrota, zatiaľ čo v ojedinelých prípadoch je výpotok obmedzený na perikardiálny vak. Ale kľúčové je – hľadať (i) výpotok v akejkoľvek telesnej dutine, (ii) granulómy v obličkách, pečeni alebo pľúcach, (iii) zväčšené vnútrobrušné a mezenterické lymfatické uzliny (obrázok 5) alebo výrazné zhrubnutie iliocekokolickej oblasti („fokálna FIP“) (obrázok 5). Röntgenové snímky hrudníka po drenáži pleurálneho výpotku môžu ukázať zmeny zodpovedajúce vírusovej pneumónii.

Obrázok 2: (A) Ultrazvukové vyšetrenie brucha ukazujúce hojnú vysoko echogénnu tekutinu (vlákna fibrínu) u mačky s ascitom s vysokým obsahom bielkovín v dôsledku efuzívnej FIP. (B) Efúzia obsahuje viskóznu žltú až slamovo sfarbenú tekutinu. (C) Röntgenový snímok brucha so vzhľadom brúseného skla naznačujúci tekutinu v bruchu.

Ak uvidíte výpotok – urobte punkciu – pretože tekutina je najlepšou diagnostickou vzorkou.

Obrázok 3: Výrazná mezenterická lymfadenomegália u mačky so suchou FIP.

Charakteristická je tekutina s vysokým obsahom bielkovín, často žltej až slamovej farby (obrázok 3B). Ak v orgáne vidíte granulóm alebo ak sú zreteľne zväčšené lymfatické uzliny – urobte FNA (aspiračná biopsia tenkou ihlou), urobte náter, použite farbenie s RapidDiff a hľadajte neutrofily a makrofágy (pyogranulomatózny zápal) bez viditeľných infekčných agens (obrázok 4) . Dve choroby, ktoré sa najčastejšie zamieňajú s FIP u dospelých mačiek, sú lymfóm a niektoré typy lymfocytickej cholangitídy (spojené s ascitom s vysokým obsahom bielkovín).

Obrázok 4: RapidDiff zafarbený náter aspirátu tenkou ihlou z mezenterických lymfatických uzlín 4-ročnej orientálnej mačky so suchou FIP. Výrazné makrofágy sú kľúčom k cytologickej diagnóze. Fotografiu poskytla Trish Martin.

Efuzívne ochorenie je samozrejme diagnostikovateľné oveľa ľahšie, pretože ascitická, perikardiálna alebo pleurálna tekutina poskytuje vhodnú vzorku, ktorá môže byť vyšetrená cytologicky, analýzou tekutiny a podrobená imunofluorescencii (IFA) na FIP antigén alebo PCR s reverznou transkriptázou na detekciu FIP nukleovej kyseliny. IFA sa vykonáva na VPDS, B14, University of Sydney (prostredníctvom Vetnostics, QML, ASAP, VetPath, Gribbles alebo IDEXX). Väčšinou je však najlacnejšie odoslať vzorku priamo do univerzitného laboratória.

Suchá FIP je problematickejšia, pretože zvyčajne vyžaduje aspiračnú biopsiu tenkou ihlou pyogranulomatóznych lézií v pečeni, obličkách alebo brušných lymfatických uzlinách. Občas môžu prípady vlhkej FIP paradoxne vykazovať vzorky tekutiny, ktoré sú negatívne pri testovaní IFA a/alebo PCR, no pacient stále pravdepodobne má FIP, čo sa prejavuje priaznivou odpoveďou na liečbu remdesivirom alebo GS-441524.

Liečba

Od októbra 2020 liečime mačky s FIP pomocou remdesiviru (IV a SCI) a odnedávna pomocou GS-441524 (orálne), takže naše protokoly sa skúsenosťami neustále vyvíjajú. Doteraz bolo liečených asi 500 mačiek. Snažíme sa vyhnúť tomu, aby sme boli v našich odporúčaniach príliš normatívni, pretože máme podozrenie, že neexistuje jednotný protokol, ktorý by vyhovoval všetkým pacientom, a každý prípad predstavuje jedinečné okolnosti, vrátane veľkosti pacienta, či je mačka stále „šťastná“ a je primerane, alebo je deprimovaná a dehydrovaná. Dôležitým faktorom je emocionálna a finančná angažovanosť majiteľa. Kľúčovou vlastnosťou, ktorú treba spomenúť, je, že oba lieky sú veľmi bezpečné, dokonca aj u chorých mačiek a mačiatok.

Všimnite si, že nasledujúce odporúčané dávky sú vyššie ako tie, ktoré boli pôvodne odporúčané pred rokom. Aj keď u mnohých pacientov fungovali nižšie dávky, zistili sme, že ide často o nesprávnu ekonomickú úvahu, pretože recidíva ochorenia na konci liečby a rozvoj vírusovej rezistencie počas liečby zrejme súvisia s nedostatočným počiatočným dávkovaním. Takže sme sa od začiatku naučili byť agresívnejší, čo je z dlhodobého hľadiska lacnejšie (tj nevyžaduje sa 2. terapia)

Naša najväčšia skúsenosť je spojená s remdesivirom. Tento liek je drahý a majiteľ sa musí zaviazať k nákladnému liečebnému procesu, ktorý trvá 3 mesiace. Pre väčšinu klientov to predstavuje emocionálnu a finančnú záťaž. Môj názor je, že v mnohých prípadoch je lepšie vynaložiť peniaze na antivírusovú terapiu ako takú, než na rozsiahlu diagnostiku a monitorovanie.

Obrázok 5: Výrazné zhrubnutie iliocekokolickej oblasti mačky Devon Rex s takzvanou „fokálnou FIP“, zvyčajnou formou neefuzívnej FIP. Fotografiu poskytla Penny Tisdall.

Jedným z prístupov u novodiagnostikovaných mačiek so závažným ochorením je hospitalizácia mačiek počas prvých 3-4 dní liečby. Pacienti začínajú liečbu remdesivirom, keď dostávajú IV tekutinovú terapiu (typicky 2-4 ml/kg/h; prvý deň Hartmannov roztok alebo Plasmalyte a následne 0,45 % NaCl a 2,5 % dextrózu s obsahom 20 mmol KCl/l). V 1. deň hospitalizácie sa remdesivir podáva vo vysokej dávke intravenózne (10–15 mg/kg zriedených na 10 ml fyziologickým roztokom a podáva sa POMALY počas 20–30 minút alebo dlhšie, manuálne alebo pomocou infúznej pumpy; u ľudských pacientov aplikácia trvá 2 hodiny), aby sa dosiahla zvýšená štartovacia dávka distribučného objemu liečiva. Tým sa dosiahne rýchla antivírusová účinnosť. V prípadoch s ochorením CNS odporúčame dennú IV dávku 20 mg/kg. Mnohé mačky sa môžu niekoľko hodín po IV infúzii remdesiviru javiť ako trochu deprimované. U ľudských pacientov môže remdesivir spôsobiť reakcie súvisiace s infúziou, vrátane nízkeho krvného tlaku, nevoľnosti, zvracania, potenia alebo triašky, ale u našich mačacích pacientov sme tieto javy nepozorovali.

Výhodou zahájenia liečby intravenózne je, že dehydratácia, ak je prítomná, sa upraví a máte IV prístup v prípade, že potrebujete podať iné lieky (napr. antikonvulzíva, kortikosteroidy). Dôležité je, že akonáhle je zavedený IV katéter, denné injekcie remdesiviru nespôsobujú žiadnu bolesť ani nepohodlie. Ak však mačka žerie a je diagnostikovaná v počiatočnom štádiu priebehu ochorenia, potom IV terapia nie je potrebná a rovnaké dávky možno podávať subkutánne, čím sa ušetrí veľa peňazí.

Mačky s FIP liečené remdesivirom sa typicky výrazne zlepšujú počas prvých 2-3 dní. Zistili sme však, že prípady efúzie a najmä tie, ktoré sa pred liečbou prejavili pleurálnym výpotkom, by sa mali dôkladne sledovať, pretože kombinácia antivírusového účinku remdesiviru a väčšej než udržiavacej dávky kryštaloidov môže viesť k prechodnému zhoršeniu pleurálneho výpotku. To vyžaduje drenáž dvakrát denne pomocou motýľovej ihly 19G (1,1mm – krémová farba) a 3-cestného uzatváracieho kohútika (ideálne pomocou ultrazvukového vedenia na nájdenie najlepšieho miesta pre zavedenie ihly). Tieto „sekundárne“ pleurálne výpotky môžu byť smrteľné, ak sa nezistia včas a zdá sa, že sa vyskytujú približne v 1 z 10 prípadov efuzívnych FIP liečených remdesivirom.

Ďalším problémom, ktorý sa v tejto dobe občas vyskytuje, je rozvoj neurologických príznakov, vrátane záchvatov. Náš názor je, že nejde o účinok lieku ako taký, ale skôr o demaskovanie subklinickej CNS FIP. Takéto mačky potrebujú starostlivé pozorovanie, zatiaľ čo vývoj záchvatov vyžaduje použitie antikonvulzívnych liekov, ako je midazolam (0,3 mg/kg IV), alfaxan alebo propofol (podávaný IV, aby bol účinný), po ktorom nasleduje levetiracetam (Keppra) (10–20 mg /kg, PO každých 8 hodín). Fenobarbitón je spoľahlivé antikonvulzívum, má však tendenciu zvyšovať metabolizmus mnohých liekov, a kým lepšie nepochopíme farmakokinetiku a metabolizmus remdesiviru a GS-441524, je pravdepodobne bezpečnejšie používať levetiracetam. Niektorí lekári tiež podávajú dexametazón alebo prednizolón ako jednorazovú liečbu na zmiernenie zápalu CNS.

Hoci obhajujeme úvodnú IV terapiu pre najťažšie prípady FIP, mačky a mačiatka, ktoré sú stále „šťastné“ a jedia, na začiatku nevyžadujú IV terapiu a môžu namiesto toho začať subkutánnymi injekciami v dávke 10-12 mg/kg/deň ( 20 mg/kg pri ochorení CNS). To je, samozrejme, oveľa lacnejšie, pretože mačky alebo mačiatka nemusia byť umiestnené na infúznej pumpe a hospitalizové v nemocnici, v stresujúcom prostredí. U klientov, ktorí majú finančné limity, môže byť toto vhodnejší spôsob zahájenia terapie. Niektorí šikovní kolegovia, ako napríklad Jim Euclid, vyvinuli hybridný prístup, kde mačiatka dostávajú subkutánne tekutiny denne ako bolus s injektovaným remdesivirom.

Následne boli mačkám podávané priebežné subkutánne injekcie remdesiviru. Pôvodne to trvalo 84 dní a takéto prípady predstavovali väčšinu prípadov, ktoré sme doteraz riešili. V poslednom čase na úvodnú terapiu používame agresívny IV/SCI remdesivir a potom mačky prechádzajú na perorálny GS-441524 počas 10 týždňov trvajúcej konsolidačnej terapie.

Po počiatočnom používaní nižších dávok, ktoré neboli úspešné u každého pacienta, teraz používame nasledujúce liečebné protokoly:

  • pre mačky s vlhkou FIP: 10-12 mg/kg raz denne (SID) počas 2 týždňov
  • pre mačky s výrazným postihnutím oka: 15 mg/kg SID subkutánnou injekciou (SCI) počas 2 týždňov; mačkám s ťažkou uveitídou by sa mali podávať aj lokálne kortikosteroidy (Pred Forte alebo Maxidex) 2-3 dni (nie dlhšie!) a atropínová očná masť
  • pre mačky s neurologickou FIP s príznakmi CNS: podávajte 20 mg/kg SID SCI počas 2-4 týždňov. 5

Je dôležité, aby majitelia boli riadne poučení o tom, ako optimálne podávať denné injekcie. Mačky budú vnímať injekciu ako menej bolestivú, ak sa roztok remdesiviru v injekčnej striekačke nechá zohriať na izbovú teplotu, namiesto toho, aby sa podával vychladený z chladničky. Okrem toho, ak ich naučíte jednoduchým úkonom, ako je používanie novej ihly pri aplikácii injekcii (t. j. použite inú ihlu, ako je tá, ktorá sa používa na natiahnutie lieku z vialky) a používanie ihiel priemeru 21G (0,8mm – zelené) alebo 23G (0,6mm – modré), injekcie budú znesiteľnejšie. Aj keď sú ihly 21G väčšie, u niektorých mačiek to možno dáva výhodu rýchlejšej aplikácie injekcie. Alternatívne môžu veterinári pripraviť kvôli zjednodušeniu pre majiteľa injekcie na celý týždeň, ktoré budú uchovávať v chladničke, a každý deň tak budú aplikovať novú injekciu.

U mačiek, ktoré naďalej vnímajú SC injekcie ako bolestivé, sme použili gabapentín perorálne (50 až 100 mg na mačku) a/alebo transmukozálne alebo SC podávaný buprenorfín 30-60 minút pred injekciou na sedáciu/analgéziu. Oblasť, do ktorej sa má podať injekcia, sa môže tiež ostrihať, aby sa 30 minút pred injekciou mohol aplikovať lokálny krém EMLA. BOVA vyrába rýchlejšie pôsobiaci lokálny anestetický gél, ktorý môže byť užitočný u niektorých pacientov. Vo výnimočných prípadoch sme zavádzali cefalický katéter každých 4-5 dní, aby majitelia mohli podávať IV terapiu namiesto SC injekcií. Zdá sa, že reakcie v mieste vpichu, ktoré boli hlásené v súvislosti s injekčne podávaným GS-441524 v zahraničí, sa pri remdesivire nevyskytujú.

Po 2-4 týždňoch užívania remdesiviru a po vymiznutí tekutiny v bruchu a zlepšení alebo vymiznutí očných a CNS príznakov teraz navrhujeme prechod na tablety GS-441524. Robí sa to z 3 dôvodov: (i) znižuje to náklady (ii) odstraňuje problém s bolestivosťou SC injekcií (iii) u niektorých pacientov je to efektívnejšie. Injekcie Remdesiviru sú pravdepodobne spoľahlivejšie ako perorálny GS-441524 a v najhorších prípadoch by ste sa mohli rozhodnúť podávať ich 4 týždne, ale pre väčšinu mačiek stačia 2 týždne a pohodlie a nižšie náklady na perorálnu formuláciu predbehnú všetko ostatné.

Používanie tabliet GS-441524 je v Austrálii pomerne nové, ale vo veľkej miere sa používa v zámorí. Odporúčaná perorálna dávka GS441524 je zvyčajne rovnaká ako dávka SCI/IV remdesiviru: vlhké prípady FIP dostanú 10-12 mg/kg PO SID, očné prípady 15 mg/kg PO SID a prípady CNS 20 mg/kg ( alebo vyššie). GS-441524 je ekonomickejší a je dokonca bezpečnejší ako remdesivir. V prípadoch CNS, kde sa podávajú veľké dávky, je pravdepodobne najlepšie podávať 10 mg/kg PO každých 12 hodín (BID), aby sa obišiel „stropný“ efekt, o ktorom sa hovorí v súvislosti s obmedzenou absorpciou vysokých dávok.

Obrázok 6. Fokálna suchá FIP s pyogranulomatóznym zápalom intraabdominálnych lymfatických uzlín. Namiesto vykonania exploračnej laparotómie, biopsie lymfatických uzlín, histológie a imunohistológie môže byť v prípade vysokého podozrenia na FIP nákladovo efektívnejšie vyskúšať 3-dňovú IV liečbu remdesivirom. FNA zväčšenej lymfatickej uzliny je pravdepodobne ideálnou diagnostickou možnosťou pre lekárov s týmto súborom zručností.

Prečo sú dávkovania približne rovnaké? Na báze mg/kg má GS441524 dvakrát toľko aktívnych molekúl ako remdesivir (kvôli rozdielu v ich molekulovej hmotnosti), ale biologická dostupnosť GS-441524 je možno iba 50 % (absorbuje sa len polovica toho, čo sa podá, a to je ovplyvnené kŕmením a tiež efektom stropnej dávky) – takže tieto dva faktory sa navzájom rušia.

Odporúčame, aby sa tablety GS-441524 podávali s malým pamlskom, aby sa zamaskovala tabletka, pričom hlavné jedlo sa podáva o 1 hodinu neskôr. Tablety, ktoré poskytuje BOVA, sú 50 mg tablety s príchuťou tuniaka, so štyrmi deliacimi ryhami, takže ich možno rozdeliť na polovicu alebo dokonca na štvrtiny.

V situáciách, keď si majitelia nemôžu dovoliť úplnú liečbu, po prvotnej liečbe remdesivirom/GS-441524 používame meflochín (Lariam; 5 mg/kg perorálne raz denne v kapsulách alebo 62,5 mg dvakrát týždenne) .

Phillip McDonagh, Jacqui Norris, Merran Govendir a kolegovia zo Sydney School of Veterinary Science preukázali, že meflochín má antivírusový účinok . 7 K tomu pravdepodobne dochádza tým, že meflochín si uzurpuje biochemické intracelulárne dráhy využívané vírusom FIP, čo je mechanizmus, ktorý bol nedávno preukázaný aj pri klofazimíne 8 (lieku proti lepre), a niekoľkých ďalších liekoch. U niekoľkých mačiek, kde si majitelia nemohli dovoliť úplnú kúru remdesivirom, sa meflochín ukázal ako účinný pre dosiahnutie hranice klinického vyliečenia.

Hlavnou výhodou nákupu remdesiviru a GS-441524 od BOVA na liečbu prípadov FIP je, že produkty, ktoré používame, podliehajú kontrole kvality. Ide len o napísanie receptu s menom a adresou klienta, menom pacienta a dávkou, ktorá sa má podať, a kompaundátor môže zvyčajne poskytnúť vialky alebo tablety ktorémukoľvek veterinárnemu lekárovi v Austrálii do 24-48 hodín.

V súčasnosti je cena 100 mg vialky remdesiviru 250$ plus GST a poštovné (celková cena zvyčajne cca. 280$). GS-441524 sa predáva v balení 10 tabliet za 600$ plus poštovné a balné. Kúpou viacerých vialiek a tabliet súčasne sa samozrejme znížia poštovné a manipulačné poplatky. Veríme, že väčšina majiteľov sa bude cítiť oveľa pohodlnejšie, keď získa produkt od známej austrálskej spoločnosti, než aby posielali peniaze do zámoria a dúfali, že lieky neznámej kvality na čiernom trhu sa bezpečne dostanú do Austrálie bez toho, aby ich zadržala colnica.

Neexistuje žiadny dôvod, prečo by dobre motivovaný veterinár nemohol tieto prípady zvládnuť vo svojej vlastnej praxi. To je často pre majiteľa pohodlnejšie, najmä ak zápasia s každodennými injekciami a potrebujú praktika vo svojej blízkosti.

Obrázok 7: Tablety Gs-441524 od BOVA Australia. Sú s príchuťou tuniaka. Môžu byť rozdelené na polovice alebo dokonca štvrtiny. OVEĽA JEDNODUCHŠIE ako injekcie pre väčšinu mačiek. Menej stresu a menej nákladov.

Veterinári, ktorí chcú preskúmať túto možnosť, alebo majú všeobecné otázky o manažmente prípadov FIP, môžu poslať e-mail Sally Coggins (dr.sallyc@gmail.com), Richardovi Malikovi (richard.malik@sydney.edu.au), Davidovi Hughesovi (concordvets@concordvets.com.au), Grette Howard (drgretta@gmail.com) alebo profesorke Jacqui Norris ( jacqui.norris@sydney.edu.au), o radu v súvislosti s diagnózou alebo liečbou. Mnoho austrálskych veterinárnych lekárov so záujmom o FIP dosiahlo značné odborné znalosti v manažmente týchto prípadov. Napríklad Andrew Spanner v Adelaide liečil viac ako 20 prípadov s vynikajúcimi výsledkami. Je teda už mnoho lekárov pre mačaciu medicínu a odborníkov na internú medicínu so skúsenosťami s liečbou FIP, a tak majú veterinári, ktorí váhajú s liečbou svojich vlastných prípadov, možnosť doporučiť svojim klientom týchto odborníkov.

Medzi lekárov, ktorí akceptujú prípady FIP od všeobecných lekárov, patria napríklad: QLD Rhett Marshall, Marcus Gunew, Alison Jukes, Rachel Korman; NSW Katherine Briscoe, Michael Linton, Randolph Baral, Melissa Catt; VIC – Carolyn O’Brien, Keshuan Chow, Amy Lingard; WA-Martine Van Boeijen a Univerzitná veterinárna nemocnica Murdoch; TAS Moira van Dorsselaer.

Všetci títo lekári (a pravdepodobne ešte viac, o ktorých nevieme) radi prijmú prípady na diagnostiku a terapiu. Všetci s vami pravdepodobne radi prediskutujú manažment prípadov.

Obrázok 8: Bengálske mačiatko s CNS a očnou FIP (A: pred) a (B: po) po Remdesivire. Táto mačka mala tiež pľúcne granulómy.

Sally Coggins, spolupracujúca s Larou Boland, Emily Pritchard, docentkou Mary Thompsonovou a profesorkou Jacqui Norris na Sydney School of Veterinary Science, má záujem o liečbu prípadov s komplexnou diagnózou a monitorovaním poskytovaným zadarmo . Bude to tvoriť súčasť doktorandského programu Sally, takže jej budete pomáhať napredovať v štúdiu tým, že jej budete posielať prípady. Dúfame, že pomocou týchto študií, získame lepšiu predstavu o tom, ako rýchlo mačky reagujú, a kedy presne možno liečbu bezpečne ukončiť. Majitelia si budú musieť zaplatiť iba za remdesivir a GS-441524 na terapiu. Táto skupina má tiež záujem o liečbu prípadov interferónom-omega a meflochínom.

Väčšine prípadov FIP sa darí veľmi dobre pri liečbe GS-441524 alebo remdesivirom. Niels Pedersen zhromaždil úžasný zdroj pre veterinárnych lekárov, ktorí sa zaujímajú o manažment prípadov FIP – https://sockfip.org/dr – pedersen – research/ . Stránka uvádza aj niekoľko odporúčaní, ako sledovať mačky počas liečby. Nie som veľmi orientovaný na protokol, takže pre mňa sú kľúčové veci, ktoré treba sledovať, ako chuť do jedla, postoj, úroveň aktivity a zmeny telesnej hmotnosti a kondície v priebehu času. Väčšina lekárov rada monitoruje hematológiu a biochémiu séra každý mesiac, aby sa zabezpečilo, že všetky merateľné abnormality sa zlepšujú, hoci to môže byť pre pacienta stresujúce a zvyšuje to náklady na liečbu. Kompromisom je odobranie niekoľkých kvapiek krvi na sledovanie PCV, celkového proteínu v plazme (TPP) pomocou refraktometrie a farby plazmy – tak sa dá určiť, či sa anémia zlepšuje, ikterus ustupuje a či sa znižuje koncentrácia gamaglobulínu, čo má za následok nižšie TPP.

Neznepokojujte sa prechodným zvýšením koncentrácií globulínu na začiatku liečby; keď sa absorbujú výpotky s vysokým obsahom bielkovín, do plazmy pacienta sa dostane veľa imunoglobínov. Tento jav môže byť bežný až do 8. týždňa liečby, ale vymizne do 12. týždňa.

Obrázok 9: MRI obrázok v priečnej rovine po kontraste s vážením T1. Poznámka: dilatácia laterálnych komôr s veľmi miernym zvýraznením ependymálnej výstelky (oranžové šípky). Obrázok s láskavým dovolením Christine Thomas.

A čo mačiatko s multifokálnym ochorením CNS, kde je FIP CNS najpravdepodobnejšou príčinou klinických príznakov? Tradičným prístupom je sérológia (na vylúčenie kryptokokózy a toxoplazmózy), dobrá anamnéza a test tiamínu na vylúčenie nedostatku vitamínu B1, potom MRI skeny (obrázok 9) a odber CSF na analýzu tekutín a multiplexnú neuro-qPCR analýzu ). Tento prístup je veľmi drahý a existuje aj isté riziko z anestézie a najmä odberu CSF. Zistili sme, že 3-5 dňová intravenózna alebo sc. liečba remdesivirom sa môže použiť ako terapeutická skúška u mačiek s pravdepodobnou CNS FIP a je cenovo výhodnou alternatívou k úplnému diagnostickému spracovaniu, ktoré môže stáť 3-5000$ alebo viac .

Podobne, ak je voľbou exploračná laparotómia, biopsia abnormálnych tkanív, histológia a imunohistochémia pre FIP antigén na diagnostiku suchej intraabdominálnej FIP oproti 3–5-dňovej liečbe s remdesivirom alebo GS-441524, môže sa zvážiť test s použitím lieku, čo je lepšia voľba z hľadiska pohody pacienta a znížených nákladov. U väčšiny mačiek s neefuzívnou FIP nastáva rýchle zlepšenie pomocou antivírusovej terapie, s normalizáciou horúčky, zlepšením chuti do jedla a lepším celkovým postojom v priebehu 2 až 3 dní. Ak pacient nereaguje na antivírusovú terapiu, potom je samozrejme rozumná exploračná laparotómia a biopsia reprezentatívnych orgánov, keďže hlavnými diferenciálnymi diagnózami sú lymfóm a lymfocytická cholangitída.

Toto je vecou osobného prístupu každého lekára. FNA na cytologické a niekedy imunohistochemické vyšetrenie alebo PCR je presvedčivou neinvazívnou možnosťou tam, kde je táto expertíza dostupná, ale niekedy nedá definitívnu odpoveď. Niektorí veterinári trvajú na diagnostike tkaniva a pozitívnej imunohistológii alebo PCR u každého pacienta, zatiaľ čo iní by radi „liečili liečiteľné“ pomocou 3–5-dňového nasadenia remdesiviru/GS-441524 a pristúpili k exploratívnej laparotómii, až keď neexistuje jednoznačná odpoveď na terapiu.

Je neuveriteľne uspokojujúce vidieť premenu mačiek a mačiatok, ktorým nie je dobre, na normálne a šťastné mačky. Je to naozaj niečo, čo vám ako lekárovi zdvihne náladu. Je to dobrá veda a dobrá veterinárna medicína!

Závery

V minulosti bola diagnóza FIP intelektuálnym cvičením, aby sme utrpenie mačky alebo mačiatka mohli ukončiť s istotou presnej diagnózy. Teraz, vďaka celoživotnmu štúdiu FIP Dr. Nielsa Pedersena, sme schopní úspešne liečiť možno 80 % alebo viac mačiek s FIP, ak má klient dostatok financií. Je príliš skoro predpovedať, či alebo koľko z nich sa bude neskôr opakovať.

Existuje potreba intenzívneho štúdia v diagnostike a manažmente prípadov, ale s vynaložením potrebného úsilia by dobrý praktický veterinár mal byť schopný spolupracovať s odhodlaným majiteľom na dosiahnutí klinického vyliečenia. Najdôležitejšie je neklásť príliš veľa prekážok do cesty oddaného majiteľa a podporovať ho počas 12-týždňového maratónskeho liečebného kurzu tým, že mu pomôžete nájsť najlepší spôsob liečby svojho pacienta. Môže to zahŕňať sedatívnu/analgetickú liečbu, ktorá pomôže mačke zlepšiť ovládateľnosť a predchádzať nepríjemným pocitom, keď klient privedie svoju mačku na kliniku denne na injekcie remdesiviru alebo prechod na tablety GS-441524, keď je stres z injekcií pre vlastníka príliš veľký. Je dôležité zvládnuť dlhú cestu a možno poskytnúť platobný plán, ktorý umožní odhodlaným klientom zlepšiť cenovú dostupnosť liečby.

Napokon, vplyv COVID-19 na výskum koronavírusov bol skutočne hlboký a vo vývoji je niekoľko veľmi sľubných liekov, ako napríklad molnupiravir od spoločnosti Merck a ďalší perorálny liek od spoločnosti Pfizer.

CELKOVÉ ZHRNUTIE

2-stupňový prístup k terapii

1.fáza – INDUKCIA

IV/SC injekcie Remdesiviru

  • Pre mačky s vlhkou FIP: 10-12 mg/kg remdesiviru subkutánnou injekciou (SCI) raz denne (SID) počas 2 týždňov
  • Pre mačky s postihnutím oka: 15 mg/kg SID remdesivir SCI počas 2 týždňov
  • Pre mačky s neurologickými príznakmi FIP a CNS: remdesivir 20 mg/kg SID počas 2 týždňov

2. fáza – KONSOLIDÁCIA

Po 2 týždňoch injekčného podávania remdesiviru prejdite na tablety GS-441524

  • Pre mačky s vlhkou FIP: 10-12 mg/kg GS-441524 perorálne SID počas 10 týždňov
  • Pre mačky s postihnutím oka: 15 mg/kg SID GS-441524 perorálne SID počas 10 týždňov
  • Pre mačky s neurologickými príznakmi FIP a CNS: GS-441524 10 mg/kg perorálne BID (20 mg/kg/deň) počas 10 týždňov

Literatúra

  1. Kim, Y.; Liu, H.; Galasiti Kankanamalage, A.C.; Weerasekara, S.; Hua, D.H.; Groutas, W.C.; Chang, K.O.; Pedersen, N.C. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog. 2016, 12, e1005531.
  2. Pedersen, N.C.; Kim, Y.; Liu, H.; Galasiti Kankanamalage, A.C.; Eckstrand, C.; Groutas, W.C.; Bannasch, M.; Meadows, J.M.; Chang, K.O. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2018, 20, 378–392.
  3. Murphy, B.G.; Perron, M.; Murakami, E.; Bauer, K.; Park, Y.; Eckstrand, C.; Liepnieks, M.; Pedersen, N.C. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet. Microbiol. 2018, 219, 226–233.
  4. Pedersen, N.C.; Perron, M.; Bannasch, M.; Montgomery, E.; Murakami,
    E.; Liepnieks, M.; Liu, H. Efficacy, and safety of the nucleoside analog GS441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2019, 21, 271–281.
  5. Dickinson PJ, Bannasch M, Thomasy SM, et al. Antiviral treatment using the adenosine nucleoside analogue GS-441524 in cats with clinically diagnosed neurological feline infectious peritonitis. Journal of Veterinary Internal Medicine. 2020. doi: 10.1111/jvim.15780.
  6. Tasker S. Diagnosis of feline infectious peritonitis: Update on evidence supporting available tests. Journal of Feline Medicine and Surgery.
    2018;20(3):228-243. doi:10.1177/1098612X18758592
  7. McDonagh, P.; Sheehy, P.A.; Norris, J.M. Identification, and characterisation of small molecule inhibitors of feline coronavirus replication. Vet. Microbiol. 2014, 174, 438–447.
  8. Yuan, S., Yin, X., Meng, X. et al. Clofazimine broadly inhibits coronaviruses including SARS-CoV-2. Nature (2021).
    https://doi.org/10.1038/s41586-021-03431-4
  9. https://sockfip.org/ – NAJLEPŠÍ zdroj na internete alebo kdekoľvek pre FIP.
Obrázok 10: Dve mačky so suchou FIP po úspešnej terapii. Ako mi nie tak dávno napísal jeden zanietený mladý veterinár v e-maile – „to je dôvod, prečo som robil vedu!“

NÁKLADY:

2 kg mačiatko s vlhkou FIP
4×100 mg vialky remdesiviru – 1000$
35×50 mg tabliet GS-441524 – 2100$
Manipulácia a GST – 30$ plus 310$ = 340$
Celkom 3440$, približne 290$ týždenne počas 12 týždňov

4 kg mačka so suchou FIP
7×100 mg vialiek remdesiviru – 1750$
70×50 mg tabliet GS-441524 – 4200$
Manipulácia a GST 30$ plus 600$
Celkom 6550$, asi 545$ týždenne počas 12 týždňov

Obrázok 11: Dvaja súrodenci, u ktorých sa vyvinula FIP a boli úspešne vyliečení remdesivirom a GS441524.
Publikované

Dlhá história Beta-d-N4-hydroxycytidínu a jeho moderná aplikácia na liečbu Covid-19 u ľudí a FIP u mačiek.

Niels C. Pedersen DVM, PhD
Originálny článok: The long history of Beta-d-N4-hydroxycytidine and its modern application to treatment of Covid-19 in people and FIP in cats.

Beta-d-N4-hydroxycytidín je malá molekula (nukleozid), ktorá bola študovaná koncom 70. rokov v bývalom Sovietskom zväze ako súčasť výskumu biologických zbraní [2]. Weaponizácia chorôb, ako sú kiahne, bola celosvetovým postrachom, ale nebezpečenstvo použitia vírusu kiahní na tento účel bolo príliš veľké. Pravé kiahne boli zo sveta vykorenené, prakticky všetky zásoby zničené a ďalší výskum zakázaný. To viedlo USA a Sovietsky zväz k výskumu ďalších RNA vírusov ako biologických zbraní a antivirotík na obranu proti nim. Vírus venezuelskej konskej encefalomyelitídy (VEEV) bol jedným z prvých vírusov, u ktorého sa seriózne zvažovalo jeho využitie ako biologickej zbrane [3]. VEEV sa na ľudí prenáša uštipnutím komárom a spôsobuje vysokú horúčku, bolesti hlavy a encefalitídu s opuchmi, ktoré môžu byť smrteľné. Zistilo sa, že beta-d-N4-hydroxycytidín nielenže inhibuje replikáciu VEEV, ale aj širokú škálu alfavírusov vrátane eboly, chikungunya, chrípkového vírusu, norovírusu, vírusu bovinnej diarey, vírusu hepatitídy C a respiračného syncyciálneho vírusu. [3-8]. Prvé správy o inhibičnom účinku beta-d-N4-hydroxycytidínu na ľudský koronavírus NL63 pochádzajú z roku 2006 [9]. Nedávne štúdie potvrdili jeho inhibičný účinok na široké spektrum ľudských a zvieracích koronavírusov [8].

Dôležitá časť novšej histórie beta-d-N4-hydroxycytidínu je spojená s Emory Institute for Drug Development (EIDD) [1], kde dostal experimentálne označenie EIDD-1931. Významnú finančnú podporu na štúdium antivirotík proti alfavírusom v inštitúciách, ako je Emory, poskytovala americká vláda už od roku 2004 [10]. Agentúra na zníženie obranných hrozieb poskytla v roku 2014 inštitucionálnu podporu s cieľom nájsť antivírusovú zlúčeninu proti VEEV a iným alfakoronavírusom. „N4-Hydroxycytidín a jeho deriváty a antivírusové použitia“ boli zahrnuté v patentovej prihláške USA 2016/106050 A1 z roku 2016 [11]. Ďalšie financovanie v roku 2019 poskytol Národný ústav pre alergie a infekcie na partnerský výskum esterifikovaného prekurzora beta-d-N4-hydroxycytidínu (EIDD-2801) na liečbu chrípky [10]. Uvedeným zámerom chemických zmien EIDD-2801 bolo zvýšenie jeho orálnej biologickej dostupnosti, čo by v konečnom dôsledku umožnilo podávať beta-d-N4-hydroxycytidín ako pilulky a nie ako injekcie. V roku 2019/2020 došlo k zmene zamerania výskumu z chrípky na SARS-CoV-2 [2]. Komercializáciou EIDD-2801 bola poverená pobočka Emory s názvom Ridgeway Biotherapeutics, ktorá následne spolupracovala so spoločnosťou Merck na zdĺhavom a nákladnom procese schvaľovania FDA. Aktuálna verzia EIDD-2081 na testovanie v teréne dostala názov Molnupiravir.

Beta-d-N4-hydroxycytidín, účinná látka Molnupiraviru, existuje v dvoch formách ako tautoméry. V jednej forme sa chová ako cytidín s jednoduchou väzbou medzi uhlíkom a skupinou N-OH. Vo svojej ďalšej forme, ktorá napodobňuje uridín, má oxim s dvojitou väzbou medzi uhlíkom a skupinou N-OH. Za prítomnosti beta-d-N4-hydroxycytidínu ho vírusová RNA-dependentná RNA polymeráza číta ako uridín namiesto cytidínu a namiesto guanozínu vkladá adenozín. Prepínanie medzi formami spôsobuje nezhody počas transkripcie, čo má za následok početné mutácie vírusového genómu a zastavenie replikácie vírusu [8].

Snaha spoločnosti Merck o podmienečné a úplné schválenie Molnupariviru FDA pokračuje. Spoločnosť Merck vo svojom vyhlásení uviedla: [12] „V očakávaní výsledkov programu MOVe-OUT spoločnosť Merck vyrába Molnupiravir na vlastné riziko. Spoločnosť Merck očakáva, že do konca roku 2021 vyrobí 10 miliónov liečebných dávok, pričom v roku 2022 sa očakáva výroba ďalších. Merck sa zaväzuje poskytovať včasný prístup k lieku Molnupiravir na celom svete, ak bude autorizovaný alebo schválený, a plánuje zaviesť prístup k viacúrovňovým cenám na základe kritérií príjmu krajín Svetovej banky, ktoré budú odrážať relatívnu schopnosť krajín financovať svoju zdravotnú reakciu na pandémiu. V rámci svojho záväzku rozšíriť globálny prístup spoločnosť Merck už skôr oznámila, že uzavrela nevýhradné dobrovoľné licenčné zmluvy na Molnupiravir so zavedenými generickými výrobcami na urýchlenie dostupnosti Molnupiraviru vo viac ako 100 krajinách s nízkymi a strednými príjmami (LMIC) po schválení alebo núdzovom povolení miestnymi regulačnými agentúrami. “ Je nepravdepodobné, že by sa táto „veľkorysosť“ vzťahovala aj na použitie u zvierat.

Lieky na inhibíciu pôvodcu súčasnej pandémie Covid-19 boli v posledných dvoch rokoch predmetom urýchlených terénnych testov a jeden z nich, Remdesivir, bol schválený v rekordnom čase pre použitie u hospitalizovaných pacientov. V minulom roku bol Molnupiravir postúpený k podmienečnému schváleniu ako perorálny liek na domácu liečbu infekcie v počiatočnom štádiu [12]. Účinné zlúčeniny proti koronavírusu však boli vyvíjané už skôr pre inú bežnú a vážnu chorobu mačiek, mačaciu infekčnú peritonitídu (FIP). Tieto lieky zahŕňajú inhibítor proteázy (GC376) [13] a inhibítor RNA dependentnej RNA polymerázy (GS-441524), ktorý je aktívnou zložkou Remdesiviru [14]. Úspech antivírusových liekov pri liečbe FIP podnietil nedávnu štúdiu EIDD-1931 a EIDD-2801 pre ich schopnosti inhibovať FIPV v tkanivových kultúrach [15]. Účinná koncentrácia EC50 pre EIDD-1931 proti FIPV je 0,09 μM, EIDD-2801 0,4 μM a GS441524 0,66 μM [15]. Percento cytotoxicity pri 100 μM je 2.8, 3.8, respektíve 0. Preto sú EIDD-1931 a EIDD-2801 o niečo účinnejšie pri inhibícii vírusov, ale tiež cytotoxickejšie ako GS-441524. Tieto laboratórne štúdie naznačujú, že EIDD-1931 a EIDD-2801 sú vynikajúcimi kandidátmi na liečbu FIP.

Napriek tomu, že EIDD-1931 a EIDD-2801 sú veľkým prísľubom pre liečbu FIP, existuje niekoľko prekážok, kvôli ktorým v blízkej budúcnosti nebude legálne používanie týchto zlúčenín veľmi pravdepodobné. GS-441524, aktívna forma Remdesiviru a patentovaná spoločnosťou Gilead Sciences, bol skúmaný na použitie u mačiek s FIP krátko pred pandémiou Covid-19. Výskum FIP [14] preto podnietil potenciálne použitie Remdesiviru proti vírusu Ebola, a nie koronavírusom podobným SARS [14]. Aj keď boli tieto štúdie realizované v spolupráci s vedcami z Gilead Sciences, spoločnosť odmietla udeliť práva na GS-441524 na liečbu u zvierat, akonáhle bolo zrejmé, že existuje oveľa väčší trh s Covid-19 u ľudí [16]. Podobne moje pokusy za posledné 2-3 roky u Emory, Ridgeback Biotherapeutics a veterinárnej divízie spoločnosti Merck skúmať EIDD-1931 a EIDD2801 pre liečbu FIP u mačiek buď zostali bez odpovede, alebo boli zamietnuté, nepochybne z podobných dôvodov, prečo Gilead odmietol udeliť práva pre GS-441524. Veľká celosvetová potreba liečby FIP však rýchlo podporila neschválený trh s GS-441524 z Číny. Tá istá potreba liečiť FIP nedávno vyvolala záujem o Molnupiravir, tiež z Číny.

Situácia s EIDD-1931 vs. EIDD-2801/Molnupiravir a GS-441524 vs. Remdesivir vyvoláva otázku, prečo sa niektoré lieky pre účely marketingu prevádzajú na proliečivá [17]. Remdesivir bol údajne esterifikovaný, aby sa zvýšila antivírusová aktivita, aj keď štúdie na mačkách ukázali, že GS-441524 a Remdesivir mali podobnú vírusovú inhibičnú aktivitu v tkanivovej kultúre [18]. Zistilo sa však, že Remdesivir sa zle absorbuje orálnou cestou, a preto bol podmienenčne schválený iba pre injekčné použitie. EIDD-2801 bol vytvorený pre zvýšenie orálnej absorpcie EIDD-1931, aj keď predchádzajúci výskum ukázal, že EIDD-1931 je dobre absorbovaný orálne aj bez esterifikácie [6]. Motívy komercializácie Remdesiviru namiesto GS-441524 na humánne použitie boli vedecky spochybnené, pretože tento sa zdá byť v niekoľkých smeroch lepší bez ďalších úprav [17]. Prečo bol pre komercializáciu vybraný EIDD-2801, keď EIDD-1931 by bol lacnejší, 4-násobne účinnejší proti vírusom a o jednu tretinu menej toxický ako EIDD-2801 [15]? Sila patentových práv a dlhá životnosť patentov môžu v týchto rozhodnutiach predstavovať dôležitejšie faktory. [16,17,19].

Jedným z problémov pri liečbe FIP u mačiek sú hematookulárne a hematoencefalické bariéry, ktoré nadobúdajú veľký význam, keď choroba postihne oči a/alebo mozog [13, 14, 20]. Tento problém bol z veľkej časti prekonaný pri liečbe očných a neurologických foriem FIP pomocou GS-441524 postupným zvyšovaním dávkovania na zvýšenie hladín v krvi a tým aj koncentrácie liečiva v komorovom moku a/alebo v mozgu [20]. GC376, jedno z najúčinnejších antivirotík proti vírusu FIP v kultúre [17], nie je účinný proti okulárnej a neurologickej FIP kvôli neschopnosti dostať do týchto miest dostatok liečiva, aj keď sa dávka niekoľkonásobne zvyšuje[14]. Našťastie sa zdá, že EIDD-1931 môže dosiahnuť účinné hladiny v mozgu, ako to naznačujú štúdie na koňoch s infekciou VEEV [3]. Rezistencia na liečivá je ďalším problémom, ktorý sa teraz prejavuje u niektorých mačiek liečených GS-441524, najmä u jedincov s neurologickou formou FIP. Dlhé liečebné procedúry a ťažkosti s transportom dostatočného množstva liečiva do mozgu podporujú rozvoj liekovej rezistencie.

Zásadný význam má krátkodobý a dlhodobý toxický účinok kandidátskeho lieku na testovaného človeka alebo zviera. V bunkových kultúrach vykázal GS-441524 nižšiu toxicitu ako GC376, EIDD-1931 a EIDD-2801 [15]. Najdôležitejšia je však toxicita, ktorá sa prejavuje in vivo. GC376 patrí medzi lieky s najvyšším inhibičným účinkom na koronavírus [15], ale pri podávaní mladým mačiatkam spomaľuje vývoj dospelého chrupu [13]. Počas takmer troch rokov používania GS-441524 v teréne nebola pozorovaná žiadna vážna toxicita, čo odzrkadľuje úplnú absenciu cytotoxických účinkov in vitro pri koncentráciách až 400 µM [18]. EIDD-1931 a EIDD-2801 však vykazujú významnú cytoxicitu pri 100 µM [15]. Preto schopnosť EIDD-1931 vytvárať fatálne mutácie v RNA vyvoláva už nejaký čas množtvo otázok [8, 21, 22]. To bol hlavný dôvod, prečo sa aplikácia na liečbu chorôb stále odkladala. Súčasná odporúčaná doba liečby Covid-19 Molnupiravirom je však v počiatočnom štádiu liečby iba 5 dní [10]. Odporúčaná doba liečby FIP s GS-441524 je ale 12 týždňov [14], čo predstavuje oveľa dlhší čas pre manifestáciu toxicity. Preto bude dôležité dôkladné pozorovanie mačiek pri liečbe EIDD-1931 alebo EIDD-2801, či už ide o krátkodobé alebo dlhodobé účinky.

Všetky doterajšie antivírusové lieky viedli k rozvoju liekovej rezistencie prostredníctvom mutácií vo vírusovom genóme. Aj keď sa Remdesivir javí menej náchylný voči takýmto mutáciám v porovnaní s liekmi používaných pri vírusových ochoreniach, ako je HIV/AIDS, rezistencia je dobre zdokumentovaná [23–25]. Rezistencia voči GS-441524 u mačiek liečených na FIP bola pozorovaná s vyššou frekvenciou, najmä u mačiek s neurologickou FIP, kde je ťažšie dopraviť do mozgu dostatočné množstvo liečiva [13, 14, 20]. Rezistencia voči GS-441524 u mačiek bude tiež pravdepodobne väčším problémom, pretože mačky s FIP sa často liečia 12 týždňov alebo dlhšie, zatiaľ čo Remdesivir (a Molnupiravir) sa odporúčajú užívať iba päť dní počas počiatočného viremického štádia Covid-19 [16]. Problém rezistencie na liečivá je v liečbe HIV/AIDS efektívne zvládnutý použitím kokteilu rôznych liekov súčasne s rôznymi profilmi rezistencie. Mutanty rezistentné na jedno liečivo budú ostatné lieky okamžite inhibovať, čím sa zabráni ich pozitívnej selekcii pri liečbe. Inhibícia rezistencie je obzvlášť silná, ak tieto dva lieky útočia na rôzne proteíny zahrnuté v replikácii vírusu. Napríklad GC376 je inhibítor proteázy [13], zatiaľ čo GS-441524 pôsobí na RNA dependentnú RNA polymerázu [18]. GC376 však nie je tak dobre absorbovaný cez hematoencefalickú bariéru. Aj keď ešte neprebehol potrebný výskum, zdá sa, že medzi GS-441524 a Molnupiravirom nebude existovať žiadna skrížená rezistencia, a pri prechode hematoencefalickou bariérou je rovnako účinný ako GS-441524 [3]. To z Molnupiraviru (alebo 5-hyroxycytidínu) robí dôležitý príspevok pre budúcu liečbu FIP.

Ako sa dalo čakať, Molnupiravir bol nedávno testovaný na mačkách s FIP najmenej jedným čínskym predajcom GS-441524 a predbežné výsledky sú uvedené na webovej stránke FIP Warriors CZ/SK [26]. Terénne testy zahŕňali 286 mačiek s rôznymi formami prirodzene sa vyskytujúcej FIP pozorovaných na klinikách pre domáce zvieratá v USA, Veľkej Británii, Taliansku, Nemecku, Francúzsku, Japonsku, Rumunsku, Turecku a Číne. 286 mačiek, ktoré sa zúčastnili štúdie, vrátane siedmich mačiek s okulárnou (n=2) a neurologickou (n=5) FIP, nedošlo k žiadnemu úhynu. Dvadsať osem z týchto mačiek bolo vyliečených po 4-6 týždňoch liečby a 258 po 8 týždňoch. Všetky liečené mačky boli zdravé aj po 3-5 mesiacoch, čo je obdobie, počas ktorého by sa u neúspešne liečených mačiek očakávali relapsy. Tieto údaje poskytujú presvedčivé dôkazy o bezpečnosti a účinnosti Molnupiraviru pre mačky s rôznymi formami FIP. Dúfame však, že táto terénna štúdia bude napísaná v rukopisnej forme, predložená k recenznému konaniu a uverejnená. Tak či tak, Molnupiravir sa už teraz predáva majiteľom mačiek s FIP. Minimálne jeden ďalší veľký predajca GS-441524 má tiež záujem používať Molnupiravir na FIP, čo naznačuje dopyt po ďalších antivírusových liečivách pre mačky s FIP.

Bezpečné a účinné dávkovanie pre Molnupiravir u mačiek s FIP nebolo publikované. Minimálne jeden predajca z Číny však poskytol iste farmakokinetické dáta a dáta z terénnych testov Molnupariviru u mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou FIP v reklamnom letáku na výrobok s názvom Hero-2081 [26]. Tieto informácie však jasne neuvádzajú množstvo Molnupiraviru v jednej z ich „50 mg tabliet“ a skutočný dávkovací interval (q12h alebo q24h?). Našťastie odhadovanú počiatočnú dávku molnupiraviru pre mačky s FIP je možné získať z publikovaných štúdií o EIDD-1931 a EIDD-2801 in vitro na bunkových kultúrach [15] a laboratórnych a terénnych štúdií GS-441524 [14,18]. Molnupiravir (EIDD-2801) má EC50 0,4 uM/ul proti FIPV v bunkovej kultúre, zatiaľ čo EC50 GS-441524 je asi 1,0 uM/ul [18]. Oba majú podobnú perorálnu absorpciu okolo 40 – 50 %, takže účinná subkutánna (SC) dávka pre Molnupiravir by bola približne polovica odporúčanej 4 mg/kg SC každých 24 hodín začiatočnej dávky pre GS441524 [14] alebo 2 mg/kg SC q24h. Dávka per-os (PO) by sa zdvojnásobila, aby sa zohľadnila menej účinná perorálna absorpcia na dávku 4 mg/kg PO každých 24 hodín. Odhadovanú počiatočnú perorálnu dávku molnupiraviru pre mačky s FIP je možné tiež vypočítať z dostupných údajov o liečbe Covid-19. Pacientom liečeným na Covid-19 sa podáva 200 mg molnupiraviru PO q12h počas 5 dní. Táto dávka bola evidentne vypočítaná z farmakokinetickej štúdie vykonanej na ľuďoch a ak priemerný človek váži 60-80 kg (70 kg), účinná inhibičná dávka je ~ 3,0 mg/kg PO q12h. Mačka má bazálny metabolický pomer 1,5 -krát vyšší ako človek a za predpokladu rovnakej orálnej absorpcie u ľudí aj mačiek by minimálna dávka pre mačky podľa tohto výpočtu bola 4,5 mg/kg PO každých 12 hodín. Za predpokladu, že molnupiravir prechádza cez hematookulárnu bariéru a hematoencefalickú bariéru rovnako efektívne ako GS-441524 [3,18], dávka by sa zvýšila ~1,5 a ~2,0-krát, aby sa umožnila adekvátna penetrácia do komorovej vody a mozgovomiechový mok pre mačky s okulárnou (~ 8 mg/kg PO, q12 h) alebo neurologickou FIP (~ 10 mg/kg PO, q12h). Liečba bude trvať 10-12 týždňov a monitorovanie odpovede na liečbu bude identické s GS-441524 [14, 20]. Tieto odporúčania sú založené na predpokladoch zo zverejnených informácií a budú potrebné ďalšie skúsenosti s Molnupiravirom v tejto oblasti. Nie je pravdepodobné, že Molnupiravir bude na liečbu FIP bezpečnejší a účinnejší ako GS-441524, ale tretie antivírusové liečivo môže byť mimoriadne užitočné pri prevencii rezistencie voči GS-441524 (ako kokteil antivirotík s rôznymi profilmi rezistencie) alebo pri liečbe mačiek, ktoré už nereagujú dobre na GS-441524. Veľkou neznámou je, či bude Molnupiravir bez dlhodobých toxických účinkov, pretože účinná látka N4-hydroxycytidín je mimoriadne účinný mutagén [21] a doba liečby FIP je oveľa dlhšia ako pri Covid-19 a existuje pravdepodobnosť väčších vedľajších účinkov.

Je škoda, že EIDD-1931 (N4-hydroxycytidín), účinnej látke Molnupiraviru, nebola pri liečbe mačiek FIP venovaná väčšia pozornosť ako Molnupiraviru. EIDD-1931 má 4-krát väčší inhibičný účinok proti vírusu ako Molnupiravir (EC50 0,09 oproti 0,4 μM) a percento cytotoxicity je o niečo nižšie (2,3% vs. 3,8% pri 100 μM) [15]. N4-hydroxycytidín je tiež účinne absorbovaný orálnou cestou [3], čo bolo pri vývoji EIDD-2801 (Molnupiravir) bagatelizované. Tento scenár je identický so scenárom GS-441524 vs. Remdesivir, pričom pre komercializáciu bol vybraný druhý z nich – Remdesivir, aj keď súčasný výskum naznačuje, že najlepším kandidátom by bol GS-441524[17].

Referencie

  1. Painter GR, Natchus MG, Cohen O, Holman W, Painter WP. Developing a direct acting, orally available antiviral agent in a pandemic: the evolution of molnupiravir as a potential treatment for COVID-19 [published online ahead of print, 2021 Jun 18]. Curr Opin Virol. 2021;50:17-22. doi:10.1016/j.coviro.2021.06.003
  2. Halford B. An emerging antiviral takes aim at COVID-19. c&en topics. 2020. https://cen.acs.org/pharmaceuticals/drug-development/emerging-antiviral-takes-aim-COVID19/98/web/2020/05.
  3. Painter GR, Richard A. Bowend RA, Bluemling GR et al. The prophylactic and therapeutic activity of a broadly active ribonucleoside analog in a murine model of intranasal Venezuelan equine encephalitis virus infection. Antiviral Res. 2019, 171:104597
  4. Costantini, V.P., Whitaker, T., Barclay, L., Lee, D., McBrayer, T.R., Schinazi, R.F., Vinje,J., 2012. Antiviral activity of nucleoside analogues against norovirus. Antivir. Ther.17 (6), 981–991. https://doi.org/10.3851/imp2229.
  5. Ehteshami, M., Tao, S., Zandi, K., Hsiao, H.M., Jiang, Y., Hammond, E., Amblard, F., Russell, O.O., Merits, A., Schinazi, R.F., 2017. Characterization of beta-d-N(4)-hydroxycytidine as a novel inhibitor of chikungunya virus. Antimicrob. Agents Chemother. 61 (4) e02395-02316. https://doi.org/10.1128/aac.02395-16.
  6. Stuyver, L.J., Whitaker, T., McBrayer, T.R., Hernandez-Santiago, B.I., Lostia, S., Tharnish, P.M., Ramesh, M., Chu, C.K., Jordan, R., Shi, J., Rachakonda, S., Watanabe, K.A., Otto, M.J., Schinazi, R.F., 2003. Ribonucleoside analogue that blocks replication of bovine viral diarrhea and hepatitis C viruses in culture. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 244–254.
  7. Yoon J., Toots M, Lee S, Lee ME, et al., 2018. Orally efficacious broad-spectrum ribonucleoside analog inhibitor of influenza and respiratory syncytial viruses. Antimicrob. Agents Chemother. 2018, 62(8): https://doi.org/10.1128/aac.00766-18
  8. Urakova N, Kuznetsova V, Crossman DK, Sokratian A, Guthrie DB, Kolykhalov AA, et al. β-d-N4Hydroxycytidine is a potent anti-alphavirus compound that induces a high level of mutations in the viral genome. J Virol. 2018, 92:e01965–e01917. doi: 10.1128/JVI.01965-17.
  9. Pyrc, K., Bosch, B.J., Berkhout, B., Jebbink, M.F., Dijkman, R., Rottier, P., van der Hoek,L., 2006. Inhibition of human coronavirus NL63 infection at early stages of the replication cycle. Antimicrob. Agents Chemother. 2006, 50(6):2000–2008. https://doi.org/10.1128/aac.01598-05.
  10. Whitfill T. A likely new treatment for Covid-19 was made possible by government-funded innovation. STAT+. https://www.statnews.com/2021/10/05/government-funding-backed-molnupiravir-possible-newcovid-19-treatment/.
  11. Painter, G.R., Guthrie, D.B., Bluemling, G., Natchus, M.G. N4-Hydroxycytidine and Derivatives and Antiviral Uses Related Thereto. US Patent Application, 2016, 2016/106050 A1.
  12. Merck news release, October 1, 2021. https://www.merck.com/news/merck-and-ridgebacksinvestigational-oral-antiviral-molnupiravir-reduced-the-risk-of-hospitalization-or-death-by-approximately-50percent-compared-to-placebo-for-patients-with-mild-or-moderat/.
  13. Pedersen NC, Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC, Eckstrand C, Groutas WC, Bannasch M, Meadows JM, Chang KO. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2018, 20(4):378-392.
  14. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, Montgomery E, Murakami E, Liepnieks M, Liu H. efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2019, 21(4):271-281.
  15. Cook SE, Vogel H and D. Castillo D. A rational approach to identifying effective combined anticoronaviral therapies against feline coronavirus. 2021. bioRxiv 2020.07.09.195016; doi: https://doi.org/10.1101/2020.07.09.195016
  16. Zhang S. A Much-Hyped COVID-19 Drug Is Almost Identical to a Black-Market Cat Cure. May 8, 2020 Shutterstock / The Atlantic, https://www.theatlantic.com/science/archive/2020/05/remdesivir-cats/611341/.
  17. Yan VC, Muller FL. Advantages of the Parent Nucleoside GS-441524 over Remdesivir for Covid-19 Treatment. ACS Medicinal Chemistry Letters. 2020, 11 (7):1361-1366 DOI: 10.1021/acsmedchemlett.0c00316
  18. Murphy BG, Perron M, Murakami E, Bauer K, Park Y, Eckstrand C, Liepnieks M, Pedersen NC. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies.Vet Microbiol. 2018, 219:226-233.
  19. Common Dreams. Public citizen. Press release, August 4, 2020, https://www.commondreams.org/newswire/2020/08/04/public-citizen-scientists-gilead-and-federalscientists-have-neglected
  20. Dickinson PJ. Coronavirus Infection of the Central Nervous System: Animal Models in the Time of Covid-Front. Vet. Sci. 2020, 23: https://doi.org/10.3389/fvets.2020.584673
  21. Zhou S, Hill CS, Sarkar S, et al., β-d-N4-hydroxycytidine Inhibits SARS-CoV-2 through lethal mutagenesis but Is also mutagenic to mammalian cells. J Infect Dis. 2021, 224:415–419, https://doi.org/10.1093/infdis/jiab247.
  22. Cohen J, Piller C. Emails offer look into whistleblower charges of cronyism behind potential COVID-19 drug. ScienceInsider-Health. 2020, https://www.science.org/news/2020/05/emails-offer-look-whistleblowercharges-cronyism-behind-potential-covid-19-drug.
  23. Agostini ML, Andres EL, Sims AC, et al. Coronavirus susceptibility to the antiviral remdesivir (GS-5734) is mediated by the viral polymerase and the proofreading exoribonuclease. MBio 2018; 9. DOI:
    10.1128/mBio.00221-18.
  24. Szemiel AM, Merits A, Orton RJ, In vitro selection of Remdesivir resistance suggests evolutionary predictability of SARS-CoV-2. Plos Path, 2021,https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009929 .
  25. Martinot M, Jary A, Fafi-Kremer S, et al., Emerging RNA-Dependent RNA Polymerase Mutation in a Remdesivir-Treated B-cell Immunodeficient Patient With Protracted Coronavirus Disease 2019, Clinical Infectious Diseases, 2020;, ciaa1474, https://doi.org/10.1093/cid/ciaa1474
  26. FIP Warriors CZ/SK – EIDD-2801 (Molnupiravir) https://www.fipwarriors.eu/en/eidd-2801-molnupiravir/
Publikované

ZHRNUTIE LIEČBY FIP POMOCOU GS-441524 (Dr. Pedersen)

Pôvodný článok: SUMMARY OF GS-441524 TREATMENT FOR FIP
Niels C. Pedersen, DVM PhD, emeritný profesor,
Stredisko pre zdravie spoločenských zvierat, škola veterinárneho lekárstva, UC Davis

Na monitorovanie liečby používame rovnaké kritériá, aké sú opísané v klinickej štúdii publikovanej v JFMS (Journal of Feline Medicine and Surgery). Majitelia by mali v denných alebo týždenných intervaloch sledovať teplotu, váhu, aktivitu, chuť do jedla a klinické príznaky pôvodného ochorenia. Krvné testy – hematológia a biochémia (vrátane hodnôt sérových bielkovín – celkový proteín, albumín, globulín, pomer A:G) na začiatku liečby a potom každé 4 týždne. Je vždy užitočné, keď sa tieto hodnoty spolu s hmotnosťou aktualizujú vo forme grafu. Cieľom je mať zdravú, čulú a aktívnu mačku na konci 12 týždňov liečby a s normálnymi hodnotami krvných testov, najmä pokiaľ ide o pomery hematokritu, celkového proteínu, globulínu, albumínu a A: G. Výrazné zvýšenie hmotnosti je tiež dobrým znamením, a niektoré mladé alebo obzvlášť vychudnuté mačky môžu počas liečby viac ako zdvojnásobiť svoju váhu. Jedná sa samozrejme o idealizovanú liečbu, a treba počítať s tým, že bude pravdepodobne potrebné upraviť dávkovanie smerom nahor, ak je odpoveď pomalá, alebo ak sa počas liečby prejavia komplikácie, ako napríklad okulárne alebo neurologické postihnutie.

Pre stabilizáciu mačiek, ktoré sú kriticky choré v čase diagnózy, alebo počas prvých dní liečby GS-441524 (GS), môže byť potrebná podporná (symptomatická) starostlivosť. Abdominálny výpotok by sa nemal odsávať, pokiaľ neutláča hrudník a nezasahuje do dýchania, pretože sa rýchlo nahradí na úkor zvyšku tela. Hrudné výpotky sú však zvyčajne spojené s rôznym stupňom dyspnoe a mali by sa odstrániť. Hrudné výpotky sa vracajú oveľa pomalšie. Symptomatická starostlivosť tiež často zahŕňa tekutiny a elektrolyty na potlačenie dehydratácie, antibiotiká pri podozrení na sekundárnu bakteriálnu infekciu a protizápalové lieky (zvyčajne systémové kortikosteroidy) a zriedkavo krvnú transfúziu. U niektorých mačiek s postihnutím oka môžu byť potrebné aj lokálne lieky na potlačenie závažného zápalu a zvýšeného vnútroočného tlaku (glaukóm).

Kortikosteroidy, ako je prednizolón, by sa mali používať len počas prvých dní liečby GS a mali by sa vysadiť, keď dôjde k rýchlemu zlepšeniu zdravotného stavu. Dlhodobé používanie kortikosteroidov s GS sa dôrazne neodporúča, pretože môže maskovať príznaky zlepšenia spôsobené GS, najmä u mačiek s neurologickou FIP, nemá žiadnu liečebnú moc a môže interferovať s vývojom ochrannej imunitnej odpovede na vírus FIP. Je možné, že táto imunitná odpoveď hrá hlavnú úlohu v konečnom vyliečení. Ak sú mačky na chronickej liečbe steroidmi, nie je potrebné znižovať dávku, pretože neexistuje dôkaz, že by sa u mačiek vyskytla závažná atrofia nadobličiek, ku ktorej dochádza u ľudí pri dlhodobej liečbe steroidmi. Mnohí majitelia, poradcovia pre liečbu GS a veterinári budú používať rôzne propagované doplnky na zlepšenie zdravia pečene, obličiek alebo imunitného systému, ako aj vitamíny ako B12. Tieto látky nemajú preukázanú účinnosť a považujem ich za vyhodené peniaze.

Liečba injekčnou formou GS, ktorá je najbežnejšia, sa môže tiež skomplikovať vredmi/léziami v mieste vpichu. Liečba je ťažká pre majiteľov aj pre mačky, pretože injekcie môžu byť bolestivé. U niektorých mačiek, najmä u tých s neurologickým postihnutím, nastáva problém s vývojom čiastočnej liekovej rezistencie, ktorá si vyžaduje zvyšovanie dávky. Reakcia na liečbu je zvyčajne do 24-72 hodín a väčšina mačiek sa vráti do normálu, alebo sa blíži k normálu v priebehu 2-4 týždňov, čo je dobré znamenie. Predpokladáme, že miera úspešnosti liečby FIP s GS-441424 je viac ako 80%, s ohľadom na zlyhanie liečby v dôsledku nesprávnej diagnózy FIP, neprimerané dávkovanie, komplikácie zdravotného stavu a rezistenciu na lieky. Mladé mačky sa liečia ľahšie a majú vyššiu mieru vyliečenia, ako mačky staršie 7 rokov. Mačky s vlhkou alebo suchou FIP, s nekomplikovanými neurologickými alebo očnými symptómami sa liečia ľahšie, ako mačky s neurologickou FIP.

Počiatočná dávka pre mačky s vlhkou alebo suchou FIP bez známok očného alebo neurologického ochorenia, je 4-6 mg/kg denne počas 12 týždňov, pričom u mladších mačiek a vlhkej FIP je tendencia smerovať k dolnej hranici a suché prípady k hornej hranici. Mačky s očnými léziami a bez neurologických príznakov začínajú s dávkou 8 mg/kg denne počas 12 týždňov. Mačky s neurologickými príznakmi začínajú na dennej dávke 10 mg/kg po dobu 12 týždňov. Ak sa u mačiek s vlhkou alebo suchou FIP na začiatku objavia očné alebo neurologické príznaky, prechádzajú na príslušné očné alebo neurologické dávky. Existuje orálna forma GS dostupná najmenej z dvoch zdrojov z Číny (Spark, Mutian), ale nepoužívam ju, takže nepoznám porovnateľné dávkovanie. Neodporúčam to však, pokiaľ injekčná dávka stúpne nad 10 mg/kg denne, pretože účinnosť orálnej absorpcie pri týchto vysokých dávkach klesá.

Odporúčam dávkovanie upraviť týždennou kontrolou hmotnosti. Prírastok hmotnosti môže byť u mnohých z týchto mačiek obrovský, a to buď preto, že sú na začiatku tak vychudnuté, alebo rastú, prípadne oboje. Ak dôjde k úbytku hmotnosti na začiatku liečby, zostávam na pôvodnom dávkovaní a neznižujem ho. Neschopnosť naberať váhu počas liečby sa považuje za zlé znamenie. Nezvyšujeme dávku, pokiaľ na to nie sú závažné dôvody, ako napríklad zhoršenie stavu, alebo sa nezlepšujú výsledky krvných testov, pomalé zlepšenie, slabá úroveň aktivity, obnovenie pôvodných klinických príznakov, alebo zmena formy ochorenia zahrňujúca aj očné alebo neurologické príznaky. Tu prichádza na rad zdravý úsudok, pretože sa nechcete zaseknúť na jednej hodnote krvi, ktorá nie je celkom bežná, ale nemá vplyv na celkový zdravotný stav mačky. Napríklad globulín môže byť stále trochu vysoký, ale ďalšie dôležité hodnoty krvných testov a zdravotný stav sú veľmi dobré. Ak existuje dobrý dôvod na zvýšenie dávky, malo by to byť vždy od +2 do +5 mg/kg denne a minimálne po dobu 4 týždňov. Ak tieto 4 týždne spôsobia predĺženie 12-týždňového trvania liečby, je to kvôli tejto úprave dávky. Dá sa očakávať pozitívna reakcia na akékoľvek zvýšenie dávky, a pokiaľ nevidíte zlepšenie, znamená to, že dávka stále nie je dostatočne vysoká, objavuje sa rezistencia na lieky, máte zlú značku GS, mačka nemá FIP , alebo existujú iné choroby, ktoré liečbu ovplyvňujú.

Jedným z najťažších rozhodnutí je určiť, kedy ukončiť liečbu. Hoci niektoré mačky, často mladšie s vlhkou FIP, môžu byť vyliečené už za 8 týždňov, a možno aj skôr, zvyčajná doba trvania liečby je 12 týždňov. Niektoré mačky môžu dokonca vyžadovať úpravu dávkovania a dlhšie obdobia liečby. Kritické krvné hodnoty, ako je hematokrit, hladina celkového proteínu, albumínu a globulínu a celkový počet bielych krviniek a absolútny počet lymfocytov sa zvyčajne u liečených mačiek normalizujú po 8-10 týždňoch, kedy často dochádza k neočakávanému zvýšeniu úrovne aktivity. Predpokladá sa, ale nie sú na to ešte dôkazy, že po 8-10 týždňov sa u mačky objaví vlastná imunita voči infekcii. Toto je situácia, ktorá sa vyskytuje pri liečbe hepatitídy C u ľudí, čo je tiež chronická infekcia spôsobená RNA vírusom, ktorá si často vyžaduje až 12 alebo viac týždňov antivírusovej liečby.

Nanešťastie neexistuje jednoduchý test, ktorý by určil, kedy došlo k vyliečeniu, a strach z relapsu často vedie majiteľov, liečebných poradcov a veterinárov k predĺženiu liečby nad hranicu 84 dní. Strach z relapsov tiež spôsobí, že ľudia zapojení do rozhodovacieho procesu budú príliš opatrní, pokiaľ ide o jednu hodnotu krvi, ktorá je trochu abnormálna (napr. mierne vysoký globulín alebo mierne nízky pomer A:G), alebo výsledky konečného ultrazvuku naznačujúce podozrivo zväčšené lymfatické uzliny, malé množstvo tekutiny v brušnej dutine, alebo nejasné nepravidelnosti v orgánoch, ako sú obličky, slezina, pankreas alebo črevá. Je potrebné pamätať na to, že do normálneho rozsahu krvných hodnôt síce spadá väčšina zvierat, ale inak sú to krivky v tvare zvona, a že sa nájde pár výnimočných pacientov, ktorí budú mať hodnoty na okraji týchto kriviek. Diagnóza podľa ultrazvuku musí vziať do úvahy stupeň patológie, ktorá sa môže vyskytnúť v brušnej dutine postihnutou FIP, ako napríklad jazvy alebo niektoré následky vo forme zmien orgánov u úspešne liečených mačiek. V situáciách, keď také otázky vyvstávajú, je lepšie pozrieť sa podrobnejšie na celkový obraz, a nielen na jednu malú časť. Najdôležitejším výsledkom liečby je návrat k normálnemu zdraviu, ktorý má dve zložky – vonkajšie príznaky zdravia a vnútorné príznaky zdravia. Medzi vonkajšie príznaky zdravia patrí návrat k normálnej úrovni aktivity, chuť k jedlu, primerané zvýšenie hmotnosti alebo rast a kvalita srsti. Posledne menované sú pre mačku často jednými z najlepších meradiel zdravia. Vnútorné príznaky zdravia sa prejavujú návratom určitých kritických hodnôt k normálu na základe periodického sledovania úplného krvného obrazu a biochémie. Najdôležitejšie hodnoty v krvnom obraze sú hematokrit a relatívny a absolútny celkový počet bielych krviniek, neutrofilov a lymfocytov. Najdôležitejšie hodnoty v biochémii (alebo sérovej elektroforéze) sú hladiny celkového proteínu, globulínu, albumínu a pomer A: G. Bilirubín je u mačiek často zvýšený pri efúznej FIP a môže byť užitočný pri monitorovaní závažnosti a trvania zápalu. V hematologických a biochemických paneloch existuje veľa ďalších hodnôt a nie je nič neobvyklé, že niektoré z nich sú o niečo vyššie alebo nižšie ako normálne, a je lepšie tieto hodnoty ignorovať, pokiaľ nie sú výrazne zvýšené a nie sú spojené s klinickými príznakmi – napríklad vysoká urea a kreatinín, ktoré sú tiež spojené so zvýšenou spotrebou vody, nadmerným močením a abnormalitami v analýze moči. Počet krvných doštičiek strojovo je u mačiek notoricky nízky v dôsledku traumy z odberu krvi a zhlukovania krvných doštičiek, a mal by sa vždy overiť manuálnym vyšetrením krvných náterov. Konečné rozhodnutie o ukončení alebo predĺžení liečby, keď sa stretnete s nejasnými pochybnosťami o rôznych testovacích postupoch, by malo vždy vychádzať z vonkajších prejavov zdravia viac, ako z ktoréhokoľvek jednotlivého výsledku testu.

Rôzne FIP skupiny prišli s rôznymi modifikáciami liečby FIP. Niektoré skupiny budú od začiatku liečiť mimoriadne vysokou dávkou GS namiesto toho, aby dávku zvyšovali iba vtedy, keď je to indikované, alebo v posledných dvoch týždňov navýšia dávkovanie GS, alebo o ďalšie dva týždne pretiahnu liečbu s vyššou dávkou GS v nádeji, že môžu skrátiť dobu trvania liečby, či znížiť pravdepodobnosť relapsu. Niektorí obhajujú použitie interferónu omega alebo nešpecifických imunostimulantov na ďalšiu stimuláciu imunitného systému, a niektorí používajú rôzne ďalšie modifikácie. Neexistuje žiadny dôkaz, že modifikácia liečby extra vysokou dávkou zlepší rýchlosť vyliečenia. Podobne interferón omega a nešpecifické imunostimulanty nemajú žiadne preukázané priaznivé účinky pri FIP, keď sa podávajú ako jediná liečba alebo ako doplnky ku GS. Objavuje sa aj prax pridávania ďalšieho antivírusového lieku, inhibítora vírusovej proteázy GC376, k liečbe GS u mačiek, u ktorých sa vyvíja rezistencia na GS, ale táto možnosť ešte vyžaduje výskum. Nakoniec je bežné, že majitelia, liečebné skupiny a veterinárni lekári pridávajú mnohé doplnky, toniká alebo injekcie (napr. B12) na zvýšenie hladín v krvi alebo na prevenciu ochorenia pečene alebo obličiek. Takéto doplnky sú zriedka potrebné u mačiek s čistou chorobou FIP.

Relapsy FIP počas 12-týždňového pozorovacieho obdobia po liečbe sa vyskytujú, a neexistuje jednoduchý krvný test na predpoveď, či došlo k vyliečeniu, alebo je možný relaps. Relapsy zvyčajne zahŕňajú infekcie, ktoré prenikli do centrálneho nervového systému (mozog, chrbtica, oči) počas liečby vlhkej alebo suchej FIP, ktorá nebola sprevádzaná neurologickými alebo okulárnymi príznakmi. Dávka GS-441524 používaná na liečbu týchto foriem FIP je často nedostatočná na účinné prekonanie hematoencefalickej alebo hematookulárnej beriéry. Hematoencefalická bariéra je nepriestupnejšia ako hematookulárna bariéra, čo vysvetľuje, prečo sa lézie očí dajú liečiť ľahšie ako infekcie mozgu alebo chrbtice. Relapsy, ktoré sa vyskytnú v období po liečbe, a ktoré zahŕňajú oči, mozog alebo chrbticu sa zvyčajne liečia najmenej 8 týždňov pri začiatočnej dennej dávke najmenej o 5 mg / kg vyššej, ako je dávka použitá počas primárnej liečby (napr. 10, 12, 15 mg/kg denne). Odporúča sa nepoužívať perorálne formy GS, ak dávka presahuje 10 mg/kg injekčnej formy denne, pretože pri vysokých perorálnych koncentráciách je znížená účinnosť absorpcie v čreve. U mačiek, ktoré sa nedajú vyliečiť z infekcie pri dávkach až 15 mg/kg denne, sa pravdepodobne vyvinula rôzna miera rezistenice voči GS-441524. Čiastočná rezistencia môže umožniť udržanie príznakov ochorenia pod kontrolou, ale nie vyliečenie, zatiaľ čo celková rezistencia sa prejavuje rôznou závažnosťou klinických príznakov počas liečby.

V čase diagnostiky môže existovať rezistencia na GS-441524, čo je však neobvyklé. Skôr sa objavuje počas liečby, a na začiatku je často čiastočná a vedie k potrebe vyššieho dávkovania. U niektorých mačiek sa môže stať úplnou. Rezistencia je najväčším problémom u mačiek s neurologickým ochorením, najmä u tých, ktoré majú neurologické príznaky, alebo sa u nich vyvine mozgová infekcia počas liečby, alebo počas relapsu po tom, čo sa liečba javila ako úspešná. Mnoho mačiek s čiastočnou rezistenciou na lieky môže byť liečené na príznaky choroby, ale relaps sa objaví hneď po ukončení liečby. Mačky sa „liečili“ na FIP už viac ako rok bez vyliečenia, ale nakoniec sa rezistencia zhoršuje, alebo majiteľovi dôjdu peniaze.

Liečba GS-441524 vykazuje žiadne, alebo len minimálne systémové vedľajšie účinky. Môže spôsobiť mierne poškodenie obličiek u niektorých mačiek, ale nemala by viesť k zlyhaniu obličiek. Systémové liekové reakcie typu vaskulitídy sa pozorovali u niekoľkých mačiek a možno ich zameniť s reakciami v mieste vpichu. Tieto liekové reakcie sú však v miestach, kde sa nepodávajú injekcie, a často sa stratia samé, alebo dobre reagujú na krátkodobú nízku dávku steroidov. Hlavným vedľajším účinkom liečby GS je bolesť v miestach vpichu, ktorá sa líši od mačky k mačke a podľa schopností osoby, ktorá injekcie aplikuje (zvyčajne majiteľ). Vredy/lézie v mieste vpichu sú u niektorých mačiek problém, a zvyčajne k nim dôjde, keď sa miesto vpichu nestrieda (nezdržujte sa medzi ramenami) a nepodáva sa do svalových a nervových vrstiev pod podkožím. Odporúčam zvoliť miesta začínajúce jeden palec za lopatkami, dole od chrbta po 1 až 2 palce pred chvostovou časťou a jednu tretinu až polovicu cesty dole k hrudníku a bruchu. Mnoho ľudí používa gabapentín pred injekciami na zmiernenie bolesti. Vredy v mieste vpichu sa zbavia okolitých chlpov a jemne sa čistia 4 alebo viackrát denne sterilnými vatovými tyčinkami namočenými v zriedenom roztoku peroxidu vodíka pre domácnosť v pomere 1:5. Zvyčajne nevyžadujú žiadne zložitejšie ošetrenie a vyliečia sa asi za 2 týždne.

Dúfame, že čoskoro bude k dispozícii legálna forma GS-441524. Liečivo s názvom Remdesivir je najväčšou súčasnou nádejou, pretože Remdesivir sa pri intravenóznom podaní ľuďom, myšiam, primátom a mačkám okamžite rozkladá na GS. Remdesivir dostal plné schválenie americkej FDA, a podobné schválenie bude pravdepodobne nasledovať aj v ďalších krajinách. Ak to tak bude, môže ho predpisovať akýkoľvek humánny lekár s licenciou a veterinári. Použitie Remdesiviru v USA sa však stále obmedzuje na konkrétnu podskupinu pacientov s Covid-19 a len za kontrolovaných podmienok a s pokračujúcim zberom údajov. Kým nebudú zrušené všetky obmedzenia, nebude ľahko dostupný ani pre ľudské použitie. Nemám skúsenosti s liečbou mačiek Remdesivirom namiesto GS-441524. Skupiny v Austrálii a niektorých ázijských krajinách však začínajú Remdesivir používať a hlásia rovnaké výsledky ako s GS-441524. Dávkovanie Remdesiviru na molárnom základe je teoreticky rovnaké ako GS-441524. Voľná ​​báza GS-441524 má molekulovú hmotnosť 291,3 g/M, zatiaľ čo Remdesivir má 602,6 g/M. Preto na získanie 1 mg GS-441524 by bolo potrebné dvakrát viac Remdesiviru (602,6/291,3=2,07). Rozpúšťadlo pre Remdesivir sa výrazne líši od rozpúšťadla používaného pre GS-441524 a je určené na IV použitie u ľudí. Nie je známe, ako sa bude zriedený Remdesivir správať pri subkutánnej aplikácii počas 12 alebo viac týždňov dlhej liečbe. U ľudí sa pri Remdesivire pozorovali mierne príznaky hepatotoxicity a nefrotoxicity. GS-441524 spôsobuje miernu a neprogresívnu renálnu toxicitu u mačiek, ale bez zjavnej pečeňovej toxicity. Nie je isté, či renálna toxicita pozorovaná u ľudí, ktorým bol podávaný Remdesivir, je spôsobená jeho aktívnou zložkou (t.j. GS-441524) alebo chemickými prísadami určenými na zvýšenie antivírusovej aktivity. O schválenie GC376 pre mačky (a ľudí) sa snaží spoločnosť Anivive, ale bude to trvať ešte dva alebo viac rokov. GC376 je inhibítor vírusovej proteázy a pôsobí odlišne ako GS-441524, ktorý inhibuje rané štádium replikácie vírusovej RNA. Preto je nepravdepodobné, že bude mať významný synergický vírusový inhibičný účinok, bude ale oveľa dôležitejší pri inhibícii liekovej rezistencie, keď sa použije v kombinovanej terapii (ako napríklad kombinovaná antivírusová terapia pre HIV/AIDS).

Publikované

Liečba FIP perorálnymi formami GS-441524

Niels C. Pedersen, Nicole Jacque,
3.10.2021
Pôvodný článok: FIP treatment with oral formulations of GS-441524

Úvod

Počiatočné testovanie GS-441524 v teréne na liečbu FIP zahŕňalo subkutánnu aplikáciu. Tento spôsob podávania bol založený na predchádzajúcich farmakokinetických (PK) štúdiách vykonaných na laboratórnych mačkách. Intravenózny a subkutánny spôsob podávania injekcie priniesol podobné vysoké hladiny v krvi, ktoré sa udržiavali v koncentráciách inhibujúcich vírusy viac ako 24 hodín. Zistilo sa, že perorálne podanie vedie k hladinám v krvi, ktoré dosahujú vrchol po 2 hodinách, ale dosahujú len približne 40 % vrcholových hladín subkutánnej a intravenóznej aplikácie (Pedersen NC, nepublikované údaje, 2018). Psy, ktoré majú dlhší črevný trakt vyvinutý pre všežravcov, však môžu perorálnou cestou absorbovať až 85 % GS441524 [1, 5]. Psy sa v štúdiách perorálnej absorpcie často používajú ako náhrada za ľudí, takže perorálna absorpcia u ľudí je tiež pravdepodobne vyššia ako u mačiek. 

Čínski dodávatelia lieku GS-441524 skopírovali riedidlo, koncentráciu lieku a spôsob subkutánneho podania, ktoré boli použité v pôvodnej publikovanej terénnej štúdii. Prvou spoločnosťou, ktorá ponúkla GS441524 na neschválenom trhu, bola spoločnosť Mutian. Spoločnosť Mutian bola tiež prvá, ktorá skúmala a ponúkala perorálnu formu lieku. Výskumníci spoločnosti Mutian zistili, že účinné hladiny lieku GS-441524 v krvi možno dosiahnuť len zvýšením koncentrácie lieku v ich perorálnych prípravkoch. Ostatné spoločnosti (napr. Aura, Lucky) následne ponúkli svoje vlastné verzie perorálne podávaného lieku GS-441524. Od septembra 2021 však spoločnosť Mutian na svojej webovej stránke už neuvádza perorálne prípravky GS (v akejkoľvek forme). V súčasnosti sú v USA najpoužívanejšími perorálnymi formami GS441524 prípravky Aura, Lucky a Capella.

Súčasné značky kapsúl/tablet sa predávajú ako výživové doplnky a na ich etiketách je uvedených niekoľko bežných neškodných chemických zlúčenín a liečivých bylín, pričom GS-441524 nie je medzi zložkami vôbec uvedený. Pravdepodobne sa tak deje preto, aby sa výrobcovia vyhli colným kontrolám. Bez ohľadu na zoznam zložiek je účinnou zložkou všetkých perorálnych výrobkov GS-441524. Presnú koncentráciu GS-441524 v rôznych perorálnych prípravkoch predajcovia utajujú, ale je zjavne vyššia (1,5 – 2-násobok?), ako by bolo potrebné, keby sa liek podával podkožne. 

Spočiatku sme sa k orálnej ceste stavali kriticky z dvoch dôvodov. Po prvé, orálne formy boli viac plytvajúce tým, čo bolo spočiatku vzácnym a drahým zdrojom. Po druhé, publikovaný výskum perorálnej absorpcie nukleozidov (GS-441524 je nukleozid) dokumentuje limitnú koncentráciu alebo strop pre perorálnu absorpciu [2-5]. Výsledky s EIDD-1931, príbuzným nukleozidom, ukázali pokles biologickej dostupnosti z 56 na 36 % so zvyšovaním perorálnej dávky [6]. Toto obmedzenie by teoreticky sťažilo dosiahnutie extrémne vysokých koncentrácií v krvi potrebných na liečbu niektorých foriem FIP (napr. neurologických) a/alebo na prekonanie problému získanej rezistencie na lieky. Perorálnu biologickú dostupnosť môžu výrazne znížiť aj niektoré látky v potrave a majitelia mačiek sú známi tým, že používajú veľké množstvo doplnkov stravy, z ktorých niektoré by mohli negatívne ovplyvniť liečbu. 

Zdá sa, že čoraz viac majiteľov a veterinárnych lekárov využíva perorálnu liečbu GS-441524 na časť alebo celú liečbu. Náklady na perorálne prípravky GS-441524 sa za posledné dva roky neustále znižujú a ich kvalita sa zvyšuje. Problém reakcií v mieste vpichu spolu s účinnejšími perorálnymi prípravkami GS-441524 stimulovali perorálnu liečbu a čoraz viac mačiek sa lieči perorálnymi liekmi buď z časti, alebo úplne. 

Zloženie a označenie

Väčšina zavedených perorálnych prípravkov sú malé tablety, ktoré sa podávajú ľahšie ako väčšie kapsuly. Novšie prípravky, ako je Sweeper, ponúkajú rozpustnú filmovú formu GS-441524, aby sa predišlo ťažkostiam pri „pilulkovaní“ u niektorých mačiek. 

Skutočné množstvo GS-441524 v tablete/kapsule a predajcom odporúčané dávkovanie perorálnych liekov sa značne líši podľa formy FIP, predajcu a skúseností majiteľa a skupín liečiacich FIP. Preto sa skutočné množstvo (mg) GS-441524 v tablete alebo kapsule zvyčajne neuvádza.   Namiesto skutočného množstva GS-441524 v tablete alebo kapsule sa dávkovanie predajcu často zakladá na počte tabliet potrebných na kg hmotnosti, napr. 1 tableta/kg per os (P0) každých (q)24 hodín (h) pre mačky s vlhkou alebo suchou FIP a bez okulárneho alebo neurologického postihnutia.  Množstvo GS-41524 v jednej takejto tablete podanej po 24 hodinách zodpovedá dávke 4-6 mg/kg SC po 24 hodinách, ale skutočné množstvo GS v jednej tablete môže byť dvojnásobné ako v 1 ml injekčného GS, aby sa kompenzovala znížená biologická dostupnosť pri podávaní perorálnou cestou. 

Okrem toho má jeden dodávateľ (Aura/Spark) tablety označené na podávanie q12h a iné na dávkovanie q24h. 1 tableta/kg po 12 hodinách obsahuje polovičné množstvo GS-441524 (pravdepodobne 4 – 6 mg) ako 1 tableta/kg po 24 hodinách (pravdepodobne 10 mg) – dôvodom je, že dávkovanie po 12 hodinách zabráni poklesu koncentrácie v krvi pred 24 hodinami. Účinné hladiny v krvi po jednorazovej dávke PO alebo SC sa však v oboch prípadoch udržiavajú 24 hodín alebo dlhšie. Pri dávkach zodpovedajúcich 10 – 15 mg/kg SC q24h môže byť ďalšou výhodou dávkovanie q8h alebo q12h oproti q24h, pretože môže pomôcť obísť absorpčný strop.  Preto sa u mačiek s dávkami zodpovedajúcimi 10 – 15 mg/kg SC q24h alebo vyššími často používa rozdelenie dávok po dávkovaní na q8h alebo q12h.

Dávkovanie

Odporúčané začiatočné dávkovanie GS-441524 pre mačky s mokrou alebo suchou FIP a bez neurologických alebo okulárnych príznakov je 4-6 mg/kg SC q24h. Injekčná dávka pre mačky s okulárnym ochorením je 8 mg/kg SC q24h a pre mačky s neurologickým ochorením 10 mg/kg SC q24h.  Ak sa u mačky začne liečba vlhkej FIP a potom sa vyvinie ochorenie očí, dávka sa okamžite zvýši na 8 mg/kg SC q24h a ak sa vyvinú neurologické príznaky, zvýši sa na 10 mg/kg SC q24h. Neúspešná liečba FIP pri dávkach vyšších ako 15 mg/kg SC q24h svedčí o rezistencii na liek. Dávky PO zodpovedajúce 4-6, 8 a 10 mg/kg SC q24h sú 10, 16 a 20 mg/kg PO q24h. (Poznámka: niektoré perorálne prípravky sú označené ako ekvivalenty SC, ale v skutočnosti obsahujú až dvojnásobok uvádzaných mg GS) Odporúčaná dĺžka liečby je 12 týždňov, pričom dávka sa zvyšuje, ak sa to považuje za potrebné. Je však známe, že niektoré mačky sa môžu vyliečiť za 6 týždňov s ktoroukoľvek formou GS-441524, viaceré za 8-10 týždňov a takmer všetky za 12 týždňov. Mladé mačky s abdominálnou vlhkou FIP majú tendenciu reagovať najrýchlejšie, mačky so suchou FIP pomalšie a mačky s neurologickou FIP najpomalšie. Preto je „univerzálnym“ odporúčaním liečiť každú mačku s FIP bez ohľadu na formu minimálne 12 týždňov. Dennú dávku vo forme PO je možné rozdeliť q12h, čo môže byť výhodné pri liečbe vyššími dávkami, aby sa predišlo absorpčnému stropu. Liečba SC a PO sa môže striedať q12h, aby sa zabránilo veľkým injekčným objemom.

Perorálne dávkovanie GS je menej presné ako pri injekciách.  Tablety sa ťažko delia, pretože majú tendenciu drobiť sa, takže delenie na polovice je často to najlepšie, čo sa dá urobiť. Ak vypočítaná dávka po užití spadá medzi uvedené dávky v tabletách, odporúča sa vždy zaokrúhliť nahor na najbližšiu polovicu tablety. 

Podávanie

Všetky perorálne značky majú obdobné pokyny na podávanie kapsúl alebo tabliet. Vo všeobecnosti sa odporúča polhodinový pôst pred a po podaní lieku. Malé množstvo pamlsku môže mačky povzbudiť, aby tablety užili, a mnohé mačky ich skonzumujú, keď sa im dajú na tanier obalené v pamlsku (napr. Churu). 

Náklady

Cena perorálneho GS sa za posledný rok výrazne znížila. Napriek tomu je relatívna cena perorálneho GS-441524 o 20 – 40 % vyššia (v závislosti od dodávateľa) ako jeho injekčná verzia.  

Faktory ovplyvňujúce perorálnu a injekčnú aplikáciu 

Mačky, u ktorých sa momentálne vyskytuje zvracanie/regurgitácia a hnačka, sa vo všeobecnosti považujú za nevhodných kandidátov na perorálnu liečbu liekom GS-441524. Preto sa mačkám so závažným gastrointestinálnym ochorením často začínajú podávať injekcie, aspoň kým sa tieto problémy nevyriešia. Väčšina ľudí, najmä v minulosti, začala s injekčným podávaním GS-441524. Injekčná forma je lacnejšia a dávkovanie je presnejšie riadené. Absorpcia GS-441524 je tiež spoľahlivejšia subkutánnou cestou ako perorálnou, čo je často rozhodujúci faktor pri počiatočnej liečbe mačiek, ktoré sú na začiatku ťažko choré a nestabilné. To, či mačka bude pokračovať v injekčnom podávaní lieku GS-441524, je často podmienené schopnosťou majiteľa aplikovať injekcie čo najefektívnejším spôsobom, ochotou mačky prispôsobiť sa bolesti pri injekcii a výskytom injekčných rán (lézií) v mieste aplikácie. Perorálne podávané lieky sú v takýchto situáciách často vítanou úľavou pre majiteľa aj mačacieho pacienta. Niektoré látky podávané perorálne môžu interferovať s absorpciou GS-441524. Preto by ste sa mali vyhnúť zaradeniu iných liekov a výživových doplnkov, ak nie sú nevyhnutné pre liečbu FIP. 

Porovnanie úspešnosti liečby injekčným a perorálnym GS-441524  

Za predpokladu, že dávkovanie je presne vypočítané a riadne nastavené, úspešnosť perorálneho lieku GS-441524 v súčasnosti reflektuje úspešnosť injekčných liekov. Napriek tomu boli zaznamenané rozdiely v reakciách medzi perorálnym a injekčným GS-441524. Malý počet mačiek nereagoval dobre na perorálny GS-441524 ako počiatočnú liečbu alebo viedol k relapsom pri nahradení injekcií. Alternatívne, prechod mačiek na perorálny GS-441524 v ekvivalentnej dávke viedol k vyriešeniu ochorenia, ktoré nereagovalo dobre na injekcie. Je ťažké priradiť tieto dramatické rozdiely v odpovedi liekovej forme, keďže GS-441524 podávaný subkutánnou alebo perorálnou cestou sa dostáva do krvného obehu a nakoniec do tkanív. Je pravdepodobnejšie, že je to spôsobené tým, že značky injekčného alebo perorálneho lieku GS-441524 používané pred takouto zmenou neboli dobré alebo že sa vyskytli problémy s absorpciou alebo podávaním.  Skutočne sa vyskytlo mnoho prípadov, keď prechod na inú perorálnu alebo injekčnú značku okamžite viedol k zlepšeniu odozvy. 

Pôvodne sa predpokladalo, že iba injekčná forma GS-441524 môže dosiahnuť extrémne vysoké hladiny v krvi a mozgovomiechovom moku potrebné na účinnú liečbu neurologického ochorenia, najmä v situáciách, keď sa u vírusu vyvinul rôzny stupeň rezistencie na lieky. Avšak perorálne značky, ako napríklad Aura/Lucky, boli účinné u mnohých mačiek s neurologickou FIP. Týkalo sa to aj niektorých mačiek, ktoré nereagovali na extrémne vysoké dávky injekčnej formy GS441524. Čoraz viac mačiek s neurologickou FIP sa lieči výlučne perorálnou formou GS. Je to spôsobené buď väčšími skúsenosťami s perorálnou liečbou v ťažkých prípadoch FIP, alebo pravdepodobne vyššou kvalitou perorálnych prípravkov. 

Prehľad v súčasnosti dostupných značiek perorálnej formy GS-441524 

Poznámka: Označenie a obsah GS odrážajú informácie poskytnuté dodávateľmi a neboli nezávisle overené. 

Mutian – Ide o pôvodnú a najznámejšiu značku orálnej formy GS-441524. Predával sa v niekoľkých rôznych formách vrátane viacerých foriem tabliet a kapsúl. Začiatkom roku 2021 prešiel Mutian na formu tabliet, označených ako 200 mg alebo 50 mg „Mutian“ alebo „Xraphconn“ – tie dodávajú ekvivalentnú SC dávku 10, resp. 2,5 mg GS-441524. Tablety sú podstatne väčšie (priemer 8,5 mm) ako tablety iných dodávateľov.  V poslednom čase je ojedinele k dispozícii nová formulácia kapsúl. Od septembra 2021 už webová stránka spoločnosti Mutian neponúka možnosť PO. Pre všetky perorálne formy lieku Mutian dodávateľ uvádza dávkovanie: 100 mg/kg „Mutian“ pre vlhkú/suchú FIP, 150 mg/kg Mutian pre okulárnu FIP a 200 mg/kg pre neurologickú FIP. 

Aura/Spark – Aura je dlhodobo zavedená značka a predáva sa v tabletách, ktoré sa podávajú každých 12 alebo 24 hodín. Predávajú sa vo verziách q12h a q24h, avšak medzi týmito dvoma verziami nie je rozdiel v zložení (t. j. predĺžené uvoľňovanie atď.). Skutočné množstvo GS-441524 v každej tablete sa neuvádza, ale označenie a účinná dávka sú nasledovné:

OznačenieEkvivalent injekčnej dávkyPokyny pre dávkovanie
Aura 12h-1kgcca. 2.5 mg/kgVlhká/suchá: 1 tableta na kg dvakrát denne
Okulárna: 1,5 tablety na kg dvakrát denne
Neurologická: 2 tablety na kg dvakrát denne  
Aura 24h–1 kgcca. 5 mg/kgVlhká/suchá: 1 tableta na kg denne
Okulárna: 1,5 tablety na kg denne
Neurologická: 2 tablety na kg denne         
Aura 12h–3 kgcca. 7.5 mg/kgVlhká/suchá: 1 tableta na 3 kg dvakrát denne
Okulárna: 1,5 tablety na 3 kg dvakrát denne
Neurologická: 2 tablety na 3 kg dvakrát denne         
Aura 24h–2 kgcca. 10 mg/kgVlhká/suchá: 1 tableta na 2 kg dvakrát denne
Okulárna: 1,5 tablety na 2 kg dvakrát denne
Neurologická: 2 tablety na 2 kg dvakrát denne         

Ekvivalentná perorálna dávka pre >10 mg/kg denne injekčného GS sa úmerne zvyšuje.  Tablety sa môžu kombinovať bez ohľadu na označenie 12/24h s použitím účinnej injekčnej dávky – napríklad 2,5 kg mačka s vlhkou FIP by mohla užívať jednu tabletu 24h – 2 kg a jednu tabletu 12h -1 kg denne.

Lucky – Tablety Lucky sú označené ako 24h – 1 kg (ekvivalentná dávka 5-6 mg/kg SC) alebo 24h – 2 kg (ekvivalentná dávka približne 10-12 mg/kg SC) a údajne majú identické zloženie ako porovnateľné tablety Aura, hoci majú iný tvar.  V prípade FIP bez okulárnych alebo neurologických príznakov by ste mali podávať jednu 1 kg tabletu denne na kg hmotnosti mačky alebo jednu 2 kg tabletu na každé 2 kg, zaokrúhlené na najbližšiu polovicu tablety. Počet tabliet na deň vynásobte číslom 1,5 v prípade očných alebo číslom 2 v prípade neurologických foriem. 

OznačenieEkvivalent injekčnej dávkyPokyny na dávkovanie pri vlhkej/suchej FIP (dávkovanie sa zdvojnásobuje pre neuro/okulárnu FIP)
Lucky 24h – 1 kgcca. 5-6 mg1 tableta na kg denne
Lucky 24h – 2 kgcca. 10-12 mg1 tableta na 2 kg denne

Capella – Capella vyrába dve veľkosti tabliet, 1 kg (dávka 5 – 6 mg SC ekvivalentu) a 2 kg (dávka 10 – 12 mg SC ekvivalentu). V prípade FIP bez okulárnych alebo neurologických príznakov by ste mali podávať jednu 1 kg tabletu denne na kg hmotnosti mačky alebo jednu 2 kg tabletu na každé 2 kg a zaokrúhliť nahor na najbližšiu polovicu tablety. Počet tabliet na deň vynásobte 1,5 v prípade okulárnych alebo 2 v prípade neurologických foriem. 

Kitty Care – Ide o ďalšiu nízkonákladovú značku, ktorá teraz ponúka injekčnú aj perorálnu formu lieku GS-441524. Predpokladá sa, že každá tableta obsahuje ekvivalent 6 mg SC dávky GS-441524. 

Hero 16 –Ide o dobre známu značku, ktorá sa dodáva v ľahko aplikovateľných a deliteľných tabletách určených na podávanie v dávke jedna tableta na 2 kg hmotnosti, ako sú tablety Capella 2 kg. Každá tableta pravdepodobne obsahuje 16 mg GS-441524. 

Rainman – Táto značka je populárna v Číne a zdá sa, že má dobrú povesť v krajinách, kde sa používa. Predáva sa v tabletách s hmotnosťou 1 kg a 2 kg, o ktorých sa predpokladá, že obsahujú ekvivalent 5 – 6 mg a 10 – 12 mg SC GS-441524. 

Mary – Mary sa predáva v kapsulách, ktoré pravdepodobne obsahujú ekvivalent 6 mg SC GS-441524

Additional brands– Panda, Pany, Sweeper, Sweeper film

Referenčné štúdie o GI absorpcii nukleozidov podobných GS-441524 a GS-441524

  1. Thomas L. A precursor to remdesivir shows therapeutic potential for COVID-19. https://www.news-medical.net/news/20210209/A-precursor-to-remdesivir-showstherapeuticpotential-for-COVID-19.aspx.
  2. Painter GR, Bowen RA, Bluemling GR, et al. The prophylactic and therapeutic activity of a broadly active ribonucleoside analog in a murine model of intranasal venezuelan equine encephalitis virus infection. Antiviral Res. 2019;171:104597. doi:10.1016/j.antiviral.2019.104597
    After oral administration EIDD-1931 is quickly absorbed as evidenced by plasma T-max-values ranging between 0.5 and 1.0 h.Exposures are high (C-ma-xvalues range between 30 and 40μM) and are dose dependent, but significantly less than dose proportional. The observation of decreasing bioavailability with increasing dose may indicate capacity limited absorption, a phenomenon that has been reported for other nucleosides (de Miranda et al., 1981). EIDD-1931, like most endogenous nucleosides and xenobiotic nucleoside analogs, is a highly polar, hydrophilic molecule (cLog P =−2.2) and therefore likely to require functional transporters to cross cell membranes. This dependence would explain the capacity limited uptake seen in the pharmacokinetic studies done using the CD-1 mice. Earlier reports also indicated that nucleoside uptake into mouse intestinal epithelial cells is primarily mediated by sodium dependent concentrative nucleoside transporters (Cass et al., 1999; Vijayalakshmi and Belt, 1988).
  3. Cass, C.E., Young, J.D., Baldwin, S.A., Cabrita, M.A., Graham, K.A., Griffiths, M.,Jennings, L.L., Mackey, J.R., Ng, A.M., Ritzel, M.W., Vickers, M.F., Yao, S.Y., 1999.Nucleoside transporters of mammalian cells. Pharm. Biotechnol. 12313–12352
  4. de Miranda, P., Krasny, H.C., Page, D.A., Elion, G.B., 1981. The disposition of acyclovir indifferent species. J. Pharmacol. Exp. Ther. 219 (2), 309–315
  5. Vijayalakshmi, D., Belt, J.A., 1988. Sodium-dependent nucleoside transport in mouse intestinal epithelial cells. Two transport systems with differing substrate specificities. Biol. Chem. 263 (36), 19419–19423.
  6. Yan VC, Khadka S, Arthur K, Ackroyd JJ, Georgiou DK, Muller FL. Pharmacokinetics of Orally Administered GS-441524 in Dogs. bioRxiv, doi: https://doi.org/10.1101/2021.02.04.429674
  7. FIP Warriors CZ/SK, https://www.fipwarriors.eu/, https://www.facebook.com/groups/fipczsk
sk_SKSK
en_GBEN sk_SKSK