Kategória: Preklady

Publikované

Terapeutický účinok antihumánnej TNF-alfa protilátky a itrakonazolu pri liečbe FIP

31.3.2020, Preklad 25.4.2021
Tomoyoshi Doki, Masahiro Toda, Nobuhisa Hasegawa, Tsutomu Hohdatsu & Tomomi Takano
Pôvodný článok: Therapeutic effect of an anti-human-TNF-alpha antibody and itraconazole on feline infectious peritonitis

Abstrakt

Infekčná peritonitída mačiek (FIP) je smrteľné ochorenie voľne žijúcich a domácich druhov mačiek. Aj keď niektoré lieky sa ukázali ako účinné pri liečbe FIP, v klinickej praxi sú stále nedostupné. V tejto štúdii sme hodnotili terapeutický účinok kombinovaného použitia adalimumabu (antihumánna TNF-alfa monoklonálna protilátka, ADA) a itrakonazolu (ICZ), ktoré sú veterinárnym lekárom v súčasnosti k dispozícii. Neutralizačná aktivita ADA proti fTNF-alfa-indukovanej cytotoxicite sa merala v bunkách WEHI-164. Desať mačiek bez špecifických patogénov (SPF) bolo naočkovaných intraperitoneálne FIPV KU-2 typu I. Mačkám, u ktorých sa vyvinula FIP, sa ADA (10 mg/zviera) podávala dvakrát medzi dňom 0 a dňom 4 po zahájení liečby. ICZ (50 mg/hlava, SID) sa podával orálne každý deň od dňa 0 po začiatku liečby. ADA preukázala na dávke závislú neutralizačnú aktivitu proti rfTNF-alfa. V experimente na zvieratách 2 z 3 mačiek preukázali zlepšenie klinických symptómov FIP a výsledkov biochémie, zvýšenie počtu lymfocytov v periférnej krvi a pokles hladiny alfa 1-AGP v plazme po zahájení liečby. Jedna z mačiek na liečbu nereagovala a bola eutanizovaná, aj keď hladina vírusového génu v ascite po zahájení liečby dočasne poklesla. Zistilo sa, že ADA má neutralizačnú aktivitu proti rfTNF-alfa. Kombinované použitie ADA a ICZ ukázalo terapeutický účinok na experimentálne indukovanú FIP. Tieto lieky považujeme za možnosť liečby, kým nebudú účinné lieky proti FIPV legálne dostupné.

Úvod

Vírus infekčnej peritonitídy mačiek (FIPV), mačací koronavírus (FCoV) z čeľade Coronaviridae, spôsobuje u voľne žijúcich a domácich druhov mačiek smrteľné ochorenie nazývané infekčná peritonitída mačiek (FIP). U mačiek, u ktorých sa vyvinie FIP, je postihnutých niekoľko orgánov vrátane pečene, pľúc, sleziny, seróz, obličiek, očí a centrálneho nervového systému a tvorbu lézií v týchto orgánoch sprevádza nekróza a pyogénny granulomatózny zápal. U niektorých mačiek bolo zaznamenané hromadenie pleurálneho výpotku a ascitickej tekutiny [1].

Virión FCoV sa skladá hlavne z nukleokapsidy (N), obalu (E), membrány (M) a peplomerových spike (S) proteínov. FCoV sú klasifikované do dvoch sérotypov, FCoV typu I a II, na základe rozdielov v aminokyselinovej sekvencii S proteínu [2, 3]. FCoV typu II bol generovaný genómovou rekombináciou medzi FCoV I. typu a psím koronavírusom II. typu (CCoV) [4,5,6]. Niekoľko sérologických a genetických prieskumov ukázalo, že FCoV typu I je dominantný a že väčšina prípadov FIP je spôsobená infekciou FIPV typu I [7,8,9].

Už skôr sme ukázali, že TNF(tumor nekrotizujúci faktor)-alfa hrá rozhodujúcu úlohu v progresii FIP. TNF-alfa je nadmerne produkovaný makrofágmi infikovanými FIPV. TNF-alfa sa podieľa na lymfopénii a zvýšených hladinách bunkového receptora FIPV sérotypu II, aminopeptidázy N (APN) [10, 11]. Tiež sa uvádza, že apoptóza neutrofilov u mačiek s FIP je inhibovaná TNF-alfa [12]. Toto zistenie naznačuje, že neutrofília u mačiek s FIP je spôsobená prežitím neutrofilov indukovaným TNF-alfa. Zistili sme, že monoklonálna protilátka (mAb) 2-4 s vysokou neutralizačnou aktivitou proti mačaciemu TNF-alfa (fTNF-alfa) je použiteľná ako liečba FIP [13, 14]. Avšak mAb anti-fTNF-alfa nebola nikdy uvedená na trh a nemôže byť klinicky použitá v zvieracích nemocniciach. V humánnej medicíne sa antihumánna TNF-alfa mAb používa na liečbu zápalových ochorení, ako je reumatoidná artritída a Crohnova choroba [15]. Je komerčne dostupná a je možné aj jej použitie vo veterinárni praxi. Nie je však známe, či je táto ľudská protilátka účinná proti FIP, chorobe mačiek.

Pre liebu FIPV bolo opísaných niekoľko antivírusových látok [16,17,18,19,20]. Bolo potvrdené, že tieto lieky znižujú množenie FIPV, ale nie sú komerčne distribuované ako veterinárne lieky. Už skôr sme zistili, že itrakonazol (ICZ), ktorý sa používa vo veterinárnej medicíne, znižuje množenie FIPV typu I [21,22,23]. Terapeutické účinky ICZ u mačiek s FIP však zostávajú nejasné.

V tejto štúdii sme hodnotili, či má adalimumab (ADA), antihumánna TNF-alfa mAb, neutralizačnú aktivitu proti fTNF-alfa. Ďalej sme hodnotili terapeutické účinky ADA a ICZ na FIP ich podávaním mačkám s experimentálne indukovanou FIP.

Materiály a metódy

Bunkové kultúry a vírusy

Bunky myšieho sarkómu WEHI-164 sa udržiavali v rastovom médiu RPMI 1640 doplnenom o 10% FCS, 600 U benzylpenicilínu draselného na ml, 240μg streptomycínsulfátu na ml a 50μM 2-merkaptoetanolu. Bunky myšieho sarkómu WEHI-164 boli z American Type Culture Collection (ATCC CRL1751).

FIPV KU-2 typu I sa pestoval v celých plodových (fcwf)-4 bunkách Felis catus pri 37°C. FIPV typu I KU-2 typu I bol izolovaný v našom laboratóriu.

Monoklonálna protilátka

Anti-fTNF-alfa mAb 2-4 boli opísané v [13] a bolo preukázané, že majú neutralizačnú aktivitu pre rekombinantný fTNF-alfa (rfTNF-alfa) a prirodzený fTNF-alfa. mAb 2-4 sa purifikovali z hybridomového kultivačného supernatantu pomocou proteínu G Sepharose (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA). Anti-humánna TNF-alfa mAb, adalimumab (ADA, Humira®), bola zakúpená od Eisai Co., Ltd. (Tokio, Japonsko) ako roztok 20mg/0,2 ml. ADA sa zriedil na koncentráciu 2mg/ml vo fyziologickom roztoku.

Itrakonazol

Itrakonazol (ICZ) bol zakúpený od spoločnosti NICHI-IKO (Toyama, Japonsko) a poskytnutý ako tableta (100 mg). Mačkám bola podávaná polovica tablety, rozdrvená na prášok a zmiešaná s jedlom.

Neutralizácia mačacieho TNF-alfa pomocou ADA v bunkách WEHI-164

Neutralizácia TNF-alfa v bunkách WEHI-164 sa testovala podľa popisu Doki a kol. [13]. Stručne povedané, bunky WEHI-164 sa suspendovali pri hustote 1×106 buniek/ml v riediacom médiu obsahujúcom 1μg aktinomycínu D (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) na ml a predinkubovali sa pri 37°C po dobu 3 hodín. Sériovo zriedené mAb sa zmiešali s 40ng rfTNF-alfa na ml. Zmes sa inkubovala pri 37°C počas 1 hodiny. Predinkubované bunky sa naočkovali v objeme 50μl do jamiek 96-jamkovej doštičky. Potom sa do každej jamky pridalo 50 mikrolitrov zmesi. Po inkubácii pri teplote 37°C počas 24 hodín sa pridalo 10μl roztoku WST-8 (WST-8 Cell Proliferation Assay Kit; Kishida Chemical Co., Ltd., Osaka, Japonsko) a merala sa absorbancia vyrobeného formazanu pri 450nm. Percento neutralizácie bolo vypočítané pomocou nasledujúceho vzorca: Neutralizácia (%) = (OD jamiek obsahujúcich mAb a rfTNF-alfa – OD jamiek obsahujúcich rfTNF-alfa bez mAb)/OD jamiek bez mAb a rfTNF-alfa × 100.

Pokus na zvieratách

Boli dodržané všetky príslušné národné a inštitucionálne smernice pre starostlivosť a použitie zvierat. Protokol o experimentovaní na zvieratách bol schválený prezidentom Kitasato University na základe rozhodnutia Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť a použitie zvierat na Kitasato University (schválenie č. 18-152). Mačky bez špecifických patogénov (SPF) boli chované v našom vlastnom laboratóriu a udržiavané v izolovanom zariadení s regulovanou teplotou.

Experimentálny harmonogram

Podľa experimentálneho harmonogramu zobrazeného na obr. 1 bolo 10 mačiek SPF (9- alebo 10-mesačné domáce krátkosrsté mačky) naočkovaných intraperitoneálne FIPV KU-2 typu I (103,6 TCID50/ml/zviera). Potom sa u mačiek denne vyšetrovali klinické príznaky a merala sa ich telesná teplota a hmotnosť. Mačkám, u ktorých sa vyvinula FIP, sa ADA (10 mg/zviera) podávala dvakrát intravenózne medzi dňom 0 a dňom 4 po začiatku liečby. ICZ (50mg/zviera, SID) sa podával orálne každý deň od dňa 0 po zahájení liečby. Krv sa odoberala mačkám v týždňových intervaloch po naočkovaní vírusom a v čase podania ADA. Heparinizovaná krv sa použila na meranie úplného a diferenciálneho počtu buniek a na izoláciu plazmy. Vzorky plazmy sa až do dňa analýzy skladovali pri -30°C. Mačky boli eutanizované po dosiahnutí humánneho koncového bodu alebo 60 dní po infikovaní. Diagnózy FIP boli potvrdené posmrtným vyšetrením s odhalením peritoneálnych a pleurálnych výpotkov a pyogranulómu v hlavných orgánoch.

Obrázok 1
Experimentálny harmonogram liečby a očkovania mačiek FIPV

Meranie plazmatického alfa1-glykoproteínu (AGP)

Plazmatické koncentrácie AGP sa stanovili pomocou mačacej doštičky alfa1 AG (The Institute for Metabolic Ecosystem Lab., Osaki, Japonsko) podľa protokolu výrobcu.

Meranie koncentrácie plazmatického vaskulárneho endoteliálneho rastového faktora (VEGF)

Plazmatické koncentrácie VEGF sa stanovili pomocou humánnej VEGF ELISA súpravy (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) podľa protokolu výrobcu. Súprava ELISA primárne deteguje mačaciu VEGF izoformu 164 [24].

Kvantitatívna RT-PCR v reálnom čase (qRT-PCR)

Na kvantifikáciu vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu sa uskutočnila qRT-PCR s použitím primeru zameraného na 3’-UTR [17]. Jeden mililiter ascitu sa zhromaždil od mačky č. 6 a po centrifugácii sa supernatant a bunky uložili oddelene. Celková RNA sa izolovala zo supernatantu a buniek z ascitu pomocou súpravy na izoláciu RNA vysokej čistoty (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemecko) podľa pokynov výrobcu. RNA bola reverzne transkribovaná a amplifikovaná s použitím RNA-direct Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Osaka, Japonsko) so špecifickými primermi 3′-UTR-F (5′-GGAGGTACAAGCAACCCTATT-3 ‚) a 3′-UTR-R (5‘-GATCCAGACGTTAGCTCTTCC-3 ‚) a sonda (FAM-5′-AGATCCGCTATGACGAGCCAACAA-3‘-BHQ1). Reakcia sa uskutočňovala v celkovom objeme 20μl/jamku na 48-jamkových doštičkách PCR s použitím systému StepOne Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pri teplote 90°C počas 30s, 60°C počas 20 minút a pri 95°C počas 1 minúty, potom nasledovalo 45 cyklov pri 90°C počas 15s a 60°C počas 1 minúty. Na získanie kontrolnej RNA na kvantifikáciu sa cDNA fragmenty amplifikované s primérmi 3’-UTR-F a 3’-UTR-R klonovali do pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA). Linearizovaný a purifikovaný plazmid bol transkribovaný pomocou RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7 (Promega, Madison, WI, USA) podľa pokynov výrobcu. Koncentrácia transkribovanej RNA sa merala pomocou spektrofotometra. Boli pripravené desaťnásobné riedenia transkriptu RNA v rozmedzí od 1×101 do 1×109 kópií/μl s 10ng MS2 RNA na ml. Počet kópií RNA sa vypočítal podľa postupu opísaného v Fronhoffs a kol. [25]. Zásobné roztoky in vitro transkribovanej RNA sa skladovali pri -80°C a zriedené pracovné roztoky sa skladovali pri -30°C.

Proteínová sekvencia

Odvodené aminokyselinové sekvencie mačacieho a humánneho TNF-alfa sa získali z RefSeq (prístupové čísla NP_001009835.1 a NP_000585.2). Porovnanie odvodených aminokyselinových sekvencií mačacieho a ľudského TNF-alfa sa uskutočnilo s použitím Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

Výsledky

Neutralizačná aktivita ADA proti rfTNF-alfa

Porovnanie odvodených aminokyselinových sekvencií mačacích a humánnych TNF-alfa je znázornené na obr. 2. Zistilo sa, že sekvencie sú identické na 89,7%.

Obrázok 2.
Porovnanie aminokyselinovej sekvencie mačacieho a ľudského TNF-alfa. *: rezíduá, ktoré interagujú s adalimumabom

Neutralizačná aktivita ADA proti rfTNF-alfa sa merala pomocou testu cytotoxicity WEHI-164. ADA neutralizovala aktivitu rfTNF-alfa spôsobom závislým od dávky, podobne ako anti-fTNF-alfa mAb 2-4 (obr. 3). Dávka mAb2-4 a ADA potrebná na inhibíciu bunkovej smrti o 50% (IC50) bola 18,1 ± 4,9 ng/ml, respektíve 36,9 ± 23,4 ng/ml.

Obrázok 3.
Krivka neutralizačnej dávky a odpovede proti rekombinantnému fTNF-alfa. Neutralizačná aktivita ADA proti fTNF-alfa indukovanej cytotoxicite sa merala v bunkách WEHI-164. Bunky WEHI-164 boli ošetrené zmesami sériových riedení ADA a fTNF-alfa a po 24 hodinách bola meraná hladina TNF-alfa indukovanej cytotoxicity.

Zmeny telesnej teploty a telesnej hmotnosti

Desať mačiek SPF bolo naočkovaných intraperitoneálne 103,6 TCID50 FIPV KU-2 typu I. Tri mačky (2, 3 a 6) vykazovali horúčku, anorexiu, letargiu a žltačku. Distenzia brucha spôsobená ascitom sa pozorovala u mačky č. 6. Tieto 3 mačky boli použité v nasledujúcich experimentoch ako FIP mačky. Liečba mačiek 2, 3 a 6 sa začala 34., 32. a 21. deň po naočkovaní vírusom.

Zmeny telesnej teploty a telesnej hmotnosti u troch mačiek sú znázornené na obr. 4. U všetkých sa vyvinula horúčka ≥ 39°C niekoľko dní pred zahájením liečby (obr. 4A). U mačiek 2 a 3 sa telesná teplota znížila na rozsah pred nástupom FIP 7. deň po začiatku liečby. Potom sa telesná teplota mačky č. 3 sa zvýšila na 38,7°C 31. deň po zahájení liečby. Telesná teplota mačky č. 6 zostala na ≥ 39,0°C aj po začiatku liečby.

Obrázok 4.
Zmeny telesnej teploty a hmotnosti mačiek. †: Mačka bola eutanizovaná, pretože jej klinický stav dosiahol humánny koncový bod

U mačiek 2 a 3 sa nepozoroval žiadny úbytok telesnej hmotnosti v porovnaní s telesnou hmotnosťou v deň 0 liečby (obr. 4B). Telesná hmotnosť mačky č. 6 naďalej klesala od dňa 0 do dňa 15, čo malo za následok 8% stratu v porovnaní s dňom 0.

Zmeny počtu WBC a lymfocytov

Celkový počet bielych krviniek a počet lymfocytov sa meral u mačiek infikovaných FIPV. U mačiek 2 a 3 sa počas celého experimentu pozorovala malá zmena v celkovom počte bielych krviniek (obr. 5A). U mačky č. 6 sa celkový počet bielych krviniek zvýšil po zahájení liečby a po šiestom dni zostal na hodnote ≥ 20 000 buniek/μl.

Obrázok 5.
Zmeny počtu WBC a lymfocytov u mačiek. †: Mačka bola eutanizovaná, pretože jej klinický stav dosiahol humánny koncový bod

U mačiek 2 a 3 sa počet lymfocytov po zahájení liečby mierne zvýšil (obr. 5B). U mačky č. 6, počet lymfocytov zostal počas celého experimentu nízky. Znížila sa na približne 800 buniek/μl v deň 6 po začiatku liečby, ale obnovila sa takmer na úroveň pred prepuknutím FIP v deň 13 a nevykazovala výraznú zmenu až do humánneho koncového bodu.

Zmeny v plazmatickej koncentrácii alfa1-kyslého glykoproteínu (AGP)

Hladina alfa 1-AGP v plazme sa merala postupne u troch mačiek. U všetkých troch mačiek sa zvýšila na vysokú hladinu ≥ 750 μg / ml na začiatku liečby (obr. 6). U mačiek 2 a 3 sa plazmatická hladina alfa 1-AGP znížila takmer na hladinu pred vývojom FIP v 14. a 16. deň po zahájení liečby. Avšak u mačky č. 6 bolo zvýšenie plazmatickej hladiny alfa 1-AGP potlačené až do 6. dňa po začiatku liečby, ale na 13. deň sa zvýšilo na približne 1 900μg/ml.

Obrázok 6.
Zmeny plazmatickej koncentrácie alfa1-kyslého glykoproteínu (AGP) u mačiek. †: Mačka bola eutanizovaná, pretože jej klinický stav dosiahol humánny koncový bod

Zmeny koncentrácie plazmatického vaskulárneho endoteliálneho rastového faktora (VEGF)

Plazmatická hladina VEGF sa postupne merala u troch mačiek. U mačky č. 2 zostal nízky (obr. 7). U mačky č. 3, sa dočasne zvýšila na približne 200 pg/ml v deň 5 pred zahájením liečby, ale znížila sa takmer na úroveň pred nástupom FIP v deň 0 liečby a po nej nevykazovala žiadny nárast. U mačky č. 6 sa plazmatická hladina VEGF zvýšila po inokulácii FIPV na približne 170 pg/ml v deň 0 liečby. Potom sa znížila počnúc 6. dňom liečby a bola podobná úrovni pred prepuknutím FIP v 13. deň.

Obrázok 7.
Zmeny koncentrácie plazmatického vaskulárneho endoteliálneho rastového faktora (VEGF) u mačiek. †: Mačka bola eutanizovaná, pretože jej klinický stav dosiahol humánny koncový bod

Hladiny vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu u mačky č. 6

Hladiny vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu zhromaždených od mačky č. 6 bolo kvantifikovaných pomocou qRT-PCR. Úroveň vírusovej RNA dočasne poklesla na 4. deň po zahájení liečby v supernatante aj v bunkách z ascitu (obr. 8). V deň 20 po začiatku liečby sa však hladiny vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu zvýšili na dvojnásobok úrovní v deň 0 liečby.

Obrázok 8.
Hladiny vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu zhromaždených od mačky č. 6 bolo kvantifikovaných pomocou qRT-PCR. Úroveň vírusovej RNA dočasne poklesla na 4. deň po zahájení liečby v supernatante aj v bunkách z ascitu (obr. 8). V deň 20 po začiatku liečby sa však hladiny vírusovej RNA v supernatante a bunkách z ascitu zvýšili na dvojnásobok úrovní v deň 0 liečby.

Biochemický panel

Po liečbe sa merali TP a pomer A/G, čo sú diagnostické indexy FIP, a AST, LDH a TB, ktoré súvisia s funkciou pečene (obr. 9). TP sa mierne zvýšila u mačky č. 3, ale u všetkých troch mačiek zostala v normálnom rozmedzí. Na druhej strane pomer A/G poklesol po vystavení FIPV u všetkých troch mačiek a v deň 0 liečby bol ≤ 0,8. U mačky č. 2, pomer A/G zostal podobný ako po začiatku liečby až do konca experimentu. U mačky č. 3, klesal až do 16. dňa liečby, ale potom už nevykazoval žiadny ďalší pokles. U mačky č. 6 pokračovalo znižovanie aj po zahájení liečby.

Obrázok 9.
Biochemický panel. Biele oblasti grafov predstavujú normálne rozsahy. †: Mačka bola eutanizovaná, pretože jej klinický stav dosiahol humánny koncový bod

AST, LDH a TB boli vyššie ako normálne rozmedzie v deň 0 alebo 3 liečby u všetkých troch mačiek. U mačiek 2 a 3 sa AST, LDH a TB znížili takmer na hladiny pred nástupom FIP v deň 7 alebo 9 po zahájení liečby. U mačky č. 6, AST, LDH a TB boli vyššie ako normálne rozmedzie v deň 0 alebo 4 po zahájení liečby a naďalej sa zvyšovali až do konca experimentu.

Diskusia

Silný terapeutický účinok možno dosiahnuť, ak sa mačkam s FIP podáva mAb anti-fTNF-alfa, ktorý potláča aktivitu TNF-alfa, exacerbátor FIP, v kombinácii s ICZ, ktorý znižuje proliferáciu (množenie) FIPV. Avšak schválenie mAb anti-fTNF-alfa ako veterinárneho lieku v každej krajine je nákladné a časovo náročné. Preto sme sa zamerali na antiľudskú TNF-alfa mAb, ktorá sa už používa na liečbu ľudských zápalových chorôb.

Pred uskutočnením pokusov na zvieratách sme skúmali, či antihumánna TNF-alfa mAb môže neutralizovať fTNF-alfa. ADA, ktorá je antihumánnou TNF-alfa mAb, demonštrovala na dávke závislú neutralizačnú aktivitu proti rfTNF-alfa, podobnú anti-fTNF-alfa mAb 2-4. Deväť skôr reportovaných anti-fTNF-alfa mAb, malo IC50 v rozmedzí od 5 do 700ng/ml proti rfTNF-alfa pri rovnakej koncentrácii [13]. IC50 ADA (36,9 ± 23,4 ng/ml) naznačuje, že má vysokú neutralizačnú aktivitu proti fTNF-alfa v porovnaní s týmito anti-fTNF-alfa mAb. Spravidla mAb proti ľudským cytokínom nevykazujú žiadnu krížovo reaktívnu neutralizačnú aktivitu proti živočíšnym cytokínom. Avšak Aguirre a kol. uviedli, že ľudský a mačací TNF-alfa majú podobné neutralizačné epitopy [26]. Navyše odvodená aminokyselinová sekvencia ľudského TNF-alfa je na 89,7% identická so sekvenciou mačacieho TNF-alfa a v obidvoch je prítomných 10 z 12 rezíduí, ktoré interagujú s ADA [27]. To sa javí ako dôvod silnej neutralizačnej aktivity adalimumabu proti mačaciemu TNF-alfa.

ADA a ICZ sme podávali mačkám s experimentálne indukovanou FIP a skúmali sme ich terapeutický účinok. Z 10 SPF mačiek, ktoré dostali intraperitoneálne aplikovaný FIPV KU-2 typu I, sa u troch vyvinula FIP. Z týchto troch mačiek bola mačka č. 6 malo zjavný ascit. U týchto troch mačiek sa usúdilo, že si vyvinuli FIP z nasledujúcich dôvodov: i) všetky tri mačky boli infikované FIPV, ii) boli pozorované klinické príznaky súvisiace s FIP, iii) zvýšené plazmatické hladiny alfa-1 AGP a VEGF a iv ) ako referencie boli použité údaje z našich minulých pokusov na zvieratách. ADA (10 mg/zviera) sa podával intravenózne trom mačkám v deň 0 a do 4 dní po začiatku liečby. Okrem toho sa ICZ (50mg/zviera) podával orálne každý deň, počínajúc dňom 0 liečby. U mačiek 2 a 3 bolo po zahájení liečby pozorované zlepšenie klinických príznakov a výsledkov chemických testov krvi, zvýšenie počtu lymfocytov v periférnej krvi a pokles hladiny alfa 1-AGP v plazme. Symptomatické zlepšenia sa pozorovali medzi 1. a 2. týždňom po začiatku liečby. Ďalej u mačiek 2 a 3 neboli na konci experimentu patologicky pozorované žiadne ascity alebo pyogénne granulómy a do konca liečebného obdobia neboli pozorované žiadne zmeny naznačujúce opakovanie FIP. Mačka č. 6 nereagovala na liečbu a bola eutanizovaná, aj keď hladina vírusového génu v ascite po zahájení liečby dočasne poklesla. Tieto výsledky silne naznačujú, že anti-humánne TNF-alfa mAb a ICZ sú účinné pri liečbe FIP.

VEGF je produkovaný makrofágmi infikovanými FIPV a zlepšuje permeabilitu mačacích endotelových buniek [28]. U mačiek s FIP koreluje plazmatická hladina VEGF s množstvom ascitu. Mačka č. 6, u ktorej bol zrejmý ascites pri predbežnom i palpačnom vyšetrení (pri eutanázii sa získalo 160ml ascitu), mala počas 3 týždňov vysokú hladinu VEGF v plazme ≥100pg/ml. U mačiek 2 a 3, u ktorých neboli zaznamenané žiadne príznaky ascitu, však plazmatická hladina VEGF zostala nízka alebo sa zvýšila iba dočasne. Potvrdilo sa teda, že plazmatická hladina VEGF koreluje s množstvom ascitu u mačiek s FIP.

Je známe, že azolové antifungálne látky vrátane ICZ majú hepatotoxicitu ako vedľajší účinok a pravdepodobne vyvolávajú cholestázu a žltačku [29,30,31,32]. Pretože sa u mačiek s FIP pozoruje zvýšenie pečeňových enzýmov, rozvoj nežiaducich účinkov po podaní ICZ by bol znepokojujúci. U mačiek 2 a 3 sa však hladiny markerov pečeňových funkcií, ktoré sa zvyšovali v priebehu liečby, vrátili do normálneho rozsahu a plazmatická žltačka zmizla. Žiadne nežiadúce účinky ICZ teda neboli zaznamenané. Z hľadiska nežiadúcich účinkov sa teda podávanie ICZ považuje pre FIP mačky za bezpečné.

Nedávno boli ako lieky na inhibíciu proliferácie FIPV vyvinuté GC-376, inhibítor 3C-like proteázy, a GS-441524, nukleozidový analóg [16,17,18,19,20]. GC-376 a GS-441524 sú účinné lieky, ktoré majú terapeutické účinky u 30 – 80% mačiek s FIP. Aj keď sa očakáva, že tieto lieky budú užitočné ako liečba FIP, ešte neboli schválené. V klinickej praxi preto nie sú k dispozícii žiadne lieky na liečbu FIP. V tejto štúdii sme preukázali, že kombinované použitie ADA a ICZ, ktoré sú veterinárnym lekárom v súčasnosti k dispozícii, je účinné pri liečbe FIP. Tieto lieky považujeme za liečebnú možnosť, kým nebudú dostupné antivírusové lieky ako GC-376 a GS-441524. Tieto antivírusové lieky navyše majú terapeutické účinky na FIP mechanizmami odlišnými od mechanizmov ADA a ICZ [16, 18, 21, 23]. V budúcnosti môže hodnotenie terapeutických účinkov ich súčasného použitia pomôcť pri vývoji účinnejšej liečby FIP.

Závery

Predmetom výskumu boli terapeutické účinky adalimumabu, antihumánnej TNF-alfa mAb a itrakonazolu na FIP. Zistilo sa, že adalimumab má neutralizačnú aktivitu proti rfTNF-alfa, podobne ako anti-fTNF-alfa mAb. FIP bola úspešne liečená u 2 z 3 mačiek s experimentálne indukovanou FIP podávaním adalimumabu a itrakonazolu.

Literatúra

  1. Pedersen NC (2014) An update on feline infectious peritonitis: diagnostics and therapeutics. Vet J 201:133–141. https://doi.org/10.1016/j.tvjl.2014.04.016Article PubMed Google Scholar 
  2. Tekes G, Thiel HJ (2016) Feline coronaviruses: pathogenesis of feline infectious peritonitis. In: Ziebuhr J (ed) Advances in virus research, vol. 96, Academic Press, pp 193–218
  3. Jaimes JA, Whittaker GR (2018) Feline coronavirus: insights into viral pathogenesis based on the spike protein structure and function. Virology 517:108–121. https://doi.org/10.1016/j.virol.2017.12.027CAS Article PubMed Google Scholar 
  4. Decaro N, Mari V, Campolo M et al (2009) Recombinant canine coronaviruses related to transmissible gastroenteritis virus of swine are circulating in dogs. J Virol 83:1532–1537. https://doi.org/10.1128/jvi.01937-08CAS Article PubMed Google Scholar 
  5. Herrewegh AA, Smeenk I, Horzinek MC et al (1998) Feline coronavirus type II strains 79-1683 and 79-1146 originate from a double recombination between feline coronavirus type I and canine coronavirus. J Virol 72:4508–4514CAS Article PubMed Google Scholar 
  6. Terada Y, Shiozaki Y, Shimoda H et al (2012) Feline infectious peritonitis virus with a large deletion in the 59-terminal region of the spike gene retains its virulence for cats. J Gen Virol 93:1930–1934. https://doi.org/10.1099/vir.0.043992-0CAS Article PubMed Google Scholar 
  7. Addie DD, Schaap IAT, Nicolson L, Jarrett O (2003) Persistence and transmission of natural type I feline coronavirus infection. J Gen Virol 84:2735–2744. https://doi.org/10.1099/vir.0.19129-0CAS Article PubMed Google Scholar 
  8. Kummrow M, Meli ML, Haessig M et al (2005) Feline coronavirus serotypes 1 and 2: seroprevalence and association with disease in Switzerland. Clin Diagn Lab Immunol 12:1209–1215. https://doi.org/10.1128/CDLI.12.10.1209-1215.2005CAS Article PubMed Google Scholar 
  9. Hohdatsu T, Okada S, Ishizuka Y et al (1992) The prevalence of types I and II feline coronavirus infections in cats. J Vet Med Sci 54:557–562. https://doi.org/10.1292/jvms.54.557CAS Article PubMed Google Scholar 
  10. Takano T, Hohdatsu T, Hashida Y et al (2007) A “possible” involvement of TNF-alpha in apoptosis induction in peripheral blood lymphocytes of cats with feline infectious peritonitis. Vet Microbiol 119:121–131. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2006.08.033CAS Article PubMed Google Scholar 
  11. Takano T, Hohdatsu T, Toda A et al (2007) TNF-alpha, produced by feline infectious peritonitis virus (FIPV)-infected macrophages, upregulates expression of type II FIPV receptor feline aminopeptidase N in feline macrophages. Virology 364:64–72. https://doi.org/10.1016/j.virol.2007.02.006CAS Article PubMed Google Scholar 
  12. Takano T, Azuma N, Satoh M et al (2009) Neutrophil survival factors (TNF-alpha, GM-CSF, and G-CSF) produced by macrophages in cats infected with feline infectious peritonitis virus contribute to the pathogenesis of granulomatous lesions. Arch Virol 154:775–781. https://doi.org/10.1007/s00705-009-0371-3CAS Article PubMed Google Scholar 
  13. Doki T, Takano T, Nishiyama Y et al (2013) Generation, characterization and therapeutic potential of anti-feline TNF-alpha MAbs for feline infectious peritonitis. Res Vet Sci 95:1248–1254. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2013.09.005CAS Article PubMed Google Scholar 
  14. Doki T, Takano T, Kawagoe K et al (2016) Therapeutic effect of anti-feline TNF-alpha monoclonal antibody for feline infectious peritonitis. Res Vet Sci 104:17–23. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2015.11.005CAS Article PubMed Google Scholar 
  15. Tracey D, Klareskog L, Sasso EH et al (2008) Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: a comprehensive review. Pharmacol Ther 117:244–279CAS Article PubMed Google Scholar 
  16. Kim Y, Lovell S, Tiew K-C et al (2012) Broad-spectrum antivirals against 3C or 3C-like proteases of picornaviruses, noroviruses, and coronaviruses. J Virol 86:11754–11762. https://doi.org/10.1128/JVI.01348-12CAS Article PubMed Google Scholar 
  17. Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC et al (2016) Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog 12:e1005531. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005531CAS Article PubMed Google Scholar 
  18. Murphy BG, Perron M, Murakami E et al (2018) The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol 219:226–233. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2018.04.026CAS Article PubMed Google Scholar 
  19. Pedersen NC, Kim Y, Liu H et al (2018) Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 20:378–392. https://doi.org/10.1177/1098612X17729626Article PubMed Google Scholar 
  20. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M et al (2019) Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 21:271–281. https://doi.org/10.1177/1098612X19825701Article PubMed Google Scholar 
  21. Takano T, Akiyama M, Doki T, Hohdatsu T (2019) Antiviral activity of itraconazole against type I feline coronavirus infection. Vet Res 50:5. https://doi.org/10.1186/s13567-019-0625-3Article PubMed Google Scholar 
  22. Takano T, Endoh M, Fukatsu H et al (2017) The cholesterol transport inhibitor U18666A inhibits type I feline coronavirus infection. Antivir Res 145:96–102. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2017.07.022CAS Article PubMed Google Scholar 
  23. Takano T, Wakayama Y, Doki T (2019) Endocytic pathway of feline coronavirus for cell entry: differences in serotype-dependent viral entry pathway. Pathogens 8:300. https://doi.org/10.3390/pathogens8040300CAS Article Google Scholar 
  24. Koga L, Kobayashi Y, Yazawa M et al (2002) Nucleotide sequence and expression of the feline vascular endothelial growth factor. J Vet Med Sci 64:453–456. https://doi.org/10.1292/jvms.64.453CAS Article PubMed Google Scholar 
  25. Fronhoffs S, Totzke G, Stier S et al (2002) A method for the rapid construction of cRNA standard curves in quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Mol Cell Probes 16:99–110. https://doi.org/10.1006/mcpr.2002.0405CAS Article PubMed Google Scholar 
  26. Aguirre A, Escobar A, Ferreira V et al (2003) An anti-human recombinant tumor necrosis factor alpha (TNFα) monoclonal antibody recognizes an epitope in feline TNFα. Vet Res 34:177–184. https://doi.org/10.1051/vetres:2002064CAS Article PubMed Google Scholar 
  27. Hu S, Liang S, Guo H et al (2013) Comparison of the inhibition mechanisms of Adalimumab and Infliximab in treating tumor necrosis factor α-associated diseases from a molecular view. J Biol Chem 288:27059–27067. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.491530CAS Article PubMed Google Scholar 
  28. Takano T, Ohyama T, Kokumoto A et al (2011) Vascular endothelial growth factor (VEGF), produced by feline infectious peritonitis (FIP) virus-infected monocytes and macrophages, induces vascular permeability and effusion in cats with FIP. Virus Res 158:161–168. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2011.03.027CAS Article PubMed Google Scholar 
  29. García Rodrǐguez LA, Duque A, Castellsague J et al (1999) A cohort study on the risk of acute liver injury among users of ketoconazole and other antifungal drugs. Br J Clin Pharmacol 48:847–852. https://doi.org/10.1046/j.1365-2125.1999.00095.xArticle PubMed Google Scholar 
  30. Kao WY, Su CW, Huang YS et al (2014) Risk of oral antifungal agent-induced liver injury in Taiwanese. Br J Clin Pharmacol 77:180–189. https://doi.org/10.1111/bcp.12178CAS Article PubMed Google Scholar 
  31. Susan M, Grant SPC (1989) Itraconazole. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in superficial and systemic mycoses. Drugs 37:310–344Article Google Scholar 
  32. Khoza S, Moyo I, Ncube D (2017) Comparative hepatotoxicity of fluconazole, ketoconazole, itraconazole, terbinafine, and griseofulvin in rats. J Toxicol. https://doi.org/10.1155/2017/6746989Article PubMed Google Scholar 

Poďakovania

Ďakujeme členom nášho laboratória za podporu pokusov na zvieratách. Táto práca bola čiastočne podporená organizáciou KAKENHI (Grants-in-Aid for Scientific Research (B), č. 16H05039) z Ministerstva školstva, kultúry, športu, vedy a techniky v Japonsku a Grantom na výskum univerzity Kitasato pre mladých vedcov z Univerzita Kitasato.

Etické vyhlásenia

Konflikt záujmov

Autori si nie sú vedomí žiadnych potenciálnych konfliktov záujmov v súvislosti s výskumom, autorstvom alebo publikovaním tohto článku.

Etické schválenie

Boli dodržané všetky príslušné národné a inštitucionálne smernice pre starostlivosť a použitie zvierat. Protokol o experimentovaní na zvieratách bol schválený prezidentom Kitasato University na základe rozhodnutia Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť a použitie zvierat na Kitasato University (schválenie č. 18-152). Mačky SPF boli chované v našom vlastnom laboratóriu a udržiavané v izolovanom zariadení s regulovanou teplotou. Veľkosti vzoriek boli určené na základe našich skúseností s modelmi infekcie FIPV a bol použitý minimálny počet mačiek.

Informovaný súhlas

Informovaný súhlas bol získaný od zákonného opatrovníka všetkých experimentálnych zvierat popísaných v tejto práci pre uskutočnené postupy. V rámci tejto publikácie nie sú identifikovateľné žiadne zvieratá ani ľudia, a preto nebol potrebný ďalší informovaný súhlas so zverejnením.

Ďalšie informácie

Poznámka vydavateľa

Springer Nature zostáva neutrálny, pokiaľ ide o jurisdikčné nároky v publikovaných mapách a inštitucionálnych prepojeniach.

Redaktorka: Sheela Ramamoorthy.

Publikované

Možná antivírusová aktivita kyseliny 5-aminolevulovej pri infekcii vírusom infekčnej peritonitídy mačiek

Tomomi Takano, Kumi Satoh, and Tomoyoshi Doki
Originálny článok: Possible Antiviral Activity of 5-Aminolevulinic Acid in Feline Infectious Peritonitis Virus (Feline Coronavirus) Infection; 10.2.2021;Preklad 18.4.2021

Abstrakt

Infekčná peritonitída mačiek (FIP) je život ohrozujúce infekčné ochorenie mačiek spôsobené virulentným mačacím koronavírusom (vírus FIP: FIPV). Na liečbu FIP sa nedávno objavilo niekoľko účinných antivirotík, ale mnohé z nich nie sú dostupné pre praktické použitie. Kyselina 5-aminolevulová (5-ALA) je nízkomolekulárna aminokyselina syntetizovaná v rastlinných a živočíšnych bunkách. 5-ALA môže byť syntetizovaná vo veľkom množstve a je široko používaná v lekárskych a poľnohospodárskych odvetviach. Dospeli sme k predpokladu, že 5-ALA inhibuje infekciu FIPV. Preto sme vyhodnotili jej antivírusovú aktivitu proti FIPV v celých plodových 4-bunkách felis catus a v primárnych mačacích makrofágoch. FIPV infekcia bola významne inhibovaná 250 μM 5-ALA. Naša štúdia naznačila, že 5-ALA je použiteľná pre liečbu a prevenciu infekcie FIPV.

Kľúčové slová: FIP, koronavírus, kyselina 5-aminolevulová, antivírusové liečivo, mačka

Úvod

Infekčná peritonitída mačiek (FIP) je život ohrozujúce infekčné ochorenie spôsobené mačacím koronavírusom (FCoV) u domácich a voľne žijúcich druhov Felidae. FCoV je u mačiek vysoko rozšírený po celom svete. FCoV je obalený jednovláknový pozitívny RNA vírus. Tento vírus patrí do rodu Alphacoronavirus z podčeľade Orthocoronavirinae z čeľade Coronaviridae (1). FCoV je sa delí na dva sérotypy podľa aminokyselinovej sekvencie spike proteínu (S), sérotyp I FCoV a sérotyp II FCoV (2). Sérologické a genetické výskumy odhalili, že FCoV typu I je dominantný na celom svete (3–5). FCoV sa šíri hlavne fekálno-orálnym prenosom (6). Väčšina mačiek infikovaných FCoV je subklinických. V S proteíne sa však vyskytlo niekoľko mutácií, ktoré viedli k vývoju virulentného typu nazývaného vírus mačacej infekčnej peritonitídy (FIPV) (7, 8). Charakteristickým patologickým nálezom FIP u mačiek je sérová tekutina v peritoneálnych a pleurálnych dutinách a pyogranulomatózne lézie v niekoľkých orgánoch (9).

FIP je imunitne sprostredkovaná a ťažko liečiteľná vírusová infekcia. Nedávno bolo publikovaných niekoľko účinných antivirotík na liečbu FIP (10, 11), mnohé z nich však nie sú dostupné pre praktické použitie. Niektoré lieky proti FCoV, ako napríklad itrakonazol, sú dostupné v kinikách pre zvieratá, ale ich liečebné účinky sú obmedzené (12). Pretože FIP je chronické a systémové ochorenie, je ťažké dosiahnuť klinickú remisiu. Preto je žiaduce, aby terapeutické lieky na FIP mali nasledujúce vlastnosti: (1) Málo vedľajších účinkov pre mačky, (2) nízka cena a (3) nízka mutagenéza patogénov.

Kyselina 5-aminolevulová (5-ALA) je nízkomolekulárna aminokyselina syntetizovaná v rastlinných a živočíšnych bunkách (13, 14). Je medziproduktom v biosyntéze tetrapyrolu. Pretože 5-ALA je vysoko rozpustná vo vode a má nízku cytotoxicitu, je široko používaná v lekárskych a poľnohospodárskych odvetviach(15). Bolo publikovaných niekoľko štúdií o účinkoch 5-ALA na infekčné choroby. Suzuki a kol. uviedli, že keď sa 5-ALA a ión železa podávali orálne myšiam infikovaným parazitom spôsobujúcom maláriu (Plasmodium yoelii), myši prežili (16). Na druhej strane sú jeho účinky na vírusovú infekciu nejasné.

Vo veterinárnom lekárstve bola fotodynamická terapia (PDT) s použitím 5-ALA skúmaná pri liečbe nádorov u psov (17), ale podľa našich vedomostí nebol skúmaný vplyv 5-ALA na infekčné choroby zvierat. Skúmali sme, či 5-ALA môže byť aplikovaná ako anti-FCoV liek in vitro.

Materiály a metódy

Bunkové kultúry, zvieratá a vírusy

Mačacie plodové 4-bunky Felis catus (fcwf)-4 (láskavo dodané Dr. MC Horzinkem z Universiteit Utrecht) boli vypestované v Eagles ‚MEM obsahujúcom 50% média L-15 Leibovitz, 5% fetálne teľacie sérum (FCS), 100 U/ml penicilínu a 100 μg/ml streptomycínu. Udržiavacie médium malo rovnaké zloženie ako rastové médium s výnimkou koncentrácie FCS (2%). Pre primárne makrofágy boli vybrané mačacie primárne makrofágy. Mačacie alveolárne makrofágy sa získali zo štyroch mačiek bez špecifických patogénov (SPF) vo veku 3 – 5 rokov bronchoalveolárnou lavážou s Hankovým vyváženým soľným roztokom. Mačacie primárne makrofágy sa udržiavali v D-MEM doplnenom o 10% FCS, 100 U/ml penicilínu a 100 μg/ml streptomycínu. SPF mačky sa udržiavali v izolovanom zariadení s regulovanou teplotou. Pokus na zvieratách bol schválený prezidentom Kitasato University na základe rozhodnutia Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť a použitie zvierat Kitasato University (18-050) a uskutočnený v súlade s Guidelines for Animal Experiments of Kitasato University. Veľkosti vzoriek boli určené na základe našej predchádzajúcej štúdie a bol použitý minimálny počet mačiek. Kmeň FCoV KU-2 typu I (FIPV-I KU-2) bol izolovaný v našom laboratóriu. FCoV-II 79-1146 láskavo poskytol Dr. M. C. Horzinek z Utrechtskej univerzity. Tieto vírusy boli kultivované v bunkách fcwf-4 pri 37°C.

Zlúčeniny

5-ALA a citrát železnatý sodný (SFC) poskytla spoločnosť Neopharma Japan (Tokio, Japonsko). 5-ALA a SFC sa rozpustili v kultivačnom médiu pri 200 mM a 50 mM. Roztok SFC sa použil ako rozpúšťadlo 5-ALA. V deň experimentov sa tieto zlúčeniny rozriedili na požadované koncentrácie v kultivačnom médiu.

Cytotoxické účinky zlúčenín

Bunky fcwf-4 sa nasadili na 96-jamkové doštičky. Zlúčeniny boli nasadené do jamiek trojmo. Po inkubácii v trvaní 96 hodín sa supernatanty kultúry odstránili, pridal sa roztok WST-8 (Kishida Chemical, Osaka, Japonsko) a bunky sa vrátili do inkubátora na 1 hodinu. Absorbancia vyprodukovaného formazanu sa merala pri 450 nm pomocou 96-jamkovej spektrofotometrickej čítačky doštičiek, podľa doporučenia výrobcu. Percento životaschopnosti buniek bolo vypočítané pomocou nasledujúceho vzorca: Životaschopnosť buniek (%) = [(OD buniek neošetrených zlúčeninou – buniek ošetrených zlúčeninou)/(OD buniek neošetrených zlúčeninou)]x100. 50% koncentrácia cytotoxicity (CC50 ) bola definovaná ako cytotoxická koncentrácia každej zlúčeniny, ktorá znížila absorbanciu ošetrených buniek na 50% v porovnaní s absorpciou neošetrených buniek.

Antivírusové účinky 5-ALA

Konfluentné monovrstvy buniek fcwf-4 sa kultivovali v médiu so zlúčeninami alebo bez nich v uvedených koncentráciách na 24-jamkových viacštancových platniach pri 37°C počas 24 alebo 48 hodín. Bunky sa premyli a vírus (MOI 0,01) sa adsorboval do buniek pri teplote 37°C počas 1 hodiny. Po premytí sa bunky kultivovali v 1,5% karboxymetylcelulóze (CMC)-MEM alebo MEM so zlúčeninami alebo bez nich. V prípade buniek kultivovaných v CMC-MEM boli bunkové monovrstvy inkubované pri teplote 37°C po dobu 48 hodín, fixované a zafarbené 1% roztokom kryštalickej fialovej obsahujúcim 10% pufrovaného formalínu a následne boli spočítané výsledné plaky. Percento zníženia alebo zvýšenia plakov bolo vypočítané pomocou nasledujúceho vzorca: Percento redukcie plakov (%) = [(počet plakov buniek ošetrených zlúčeninou)/(počet plakov buniek neošetrených zlúčeninou)]x100. EC50 bola definovaná ako účinná koncentrácia zlúčenín, ktorá znížila titer vírusu v supernatante kultúry infikovaných buniek na 50% v porovnaní s titrom vírusovej kontroly. V prípade buniek kultivovaných v MEM sa kultivačné supernatanty zozbierali 48 hodín po infekcii a titre vírusu sa merali pomocou testu TCID50.

Primárne mačacie makrofágy sa kultivovali v médiu so zlúčeninami alebo bez nich v uvedených koncentráciách na 24-jamkových viacnásobných doštičkách pri 37°C po dobu 48 hodín. Po premytí PBS sa nechal FIPV 79-1146 (1 x 104 TCID50) adsorbovať do buniek pri 37°C s 5% CO2 po dobu 1 hodiny. Po premytí PBS sa bunky kultivovali v médiu a supernatanty sa zhromaždili. Titre vírusu sa merali pomocou testu TCID50.

Štatistická analýza

Údaje iba z dvoch skupín sa analyzovali pomocou Studentovho t-testu (Welchov t-test) a údaje viacerých skupín sa analyzovali jednosmernou ANOVA nasledovanou Tukeyho testom. Za významnú sa považovala hodnota P <0,05.

Výsledky

Cytotoxické a antivírusové účinky 5-ALA

Pre stanovenie netoxickej koncentrácie 5-ALA proti bunkám fcwf-4 sa vykonal test cytotixicity (obrázok 1). Viac ako 75% buniek fcwf-4 prežilo v prítomnosti 1 000 μM 5-ALA (maximálna koncentrácia v tomto experimente). Vehikulum nevykazuje žiadne cytotoxické účinky na bunky fcwf-4.

Obrázok 1.

Cytotoxické účinky 5-ALA na bunky fcwf-4. Životaschopnosť buniek fcwf-4 sa merala pomocou testu WST-8. Čierny krúžok: 5-ALA. Biely krúžok: Vehikulum (SFC). Vehikulum (kontrolné rozpúšťadlo) bolo pri každom postupnom riedení rovnaké ako vehikulum v roztoku 5-ALA. Výsledky sú uvedené ako priemer ± SE. Údaje predstavujú tri nezávislé experimenty (n = 3).

Účinky 5-ALA na infekciu FIPV v mačacej bunkovej línii

Antivírusové účinky 5-ALA proti FIPV sa hodnotili testom inhibície plaku v bunkách fcwf-4. Bunky boli liečené 5-ALA nasledujúcimi 3 postupmi: 24-hodinová predbežná liečba (pre-24h), 24-h predbežná liečba nasledovaná 49-hodinovou liečbou FIPV (pre-24h a co-49h) a 48-hodinová predbežná liečba, po ktorej nasledovala 49-hodinová liečba FIPV (pre-48h a co-49h). Pri pre-24h sa percento inhibície plaku významne zvýšilo pri 500μM alebo vyššej (obrázky 2A, B). Pri pre-24h a co-49h sa percento inhibície plakov významne zvýšilo pri 125μM alebo vyššej (obrázky 2C, D). Pri pre-48h a co-49h dosiahlo percento inhibície plaku pri FIPV typu I pri 125 μM 5-ALA 75% (obrázky 2E, F). Kontrolný nosič, SFC, nevykazoval žiadne plakové inhibičné účinky na FCoV za akýchkoľvek podmienok. Podľa titračného testu bola produkcia FIPV typu I a typu II významne znížená pri 250 a 500μM 5-ALA (obrázok 3).

Obrázok 2.
Test inhibície plaku FIPV v bunkách fcwf-4 liečených 5-ALA. (A, B) Účinky 24-hodinovej predbežnej liečby na antivírusovú aktivitu 5-ALA. Rýchlosť plakovej inhibície FIPV infikovaných buniek fcwf-4 predbežne liečených 5-ALA po dobu 24 hodín. (C, D) Účinky 24-hodinovej predbežnej liečby a 48-hodinovej následnej liečby na antivírusovú aktivitu 5-ALA. Rýchlosť plakovej inhibície FIPV infikovaných buniek fcwf-4 predbežne liečených počas 24 hodín a dodatočne liečených počas 48 hodín s 5-ALA. (E, F) Účinky 48-hodinovej predbežnej liečby a 48-hodinovej následnej liečby na antivírusovú aktivitu 5-ALA. Rýchlosť plakovej inhibície FIPV-infikovaných buniek fcwf-4 predbežne liečených po dobu 48 hodín a následne 48 hodín s 5-ALA. (A, C, E) typ I FIPV. (B, D, F) typ II FIPV. Čierna stĺpec: 5-ALA. Biela stĺpec: Vehikulum (kontrolné rozpúšťadlo). Výsledky sú uvedené ako priemer ± SE. Údaje predstavujú štyri nezávislé experimenty (n = 4). ** p <0,01 (* p <0,05) vs. vehikulum.
Obrázok 3.
Inhibícia infekcie FIPV 5-ALA v bunkách fcwf-4. (A, C) Účinky 48-hodinovej predbežnej liečby a 48-hodinovej následnej liečby na antivírusovú aktivitu 250 μM 5-ALA. (B, D) Účinky 48-hodinovej predbežnej liečby a 48-hodinovej následnej liečby na antivírusovú aktivitu 500 μM 5-ALA. (A, B) 250 μM 5-ALA. (A, B) typu I FIPV. (C, D) typu II FIPV. Čierny krúžok: 5-ALA. Biely krúžok: vehikulum (kontrolné rozpúšťadlo). Výsledky sú uvedené ako priemer ± SE. Údaje predstavujú štyri nezávislé experimenty (n = 4). ** p <0,01 (* p <0,05) vs. vehikulum.

Účinky 5-ALA na infekciu FIPV v mačacej bunkovej línii

Makrofágy infikované FIPV sa podieľajú na progresii symptómov FIP do ťažkého stavu. Skúmali sme, či 5-ALA inhibuje množenie FIPV v makrofágoch. V tomto experimente sa použil FIPV 79-1146 typu II s vysokou schopnosťou množenia v primárnych makrofágoch mačiek. Produkcia vírusu v FIPV-infikovaných makrofágoch bola znížená pri 250μM 5-ALA u troch zo štyroch mačiek (obrázok 4).

Obrázok 4.
Inhibícia infekcie FIPV v makrofágoch. Účinky na antivírusovú aktivitu 5-ALA (250μM) v primárnych makrofágoch mačiek. Čierna stĺpec: 5-ALA. Biely stĺpec: Vehikulum (kontolné rozpúšťadlo). Údaje predstavujú tri nezávislé experimenty (n = 3).

Diskusia

5-ALA je medziproduktom syntézy tetrapyrolu u zvierat, rastlín a mikroorganizmov (13–15). V 80. rokoch bola hlásená možnosť účinnosti 5-ALA u rastlinách (18), ale bolo ťažké vyrobiť 5-ALA v dostatočnom množstve pre praktické použitie, pretože v mikroorganizmoch sa produkuje iba malé množstvo. Po tom, čo Nishikawa a kol. zaviedla metódu masovej produkcie 5-ALA s využitím baktérií (19), účinnosť 5-ALA sa potvrdila nielen v poľnohospodárstve, ale aj v lekárskych a biologických oblastiach. 5-ALA je lacný liek a prakticky sa používa ako doplnok na zlepšenie výkonnosti zvierat a imunitnú odpoveď v oblasti veterinárneho lekárstva (14, 20).

5-ALA inhibovala rast FIPV v bunkách fcwf-4. Bolo zistené, že kovové komplexy metabolitu 5-ALA, protoporfyrín IX (PpIX), majú antivírusovú aktivitu (21–23). Kovový komplex PpIX, hem, inhibuje množenie vírusu dengue (21). Na druhej strane, množenie vírusu Zika nie je hemom inhibované (23). Nie je jasné, či hem inhibuje množenie FCoV. Spravidla zvýšenie intracelulárneho hemu stimuluje produkciu hemeoxygenázy-1 (HO-1), enzýmu degradujúceho hem. Uvádza sa, že HO-1 indukuje antivírusovú aktivitu (24, 25). Avšak v predbežnom experimente sme potvrdili, že hladina expresie HO-1 mRNA v bunkách ošetrených 250μM 5-ALA ostala nezmenená (údaje nie sú uvedené). Na základe tohto poznatku dochádza pri 5-ALA-indukovanej inhibícii FIPV infekcie v dôsledku iného faktora ako hem a HO-1.

V súčasnosti už existuje veľa štúdií o terapeutických liekoch na FIP. Bolo identifikovaných veľa liekov účinných na FIP in vitro a bolo potvrdené, že niektoré vykazujú liečebné účinky pri podávaní mačkám s FIP (10–12). Účinky všetkých liekov však boli slabé v prípadoch s neurologickými prejavmi. Za príčinu sa považoval zlý prenos týchto liekov do centrálneho nervového systému; preto je potrebný liek vykazujúci antivírusové účinky proti FIPV schopnému dostať sa do mozgového tkaniva. 5-ALA je aminokyselina s nízkou molekulovou hmotnosťou a možnou dobrou penteračnou schopnosťou do mozgového tkaniva (26). Ďalej sa uvádza, že difúzia 5-ALA z krvi do normálneho mozgového tkaniva je veľmi nízka (27), čo naznačuje, že vykazuje menej nepriaznivých účinkov. FIP možno jednoznačne diagnostikovať iba detekciou antigénu FCoV v lézii (28). Keď sa však liečba začne až po stanovení jednoznačnej diagnózy, príznaky medzitým progradovali do stavu, keď už v mnohých prípadoch sa nedostaví reakcia na liečbu. Preto, ak je k dispozícii liek, ktorý je možné profylakticky podať už pred diagnostikovaním FIP, je možné zabrániť progresii príznakov, pre čo môže byť 5-ALA ideálnym prostriedkom. V našom experimente s cieľovými bunkami FIPV, makrofágmi, však antivírusové účinky 5-ALA neboli u niektorých mačiek pozorované. Preto, keď sa 5-ALA používa ako terapeutické liečivo na FIP, anti-FCoV lieky, ako sú GS-441524 (29), GC-376 (30), U18666A (31) a itrakonazol (32) alebo protizápalové lieky, ako napríklad anti-TNF-alfa protilátka (33), by mali byť súbežne používané aj ďalej.

V teréne dochádza medzi mačkami hlavne k prenosu FECV, zatiaľ čo horizontálna infekcia FIPV medzi mačkami sa považuje za zriedkavú (34). Zistilo sa, že FIPV je generovaný genetickou mutáciou FECV. Ak teda existujú prostriedky na prevenciu infekcie FECV na dennej báze, môže sa zabrániť rozvoju FIP. Nie je vyvinutá žiadna vakcína schopná zabrániť infekcii FECV. Addie a kol. uviedli, že vylučovanie vírusového génu vo výkaloch prestalo u mačiek infikovaných FECV liečených syntetickým analógom adenozínu (35). Preto sa očakáva elimiácia FECV infikujúceho črevo podaním ativirotika FECV infikovaným mačkám. Syntetické analógy adenozínu však môžu indukovať mutáciu génu koronavírusu (36). Navyše, aj keď hladina génu FECV vo výkaloch klesla pod hranicu detekcie u mačiek liečených syntetickým adenozínovým analógom, je možné, že FECV latentne infikoval črevo alebo iné tkanivá. Aby sa zabránilo mutácii génu FECV a spoľahlivo sa eliminovala infekcia FECV, je potrebné dlhodobé podávanie syntetického analógu adenozínu, ale to nie je kvôli jeho vysokej cene reálne. Na druhej strane sa 5-ALA sa prakticky používa ako doplnok stravy. 5-ALA má nízku toxicitu pre zvieratá a rastliny, čo výrazne naznačuje možnosť dlhodobého podávania 5-ALA mačkám. V budúcnosti je potrebné preskúmať, či je 5-ALA použiteľný ako doplnok na zabránenie rozvoja FIP u mačiek infikovaných FECV.

V tejto štúdii sme potvrdili možnosť, že 5-ALA inhibuje množenie FIPV a produkciu TNF-alfa. Pretože 5-ALA je aminokyselina prítomná v tele, je možné jej okamžité podanie. Je však potrebné podávať 5-ALA mačkám s FIP a sledovať, či je možné dosiahnuť terapeutické účinky. Ďalej treba skúmať, či dlhodobé podávanie 5-ALA eliminuje vírus a inhibuje vývoj FIP u mačiek infikovaných FECV.

Referencie

  1. ICTV Coronaviridae. Virus Taxonomy: 2019 Release. (2020). Available online at: https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_9th_report/positive-sense-rna-viruses-2011/w/posrna_viruses/222/coronaviridae (accessed December 25, 2020).
  2. Motokawa K, Hohdatsu T, Aizawa C, Koyama H, Hashimoto H. Molecular cloning and sequence determination of the peplomer protein gene of feline infectious peritonitis virus type I. Arch Virol. (1995) 140:469–80. 10.1007/BF01718424 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  3. Hohdatsu T, Okada S, Ishizuka Y, Yamada H, Koyama H. The prevalence of types I and II feline coronavirus infections in cats. J Vet Med Sci. (1992) 54:557–62. 10.1292/jvms.54.557 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  4. Kummrow M, Meli ML, Haessig M, Goenczi E, Poland A, Pedersen NC, et al. . (2005). Feline coronavirus serotypes 1 and 2: seroprevalence and association with disease in Switzerland. Clin Diagn Lab Immunol. 12:1209–15. 10.1128/CDLI.12.10.1209-1215.2005 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  5. Wang YT, Chueh LL, Wan CH. An 8-year epidemiologic study based on baculovirus-expressed type-specific spike proteins for the differentiation of type I and II feline coronavirus infections. BMC Vet Res. (2014) 10:186 10.1186/s12917-014-0186-7 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  6. Pedersen NC. An overview of feline enteric coronavirus and infectious peritonitis virus infections. Feline Pract. (1995) 23:7–21. [Google Scholar]
  7. Chang HW, Egberink HF, Halpin R, Spiro DJ, Rottier PJ. Spike protein fusion peptide and feline coronavirus virulence. Emerg Infect Dis. (2012) 18:1089. 10.3201/eid1807.120143 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  8. Licitra BN, Millet JK, Regan AD, Hamilton BS, Rinaldi VD, Duhamel GE, et al. . Mutation in spike protein cleavage site and pathogenesis of feline coronavirus. Emerg Infect Dis. (2013) 19:1066. 10.3201/eid1907.121094 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  9. Tekes G, Thiel HJ. Feline coronaviruses: pathogenesis of feline infectious peritonitis. Adv Virus Res. (2016) 96:193–218. 10.1016/bs.aivir.2016.08.002 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  10. Pedersen NC, Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC, Eckstrand C, Groutas WC, et al. . Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. (2018) 20:378–92. 10.1177/1098612X17729626 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  11. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, Montgomery E, Murakami E, Liepnieks M, et al. . Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. (2019) 21:271–81. 10.1177/1098612X19825701 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  12. Kameshima S, Kimura Y, Doki T, Takano T, Park CH, Itoh N. Clinical efficacy of combination therapy of itraconazole and prednisolone for treating effusive feline infectious peritonitis. J Vet Med Sci. (2020) 82:1492–6. 10.1292/jvms.20-0049 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  13. Czarnecki O, Grimm B. New insights in the topology of the biosynthesis of 5-aminolevulinic acid. Plant Signal Behav. (2013) 8:e23124. 10.4161/psb.23124 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  14. Hendawy AO, Khattab MS, Sugimura S, Sato K. Effects of 5-aminolevulinic acid as a supplement on animal performance, iron status, and immune response in farm animals: a review. Animals. (2020) 10:1352. 10.3390/ani10081352 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  15. Sasaki K, Watanabe M, Tanaka T, Tanaka T. Biosynthesis, biotechnological production and applications of 5-aminolevulinic acid. Appl Microbiol Biotechnol. (2002) 58:23–9. 10.1007/s00253-001-0858-7 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  16. Suzuki S, Hikosaka K, Balogun EO, Komatsuya K, Niikura M, Kobayashi F, et al. . In vivo curative and protective potential of orally administered 5-aminolevulinic acid plus ferrous ion against malaria. Antimicrob Agents Chemother. (2015) 59:6960–7. 10.1128/AAC.01910-15 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  17. Osaki T, Yokoe I, Ogura S, Takahashi K, Murakami K, Inoue K, et al. . Photodynamic detection of canine mammary gland tumors after oral administration of 5-aminolevulinic acid. Vet Comp Oncol. (2017) 15:731–9. 10.1111/vco.12213 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  18. Rebeiz CA, Montazer-Zouhoor A, Hopen HJ, Wu SM. Photodynamic herbicides: 1. Concept and phenomenology. Enzyme Microb Technol. (1984) 6:390–401. 10.1016/0141-0229(84)90012-7 [CrossRef] [Google Scholar]
  19. Nishikawa S, Watanabe K, Tanaka T, Miyachi N, Hotta Y, Murooka Y. Rhodobacter sphaeroides mutants which accumulate 5-aminolevulinic acid under aerobic and dark conditions. J Biosci Bioeng. (1999) 87:798–804. 10.1016/S1389-1723(99)80156-X [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  20. Sasaki A, Iwatani N, Harada K. Improvement effect of 5-aminolevulinic acid on hyperlipidemia in miniature schnauzer dogs: an open study in 5 cases of one pedigree. Yonago Acta Med. (2020) 63:234–8. 10.33160/yam.2020.08.006 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  21. Assunção-Miranda I, Cruz-Oliveira C, Neris RLS, Figueiredo CM, Pereira LPS, Rodrigues D, et al. . Inactivation of dengue and yellow fever viruses by heme, cobalt-protoporphyrin IX and tin-protoporphyrin IX. J Appl Microbiol. (2016) 120:790–804. 10.1111/jam.13038 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  22. Cruz-Oliveira C, Almeida AF, Freire JM, Caruso MB, Morando MA, Ferreira VN, et al. . Mechanisms of vesicular stomatitis virus inactivation by protoporphyrin IX, zinc-protoporphyrin IX, and mesoporphyrin IX. Antimicrob Agents Chemother. (2017) 61:e00053–17. 10.1128/AAC.00053-17 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  23. Neris RL, Figueiredo CM, Higa LM, Araujo DF, Carvalho CA, Verçoza BR, et al. Co-protoporphyrin IX and Sn-protoporphyrin IX inactivate Zika, Chikungunya and other arboviruses by targeting the viral envelope. Sci Rep. (2018) 8:9805 10.1038/s41598-018-27855-7 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  24. Espinoza JA, González PA, Kalergis AM. Modulation of antiviral immunity by heme oxygenase-1. Am J Pathol. (2017) 187:487–93. 10.1016/j.ajpath.2016.11.011 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  25. Tseng CK, Lin CK, Wu YH, Chen YH, Chen WC, Young KC, et al. . Human heme oxygenase 1 is a potential host cell factor against dengue virus replication. Sci Rep. (2016) 6:32176. 10.1038/srep32176 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  26. Novotny A, Xiang J, Stummer W, Teuscher NS, Smith DE, Keep RF. Mechanisms of 5-aminolevulinic acid uptake at the choroid plexus. J Neurochem. (2000) 75:321–8. 10.1046/j.1471-4159.2000.0750321.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  27. Ennis SR, Novotny A, Xiang J, Shakui P, Masada T, Stummer W, et al. . Transport of 5-aminolevulinic acid between blood and brain. Brain Res. (2003) 959:226–34. 10.1016/S0006-8993(02)03749-6 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  28. Tasker S. Diagnosis of feline infectious peritonitis: update on evidence supporting available tests. J Feline Med Surg. (2018) 20:228–43. 10.1177/1098612X18758592 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  29. Murphy BG, Perron M, Murakami E, Bauer K, Park Y, Eckstrand C, et al. . The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol. (2018) 219:226–33. 10.1016/j.vetmic.2018.04.026 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  30. Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC, Weerasekara S, Hua DH, Groutas WC, et al. . Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog. (2016) 12:e1005531. 10.1371/journal.ppat.1005531 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  31. Takano T, Endoh M, Fukatsu H, Sakurada H, Doki T, Hohdatsu T. The cholesterol transport inhibitor U18666A inhibits type I feline coronavirus infection. Antiviral Res. (2017) 145:96–102. 10.1016/j.antiviral.2017.07.022 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  32. Takano T, Akiyama M, Doki T, Hohdatsu T. Antiviral activity of itraconazole against type I feline coronavirus infection. Vet Res. (2019) 50:5. 10.1186/s13567-019-0625-3 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  33. Doki T, Takano T, Kawagoe K, Kito A, Hohdatsu T. Therapeutic effect of anti-feline TNF-alpha monoclonal antibody for feline infectious peritonitis. Res Vet Sci. (2016) 104:17–23. 10.1016/j.rvsc.2015.11.005 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  34. Pedersen NC. An update on feline infectious peritonitis: virology and immunopathogenesis. Vet J. (2014) 201:123–32. 10.1016/j.tvjl.2014.04.017 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  35. Addie DD, Curran S, Bellini F, Crowe B, Sheehan E, Ukrainchuk L, et al. . Oral Mutian® X stopped faecal feline coronavirus shedding by naturally infected cats. Res Vet Sci. (2020) 130:222–9. 10.1016/j.rvsc.2020.02.012 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  36. Pruijssers AJ, Denison MR. Nucleoside analogues for the treatment of coronavirus infections. Curr Opin Virol. (2019) 35:57–62. 10.1016/j.coviro.2019.04.002 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Publikované

Myokarditída u domácich zvierat prirodzene infikovaných britským variantom COVID-19

Luca Ferasin, DVM, Ph.D, Matthieu Fritz, Ph.D, Heidi Ferasin, DVM, Pierre Becquart, Ph.D, Vincent Legros, DVM, Ph.D and Eric M. Leroy
Pôvodný článok: Myocarditis in naturally infected pets with the British variant of COVID-19; 18.3.2021; Preklad 1.4.2021

Abstrakt

Domáce zvieratá sa môžu infikovať SARS-CoV-2, ale na základe zatiaľ dostupných obmedzených informácií nie je známe, či nový britský variant B.1.1.7 môže ľahšie infikovať určité druhy zvierat alebo zvýšiť možnosť prenosu z človeka na zviera. V tejto štúdii uvádzame prvé prípady infekcie domácich mačiek a psov britským variantom B.1.1.7 SARS-CoV-2 diagnostikovaným v špecializovanej veterinárnej nemocnici v juhovýchodnom Anglicku. Ďalej sme zistili, že u mnohých majiteľov a opatrovateľov týchto domácich miláčikov sa vyvinuli respiračné príznaky Covid-19 3-6 týždňov pred tým, ako ich domáce zvieratá ochoreli, a tiež mali pozitívny test PCR na Covid-19. Je zaujímavé, že u všetkých týchto domácich zvierat infikovaných B.1.1.7 sa vyvinuli atypické klinické prejavy vrátane závažných srdcových abnormalít súvisiacich s myokarditídou a závažného zhoršenia celkového zdravotného stavu pacienta, ale bez akýchkoľvek primárnych respiračných príznakov. Naše objavy demonštrujú prvýkrát schopnosť spoločenských zvierat byť infikované variantom B.1.1.7 SARS-CoV-2 a vyvolávajú otázky týkajúce sa jeho patogenity u týchto zvierat. Okrem toho, vzhľadom na zvýšenú infekčnosť a prenosnosť variantu B.1.1.7 pre človeka, tieto zistenia tiež viac ako kedykoľvek predtým zdôrazňujú riziko, že spoločenské zvieratá môžu potenciálne hrať dôležitejšiu úlohu v dynamike vypuknutia SARS-CoV-2, ako sa doteraz myslelo.

Úvod

Pandémia COVID-19 v dôsledku ťažkého akútneho respiračného syndrómu spôsobeného koronavírusom 2. typu (SARS-CoV-2) vyznačujúca sa zmenou aminokyseliny spike proteínu (S) D614G (označovaná ako variant B. 1) postihla niekoľko miliónov prípadov na celom svete. Táto globálna situácia uprednostnila výskyt mnohých genómových mutácií, z ktorých niektoré vytvorili varianty so selektívnymi výhodami 1. Na konci jesene 2020 sa v niekoľkých krajinách objavili tri pozoruhodné varianty, ktoré sa potom rýchlo rozšírili do celého sveta, vrátane B.1.1.7 (tiež označovaného ako 20I/N501Y.V1), ktorý bol prvýkrát zistený v Anglicku 2, B.1.351 (20J/N501Y.V2) prvýkrát detekovaný v Južnej Afrike a nedávno identifikovaný „brazílisky“ variant P.1 (20I/N501Y.V3). Tieto tri varianty nesú konšteláciu genetických mutácií, vrátane tých na úrovni domény viažucej receptor proteínu S (RDB), ktorá je nevyhnutná pre väzbu na receptor ACE-2 hostiteľskej bunky na uľahčenie vstupu vírusu.

Odhaduje sa, že variant B.1.1.7, označovaný tiež ako obávaný variant (VOC) 202012/01 alebo 20I/501Y.V1, sa objavil v septembri 2020 v Kente, grófstve v juhovýchodnom Anglicku, a rýchlo prekonal ostatné v Anglicku už existujúce varianty v dôsledku zvýšenej prenosnosti a infekčnosti 2. Viaceré dôkazy naznačujú, že jeho zvýšenú prenosnosť riadi mutácia N501Y a delécia aminokyseliny Δ69/70 v RDB 3. Následne došlo k zvýšeniu výskytu B.1.1.7 počas celoštátneho lockdownu zavedeného vládou Spojeného kráľovstva od 5. novembra do 2. decembra 2020, a to aj napriek prísnym obmedzeniam, čo spôsobilo mimoriadny nárast prípadov COVID-19, ktoré sa osobitne dotkli oblasti Veľkého Londýna. K 7. februáru 2021 predstavoval VOC 202012/01 zhruba 95% nových infekcií SARS-CoV-2 vo Veľkej Británii a v súčasnosti bol identifikovaný v najmenej 86 krajinách.

Celosvetovo bolo zaznamenaných už niekoľko prípadov infekcie SARS-CoV-2 u domácich miláčikov (najmä mačiek a psov), a predpokladá sa, že tieto zvieratá boli infikované ich majiteľmi alebo opatrovateľmi. Infekcie domácich miláčikov väčšinou viedli k nebadateľným až miernym zažívacím a respiračným príznakom, ako sú kašeľ, nádcha, kýchanie a zápal spojiviek 4–6. Je zaujímavé, že napriek nekontrolovanému nárastu prípadov COVID-19, ku ktorému vo Veľkej Británii došlo od novembra 2020, neboli u spoločenských zvierat zatiaľ hlásené žiadne infekcie vírusom SARS-CoV-2. Prekvapivejšie je, že podľa najlepších vedomostí autorov doteraz nikdy nebola zdokumentovaná prirodzená infekcia žiadneho zvieraťa variantom B.1.1.7, a to ani v Anglicku, ani nikde inde.

Výsledky

Hlásime náhle zvýšenie počtu domácich psov a mačiek s myokarditídou na kardiologickom oddelení The Ralph Veterinary Referral Center (RVRC) na okraji Londýna (UK), medzi decembrom 2020 a februárom 2021, s neočakávaným nárastom incidencie z 1,4% na 12,8% (8,5% u mačiek a 4,3% u psov). Zdá sa, že tento náhly nárast prípadov kopíroval krivku a časovú líniu ľudskej pandémie COVID-19 vo Veľkej Británii v dôsledku variantu B.1.1.7, ktorá sa začala v polovici decembra 2020 a vyvrcholila koncom januára 2021 pred návratom na historickú úroveň v polovici februára 2021.

Žiadny z týchto pacientov s myokarditídou nemal v anamnéze srdcové choroby a ich klinický obraz bol podobný a charakterizovaný akútnym nástupom letargie, nechutenstvom, tachypnoe/dyspnoe (sekundárne v dôsledku výskytu kongestívneho zlyhania srdca) a v niektorých prípadoch synkopálnymi udalosťami. Diagnostické vyšetrenia odhalili prítomnosť zvýšeného srdcového troponínu-I (medián 6,8; rozsah 0,68 až 61,1 ng/ml [normálny referenčný rozsah 0,0-0,2 ng/ml]) sprevádzanú echokardiografickým dôkazom remodelácie myokardu a/alebo známkami pleurálneho výpotku a/alebo pľúcneho edému, často potvrdenými na hrudných rádiografoch a/alebo závažné komorové arytmie na elektrokardiografii (pozri doplnkový obrázok S1). Všetky postihnuté zvieratá dosiahli pozoruhodné zlepšenie po odpočinku v klietke, kyslíkovej terapii, akútnej diuréze a v niektorých prípadoch antiarytmickej liečbe doplnkom sotalolu a rybieho oleja predtým, ako boli po niekoľkých dňoch intenzívnej starostlivosti prepustené na perorálnu liečbu. Je pozoruhodné, že u väčšiny majiteľov a opatrovateľev týchto domácich miláčikov s myokarditídou sa vyvinuli respiračné príznaky Covid-19 v priebehu 3-6 týždňov pred tým, ako ochoreli ich domáce zvieratá, a mnoho z týchto majiteľov malo pozitívny PCR test na Covid-19. Vzhľadom na túto náhodu a zaujímavý simultánny vývoj myokarditídy u týchto domácich miláčikov a prepuknutie choroby B1.1.7 COVID-19 vo Veľkej Británii sme sa rozhodli preskúmať infekciu SARS-CoV-2 u týchto zvierat. Na tento účel sa odobrali vzorky séra, ako aj oro/nazofaryngeálne a rektálne výtery od siedmich zvierat (šesť mačiek a jeden pes) pri počiatočnej prezentácii na RVRC medzi 22. januárom a 10. februárom 2021 (tabuľka 1). V rovnakom období sme odobrali vzorky krvi od štyroch ďalších domácich miláčikov (dvoch mačiek a dvoch psov) počas ich zotavovania, 2-6 týždňov po tom, čo sa u nich objavili príznaky myokarditídy. U žiadneho z 11 zvierat s myokarditídou sa nevyvinuli žiadne príznaky podobné chrípke a všetky sa klinicky zlepšili v priebehu niekoľkých dní intenzívnej starostlivosti, hoci jedna mačka (LL) mala jeden týždeň po prepustení relaps jej klinických príznakov charakterizovaných výraznou letargiou a nekontrolovanou komorovou tachykardiou, čo podnietilo jej majiteľov, aby sa rozhodli pre eutanáziu. Všetky mačky a psy boli kastrovaní a vo veku od jedného do 12 rokov. Po odbere boli všetky vzorky skladované pri -20 ° C až do transportu v ľade do laboratória MIVEGEC vo Montpellier vo Francúzsku na sérologické a virologické vyšetrenia.

DruhPlemenoVekPohlavieDniVšeobecné príznakyT
°C		Srdcové abnormalityTroponin ng/mlCovid-19+ kontaktSNSARS-CoV-2 ddPCRSérológia
?DSH9M2Letargia
Nechutenstvo		37.1CHF7.9✔️–––
?DSH9M2Letargia
Nechutenstvo		37.0CHF, VA0.68✔️–33 kópií RNA/µL–
?Manx12F2Letargia35.2CHF, VA6.8❓–––
?Sphynx10F3Synkopa37.9CHF, VA45.6❓–12 kópií RNA/µL–
?Labrador9F4Letargia
Nechutenstvo
Hemoragická hnačka		37.6VA43.5✔️–13 kópií RNA/µL–
?DSH9M8Letargia37.8CHF1.31❓––N proteín
?Škótska klapouchá1M10Letargia
Nechutenstvo		37.3CHF12.1❓–––
?Mastiff8F14Synkopa38.0CHF, VA2.5❓–NA–
?Sibírska1F28Letargia38.5CHF4.92✔️–NAN proteín
RBD
S trimer
?Dalmatín8M37Syncope38.2VA61.1✔️+NARBD
S trimer
?Perzská1M64Letargia37.5CHF, VA0.83❓–NA–
Tabuľka 1: Charakteristika psov a mačiek s diagnostikovanou myokarditídou vo veterinárnom odporúčajúcom stredisku Ralph medzi 22. januárom a 10. februárom 2021
Dni: Počet dní medzi objavením sa príznakov a konzultáciou u veterinára, DSH: Domáca krátkosrstá, CHF: kongestívne zlyhanie srdca, VA: Ventrikulárna arytmia, NA: Neaplikovateľné

Oro/nazofaryngeálne a rektálne výtery boli testované pomocou kvapôčkovej digitálnej RT-PCR (ddPCR) zameranej na jednu oblasť špecifickú pre SARS-CoV-2 N gén a dve oblasti Spike proteínu špecifické pre tri súčasné prevládajúce SARS-CoV-2 varianty, menovite 20I/N501Y.V1, 20J/N501Y.V2 a 20I/N501Y.V3. Jedna cieľová oblasť obsahujúca mutáciu N501Y je spoločná pre tri varianty a druhá cieľová oblasť obsahujúca deléciu Δ69-70 je špecifická pre variant B.1.1.7. Séra sa testovali na IgG špecifický pre SARS-CoV-2 pomocou troch mikrosférových imunotestov (MIA), ktoré detegovali väzbu IgG na N proteín, S1-RBD-proteín alebo S trimerický proteín, ako aj testom na báze retrovírusov na detekciu SARS-CoV-2 neutralizujúce protilátky (pozri Materiály a metódy).

U všetkých oro/nazofaryngeálnych výterov sa zistilo, že SARS-CoV-2 ddPCR sú negatívne. Pozitívne signály ddPCR sa však získali pre tri oblasti z rektálnych výterov od troch zo siedmich zvierat (dve mačky a jeden pes), čo naznačuje infekciu britským variantom B.1.1.7. Koncentrácia RNA bola v rozmedzí od 12 do 33 kópií/μL vzorky, čo naznačuje nízku vírusovú nálož (tabuľka 1). Okrem toho sa zistilo, že vzorky od jedného zvieraťa odobraté počas akútnej fázy choroby, ktoré vykazovalo negatívny výsledok ddPCR, ako aj u dvoch zo štyroch zvierat odobratých počas obdobia zotavenia, obsahovali protilátky SARS-CoV-2. Celkovo sa teda u šiestich z našich 11 skúmaných zvierat ukázalo, že sú SARS-CoV-2 pozitívne, a to buď ddPCR, alebo sérologicky. Zaujímavejšie je, že keď vezmeme do úvahy iba päť zvierat, u ktorých majiteľov alebo opatrovateľov bola laboratórne potvrdená pozitivita na Covid-19, štyri sa ukázali SARS-CoV-2 pozitívne (tabuľka 1).

Obrázok 1: Stopa EKG zaznamenaná u jedného zo psov ukazuje príznaky akútnej myokarditídy vykazujúcej pretrvávajúcu monomorfnú ventrikulárnu tachykardiu pri 320 bpm (vzorka získaná z 5-minútového nepretržitého 6-zvodového záznamu EKG, 50 mm/s, 10 mm/mV).

Diskusia

Pokiaľ je nám známe, toto je prvá správa o infekcii mačiek aj psov britským variantom SARS-CoV-2 B.1.1.7. Vzhľadom na zvýšenú infekčnosť a prenosnosť variantu B.1.1.7 pre človeka, objav mačiek a psov infikovaných B.1.1.7 viac ako kedykoľvek predtým zdôrazňuje riziko, že spoločenské zvieratá môžu potenciálne hrať významnú úlohu pri dynamike prepuknutia choroby SARS-CoV-2, ako sa doteraz myslelo. Naliehavo sú preto potrebné ďalšie štúdie na preskúmanie pravdepodobnosti prenosu variantu B.1.1.7 typu zviera-zviera, ako aj zviera-človek, a na preukázanie, či mutácia N501Y a delécia Δ69-70 spôsobujú, že vírus je pre tieto zvieratá infekčnejší.

Ďalším pozoruhodným a neočakávaným zistením našej štúdie je vývoj neobvyklých klinických prejavov u mačiek a psov infikovaných B.1.1.7, vrátane závažných srdcových abnormalít sekundárnych po myokarditíde a závažného zhoršenia celkového zdravotného stavu pacienta, ale bez akýchkoľvek primárnych respiračných príznakov. S výnimkou jedinej mačky zo Španielska, u ktorej sa vyskytlo kardiorespiračné zlyhanie vedúce k závažnej respiračnej tiesni 7, boli doteraz hlásené ako prirodzené, tak aj experimentálne infekcie SARS-CoV-2 u mačiek a psov buď asymptomatické alebo s miernym ochorením horných dýchacích ciest . Aj keď sa zdá, že infekcia B.1.1.7 u ľudí súvisí s vyššou úmrtnosťou na COVID-19 alebo klinickou závažnosťou, je potrebné uznať a riešiť súvislosť medzi myokarditídou a infekciou B.1.1.7 u domácich domácich miláčikov. 8 V tejto súvislosti je dôležité zdôrazniť skutočnosť, že myokarditída spojená s multisystémovým zápalovým syndrómom je tiež dobre známou komplikáciou COVID-19 u ľudí (dospelých aj detí) pravdepodobne kvôli prehnanej imunitnej odpovedi hostiteľa 9,10.

Naše objavy dokazujú schopnosť spoločenských zvierat infikovať sa variantom SARS-CoV-2 B.1.1.7 a vyvolávajú otázky týkajúce sa jeho patogenity u týchto zvierat. Preto je naliehavo potrebné výrazne urýchliť a posilniť vyšetrovanie a dohľad nad infekciami zvierat vysoko prenosnými variantmi, ako sú britský B.1.1.7, juhoafrický B1.351 a brazílsky P.1 ako súčasť globálneho reakcie na prebiehajúcu pandémiu viacerých druhov COVID-19.

Materiály a metódy

Extrakcia RNA


Rektálne a oro/naso-faryngeálne výtery boli resuspendované vortexovaním v 300 μL PBS. Celková RNA sa extrahovala z 200 μL supernatantu z rektálneho výteru a z 200 μL vírusového transportného média z nosohltanových výterov. Extrakcia sa uskutočňovala na extrakčnom systéme IndiMag 48 (Indical Bioscience) pomocou technológie magnetických guľôčok so súpravou IndiMag Pathogen podľa pokynov výrobcu. Elučný objem bol 100 μL.

Jednokroková dRT-PCR


Procedúra RT-dPCR sa uskutočňovala podľa pokynov výrobcu s použitím QIAcuity 8, 5-plexu (Qiagen, Nemecko), súpravy QIAcuity One-Step Viral RT-PCR (kat. Č. 1123145, Qiagen, Nemecko) a 24-jamkovej 26K nanodosky (kat. Č. 250001, Qiagen, Nemecko). Technika ddRT-PCR preukázala pre diagnostiku COVID-19 vyššiu senzitivitu a špecificitu v porovnaní s RT-qPCR. 11

Stručne povedané, reakčná zmes RT-dPCR bola zostavená nasledovne: 4x jednokrokový vírusový RT-PCR Master Mix 10 μl, 100x multiplexná reverzná transkripčná zmes 0,4 μl, 20x sada primérov a sond 0149, 0130, 0150 (ref IAGE) 2 μl x3 (6 μL), voda bez RNázy 22,6 μl a templát RNA 1 μl, v konečnom objeme 40 μl. Cieľ 0130 cieľ 2019-nCoV_N2 NC_045512v2 fluorofor HEX, dĺžka amplikónu 67 bp. Cieľová oblasť 0149: delécia mutácie 69-70, línia B1.1 a B1.258, fluorofor HEX, dĺžka amplikónu 100 bp. Cieľová oblasť 0150 S: mutácia N501Y, línia B1.1.7, fluorofor Cy5, dĺžka amplikónu 133 bp. Sekvencie sú dôverné a sú uložené pod číslom EP20306715.2. Zmes bola pripravená na predbežnej doštičke a potom prenesená do 24-jamkovej 26K nanodosky. Potom bola zavedená do prístroja QIAcuity 8, čo je plne automatizovaný systém. Pracovný postup zahŕňal i) krok primovania a valcovania za účelom generovania a izolácie komorových oddielov, ii) krok amplifikácie podľa nasledujúceho cyklického protokolu: 50°C počas 40 minút pre reverznú transkripciu, 95°C počas 2 minút pre aktiváciu enzýmu, 95°C po dobu 5s pre denaturáciu a 60°C po dobu 30s pre žíhanie/predĺženie po dobu 40 cyklov a iii) krok zobrazovania sa uskutočnil načítaním v nasledujúcich kanáloch FAM, HEX a CY5. Celý čas pracovného toku bol v prípade týchto troch krokov približne 2 hodiny. Pokusy sa uskutočňovali s použitím negatívnej kontroly (bez kontroly templátu, NTC) a pozitívnej kontroly (vzorka pacienta bola pomocou nášho rutinného diagnostického testovania potvrdená ako pozitívna pomocou RT-PCR). Všetky reakcie mali najmenej 25 400 oddielov. Dáta sa analyzovali pomocou softvéru QIAcuity Suite Software V1.1.3 (Qiagen, Nemecko) a vyjadrili sa ako kópie/μl.

Mikrosférový imunotest


Vzorky séra mačiek a psov sa testovali pomocou multiplexného mikroskopického imunotestu (MIA). Na zachytenie špecifických sérových protilátok sa použilo 10 μg troch rekombinantných antigénov SARS-CoV-2: nukleoproteín (N), doména viažuca receptor (RBD) a trimérny spike (tri-S). Separátne súpravy mikrosfér MagPlex (Luminex Corp) sa príslušne spojili s vírusovými antigénmi pomocou amínovej spojovacej súpravy (Bio-Rad Laboratories) podľa pokynov výrobcu, zatiaľ čo súprava mikrosfér spojená s rekombinantným ľudským proteínom (O6-metylguanínová DNA metyltransferáza) sa použila ako kontrola v teste. Procedúra MIA sa uskutočňovala tak, ako je opísané v 12. Stručne povedané, zmesi mikrosfér sa postupne inkubovali chránené pred svetlom na orbitálnej trepačke so vzorkami séra (1: 400), biotinylovaným proteínom A a biotinylovaným proteínom G (každý 4 μg / ml) (Thermo Fisher Scientific) a Streptavidín-R-fykoerytrín (4 μg / ml) (Life technologies). Merania sa uskutočňovali pomocou prístroja Magpix (Luminex). Relatívne fluorescenčné intenzity (RFI) sa vypočítali pre každú vzorku vydelením signálu MFI nameraného pre sady mikrosfér potiahnutých antigénom signálom MFI získaným pre sadu kontrolných mikrosfér, aby sa zohľadnila nešpecifická väzba protilátok na guľôčky. Hraničné hodnoty špecifickej séropozitivity pre každý antigén boli stanovené na tri štandardné odchýlky nad priemernú hodnotu RFI vzoriek séra 29 psov a 30 mačiek odobratých pred rokom 2019. Na základe predpandemickej populácie bola MIA špecificita pre N proteín stanovená na 96,6%. pre psy a mačky, 96,6% pre RBD pre mačky a 100% pre psy a 100% pre tri-S pre mačky a 96,6% pre psy.

Meranie neutralizačnej aktivity


Na meranie neutralizačnej aktivity v sérach mačiek a psov sa použila pseudo častica na báze MLV nesúca reportér GFP pseudotypizovaný špičkou SARS-CoV2 (SARS-CoV-2pp). Každá pozitívna vzorka SARS-CoV2 detegovaná pomocou MIA bola spracovaná neutralizačným postupom, ako bol opísaný v 13. Úroveň infekčnosti bola vyjadrená ako % GFP pozitívnych buniek a porovnaná s bunkami infikovanými SARS-CoV-2pp inkubovanými bez séra. Pre-pandemické séra z Francúzska sa použili ako negatívne kontroly a anti-SARS-CoV-2 RBD protilátka sa použila ako pozitívna kontrola.

Prehlásenie o konflikte záujmov


Žiadny z autorov nemá v tejto štúdii žiadny konflikt záujmov (finančný ani osobný).

Financovanie


Štúdia bola financovaná Francúzskou národnou agentúrou pre výskum (ANR-RA-COVID-19; Geografická a časová sérologická štúdia infekcie spoločenských zvierat vírusom SARS-CoV-2 počas druhej vlny COVID-19 vo Francúzsku, CoVet) a projekt IDEXLYON z Université de Lyon ako súčasť „Programu Investissements d’Avenir“ (ANR-16-IDEX-0005) a Institut de Recherche pour le Développement (IRD).

Poďakovanie


Sme vďační majiteľom domácich miláčikov, že nám dali súhlas na odber vzoriek od svojich zvierat. Ďakujeme tiež Dr. Laurentovi Locquetovi a Dr. Altinovi Cala za to, že prispeli ku klinickému manažmentu týchto pacientov. Ďakujeme tiež Franzovi Durandetovi (IAGE – Ingénierie et Analyze en Génétique Environnementale, Grabels, Francúzsko), Alix de Mont-Marin (Innovative Diagnostics, Francúzsko) a Afif M. Abdel Nour (Qiagen, Francúzsko) za pomoc v molekulárnej biológii. Ďalej ďakujeme Françoisovi Loïcovi Cossetovi, Solène Denollyovej, Bertrandovi Bosonovi z CIRI – Centre International de Recherche en Infectiologie, Team EVIR, Univ Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Inserm, U111, UMR5308, ENS Lyon, za vývoj techniky seroneutralizácie. Na záver ďakujeme doktorovi Thierrymu Buronfosseovi za láskavý dar predpandemických sér.

Referencie

  1. Rambaut, A., et al. A dynamic nomenclature proposal for SARS-CoV-2 lineages to assist genomic epidemiology. Nature microbiology 5, 1403–1407 (2020).Google Scholar
  2. (PHE), P.H.E. Investigation of novel SARS-CoV-2 variant: Variant of concern 202012/01: Technical briefing 6. London: PHE. 13 Feb 2021. Available from: www.gov.uk/government/publications/investigation-of-novel-sars-cov-2-variant-variant-of-concern-20201201 (2021).Google Scholar
  3. Leung, K., Shum, M.H., Leung, G.M., Lam, T.T. & Wu, J.T. Early transmissibility assessment of the N501Y mutant strains of SARS-CoV-2 in the United Kingdom, October to November 2020. Euro surveillance: bulletin Europeen sur les maladies transmissibles = European communicable disease bulletin 26 (2021).Google Scholar
  4. Barrs, V., et al. SARS-CoV-2 in Quarantined Domestic Cats from COVID-19 Households or Close Contacts, Hong Kong, China. Emerging Infectious Disease journal 26, 3071 (2020).Google Scholar
  5. Hosie, M.J., et al. Respiratory disease in cats associated with human-to-cat transmission of SARS-CoV-2 in the UK. bioRxiv, 2020.2009.2023.309948 (2020).Google Scholar
  6. Sit, T.H.C., et al. Infection of dogs with SARS-CoV-2. Nature 586, 776–778 (2020).Google Scholar
  7. Segalés, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 in a cat owned by a COVID-19-affected patient in Spain. Proceedings of the National Academy of Sciences 117, 24790–24793 (2020).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  8. Challen, R., et al. Risk of mortality in patients infected with SARS-CoV-2 variant of concern 202012/1: matched cohort study. BMJ 372, n579 (2021).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  9. Morris, S.B., et al. Case Series of Multisystem Inflammatory Syndrome in Adults Associated with SARS-CoV-2 Infection – United Kingdom and United States, March-August 2020. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 69, 1450–1456 (2020).CrossRefPubMedGoogle Scholar
  10. Valverde, I., et al. Acute Cardiovascular Manifestations in 286 Children With Multisystem Inflammatory Syndrome Associated With COVID-19 Infection in Europe. Circulation 143, 21–32 (2021).Google Scholar
  11. Falzone, L., et al. Sensitivity assessment of droplet digital PCR for SARS-CoV-2 detection. Int J Mol Med 46, 957–964 (2020).CrossRefGoogle Scholar
  12. Fritz, M., et al. High prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in pets from COVID-19+ households. One Health 11, 100192 (2021).Google Scholar
  13. Legros, V., et al. A longitudinal study of SARS-CoV-2-infected patients reveals a high correlation between neutralizing antibodies and COVID-19 severity. Cellular & Molecular Immunology 18, 318–327 (2021).Google Scholar
Publikované

Retrospektívna štúdia klinických a laboratórnych charakteristík a liečby mačiek s vysoko suspektnou FIP v čínskom Wu-chane

4.3.2021; Preklad 16.4.2021
Yiya Yin, Ting Li, Chaohao Wang, Xiaoya Liu, Hehao Ouyang, Wanfeng Ji, Jiahao Liu, Xueyu Liao, Junyi Li, and Changmin Hu

Pôvodný článok: A retrospective study of clinical and laboratory features and treatment on cats highly suspected of feline infectious peritonitis in Wuhan, China

Abstrakt

Infekčná peritonitída mačiek (FIP) je systémové, potenciálne smrteľné vírusové ochorenie. Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať klinické a laboratórne charakteristiky a liečbu mačiek s vysoko suspektnou FIP v čínskom Wu-chane. Klinické záznamy 127 mačiek s vysoko suspektnou FIP boli preverované na históriu, klinické príznaky, fyzikálne nálezy a výsledky diagnostických testov. Pohlavie, stav kastrácie, plemeno, vek a mesiac nástupu ochorenia sa porovnali s charakteristikami klinickej populácie. Vek a stav kastrácie významne korelovali s podozrením na FIP. Pohlavie, plemeno a mesiac prepuknutia príznakov nemali s FIP súvislosť. Omnoho viac prípadov podozrenia na FIP bolo zaznamenaných u mladých mačiek alebo intaktných samcov. Výpotok sa pozoroval u 85,8% mačiek s podozrením na FIP. Bežnými abnormalitami v prípadoch FIP bolo zvýšenie sérového amyloidu A (SAA) a lymfopénia. Ďalej 91,7% mačiek s vysoko suspektnou FIP malo pomer albumín/globulín (A/G) <0,6, zatiaľ čo 85,3% malo pomer A/G <0,5. Úmrtnosť pre mačky s podozrením na FIP bola 67% a šesť predložených prípadov bolo potvrdených FIP-špecifickou imunohistochémiou. Z 30 mačiek liečených GS-441524 a/alebo GC376 bolo 29 klinicky vyliečených. Štúdia zdôrazňuje rozmanitosť klinických prejavov pri diagnostikovaní tohto potenciálne smrteľného ochorenia. Pomer A/G a SAA mali vyššiu diagnostickú hodnotu. GS-441524 a GC376 sa ukázali byť účinné pri liečbe mačiek s podozrením na FIP.

Kľučové slová: Zoológia, Diagnostika infekčných chorôb

Úvod

Infekčná peritonitída mačiek (FIP) je svetovo rozšírené ochorenie domácich a divých mačiek. Patogénom FIP je vírus mačacej infekčnej peritonitídy (FIPV), ktorý vznikol mutáciou mačacieho koronavírusu (FCoV) 1,2. Aj keď už bol uskutočnený rozsiahly výskum FIP, FIP zostáva jednou z najrozšírenejších a najsmrteľnejších infekčných chorôb mačiek.

Okrem nešpecifických klinických príznakov, ako sú malátnosť, nechutenstvo, kolísavá horúčka a úbytok hmotnosti, je klinický obraz FIP zložitý a variabilný. Rôzne klinické príznaky môžu byť výsledkom variácií vírusu a povahy imunitnej odpovede jednotlivého hostiteľa. FIP možno rozdeliť na tri typy – efuzívny, neefuzívny a zmiešaný – podľa rôznych klinických znakov, ktoré sa objavia, sa tieto typy môžu u každej jednotlivej mačky časom meniť. Efuzívna (vlhká) FIP sa prejavuje hlavne ako ascites a/alebo pleurálny výpotok, zatiaľ čo neefuzívna (suchá) FIP sa prejavuje hlavne tvorbou granulómov v centrálnom nervovom systéme, v očiach a v brušných orgánoch a neprodukuje výpotok v telesnej dutine3. Ak sa príznaky efuzívnej a neeufuzívnej formy objavujú súčasne, jedná sa o zmiešanú FIP4. Pokiaľ vieme, existuje iba málo štúdií o klinických a laboratórnych vlastnostiach FIP v Číne.

Diagnostika FIP pred smrťou je kontroverzná a komplikovaná záležitosť. Je ťažšie diagnostikovať FIP in vivo u mačiek bez výpotku, pretože klinické príznaky a laboratórne vlastnosti sú pomerne nejasné. Imunofluorescenčné farbenie antigénu FCoV v makrofágoch je vysoko špecifické, ale je ťažké ho zistiť kvôli nízkemu počtu makrofágov v efúzii. V súčasnosti je zlatým štandardom pre diagnostiku FIP imunohistochémia (IHC) na identifikáciu antigénov FCoV v postihnutých tkanivách. Táto invazívna metóda má však nízku operatívnosť a vyžaduje profesionálne detekčné vybavenie a personál. Negatívny výsledok IHC zároveň nevylučuje diagnózu FIP, čo predstavuje ďalšiu výzvu pre diagnostiku tohto ochorenia5. FIP má extrémne vysokú úmrtnosť a donedávna bola považovaná za smrteľné ochorenie. V posledných rokoch sa ukázalo, že inhibítor 3C proteázy (GC376) a nukleozidový analóg (GS-441524) majú na FIP určitý terapeutický účinok6–9. Účelom tejto štúdie je zistiť epidemiologické vlastnosti a súvisiace rizikové faktory FIP, zhrnúť bežné klinické príznaky a laboratórne charakteristiky a vyhodnotiť terapeutické účinky GS-441524 a GC376.

Materiály a metódy

Selekcia prípadov

Táto štúdia spätne vyhodnocovala lekárske záznamy v databáze 12 veterinárnych nemocníc v čínskom Wu-chane od 1. januára 2019 do 1. januára 2020. Z dôvodu obmedzení diagnostických zariadení vo veterinárnych nemocniciach a zdráhaniu majiteľov mačiek poskytnúť súhlas s invazívnymi diagnostickými postupmi, ako je biopsia, väčšina prípadov nebola potvrdená IHC. Preto boli na základe predtým publikovanej literatúry v tejto oblasti stanovené nasledujúce kritériá zaradenia pre diagnostiku suspektných prípadov FIP5–15. Ako vysoko suspektné prípady FIP boli definované tie, ktoré spĺňali najmenej štyri z nasledujúcich charakteristík: 1) Typické klinické príznaky výpotku FIP (pleurálny výpotok a/alebo ascites) alebo typické klinické príznaky neefuzívnej FIP (očné a neurologické príznaky); 2) Znížený pomer hodnoty albumín/globulín (A/G<0,6); 3) Rivaltov test vykazujúci pozitívne výsledky v efúzii; 4) Pozitívna detekcia FCoV RNA v efúzii polymerázovou reťazovou reakciou s reverznou transkripciou (RT-PCR); 5) Vzorky tkanív odobraté pri pitve, ktoré ukazujú typické histologické znaky FIP, a to systémovú vaskulitídu a pyogranulomatózne lézie.

Z 20 984 mačiek registrovaných v 12 veterinárnych nemocniciach bolo podľa vyššie uvedených kritérií zahrnutých 127 prípadov s vysokým podozrením na FIP. Prostredníctvom zhromažďovania základných informácií, vyšetrenia histórie, klinických príznakov, hematologických a biochemických analýz, diagnostického zobrazovania, RT-PCR, Rivaltovho testu, prieskumnej laparotómie a histopatológie boli prípady komplexne diagnostikované a analyzované a boli zaznamenané podrobné informácie a výsledky vyšetrení (pozri Doplnková tabuľka S1 pre záznamový list prípadu FIP). Všetky informácie boli zhromaždené so súhlasom a za spolupráce veterinárnych lekárov a majiteľov mačiek. Protokol bol schválený Výborom pre riadenie a etiku zvierat Centra laboratórnych zvierat na Huazhongskej poľnohospodárskej univerzite (schvaľovacie číslo: HZAUCA-2018–005).

Štatistická analýza

Štatistická analýza sa uskutočňovala pomocou komerčného softvéru (SPSS verzia 21.0 [IBM]). Pre všetky hodnotené premenné boli použité popisné štatistiky. Kategorické údaje sa analyzovali pomocou Pearsonovho testu chí-kvadrát (χ2). V kontingenčných tabuľkách 2×2 s očakávanými hodnotami buniek <5 sa použili Fisherove presné dvojstranné výsledky. Pohlavie, stav kastrácie, plemeno, vek a nástupu príznakov suspektnej FIP sa porovnali s mačacou klinickou populáciou (20 984 mačiek), prezentovanou od januára 2019 do januára 2020 z 12 veterinárnych nemocníc, aby sa určilo, či sú tieto rizikové faktory spojené s FIP.

Anamnéza, klinické príznaky a výsledky laboratórnych vyšetrení FIP podozrivých prípadov boli spätne analyzované, aby sa zhrnuli bežné klinické znaky a abnormality laboratórneho vyšetrenia choroby. Vzorky boli náhodne vybrané z mačiek podrobených prieskumnej laparotómii a zaslané spoločnosti LABOKLIN GMBH & CO. KG (Bad Kissingen, Nemecko) pre IHC, aby sa overilo, či sú inklúzne kritériá pre prípady FIP správne a odôvodnené. Okrem toho sa hodnotil terapeutický účinok GS-441524 a GC376.

Etické schválenie

Boli dodržané všetky príslušné medzinárodné, národné a inštitucionálne smernice pre starostlivosť a použitie zvierat. Všetky postupy vykonané v štúdiách na zvieratách boli v súlade s etickými normami inštitúcie, v ktorej sa štúdie uskutočňovali.

Výsledky

Rizikové faktory

Medzi FIP a pohlavím nebola zistená významná korelácia (p = 0,083). FIP však významne korelovala so stavom kastrácie (p <0,001) a intaktní samci boli náchylnejšie na ochorenie. Pokiaľ ide o plemeno, či už klasifikované ako krížené alebo čistokrvné (p = 0,069) alebo špecifické pre každé plemeno (p = 0,246), nezistila sa žiadna korelácia s FIP. Medzi vekom a FIP bola signifikantná korelácia (p <0,001) a mladé mačky boli náchylnejšie. Vek prípadov suspektnej FIP sa pohyboval od 1 mesiaca do 8 rokov a 2 mesiacov, s priemerným vekom 13,1 mesiaca a stredným vekom 8 mesiacov. V týchto prípadoch bolo 40,2% mladších ako 6 mesiacov, 67% mladších ako 1 rok a 90,6% mladších ako 2 roky; navyše prevalencia u starších mačiek bola významne nižšia, ako prevalencia u mladých mačiek (tabuľka 1). Korelácia mesiaca nástupu choroby sa študovala prvýkrát a pre každý mesiac sa spočítal počet mačiek s podozrením na FIP a populácia kliniky. Výsledky ukázali, že najvyššia prevalencia bola v máji 1%. Prevalencia v januári (0,95%), februári (0,87%), septembri (0,66%) a novembri (0,77%) bola vyššia ako celková prevalencia a najnižšia prevalencia bola v júli 0,35%. V štatistickej analýze však neexistovala korelácia medzi FIP a mesiacom (p = 0,135; tabuľka 1).

Tabuľka 1

Rizikové faktory mačiek s vysokým podozrením na FIP v porovnaní s klinickou populáciou.

Rizikové faktory Podozrenie na FIP (n = 127) Klinická populácia (n = 20984) χ2 p hodnota OR 95% CI
Pohlavie n = 127 (%) n = 17,494 (%) 3.009 0.083    
Samec 78 (61.4) 9397 (53.7)     1.372 0.958–1.963
Samica 49 (38.6) 8097 (46.3)     0.729 0.509–1.043
Status kastrácie n = 127 (%) n = 16041 (%) 45.684  < 0.001***    
Nekastrovaný samec 69 (54.3) 4887 (30.5)     Ref  
Kastrovaný samec 9 (7.1) 3791 (23.6)     0.168 0.084–0.337
Nekastrovaná samica 39 (30.7) 4472 (27.9)     0.618 0.416–0.917
Kastrovaná samica 10 (7.9) 2891 (18.0)     0.245 0.126–0.476
Plemeno n = 127 (%) n = 16469 (%) 3.307 0.069    
Krížené 36 (28.3) 5953 (36.1)     0.699 0.474–1.029
Čistokrvné 91 (71.7) 10,516 (63.9)     1.431 0.972–2.108
Plemeno(špecifické) n = 127 (%) n = 16469 (%) 16.752 0.053    
Krížené 36 (28.3) 5953 (36.1)     Ref  
Britská krátkosrstá 60 (47.2) 6558 (39.8)     1.513 0.999–2.290
Americká krátkosrstá 8 (6.3) 1275 (7.7)     1.038 0.481–2.237
Ragdoll 9 (7.1) 877 (5.3)     1.697 0.815–3.535
Siamská 6 (4.7) 430 (2.6)     2.307 0.967–5.506
Exotická mačka 3 (2.4) 1019 (6.2)     0.487 0.150–1.584
Chinchilla (Perzská) 2 (1.6) 258 (1.6)     1.282 0.307–5.353
Škótska klapouchá 1 (0.8) 44 (0.3)     3.758 0.504–28.021
Americký curl 1 (0.8) 28 (0.2)     5.906 0.782–44.581
Bengálska 1 (0.8) 27 (0.2)     6.124 0.810–46.291
Vekové skupiny n = 127 (%) n = 19772 (%) 220.276  < 0.001***    
 ≤ 6 M 51 (40.2) 1530 (7.7)     Ref  
6 M < A ≤ 1Y 34 (26.8) 3254 (16.5)     0.313 0.202–0.486
1Y < A ≤ 2Y 30 (23.6) 4660 (23.6)     0.193 0.123–0.304
2Y < A ≤ 4Y 8 (6.3) 4027 (20.4)     0.060 0.028–0.126
4Y < A ≤ 7Y 3 (2.4) 3507 (17.7)     0.026 0.008–0.082
A > 7Y 1 (0.8) 2794 (14.1)     0.011 0.001–0.078
Nástupné mesiace n = 127 (%) n = 20984 (%) 16.166 0.135    
Január 16 (12.6) 1685 (8.0)     Ref  
Február 13 (10.2) 1500 (7.1)     0.913 0.438–1.904
Marec 7 (5.5) 1768 (8.4)     0.417 0.171–1.016
Apríl 7 (5.5) 1656 (7.9)     0.445 0.183–1.085
Máj 17 (13.4) 1689 (8.1)     1.054 0.531–2.094
Jún 10 (7.9) 2109 (10.1)     0.499 0.226–1.103
Júl 7 (5.5) 2022 (9.6)     0.365 0.150–0.888
August 9 (7.1) 1773 (8.4)     0.535 0.236–1.213
September 12 (9.4) 1812 (8.6)     0.697 0.329–1.479
Október 8 (6.3) 1734 (8.3)     0.486 0.207–1.138
November 13 (10.2) 1698 (8.1)     0.806 0.387–1.681
December 8 (6.3) 1529 (7.3)     0.551 0.235–1.291

Dáta vyjadrené ako n (%); χ2 = Chi-kvadrát; OR = Pomer šancí; CI = Interval spoľahlivosti; Ref = Referenčná kategória; A = Vek; Y = Roky; ***: p < 0.001, vyjadruje štatisticky významný rozdiel.

Stresujúce udalosti pred diagnostikovaním boli dokumentované u 60/127 mačiek. Pretože niektoré mačky mali viac stresorov, bolo zaznamenaných spolu 77 stresorov. Z týchto udalostí bola zmena prostredia najbežnejším faktorom vedúcim k stresu (40,3%), po ktorom nasledovali nové domáce zvieratá v domácnosti, ktoré koexistovali s inými chorobami, zastrašovaním a zmenou stravy (obr. 1). Okrem toho sa zhromaždili informácie o hustote mačiek v domácnosti, z toho 43 (51,8%) boli domácnosti s jednou mačkou a 40 (48,2%) boli domácnosti s početnými mačkami.

Obrázok 1
Frekvencia dokumentovanej stresovej situácie mačiek s vysokým podozrením na FIP.

Klinické príznaky

Zo 127 mačiek s vysoko suspektnou FIP sa u 12 (9,4%) prejavila suchá FIP a u 109 (85,8%) sa prejavila efúzna FIP, z toho 92 sa prejavilo ascitom (84,4%), 11 pleurálnym výpotkom (10,1%) a 6 s ascitom a pleurálnym výpotkom (5,5%). Okrem toho 6 mačiek (4,7%) malo zmiešanú FIP. U niektorých sa najskôr prejavila suchá FIP, potom nasledoval ascit a vývoj efuzívnej FIP. Niektoré mačky vykazovali najskôr efuzívnu FIP a niekoľko dní pred smrťou sa u nich vyvinuli neurologické príznaky

Klinické príznaky mačiek s vysokým podozrením na FIP sú uvedené v tabuľke 2. Najbežnejšími nešpecifickými znakmi boli strata hmotnosti (93,8%), malátnosť (86,2%) a nechuenstvo (86%). Vo viac ako polovici prípadov bol prítomný ikterus a 59,4%, respektíve 52,9% horúčka. Z 85 mačiek s vysoko suspektnou FIP, u ktorých bola teplota dokumentovaná pri fyzikálnom vyšetrení, malo 52,9% teplotu nad 39,5 ℃, 36,5% malo teplotu nad 40℃ a 10,6% malo teplotu nad 40,5℃ (pozri doplnkový obrázok S1.). Vo výsledkoch malo 41,3% mačiek hmatateľnú masu pri brušnej palpácii, čo mohlo byť buď zväčšenie mezenterických lymfatických uzlín alebo narastanie črevnej steny. Hnačka bola menej častá a vyskytla sa iba u 17,6%, zatiaľ čo dyspnoe sa vyskytla u 35,2% a bola najbežnejšia u mačiek s pleurálnym výpotkom. Okrem toho, očné a neurologické príznaky sa všeobecne vyskytli iba pri suchých alebo zmiešaných formách FIP.

Tabuľka 2

Klinické príznaky mačiek s vysokým podozrením na FIP.

Klinické príznaky Vyšetrené zvieratá (n) Počet mačiek s klinickými príznakmi (n) Percento mačiek s klinickými príznakmi (%)
Strata hmotnosti 64 60 93.8
Malátnosť 94 81 86.2
Nechutenstvo 100 86 86
Ikterus 64 38 59.4
Horúčka 85 45 52.9
Brušná hmota 63 26 41.3
Dyspnoe 71 25 35.2
Hnačka 85 15 17.6
Očné príznaky 103 9 8.7
Neurologické príznaky 103 9 8.7
Tipy FIP
Suchá 127 12 9.4
Ascites 127 92
Efuzívna pleurálna 127 11 85.8
Obidve 127 6
Zmiešaná 127 6 4.7

Očné príznaky zahŕňali uveitídu, edém rohovky, edém, anizokóriu a odlúčenie sietnice. Neurologické príznaky zahŕňali ataxiu, ochrnutie zadných končatín, nystagmus, zášklby a slinenie. Počet údajov uvedený ako n.

Hematológia a sérová biochémia

Ako je zrejmé z tabuľky 3, hematokrit (HCT) poklesol u 40,2% mačiek, ale iba u 15,9% mačiek došlo k poklesu počtu červených krviniek (RBC). U polovice mačiek sa vyvinula lymfcytopénia, u 33,9% došlo k zvýšeniu počtu bielych krviniek (WBC) a u 34,3% došlo k zvýšeniu počtu neutrofilov (NEU).

Tabuľka 3

Hematológia a sérová biochémia mačiek s vysokým podozrením na FIP.

Meranie Jednotky Referenčný interval Vyšetrené zvieratá Rozsah Priemer Medián Zvýšený Znížený Normálny
Červené krvinky  × 1012/L 5–10 107 3.22–12.5 6.78 6.81 7 (6.5) 17 (15.9) 83 (77.6)
Haematokrit % 24–45 82 13.8–46.6 26.68 26 2 (2.4) 33 (40.2) 47 (57.3)
Biele krvinky  × 109/L 5–18.9 109 0–71.9 17.23 15.6 37 (33.9) 8 (7.3) 64 (58.7)
Lymfocyty  × 109/L 1.5–7.8 106 0–27.8 3.42 1.45 11 (10.4) 53 (50.0) 42 (39.6)
Neutrofily  × 109/L 2.5–12.5 35 0–30.83 9.7 7.93 12 (34.3) 8 (22.9) 15 (42.9)
Celková bielkovina g/L 57–89 109 47–120 75.77 76 16 (14.7) 11 (10.1) 82 (75.2)
Albumín g/L 22–40 109 10–33 20.96 21 0 64 (58.7) 45 (41.3)
Globulín g/L 28–51 109 30–96 55.03 53 63 (57.8) 0 46 (42.2)
Albumín/Globulín / / 109 0.137–0.767 0.399 0.385 / / /
Celkový bilirubín µmol/L 0–15 76 0.8–147.1 25.2 15 37 (48.7) 0 39 (51.3)
Alanínaminotransferáza U/L 12–130 101 10–488 49.31 35 5 (5.0) 13 (12.9) 83 (82.2)
Alkalická fosfatáza U/L 14–111 74 0–155 35.53 27.5 3 (4.1) 19 (25.7) 52 (70.3)
Kreatinín µmol/L 71–212 94 7.3–302 79.04 71 1 (1.1) 45 (47.9) 48 (51.1)
Urea mmol/L 5.7–12.9 89 2.2–44.27 6.05 5.1 2 (2.2) 54 (60.7) 33 (37.1)
Amyláza U/L 500–1500 39 26–3178 1356.01 1187 13 (33.3) 2 (5.1) 24 (61.5)
Lipáza U/L 100–1400 11 81–1163 460.91 470 0 2 (18.2) 9 (81.8)
Mačací sérový amyloid A mg/L 0–8 44 16.9–253 121.82 118.35 44 (100.0) 0 0

Dáta vyjadrené ako n (%).

V sérovej biochémii boli hladiny celkového proteínu (TP) väčšinou normálne (75,2%); niekoľko (14,7%) mačiek malo zvýšenú hladinu a veľmi málo malo zníženú hladinu. Viac ako polovica mačiek s vysoko suspektnou FIP vykazovala hypoalbuminémiu (58,7%). Aj keď hladiny albumínu (ALB) u zostávajúcich mačiek boli normálne, boli tiež blízko dolnej hranice referenčného rozsahu. Hyperglobulinémia bola tiež častá u mačiek s vysokým podozrením na FIP (57,8%) a zvyšok mačiek mal normálnu hladinu globulínu (GLOB). Pomer A/G sa pohyboval od 0,137 do 0,767, s priemerom 0,399 a mediánom 0,385. Medzi výsledkami bolo 91,7% menej ako 0,6, 85,3% bolo menej ako 0,5 a 54,1% bolo menej ako 0,4 (pozri doplnkový obrázok S2). Zvýšenie celkového bilirubínu (TBIL) sa pozorovalo u takmer polovice mačiek s vysoko suspektnou FIP (48,7%) a alanínaminotransferáza (ALT) a alkalická fosfatáza (ALP) boli väčšinou normálne. Kreatinín (CRE) sa znížil u 47,9% mačiek, zatiaľ čo močovina sa znížila u 60,7% mačiek a zriedka sa zvýšila. Amyláza (AMYL) a lipáza (LIPA) boli väčšinou negatívne a pozitívne iba u menšieho množstva mačiek. Okrem toho sa mačací sérový amyloid A (SAA) zvýšil u všetkých mačiek (Tabuľka 3).

Zobrazovacia a molekulárna biológia

Zo 127 mačiek bolo 90 vyšetrených ultrazvukom, ktorý ukázal rôzne stupne ascitu a u niekoľkých mačiek sa ukázala strata kortikomedulárneho rozlíšenia v obličkách. Rádiografia sa uskutočnila u 21 mačiek, ktoré vykazovali pleurálny výpotok a/alebo ascites (obr. 2). Spomedzi 109 mačiek s výpotkom u 98 došlo k odsatiu výpotku. Potom sme pomocou RT-PCR detegovali FCoV RNA u 98 výpotkov, pričom 83 mačiek (84,7%) vykazovalo pozitivitu FCoV. Mutácia FCoV bola detegovaná v 34 FCoV-pozitívnych výpotkoch s 12 úspešne sekvenovanými a získanými čiastočnými sekvenciami génu S, pričom všetky mali mutácie M1058L alebo S1060A. Ďalej boli testy spoločnosti Rivalta vykonané v 85 prípadoch s mierou pozitivity 100%; Testy na protilátky FCoV sa uskutočnili v 12 prípadoch a všetky boli pozitívne. Mikroskopické vyšetrenie výterov z výpotkov 25 mačiek ukázalo veľa ružových proteínových granúl a zvýšenie zápalových buniek.

Obrázok 2
Výsledky klinického vyšetrenia 4-mesačnej intaktnej samice britskej krátkosrstej mačky s vlhkou FIP. (a) Ultrazvuk ukázal veľké množstvo ascitu, v ktorom plávalo črevo; (b) rádiografia odhalila veľké množstvo výpotku v brušnej dutine; (c) povrch obličky bol posiaty miliárnymi bielymi uzlíkmi; (d) boli pozorované ascites a zväčšené mezenterické lymfatické uzliny. (e) Stredne ťažká pyogranulomatózna intersticiálna nefritída (hematoxylín a eozín, × 400). Intersticium kortexu vykazovalo ohniskovú výraznú infiltráciu makrofágmi, lymfocytmi, neutrofilmi a niektorými plazmatickými bunkami; (f) obličkové makrofágy boli zafarbené silno pozitívne na antigén FCoV pomocou imunohistochémie, × 400.

Histopatológia a imunohistochémia

13 mačiek bolo podrobených prieskumnej laparotómii a histopatologická diagnostika bola vykonaná u 9 mačiek (podrobnosti o 13 mačkách nájdete v doplnkovej tabuľke S2). Po prieskumnej laparotómii boli vzorky podrobené histopatologickému vyšetreniu a zistili sme typické patologické zmeny FIP, a to systémovú vaskulitídu a pyogranulomatózne lézie (obr. 2). Náhodne sa vybrali vzorky tkanív šiestich mačiek, ktoré sa poslali spoločnosti LABOKLIN GMBH & CO. KG pre IHC. Toto testovanie odhalilo, že tkanivové makrofágy vykázali pozitívne sfarbenie pre antigén FCoV, čo potvrdilo diagnózu FIP (pozri doplnkový obrázok S3–S8).

Liečba a výsledky

Boli zaznamenané výsledky 88 mačiek. Z nich nakoniec zomrelo 59 s mierou úmrtnosti 67%. Tridsaťdva mačiek bolo bolo priamo eutanizovaných. Dvadsaťšesť mačiek nepodstúpilo žiadnu liečbu alebo sa liečilo iba na príznaky a nakoniec zomreli prirodzene. Iba jedna suchá FIP bola liečená GS-441524 počas 4 týždňov. Po ústupe choroby sa majiteľ rozhodol liečbu vysadiť a mačka nakoniec relapsovala a bola usmrtená. Okrem toho bolo 29 mačiek (25 vlhkých, 3 suché a 1 zmiešaná) liečených GS-441524 (2-4 mg/kg, jedenkrát denne po dobu najmenej 4 týždňov) alebo GC-376 (6-8 mg/kg) raz denne po dobu najmenej 4 týždňov) s úspešnosťou 33%. Najviditeľnejšími znakmi boli rýchly úbytok ascitu a/alebo pleurálneho výpotku (do 1 týždňa), zotavenie psychiky a chuti do jedla a prírastok hmotnosti. Najdlhšie prežila mačka s vlhkou FIP, ktorá bola diagnostikovaná 1. januára 2019 a prežila viac ako rok.

Diskusia

V minulosti bola FIP vedcami považovaná za smrteľné ochorenie. Okrem toho je ťažké uplatniť zlatý štandard IHC pri diagnostike FIP v Číne. S rozvojom výskumu postupne došlo k prielomovým objavom v liečbe FIP, ako napríklad štúdie o GS-441524 a GC376 6–9,16. Vedľajšie účinky týchto dvoch liekov však nie sú jasné a nemožno ich okamžite použiť pre klinickú liečbu. Preto je pre FIP v Číne zásadné ustanovenie presnejšieho diagnostického systému. Tento príspevok skúmal 127 prípadov FIP vo Wu-chane v Číne a študoval diagnostické metódy niekoľkých nemocníc. Zameral sa na klinické postupy lekárov pri diagnostike ochorenia a zlepšenie FIP diagnostického systému.

V tejto štúdii boli zhromaždené údaje o 127 prípadoch s vysoko suspektnou FIP, kde 13 mačiek podstúpilo prieskumnú laparotómiu, 9 vzoriek od mačiek s vysokým podozrením na FIP podstúpilo histopatológiu a 6 vzoriek podstúpilo IHC, pričom všetky boli nakoniec potvrdené ako FIP. Preto boli kritériá začlenenia pre prípady do tejto štúdie odôvodnené. Uskutočnilo sa veľa výskumov a štúdií o FIP na základe analýzy vysoko suspektných prípadov, ktoré nebolo možné diagnostikovať metódami zlatého štandardu (IHC), ale stále poskytovali veľkú referenčnú hodnotu pre diagnostiku a liečbu FIP17–22. Implementácia invazívnych diagnostických metód bola navyše v klinickej praxi zložitá. Pitvu po smrti neboli ochotní akceptovať ani majitelia mačiek, ktorí si vybrali eutanáziu. Ak teda IHC nie je k dispozícii, je presnejšia diagnostika prípadu suspektnej FIP problémom, ktorému v súčasnosti venujú veterinári veľkú pozornosť.

V tejto štúdii bola prevalencia mačiek s vysoko suspektnou FIP 0,61%. Riemerov výskum v Nemecku ukázal, že prevalencia FIP bola 1,42% 14. Predchádzajúce štúdie tiež ukázali, že prevalencia FIP bola v domácnostiach s jednou mačkou alebo s dvoma mačkami 0,02%, zatiaľ čo prevalencia v útulkoch bola 5-10% 23,24. Medzi pohlavím a FIP nebola zistená žiadna korelácia. Niektoré štúdie však naznačili, že samci sú náchylnejší na FIP25. Prevalencia intaktných samcov bola významne vyššia ako prevalencia u iných skupín a prevalencia kastrovaných mačiek bola nižšia, čo je v súlade s Rohrbachovými zisteniami26. Môže to byť preto, že pohlavné hormóny, najmä androgény, majú negatívny vplyv na imunitný systém a zvyšujú riziko šírenia a mutácie vírusov27. Ako už bolo uvedené, táto štúdia ukázala, že FIP je významne spojená s vekom, takže mladé mačky sú náchylnejšie, pravdepodobne preto, že nezrelý imunitný systém a rôzne stresové faktory často viedli k vysokej vírusovej záťaži u mladých mačiek. Je možné, že zvýšená miera nekastrovaných mačiek mohla byť čiastočne spôsobená aj nízkym vekom infikovaných mačiek, čo znamená, že k ochoreniu došlo pred dosiahnutím veku kastrácie. Čistokrvné mačky sa predtým považovali za náchylnejšie na FIP. Stále rastúci počet štúdií, vrátane tejto štúdie, však ukázal, že podiel čistokrvných mačiek v porovnaní s populáciou kliniky nevybočoval z priemeru14. Táto štúdia tiež skúmala pravidelnosť mesiaca prepuknutia FIP, s čím sa neuvažovalo v iných epidemiologických prieskumoch súvisiacich s FIP, a nakoniec nezistila žiadny významný rozdiel v prevalencii FIP v závislosti na mesiaci. Táto štúdia zaznamenala stresory u 60 mačiek, z ktorých najbežnejšia bola zmena prostredia. Niet pochýb o tom, že stres môže inhibovať imunitné funkcie a zvyšovať náchylnosť vírusov na mutácie a množenie10. Hustota bývania sa považovala za jeden z hlavných rizikových faktorov aj pre FIP a preplnenosť by mohla viesť k mutácii vírusov a rozvoju chorôb14. Každopádne niekoľko mačiek s vysokým podozrením na FIP v tejto štúdii pochádzala z domácností s jednou mačkou. Môže to byť preto, že tieto mačky boli vystavené pôsobeniu FCoV, keď v detstve žili v domácnosti s viacerými mačkami, a potom sa presunuli do domácnosti s jednou mačkou pred vyvinutím FIP.

Väčšina prezentovaných prípadov FIP boli efuzívne (až 85,8%), z ktorých väčšinu predstavovali ascites. FIP môže ovplyvňovať systémové orgány, najčastejšie brušné orgány, vrátane čreva, mezenterických lymfatických uzlín, pečene, obličiek a sleziny. Neurologické a očné príznaky boli typickými znakmi suchej FIP. Retrospektívna štúdia 286 mačiek s neurologickým ochorením ukázala, že FIP bol jednou z hlavných príčin neurologických ochorení mačiek28. V tejto štúdii malo 52,9% infikovaných mačiek teplotu vyššiu ako 39,5°C a 36,5% malo teplotu vyššiu ako 40°C. Iný výskum ukázal, že podiel mačiek s horúčkou bol vyšší, kde 82% mačiek malo teplotu vyššiu ako 39,5℃ a 39% malo teplotu vyššiu ako 40℃; Zistilo sa tiež, že horúčka je častejšia u efúznej FIP14. Neboli zaznamenané prípady perikardiálneho výpotku, opuchu skrota alebo kožných papúl, ktoré nie sú bežné, ale nebolo možné ich pri bežnom vyšetrení ignorovať. Klinické príznaky FIP sa vždy menia v priebehu času (napríklad postupná produkcia výpotku a zmeny na funduse), preto bolo veľmi dôležité opakované klinické vyšetrenie, aby sa zabránilo oneskoreniu v diagnostike a liečbe.

Zmeny v hematológii a biochémii séra mohli iba zvýšiť alebo znížiť podozrenie na FIP, ale nemohli sa použiť ako definitívna diagnostická metóda. V tejto štúdii neboli zaznamenané zjavné známky hematologických zmien v diagnostike prípadov FIP, s poklesom HCT u 40,2% mačiek a LYM u 50% mačiek. Mnohé štúdie však preukázali, že lymfocytopénia je najbežnejšou hematologickou abnormalitou FIP vyvolanou prirodzenou alebo experimentálnou infekciou29,30, spôsobenou vírusom indukovanou apoptózou T-lymfocytov31. V tejto štúdii predpokladáme, že testovanie hladiny bielkovín hrá dôležitú úlohu pri diagnostike prípadov FIP. ALB poklesol u 58,7% mačiek a GLOB sa zvýšil u 57,8% mačiek, takže keď sa obidve vyskytli súčasne, TP často zostal v normálnom rozmedzí. Z tohto dôvodu iba 14,7% mačiek preukázalo zvýšenie TP. Hyperglobulinémia aj hypoalbuminémia mohli zvýšiť podozrenie na FIP, ale najdôležitejšou sérovou biochemickou abnormalitou bol pomer A/G. K zníženiu pomeru A/G došlo takmer vo všetkých prípadoch FIP. Rôzne štúdie priniesli odlišné výsledky týkajúce sa efektívnej kritickej hodnoty pomeru A/G32. Podľa pomerov A/G v tejto štúdii (91,7% <0,6, 85,3% <0,5 a 54,1% <0,4) možno za kritickú hodnotu považovať pomer 0,5. Keď bol pomer A/G>0,8, bola pravdepodobnosť FIP veľmi malá; keď bol pomer 0,5<A/G<0,8, FIP bola jednou z možností; a keď bol pomer A/G<0,5, FIP už bola vysoko suspektná. FIP bola navyše sprevádzaná zápalovou odpoveďou, ktorá viedla k zvýšeniu koncentrácie proteínu akútnej fázy33. Preto predpokladáme, že zvýšenie SAA môže pomôcť pri diagnostike FIP.

V porovnaní so sérovou detekciou má detekcia a analýza výpotku z telesnej dutiny u mačiek lepšiu prediktívnu hodnotu32. Miera pozitivity Rivaltovho testu bola v tejto štúdii 100%. Štúdia naznačila, že senzitivita Rivaltovho testu bola 91,3%, špecificita bola 65,5%, pozitívna prediktívna hodnota bola 58,4% a negatívna prediktívna hodnota bola 93,4% 34. Rivaltov test je lacná a rýchla detekčná metóda, ktorá nevyžaduje drahé prístroje a je ľahko zvládnuteľná. Z hľadiska dobrej citlivosti a negatívnej prediktívnej hodnoty by mal byť do diagnostiky každej mačky s výpotkom zahrnutý Rivaltov test15. Pozitívna miera FCoV RNA detegovaná pomocou RT-PCR bola 84,7%. Všetky koronavírusy, vrátane FCoV, však často mutujú a rekombinujú, takže RT-PCR navrhnutá pre špecifické sekvencie nemohla amplifikovať všetky FCoV35 a pozitívne výsledky iba reprezentovali prítomnosť FCoV, ale nie presný FIPV.

V tejto štúdii bolo GS-441524 liečených celkovo 24 mačiek, z toho 23 bolo vyliečených. Iba u jednej mačky došlo k relapsu po 4 týždňoch liečby a nakoniec bola utratená. Liečba GS-441524 po dobu viac ako 8 týždňov sa ukázala ako vysoko účinná. Liečba GC376 samotným alebo v kombinácii s GS-441524 bola tiež účinná. V skutočnosti bola väčšina konečných úmrtí spôsobená absenciou liečby, výhradne symptomatickou liečbou alebo eutanáziou. Pruijssers a Denison navyše naznačili, že kombinácia silných širokospektrálnych liekov proti koronavírusom môže zvýšiť účinnosť a znížiť výskyt rezistencie na lieky36.

Záverom je možné skonštatovať, že FIP nekorelovala s pohlavím, plemenom alebo mesiacom, ale významne korelovala s vekom a stavom kastrácie. FIP sa významne častejšie vyskytovala u mladých mačiek alebo intaktných samcov. Najbežnejšou klinickou formou bola vlhká FIP. Znížený pomer A/G, zvýšený SAA a lymfopénia boli bežné laboratórne abnormality. GS-441524 a GC376 preukázali účinnosť pri liečbe mačiek s podozrením na FIP.

Doplnkové informácie

Doplňujúce obrázky. (5,0 mil. Docx)

Poďakovania

Autori by chceli poďakovať veterinárom a majiteľom mačiek, bez ktorých pomoci by sa táto štúdia nemohla uskutočniť. Štúdia bola financovaná z Národného kľúčového plánu výskumu a vývoja (č. 2020YFC08845600) a fakultnej nemocnice Huazhong Agricultural University. Štúdia bola vykonaná v súlade s pokynmi ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) (https://arriveguidelines.org).

Autorské príspevky

Koncepcia a návrh štúdie: C.H. a Y.Yin. Zber údajov: Y.Y., H.O., W.J., J.L., X.L. a J.L. Analýza dát: Y.Y., T.L., C.W. a X.L. Rukopis: Y.Y. a C.H. Všetci autori recenzovali rukopis.

Dostupnosť dát

Všetky údaje generované alebo analyzované počas tejto štúdie sú obsiahnuté v tomto publikovanom článku (a jeho súboroch s doplňujúcimi informáciami).

Konflikt záujmov

Autori si nie sú vedomí žiadneho konfliktu záujmov.

Poznámky pod čiarou

Poznámka vydavateľa

Springer Nature zostáva neutrálny, pokiaľ ide o jurisdikčné nároky v publikovaných mapách a inštitucionálnych prepojeniach.

Referencie

  1. Bank-Wolf BR, et al. Mutations of 3c and spike protein genes correlate with the occurrence of feline infectious peritonitis. Vet. Microbiol. 2014;173:177–188. doi: 10.1016/j.vetmic.2014.07.020. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  2. Lewis CS, et al. Genotyping coronaviruses associated with feline infectious peritonitis. J. Gen. Virol. 2015;96:1358. doi: 10.1099/vir.0.000084. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  3. Norsworthy, G. D., Grace, S.F., Crystal, M.A. & Tilley, L.P. The feline patient (4thed), 181–183 (John Wiley & Sons, New York, 2011).
  4. Pedersen NC. A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963–2008. J. Feline Med. Surg. 2009;11:225–258. doi: 10.1016/j.jfms.2008.09.008. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  5. Sykes JE. Canine and Feline Infectious Diseases, 195–208. W. B. Saunders; 2014. [Google Scholar]
  6. Kim Y, et al. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog. 2016;12:1–18. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
  7. Murphy BG, et al. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet. Microbiol. 2018;219:226–233. doi: 10.1016/j.vetmic.2018.04.026. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  8. Pedersen NC, et al. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2018;20:378–392. doi: 10.1177/1098612X17729626. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  9. Pedersen NC, et al. Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2019;21:271–281. doi: 10.1177/1098612X19825701. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  10. Addie, D. D. et al. Feline infectious peritonitis. ABCD guidelines on prevention and management. J. Feline Med. Surg.11, 594–604 (2009). [PMC free article] [PubMed]
  11. Greene CE. Infectious diseases of the dog and cat, 92–108. W. B. Saunders; 2012. [Google Scholar]
  12. Kipar A, Meli ML. Feline infectious peritonitis: still an enigma? Vet. Pathol. 2014;51:505–526. doi: 10.1177/0300985814522077. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  13. Pedersen NC. An update on feline infectious peritonitis: diagnostics and therapeutics. Vet. J. 2014;201:133–141. doi: 10.1016/j.tvjl.2014.04.016. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  14. Riemer F, Kuehner KA, Ritz S, Sauter-Louis C, Hartmann K. Clinical and laboratory features of cats with feline infectious peritonitis–a retrospective study of 231 confirmed cases (2000–2010) J. Feline Med. Surg. 2016;18:348–356. doi: 10.1177/1098612X15586209. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  15. Felten S, Hartmann K. Diagnosis of feline infectious peritonitis: a review of the current literature. Viruses. 2019;11:1068. doi: 10.3390/v11111068. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  16. Dickinson PJ, Bannasch M, Thomasy SM, et al. Antiviral treatment using the adenosine nucleoside analogue GS-441524 in cats with clinically diagnosed neurological feline infectious peritonitis. J. Vet. Intern. Med. 2020;34:1587–1593. doi: 10.1111/jvim.15780. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  17. Soma T, Ishii H. Detection of feline coronavirus antibody, feline immunodeficiency virus antibody, and feline leukemia virus antigen in ascites from cats with effusive feline infectious peritonitis. J. Vet. Med. Sci. 2004;66:89–90. doi: 10.1292/jvms.66.89. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  18. Simons FA, et al. A mRNA PCR for the diagnosis of feline infectious peritonitis. J. Virol. Methods. 2005;124:111–116. doi: 10.1016/j.jviromet.2004.11.012. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  19. Can-Şahna K, Ataseven VS, Pınar D, Oğuzoğlu TÇ. The detection of feline coronaviruses in blood samples from cats by mRNA RT-PCR. J. Feline Med. Surg. 2007;9:369–372. doi: 10.1016/j.jfms.2007.03.002. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  20. Sharif S, et al. Evaluation of feline coronavirus viraemia in clinically healthy and ill cats with feline infectious peritonitis. J. Anim. Vet. Adv. 2011;10:18–22. doi: 10.3923/javaa.2011.18.22. [CrossRef] [Google Scholar]
  21. Li C, et al. Circulation and genetic diversity of Feline coronavirus type I and II from clinically healthy and FIP-suspected cats in China. Transbound. Emerg. Dis. 2019;66:763–775. doi: 10.1111/tbed.13081. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  22. Lorusso E, et al. Discrepancies between feline coronavirus antibody and nucleic acid detection in effusions of cats with suspected feline infectious peritonitis. Res. Vet. Sci. 2019;125:421–424. doi: 10.1016/j.rvsc.2017.10.004. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  23. Pedersen NC. Serologic studies of naturally occurring feline infectious peritonitis. Am. J. Vet. Res. 1976;37:1449–1453. [PubMed] [Google Scholar]
  24. Addie DD, Jarrett O. A study of naturally occurring feline coronavirus infections in kittens. Vet. Rec. 1992;130:133–137. doi: 10.1136/vr.130.7.133. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  25. Worthing KA, et al. Risk factors for feline infectious peritonitis in Australian cats. J. Feline Med. Surg. 2012;14:405–412. doi: 10.1177/1098612X12441875. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  26. Rohrbach BW, et al. Epidemiology of feline infectious peritonitis among cats examined at veterinary medical teaching hospitals. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2001;218:1111–1115. doi: 10.2460/javma.2001.218.1111. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  27. Grossman CJ. Interactions between the gonadal steroids and the immune system. Science. 1985;227:257–261. doi: 10.1126/science.3871252. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  28. Bradshaw, J. M., Pearson, G. R. & Gruffydd-Jones, T. J. A Retrospective Study of 286 Cases of Neurological Disorders of the Cat. J. Comp. Pathol.131, 112–120. [PMC free article] [PubMed]
  29. Dean GA, Olivry T, Stanton C, Pedersen NC. In vivo cytokine response to experimental feline infectious peritonitis virus infection. Vet. Microbiol. 2003;97:1–12. doi: 10.1016/j.vetmic.2003.08.010. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  30. de Groot-Mijnes JDF, van Dun JM, van der Most RG, de Groot RJ. Natural history of a recurrent feline coronavirus infection and the role of cellular immunity in survival and disease. J. Virol. 2005;79:1036–1044. doi: 10.1128/JVI.79.2.1036-1044.2005. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  31. Vermeulen BL, et al. Suppression of NK cells and regulatory T lymphocytes in cats naturally infected with feline infectious peritonitis virus. Vet. Microbiol. 2013;164:46–59. doi: 10.1016/j.vetmic.2013.01.042. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  32. Hartmann K, et al. Comparison of different tests to diagnose feline infectious peritonitis. J. Vet. Intern. Med. 2003;17:781–790. doi: 10.1111/j.1939-1676.2003.tb02515.x. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  33. Hazuchova K, Held S, Neiger R. Usefulness of acute phase proteins in differentiating between feline infectious peritonitis and other diseases in cats with body cavity effusions. J. Feline Med. Surg. 2017;19:809–816. doi: 10.1177/1098612X16658925. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  34. Fischer Y, Sauter-Louis C, Hartmann K. Diagnostic accuracy of the Rivalta test for feline infectious peritonitis. Vet. Clin. Pathol. 2012;41:558–567. doi: 10.1111/j.1939-165X.2012.00464.x. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  35. Tasker S. Diagnosis of feline infectious peritonitis: Update on evidence supporting available tests. J. Feline Med. Surg. 2018;20:228–243. doi: 10.1177/1098612X18758592. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  36. Pruijssers AJ, Denison MR. Nucleoside analogues for the treatment of coronavirus infections. Curr. Opin. Virol. 2019;35:57–62. doi: 10.1016/j.coviro.2019.04.002. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Publikované

FIP u starých mačiek

Pôvodný článok: 2021 – FIP IN AGED CATS
Niels C. Pedersen, DVM, PhD, Emeritný profesor, Škola veterinárneho lekárstva University of California, Davis; 11.2.2021

Fakty: Vzťah veku a incidencie FIP už bol v literatúre diskutovaný a dokonca bol aj predmetom výskumu [1]. 29% prípadov FIP sa vyskytuje u mačiatok do 0,5 roka, 50% do 1 roka, 80% do veku 3 roky a 96% do 8 rokov (tabuľka 1). Výskyt FIP medzi 7. a 11. rokom života je extrémne nízky. Prinajmenšom dve štúdie, jedna z USA v roku 1976 [2] a druhá z Európy v roku 2021 [3][tabuľka 1], potvrdzujú skutočný, ale menej dramatický nárast výskytu na 3% u starších mačiek. Zámerom tohto článku je rozobrať príčiny tohto nárastu a jeho dôsledky pre diagnostiku a úspešnú liečbu FIP u starých mačiek.

Tabuľka 1. Vek mačiek v čase diagnózy FIP na základe údajov získaných o mačkách liečených pomocou GS-441524 z Európy 2019-2021.

Zdroj expozície FIP: FIP je výsledkom expozície FECV [4] a to isté platí aj pre staršie mačky. Existuje však niekoľko jedinečných situácií, ktoré sú s takouto expozíciou spojené. Prvý scenár je analogický s tým, ktorý sa vyskytuje u mladších mačiek, t. j. hromadná expozícia mladších mačiek. Je však bežné, že staršie mačky sa spárujú ako mačiatka a žijú svoj život spoločne v relatívnej izolácii. To vedie k ďalšiemu zaujímavému scenáru, pri ktorom je pravdepodobné, že jedna mačka z páru zomrie skôr ako druhá, čo ju ponechá bez spoločníka. Nového spoločníka, najčastejšie mačiatko, potom získate od záchranárskej organizácie, útulku alebo chovateľskej stanice. Šanca, že mačiatko z týchto zdrojov vylučuje FECV, je vysoké. Existuje tiež druhý zdroj expozície FECV, ktorý nevyžaduje kontakt mačky s mačkou. Je známe, že FECV sa môže preniesť z jednej mačky na druhú prostredníctvom ľudského oblečenia. FECV je prítomný vo vysokých koncentráciách v prachu podstielky, najmä u mladých mačiek a mačiatok, a v prostredí môže prežiť mnoho dní. Preto je kontakt majiteľa s mladšími mačkami mimo domova ďalším zdrojom infekcie FECV.

Jedinečné aspekty FIP u starých mačiek: Skúsenosti s liečbou starých mačiek GS-441524 vedú k trom možným faktorom, ktoré by nás mali zaujímať: 1) chybne diagnostikovaná FIP, 2) existencia FIP v spojení s jednou alebo viacerými ďalšími poruchami bežnými u starnúcej mačky a 3) liečba FIP v súvislosti s oslabeným imunitným systémom.

Chybná diagnóza FIP: Pozorovania uskutočnené u mačiek liečených GS-441524 naznačujú, že FIP u starších mačiek je náchylnejšia na nesprávnu diagnózu a je ťažšie ju liečiť. Chybná diagnóza FIP u starých mačiek sa dá najlepšie vysvetliť jednoduchou pravdepodobnosťou. Napríklad v jednej štúdii sa zistilo, že FIP je najbežnejšou príčinou ochorenia chrbtice u mačiek mladších ako dva roky, zatiaľ čo rakovina bola najbežnejšou samostatnou poruchou vo vekovom rozmedzí 2 – 8 rokov [5]. Preto by prvou úvahou o poruche chrbtice u mladej mačky mala byť FIP, zatiaľ čo prvou úvahou u starej mačky by mala byť rakovina. Výskyt mnohých typov rakoviny, ktorá nie je vyvolaná retrovírusom, tiež stúpa, počnúc vekom okolo 7-9 rokov, a predstavuje asi jednu tretinu úmrtí starých mačiek. Chronické ochorenie obličiek sa tiež začína klinicky prejavovať približne v rovnakom veku a predstavuje asi jednu tretinu úmrtí starých mačiek. Medzi zostávajúce úmrtia starých mačiek patrí cukrovka a hypertyreóza a početné muskuloskeletálne, kardiovaskulárne, neurologické a gastrointestinálne poruchy. Staré mačky, rovnako ako starí ľudia, majú sklon k zníženiu imunitnej funkcie, čo sa často prejavuje zvýšením hladín sérového imunoglobulínu a chorobami spojenými s relatívnou imunodeficienciou a autoimunitou. Klinické a laboratórne príznaky týchto porúch starnutia často napodobňujú príznaky FIP, ale pravdepodobnosť, že starnúce mačky budú mať FIP, je oveľa nižšia ako u týchto iných stavov. Naopak, pravdepodobnosť výskytu mladej mačky s klinickými a laboratórnymi znakmi kompatibilnými s FIP, ktorá má FIP, je oveľa vyššia ako u starej mačky s podobnými nálezmi.

FIP ako sekundárne ochorenie: Druhý scenár je bežnejší u mnohých starých mačiek s FIP trpiacich inými vážnymi chorobnými stavmi. Chronické zlyhanie obličiek je najbežnejším z týchto základných stavov, pričom rakoviny ako lymfóm sú menej časté. Staršie mačky tiež trpia starnutím imunitného systému, čo vedie k stavu relatívnej imunodeficiencie, čo je ďalším predisponujúcim faktorom pre FIP.

FIP a imunodeficiencia v dôsledku starnutia: Imunitný systém je citlivý na nepriaznivé účinky starnutia u všetkých druhov zvierat, vrátane mačiek [6, 7]. Pokles imunitnej funkcie u starnúcich mačiek je spojený so zmenami v populáciách B a T lymfocytov a zvýšenými hladinami nešpecifického imunoglobulínu. Preto majú staré mačky často vyššiu hladinu sérových bielkovín a globulínu, ako je bežné. Zvýšenie celkových hladín sérových bielkovín a globulínov u mladších mačiek sa často považuje za príznaky FIP, zatiaľ čo ich diagnostická hodnota u starších mačiek je menej významná.

Relatívna imunodeficiencia spôsobená starnutím sťažuje boj s novými infekciami a staršími infekciami, ktoré zostávajú v tele skryté alebo latentné po celé desaťročia. Najlepšie študované príklady vplyvu starnutia na odolnosť voči novým a latentným infekciám pochádzajú od ľudí. Úmrtia na COVID-19 u starých ľudí s komplikujúcimi chorobami, ako je cukrovka a chronické ochorenie pľúc, sú najlepším príkladom vplyvu starnutia a chronických degeneratívnych chorôb na odolnosť voči infekčným činiteľom. Je dobre známe, že tuberkulóza zostáva latentne v pľúcnych lymfatických uzlinách po celé desaťročia pred opätovnou aktiváciou. Preto je TBC osobitným problémom u ľudí v zariadeniach pre seniorov a u jedincov liečených na autoimunitné poruchy pomocou inhibítorov cytokínov. Existujú tiež náznaky, že FIP môže u niektorých mačiek existovať v subklinickom stave mesiace až roky, kým sa klinicky prejaví. Existujú aj prípady mačiek, ktoré žijú celý život v bytovej izolácii, kým sa u nich v starobe vyvinie FIP.

Záver: FIP u starých mačiek je našťastie neobvyklá, ale má jedinečné vlastnosti, ktoré ovplyvňujú diagnostiku a liečbu. Je potrebné venovať osobitnú pozornosť verifikácii diagnózy FIP a identifikácii ďalších zdravotných faktorov, ktoré buď predisponujú k FIP, alebo komplikujú jej úspešnú liečbu. U starších mačiek je to veľká diagnostická výzva a liečbu sťažujú ďalšie degeneratívne poruchy bežné pre túto vekovú skupinu. Miera vyliečenia FIP, ktorá je u mladých mačiek vyššia ako 80%, nie je u starých mačiek taká vysoká.

Referencie

  1. Pedersen NC, Liu H, Gandolfi B, Lyons LA. The influence of age and genetics on natural
    resistance to experimentally induced feline infectious peritonitis. Vet Immunol Immunopathol.
    2014, 162(1-2):33-40.
  2. Pedersen NC. Feline infectious peritonitis. Something old, something new. Feline
    Practice. 1976, 6:42-51.
  3. FIP Warriors CZ/SK. 2021. Statistics on FIP treatment in the Czech & Slovak Republics.
    https://www.fipwarriors.eu/en/stats/.
  4. Pedersen NC. Virologic and immunologic aspects of feline infectious peritonitis virus infection.
    Adv Exp Med Biol. 1987, 218:529-50.
  5. Marioni-Henry K, Vite CH, Newton AL, Van Winkle TJ. Prevalence of diseases of
    the spinal cord of cats. Journal Veterinary Internal Medicine, 2004, 18, 851-58.
  6. Day MJ. Ageing, immunosenescence and inflammageing in the dog and cat. J Comp
    Pathol. 2010, 142 Suppl 1:S60-9.
  7. Cornell Feline Health Center. The Special Needs of the Senior Cat. 2016.
    https://www.vet.cornell.edu/departments-centers-and-institutes/cornell-feline-healthcenter/health-information/feline-health-topics/special-needs-senior-cat
Publikované

Infekcia FIP a imunita

Pôvodný článok: FIP infection and immunity (2010)

Imunita voči infekcii vírusom FIP (FIPV) je fascinujúca téma z viacerých dôvodov. Po prvé sa zdá, že humorálna imunita nie je dôležitá pri ochrane, ale môže sa skutočne podieľať na priebehu choroby. Po druhé, ochranná imunita sa zdá byť do značnej miery sprostredkovaná bunkami a môže byť infekčného – „premoničného“ typu. Po tretie, typ a sila imunity zrejme určuje formu, akú bude mať infekcia FIPV[1]. Existuje dôvodný predpoklad, že silná humorálna (nešpecifická) imunita s veľmi slabou alebo neexistujúcou bunkovou imunitou povedie k efúznej FIP, humorálna imunita so strednou bunkovou imunitou povedie k neefúznej FIP a humorálna imunita so silnou bunkovou imunitou zabráni ochoreniu. Aj keď ide hlavne o pracovné hypotézy, pre každú z nich existujú pomerne presvedčivé dôkazy[2].

Protilátky proti antigénom FIPV sa zúčastňujú na dvoch rôznych imunitných procesoch, z ktorých ani jeden nekoreluje s imunitou. Prvým procesom je hypersenzitívna reakcia typu Arthus zameraná na malé venuly, zatiaľ čo druhým procesom je protilátkami sprostredkované zvýšenie vírusovej absorpcie a replikácie makrofágmi. Všetky tri zložky reakcie typu Arthus, antigén, komplement a protilátka sú prítomné vo vysokých hladinách v léziách, najmä u mačiek s efúznou FIP. Arthus reakcie sú charakterizované vaskulitídou, opuchmi, migráciou zápalových buniek a nekrózou. Protilátkami sprostredkované vystupňovanie ochorenia bolo popísané už Pedersenom a Boylom. Zistili, že výskyt protilátok a príznaky choroby boli vždy úzko spojené. U séronegatívnych (naivných) mačiek sa vyvinuli najskoršie príznaky FIP v priebehu 10-16 dní alebo viac po experimentálnej infekcii a načasovanie ochorenia sa vždy zhodovalo s výskytom protilátok. Zdravé mačky pozitívne na protilátky FCoV (t.j. boli vystavené FECV) boli potom vystavené pôsobeniu FIPV. Neskôr sa potvrdilo, že fenomén protilátkami sprostredkovaného vzostupu choroby zahŕňa protilátky proti špecifickým epitopom na spike proteíne; tieto protilátky tiež fungovali ako neutralizačné protilátky in vitro. Infekcia makrofágov in vitro sa výrazne zvýšila pridaním imunitného séra. To viedlo k prijateľnej teórii, v ktorej boli vírusové častice potiahnuté protilátkou a komplementom absorbované cez fc receptory na makrofágoch procesom endocytózy[3]. Takto sa FIPV dostáva do hostiteľskej bunky tohto momentu sa vírus šíri do ďalších miest tela migráciou makrofágov. Protilátkou sprostredkované zosilnenie infarktu makrofágov sa javí ako sérotypovo špecifické, t.j. protilátka voči FIPV sérotypu II zvyšuje iba makrofágovú infekciu FIPV sérotypu II[4].

Protilátkami sprostredkovaná imunopatogenéza pri efúznej FIP a úloha makrofágov pri chorobe sa javia podobné tým, ktoré sú opísané pri syndróme hemoragického šoku Dengue (Halstead, 1979). Charakteristickým znakom syndrómu šokového ochorenia Dengue a efúznej FIP je reakcia typu Arthus. Vírusom naložené makrofágy, vírusové častice a vírusové proteíny sa hromadia okolo malých žiliek. Tieto lokalizované zdroje antigénov, ako aj antigény v krvi, môžu komplementárne reagovať a vytvárať imunokomplexy. V dôsledku toho sa imunitné komplexy ukladajú okolo malých venúl a spúšťajú uvoľňovanie špecifických makrofágových faktorov, ktoré spôsobujú poškodenie tkaniva. Paltrinieri a kol. (1998) tiež demonštrovali, že lézie FIP obsahovali veľa vírusom infikovaných makrofágov, a že extracelulárne vírusové antigény boli detegovateľné v ohniskách spolu s nekrózou. Nekróza je jedným z charakteristických znakov vaskulitídy typu Arthus[5].

Aj keď sa na poli protilátkami sprostredkovaného potencovania FIP urobilo veľa práce, pri prirodzene sa vyskytujúcej FIP môže mať iný charakter, ako v laboratóriu. Tento jav bol popísaný hlavne medzi určitými izolátmi FCoV a neznámymi kmeňmi FECV. Všeobecne sa ukazuje, že čím virulentnejší je izolát FIPV, tým je pravdepodobnejšie, že bude odpovedať na zosilnenie protilátok (Pedersen, 2009). Ak humorálna imunita nechráni mačky pred virulentnými kmeňmi FIPV, aká je potom povaha imunity voči FIPV? Predpokladá sa, že imunita voči FIPV je do značnej miery sprostredkovaná bunkami. Dôvody tohto predpokladu zahŕňajú:

  • Neefúzna forma FIP pripomína tuberkulózu a hlboké mykotické infekcie ľudí a zvierat a je známe, že imunita voči týmto infekciám zahŕňa predovšetkým bunkové mechanizmy
  • Lézie suchej FIP pripomínajú hypersenzitívne reakcie typu IV s centrálnymi makrofágmi obsahujúcimi relatívne malé množstvo vírusu a obklopenými hustými infiltrátmi plazmatických buniek a CD4+ lymfocytov, zatiaľ čo pyogranulómy vlhkej FIP sú agregáty makrofágov naplnených vírusom a obklopené hlavne neutrofilmi a edém.
  • Klinický výskyt FIP ​​sa môže výrazne zvýšiť súbežnou infekciou FeLV. Infekcia FeLV je silným supresorom bunkovej imunity a humorálnej imunity sprostredkovanej T-lymfocytmi.
  • Imunita voči FIP sa nemôže prenášať pasívne hyperimunným sérom bez ohľadu na to, či sa sérum odoberá mačkám infikovaným FECV alebo mačkám, ktoré prežili expozíciu FIPV.
  • Reakcia precitlivelosti oneskoreného typu na antigény FIP môže byť vyvolaná v spojení s mačkami imúnnymi proti FIP a lymfocyty periférnej krvi získaných mačiek reagujú in vitro na antigén FIPV.
  • Je známe, že mačky sú nosičmi FIPV vo forme latentnej alebo skrytej infekcie a túto infekciu je možné znovu aktivovať infikovaním takýchto nosičov FeLV, ale nie metylprednizolónacetátom[6].

Je známa existencia stavu nosiča druhého typu pri infekciách, ako je tuberkulóza, blastomykóza, histoplazmóza a kokcidioidomykóza, a imunita sa v týchto situáciách udržuje pretrvávaním malého počtu organizmov v mezenterických alebo bronchiálnych lymfatických uzlinách. Tento typ imunity, ktorý sa nazýva „premoničná“ (intuitívna) alebo infekčná imunita, pretrváva iba dovtedy, kým intracelulárne patogény pretrvávajú v reaktivovateľnej forme (Pedersen, 1987). Rovnaký jav bol pravdepodobne pozorovaný u mačiek imunizovaných živým FIPV s modifikovanou virulenciou. Imunizované mačky ani po štyroch mesiacoch nevykazovali žiadne vonkajšie príznaky choroby, ak boli vystavené virulentnému FIPV, ale histologicky boli potvrdené zvyškové lézie FIP[7].

DeGroot-Mijnes a kol. (2005) predložili jednotný koncept reakcií T-lymfocytov pri FIP. Postulovali, že vírusom indukované vyčerpanie T-lymfocytov a antivírusová odpoveď T-lymfocytov sú protichodné sily a že účinnosť včasných reakcií T-lymfocytov kriticky určuje výsledok infekcie. Ak vírus vyhrá, dôjde k FIP, zatiaľ čo v prípade víťazstva hostiteľa sa nevyvinie žiadna choroba. Pozorovali konzistentný nárast hladín vírusovej RNA v krvi mačiek s FIP v konečnom štádiu, čo naznačuje, že smrteľné ochorenie priamo súvisí so stratou imunitnej kontroly a nekontrolovanou cirkulárnou replikáciou. Paltrinieri a kol. (1998) analyzovali lymfocytové podskupiny CD5, CD4, CD8, CD21 markerov prietokovou cytometriou [8]. Mačky, ktoré boli nedávno infikované FECV, u ktorých sa nevyvinula FIP, vykazovali stredný nárast T-lymfocytov. Mačky infikované FECV s vysokou prevalenciou FIP vykazovali mierny a pretrvávajúci pokles podskupín T-lymfocytov, zatiaľ čo mačky s FIP mali výrazný pokles vo všetkých podskupinách lymfocytov. Samozrejme sa dá s použitím prístupu o tom, či bolo skôr kura alebo vajce, tvrdiť, že o výsledku rozhoduje úroveň virémie [9].

Zdá sa, že genetické aj hostiteľské faktory majú silný vplyv na odolnosť alebo náchylnosť na prirodzene sa vyskytujúcu FIPV. Štúdie FIP na mnohých čistokrvných perzských chovateľských staniciach preukázali, že náchylnosť je dedičná a má asi 50% podiel na výskyte choroby [10]. Addie a kol. (2004) sa pokúsili spojiť náchylnosť na ochorenie s určitýmy alelami v géne DRB mačacieho MHC (mačací leukocytový antigén alebo FLA). Ukázalo sa, že jednotlivé mačky majú medzi dvoma a šiestimi alelami FLA-DRB, ale zdá sa, že žiadna špecifická alela nesúvisí ani s vývojom FIP, rezistenciou na FCoV všeobecne, ani so stavom nosiča FECV. Toto však bola iba pilotná štúdia s obmedzeným počtom mačiek alebo malým rozsahom štúdie, aby sa mohlo dospieť k záveru, že genetické rozdiely v komplexe FLA nie sú súčasťou FIP. Bolo reportované, že mačky, u ktorých sa vyvinula FIP po prirodzenej expozícii FCoV, mali významne vyššiu mieru vírusovej replikácie alebo zníženú kapacitu na klírens vírusu ako mačky, ktoré vírusu boli vystavené, ale FIP sa nevyvinula; čo naznačuje faktor hostiteľa [11].

Referencie

  1.  Kipar, A et al (2006) FCoV infection: cats with FIP exhibit significantly higher viral loads than healthy infected cats. JFMS 8:69-72
  2. ↑ Benetka, V et al (2006) M gene analysis of atypical strains of feline and canine coronavirus circulating in an Austrian animal shelter. Vet Rec 159:170-174
  3. ↑ Olsen CW et al (1992) Monoclonal antibodies to the spike protein of feline infectious peritonitis virus mediate antibody-dependent enhancement of infection of feline macrophages. J Virol 66:956-965
  4. ↑ Motokawa K et al (1996) Comparison of the amino acid sequence and phylogenetic analysis of the peplomer, integral membrane and nucleocaspid proteins of feline, canine and porcine cornaviruses. Microbiol Immunol 40:425-433
  5. ↑ Lin, CN et al (2009) Field strain feline coronaviruses with small deletions in ORF7b
  6. ↑ Dr Addie.com
  7. ↑ Pedersen NC (1976) Feline infectious peritonitis. Something old, something new. Feline Practise6:42-51
  8. ↑ de Groot RJ & Horzinek MC (1995) Feline Infectious Peritonitis. In: Siddell, SG ed. The Coronaviridae: a review of coronaviruses and toroviruses. New York, Plenum Press pp:294
  9. ↑ Pedersen NC et al (1981) Infection studies in kittens utilising feline infectious peritonitis virus propogated in cell culture. Am J Vet Res 42:363-367
  10. ↑ Martin ML (1985) Coronavirus enteritis and a recent outbreak following modified live virus vaccination. Compend Cont Educ Pract VetItalic text 7:1012-1017
  11. ↑ Paltrinieri, S et al (1998) Some aspects of humoral and cellular immunity in naturally occurring feline infectious peritonitis. Vet Immunol Immunopathol 65:205-220
Publikované

Účinnosť a bezpečnosť nukleozidového analógu GS-441524 pri liečbe mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou mačacou infekčnou peritonitídou

13.2.2019, Journal of Feline Medicine and Surgery; Preklad 10.2.2021
Pôvodný článok: Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis
Niels C Pedersen, Michel Perron, Michael Bannasch, Elizabeth Montgomery, Eisuke Murakami, Molly Liepnieks, and Hongwei Liu

Abstrakt

Ciele

Cieľom tejto štúdie bolo zistiť bezpečnosť a účinnosť nukleozidového analógu GS-441524 pre mačky trpiace rôznymi formami prirodzene získanej infekčnej peritonitídy mačiek (FIP).

Metódy

Mačky boli vo veku od 3,4 do 73 mesiacov (priemerne 13,6 mesiaca); 26 mačiek malo vlhkú alebo zmiešanú FIP, 5 suchú formu FIP. Mačky so závažnou neurologickou a okulárnou FIP neboli do štúdie prijaté. Skupina začala s GS-441524 v dávke 2,0 mg/kg SC q24h po dobu najmenej 12 týždňov, ktorá sa zvyšovala, keď to bolo indikované, na 4,0 mg/kg SC q24h.

Výsledky

Štyri z 31 mačiek, ktoré mali ťažkú formu ochorenia, uhynuli alebo boli eutanizované do 2-5 dní a piata mačka po 26 dňoch. Zvyšných 26 mačiek dokončilo plánovaných 12 alebo viac týždňov liečby. Osemnásť z týchto 26 mačiek zostáva zdravých v čase publikácie (OnlineFirst, február 2019) po jednom kole liečby, zatiaľ čo osem ďalších utrpelo relapsy choroby v priebehu 3–84 dní. Šesť z relapsov bolo neneurologických a dva neurologické. Tri z ôsmich ralapsujuúcich mačiek boli liečené opäť rovnakou dávkou, zatiaľ čo piatim mačkám bola dávka zvýšená z 2,0 na 4,0 mg/kg každých 24 hodín. Päť mačiek liečených druhýkrát vyššou dávkou, vrátane jednej s neurologickým ochorením, reagovalo dobre a v čase publikácie boli zdravé. Jedna z troch mačiek znovu liečených pôvodnou nižšou dávkou však mala relaps s neurologickým ochorením a bola eutanizovaná, zatiaľ čo dve zostávajúce mačky reagovali priaznivo, ale došlo k druhému relapsu. Tieto dve mačky boli úspešne liečené tretíkrát pri vyššej dávke, čo vo výsledku viedlo k 25 dlhodobo preživším mačkám. Jedna z 25 úspešne liečených mačiek bola následne eutanizovaná z dôvodu pravdepodobného nesúvisiaceho ochorenia srdca, zatiaľ čo 24 zostalo zdravých.

Záver a význam

GS-441524 sa ukázal ako bezpečný a efektívny pri liečbe FIP. Bola stanovená optimálna dávka 4,0 mg/kg SC q24h po dobu najmenej 12 týždňov.

Kľúčové slová: Nukleozidový analóg, GS-441524, infekčná peritonitída mačiek, FIP, klinická štúdia

Úvod

Lieky, ktoré inhibujú replikáciu vírusov, sa stali ústredným bodom zaujmu pri liečbe ľudských akútnych a chronických RNA a DNA infekcií. Vývoj záujmu o antivírusové lieky pre infekcie zvierat bol však oveľa pomalší. To platí najmä pre mačky, ktoré trpia niekoľkými chronickými vírusovými infekciami podobnými tým ľudským. Medzi infekčné činitele patrí vírus mačacej leukémie a imunodeficiencie (FeLV a FIV), mačací herpesvírus (FHV), virulentný systémový kalicivírus a koronavírus spôsobujúci mačaciu infekčnú peritonitídu (FIPV). Infekcie FeLV a FIV sa darí udržiavať pod kontrolou pomocou testovania, izolácie a/alebo očkovania. Ochorenie spojené s FHV bolo prvou mačacou vírusovou infekciou, kde bolo pre liečbu použité antivirotikum. Vysoko smrteľný systémový kalicivírus postihuje iba malý počet mačiek. Infekcia FIPV je najlepším kandidátom pre vývoj antivírusových liekov, pretože vakcíny sú neúčinné, prostredie s mnohými mačkami veľmi komplikuje prevenciu a zabíja 0,3–1,4% mačiek na celom svete.

Výskyt exotických chorôb, ako je ebola, stredovýchodný respiračný syndróm (MERS) a ťažký akútny respiračný syndróm (SARS) u ľudí, podnietil intenzívny výskum liekov, ktoré inhibujú replikáciu vírusu RNA. Jedným z najsľubnejších antivírusových liekov proti vznikajúcim RNA vírusom je proliečivo (prodrug) adenozínový nukleozidový monofosfát GS-5734 (Remdesivir; Gilead Sciences). GS-5734 preukázal účinnosť pri experimentálnej ebole u opíc rhesus a inhiboval epidemické aj zoonotické koronavírusy v tkanivových kultúrach a v myšacích infekčných modeloch. Tieto sľubné zistenia iniciovali výskum GS-5734 a jeho pôvodného nukleozidu GS-441524 proti FIPV infekcii mačiek. GS-441524 a GS-5734 majú porovnateľné hodnoty EC50 (1,0 uM) a CC50 (> 100 uM) proti FIPV v mačacích bunkách. Preto sa rozhodlo pre účely dalších testov s laboratórnymi mačkami zamerať na chemicky menej komplexný GS-441524. Farmakokinetická štúdia na dvoch laboratórnych mačkách preukázala trvalé a účinné plazmatické hladiny GS-441524 vyše 24 hodín po dávke podanej subkutánne (SC) alebo intravenózne (IV). Tieto výsledky sa rozšírili na 10 laboratórnych mačiek s experimentálne indukovanou brušnou efúznou mačacou infekčnou peritonitídou (FIP). Táto štúdia preukázala, že GS-441524 je vysoko účinný proti experimentálnej FIP, a otvorila tak cestu pre túto klinickú štúdiu.

Cieľom tejto štúdie bolo demonštrovať bezpečnosť a účinnosť GS-441524 pri liečbe mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou FIP. Malomolekulárne lieky, ako je GS-441524, majú hmotnosť <900 daltonov a veľkosť približne 1 nm a môžu ľahko prenikať do buniek a interagovať s kľúčovými cieľovými molekulami. Na rozdiel od už publikovaných látok alebo liekov, ktoré inhibujú FIPV brzdením bunkových procesov vírusmi využívaných pre ich replikáciu, malé molekuly, ako je GS-441524, interferujú priamo s vírusom kódovanými replikačnými procesmi.

Materiály a metódy

Príprava lieku

GS-441524 poskytla spoločnosť Gilead Sciences ako čistý a vysoko stabilný prášok, ktorý bol zriedený na koncentráciu 10 alebo 15 mg/ml v 5% etanole, 30% propylénglykole, 45% PEG 400, 20% vode (pH 1,5 s HCI ). Roztok bol umiestnený do sterilných 50 ml sklenených injekčných fľaštičiek, v ktorých sa pretrepal až do rozpustenia a potom sa podrobil sonickej vodnej kúpeli na 5 až 20 minút, kým nebol číry. Zriedený liek bol uložený do chladu a bol použitý v priebehu 3–4 týždňov.

Koncepcia štúdie

Táto štúdia prebiehala podľa protokolov 19336 a 19863 schválených Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat a Výborom pre hodnotenie klinických skúšok Komisie pre klinické skúšky veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice na Kalifornskej univerzite v Davise. Inštitucionálne pravidlá vylučujú použitie chorých mačiek z útulkov alebo z podobných zariadení, kvôli požiadavke legálneho vlastníctva/adopcie a zaobchádzania za špecifických podmienok so súhlasom majiteľa (doplňujúci materiál). Štúdia nezahŕňala kontrolnú skupinu, pretože neexistuje účinná zrovnávacia liečba. Nebola zahrnutá ani placebo skupina, pretože prípravné štúdie in vitro a in vivo naznačovali, že GS-441524 bude bezpečný a účinnejší ako žiadna liečba.

Výber prípadov a potvrdenie diagnózy

Mačky s FIP boli prijaté od majiteľov alebo ich veterinárnych lekárov, ktorí hľadali súčasné možnosti liečby alebo prístup k predchádzajúcej štúdii antivírusových liekov. Počiatočná diagnóza FIP bola založená predovšetkým na charakteristickej signalizácii, klinických anamnézach a príznakoch choroby, výsledkoch bežných laboratórnych testov a vyšetrení brušných alebo hrudných výpotkov. Definitívnejšia diagnóza založená na RT-PCR alebo imunohistochémii bola síce žiaduca, ale nebola nevyhnutnou podmienkou pre zaradenie. Mačky so zjavným očným alebo neurologickým ochorením boli vyradené kvôli pochybnostiam ohľadne schopnosti antivírusových liekov, vrátane GS-441524, preniknúť cez hematoencefalickú alebo hematookulárnu bariéru.

Do štúdie bolo prijatých 31 mačiek a ich majiteľov (tabuľka 1). Majitelia alebo zástupcovia 26 mačiek prišli na úvodnú liečbu priamo do UC Davis a päť majiteľov a ich mačky (CT59, CT73, CT76, CT78, CT80) boli v ošetrení miestneho veterinára. Mačky prítomné na UC Davis boli znovu prehodnotené, ich diagnóza FIP bola znovu potvrdená na základe signalizácie, klinickej anamnézy, fyzikálneho vyšetrenia, výsledkov predchádzajúcich laboratórnych testov a opakovania kompletného krvného obrazu (CBC), sérových bielkovín a analýz výpotkov. Hrudný alebo brušný výpotok u mačiek s vlhkou FIP bol potvrdený ako pozitívny na FIPV 7b RNA pomocou RT-PCR. Mačky so známkami neefúznej FIP boli ďalej testované brušnou a hrudnou ultrasonografiou na primárne lézie. Očné ochorenie bolo potvrdené oftalmologickou službou VMTH, UC Davis. Neurologický stav v prípadoch s možnými príznakmi ochorenia centrálneho nervového systému bol vyhodnocovaný neurologickou službou VMTH.

Tabuľka 1
Zoznam 31 mačiek zaradených do testovania vrátane laboratórneho označenia, mena mačky, plemena, klinickej formy infekčnej peritonitídy (FIP) a dátumu diagnózy

IDMenoDátum narodeniaPlemenoPohlaviePôvodDátum diagnózyForma FIP
CT52Luna9.1.2017SavannahFChovateľ24.4.2017Brušná efúzna
CT53Ice Bear2.8.2016DLHMCZáchranná skupina5.5.2017Brušná efúzna
CT54Charolett11.7.2016SiberianFChovateľ15.4.2017Brušná efúzna
CT55Dempsey26.6.2016DSHMCZáchranná skupina15.4.2017Brušná efúzna
CT56Mudsa1.7.2016DSHMCÚtulok12.5.2017Brušná efúzna
CT57Boone31.10.2016DSHFSZáchranná skupina8.5.2017Brušná efúzna
CT58Justyna17.4.2016RagdollFChovateľ25.5.2017Brušná efúzna
CT59Bubba11.4.2011DLHMCTúlavá10.4.2017Brušná neefúzna
CT60Joey25.7.2016DSHMCZáchranná skupina20.5.2017Brušná efúzna
CT61Hudson1.7.2016DSHMCZáchranná skupina29.5.2017Hrudná efúzna
CT62Luca10.3.2016DSHMCZáchranná skupina30.5.2017Brušná efúzna
CT63Bao Bao6.11.2016DSHMCZáchranná skupina3.6.2017Brušná efúzna
CT64Cedrick27.6.2016DSHMCZáchranná skupina22.5.2017Brušná neefúzna
CT65Mona14.3.2016Exotic SH/PersianFChovateľ11.6.2017Hrudná efúzna
CT66Squeekers7.6.2016DSHFSÚtulok14.6.2017Brušná efúzna
CT67Double2.3.2016RagdollFSChovateľ20.6.2017Brušná efúzna
CT68Tuckerman8.5.2016Maine CoonMCZáchranná skupina22.6.2017Brušná efúzna
CT69Danny16.6.2015SnowshoeMCÚtulok22.6.2017Hrudná efúzna
CT70Tolstoy1.8.2014DSHMCZáchranná skupina25.6.2017Brušná efúzna
CT71Amadeus29.6.2016DSHMCTúlavá20.6.2017Hrudná efúzna
CT72Bella25.2.2017British SHFChovateľ20.6.2017Brušná efúzna
CT73Siersha8.8.2015DSHFSÚtulok21.6.2017Brušná neefúzna
CT74Maive4.3.2017SiberianFSChovateľ7.7.2017Brušná efúzna
CT75Lucy31.3.2017DSHFZáchranná skupina10.7.2017Brušná efúzna
CT76Pie20.7.2016Exotic SHMChovateľ28.6.2017Brušná efúzna
CT77Mila15.3.2017SiberianFSChovateľ3.7.2017Brušná efúzna
CT78Polly1.3.2016DSHMCZáchranná skupina22.7.2017Brušná neefúzna
CT79Oona21.9.2016HimalayanFChovateľ18.7.2017Hrudná neefúzna
CT80Fezzik17.10.2016DLHMCTúlavá25.7.2017Brušná efúzna
CT81Jewelkat8.9.2016PersianFSChovateľ1.8.2017Hrudná efúzna
CT82Tiko8.4.2016DSHMCZáchranná skupina6.8.2017Brušná efúzna
F = samica nekastrovaná; FS = samica kastrovaná; M = samec nekastrovaný; MC = samec kastrovaný; DLH = domáca dlhosrstá; DSH = domáca krátkosrstá; SH = krátkosrstá;

Liečebný režim

Na základe predchádzajúcich experimentov s tkanivovými kultúrami a farmakokinetických štúdií na laboratórnych mačkách bol počiatočný dávkovací režim pre GS-441524 stanovený na 2,0 mg/kg SC q24h. Na základe skúseností s inhibítorom 3CL proteázy GC376 proti prirodzene sa vyskytujúcej FIP bola určená minimálna doba liečby 12 týždňov. Liečba sa predĺžila o jeden alebo viac týždňov u mačiek, ktoré stále mali abnormálne hodnoty sérových bielkovín. V neskorších štádiách štúdie sa dávka zvýšila z 2,0 na 4,0 mg/kg v prípadoch, keď sa liečba musela predĺžiť, alebo keď došlo k relapsu choroby. Majiteľom bola každé 4 týždne zasielaná nová dávka lieku vo forme vopred natiahnutých injekčných striekačiek Luer lock s objemom 1 alebo 3 ml s 1 palcovými ihlami Luer veľkosti 22G (0,7x25mm). Injekčné striekačky sa uložili do chladničky a pred aplikáciou sa zahriali na izbovú teplotu. Injekcie boli aplikované pozdĺž chrbtice od 2 cm za lopatkami do polovice bedrovej oblasti a do polovice vzdialenosti nadol na susedný hrudník a boky.

Monitorovanie počas počiatočného obdobia liečby

V čase vstupu do testovania bola u mačiek vysadená všetka liečba, ktorá nebola nevyhnutná – antibiotiká, kortikosteroidy, interferóny, pentoxifylín, nesteroidné protizápalové lieky, alebo lieky na tlmenie bolesti. Počas pobytu na UC Davis boli mačky každých 12 hodín monitorované z hľadiska teploty, chuti do jedla, aktivity, močenia a defekácie. Krv bola odoberaná v 1–3 denných intervaloch na vyhodnotenie hematokritu, celkového proteínu, bilirubínu, počtu bielych krviniek a diferenciálneho počtu bielych krviniek.

Vzorky ascitu sa odobrali na začiatku a potom sa odoberali v jedno alebo niekoľko denných intervaloch čo najdlhšie, ako to bolo možné, a testovali sa na úrovne prepisov FIPV 7b RNA kvantitatívnou (q) RT-PCR (IDEXX molekulárna diagnostika). Rezy tkaniva fixovaného formalínom od piatich pitvaných mačiek, boli podrobené imunohistochémii na proteín nukleokapsidy FIPV.

Monitorovanie počiatočnej a dlhodobej reakcie na liečbu

Mačky boli prepustené do domáceho ošetrenia, keď bola zaznamenaná významná priaznivá odpoveď na liečbu, zvyčajne do 3–5 dní. Počas tohto obdobia boli majitelia poučení, ako správne podávať subkutánne injekcie, a boli vyzvaní, aby pokračovali v denných záznamoch o telesnej teplote, aktivite, chuti do jedla, defekácii a močení a týždenných meraniach telesnej hmotnosti. CBC a sérový chemický panel boli robené v mesačných intervaloch miestnymi veterinármi alebo počas návštev VMTH. Bolo potrebné zaznamenávať a okamžite hlásiť akékoľvek abnormálne príznaky alebo správanie. Odôvodnená eutanázia bola zvyčajne vykonaná veterinárnym lekárom majiteľa alebo, ak to bolo možné, v UC Davis. Telá boli okamžite ochladené a zapečatené v plastových vreciach, a odoslané do 2 alebo menej dní v kontajneroch chladených ľadom na UC Davis expresnou poštou. Pitvy boli vykonané jedným z autorov (ML) v Anatomic Pathology Service, School of Veterinary Medicine, UC Davis. Bola rešpektovaná žiadosť majiteľa o konečnú dispozíciu tela.

Výsledky

Signalizácia a prezentácia choroby

Do štúdie bolo zaradených 31 mačiek vo veku od 3,4 do 73 mesiacov (priemerne 13,6 mesiacov) (tabuľka 1). Osemnásť mačiek boli domáce krátkosrsté a dlhosrsté , 13 mačiek predstavovalo zástupcov 10 rôznych plemien (tabuľka 1). Domáce mačky boli adoptované z organizácií na záchranu mačiek (n = 13), útulkov (n = 2) alebo to boli túlavé mačky z okolia (n = 3). Štúdia zahŕňala 14 samíc (7 nekastrovaných; 7 kastrovaných) a 17 samcov (1 nekastrovaný; 16 kastrovaných).

Dvadsaťšesť z 31 mačiek malo vlhkú FIP (6 hrudná, 20 brušná). Päť mačiek malo neefúznu FIP; štyri z nich (CT59, CT64, CT73, CT78) s ochorením lokalizovaným do brucha (mezenterické a ileo/cekálne/kolické lymfatické uzliny) a jedna (CT79) do hrudníka (pľúca, hilárne lymfatické uzliny) (tabuľka 1). Štyri ďalšie mačky vykazovali znaky skoršej suchej FIP, ktorá prešla do efúznej formy (CT57, CT65, CT67, CT71) (tabuľka 1). Hrubé príznaky očného ochorenia zodpovedajúce FIP sa potvrdili oftalmoskopickým vyšetrením u troch z 31 mačiek (CT56, CT65, CT71). Dve mačky (CT71, CT80) neochotne alebo už vôbec nedokázali skákať na vyvýšené miesta, čo naznačovalo neurologické postihnutie.

Výsledky liečby

Štyri mačky boli eutanizované (CT62, CT72, CT75) alebo uhynuli (CT56) počas prvých 2–5 dní kvôli závažnému ochoreniu a iným komplikáciám a piata mačka bola eutanizovaná (CT54) po 26 dňoch z dôvodu chýbajúcej reakcie na liečbu (obrázok 1). Liečba prebiehala bez prerušenia, s výnimkou troch mačiek, ktorým bol v 4. (mačka CT80) alebo 8. týždni (mačky CT53, CT71) poskytnutý dvojtýždňový oddych kvôli problémom s podávaním injekcií a kožným reakciám (obrázok 1). Mačka CT53 bola po druhom relapse liečená po dobu 8 a nie 12 týždňov z dôvodu zvýšenia močoviny v krvi a zvýšenia sérových hladín symetrického dimetylarginínu (SDMA).

Obrázok 1.
Časová škála liečby a klinický výsledok 31 mačiek, ktoré boli zaradené do klinickej štúdie GS-441524. Obdobie liečby je označené plnou čiarou (dávka 2 mg/kg) alebo prerušovanou čiarou (dávka 4 mg/kg). Hviezdičky označujú bod relapsu. Dátum ukončenia liečby pre mačky, ktoré dosiahli trvalú klinickú remisiu, je uvedený v zátvorkách. Časový bod a príčina smrti sú označené krížikom

Klinická reakcia 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby, bola dramatická. Horúčka zvyčajne ustúpila do 12–36 hodín (obrázok 2), súčasne s každodenným výrazným zvýšovaním chute do jedla, úrovne aktivity a prírastku hmotnosti. Brušné výpotky rýchlo vymizli počas 1-2 týždňov, počnúc asi 10.-14. dňom po zahájení liečby. Mačky s hrudným výpotkom zvyčajne vykazujúce dýchavičnosť, absolvovali u praktickych súkromných veterinárov odsatie pleurálnych výpotkov ešte pred príchodom na UC Davis. Zbytková dýchavičnosť a hrudný výpotok rýchlo reagovali na liečbu a po 7 dňoch už neboli vôbec viditeľné. Žltačka pomaly odznela v priebehu 2–4 týždňov, súčasne s poklesom hyperbilirubinémie. Známky očného ochorenia začali miznúť do 24-48 hodín a prestali byť zjavné navonok i pre oftalmoskopické vyšetrenie do 7–14 dní. V priebehu liečby začalo dochádzať k zmenšovaniu zväčšených mezenterických a ileo/cekálno/kolických lymfatických uzlín. Všetkých 26 mačiek vyzeralo podľa odhadov majiteľov navonok normálne alebo takmer normálne po 2 týždňoch liečby. Po 2 týždňoch liečby sa kládol dôraz na sledovanie niekoľkých parametrov krvných testov. Kľúčové hodnoty zahŕňali hematokrit, celkový počet bielych krviniek, absolútny počet lymfocytov, celkový sérový proteín, sérový globulín, sérový albumín a pomer albumín: globulín (A:G).

Obrázok 2.
Priemer (plná čiara) a 1 SD (smerodajná odchýlka) (čiarkovane) telesných teplôt počas prvých 5 dní liečby GS-441524. Normálny teplotný rozsah pre mačky je 37,7–39,1 °C (100–102,5 ° F). Teploty klesli do normálneho rozsahu do 12–36 hodín od začiatku liečby

Osemnásť z 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov neprerušenej primárnej liečby, nevyžadovalo žiadnu ďalšiu liečbu. Osem ďalších mačiek však utrpelo relapsy choroby v priebehu 3–84 dní (priemerne 23 dní) (obrázok 1). Táto skupina zahŕňala tri mačky, u ktorých došlo k dočasnému prerušeniu počiatočnej liečby (CT53, CT71, CT80), a päť mačiek (CT53, CT57, CT60, CT68, CT73), ktoré vyžadovali predĺženú primárnu liečbu (obrázok 1). Relapsy choroby u 2/8 mačiek (CT57, CT71) mali zjavne neurologický charakter s vysokou horúčkou a silnou zadnou ataxiou a nekoordináciou, zatiaľ čo relapsy choroby u zvyšných šiestich mačiek pozostávali hlavne z horúčky, anorexie a znízenej aktivity. Iba jedna mačka (CT60) mala pri relapse zjavný brušný výpotok. Jedna mačka (CT57) bola eutanizovaná 2 týždne po relapse s neurologickými príznakmi, ktoré nereagovali na druhé kolo liečby.

U ôsmich mačiek bolo rozhodnuté zvýšiť dávku GS-441524 z 2,0 na 4,0 mg/kg, buď z dôvodu predĺženia liečby (CT77, CT80), alebo z dôvodu jedného (CT60, CT68, CT71, CT73) alebo dvoch relapsov (CT53, CT63), alebo preto, že relaps mal neurologickú formu (CT71). Všetkých osem mačiek reagovalo pozitívne na režim zvýšeného dávkovania.

Celkovo 25/26 mačiek liečených 12 týždňov alebo dlhšie dosiahlo trvalú remisiu FIP, hoci jedna z nich následne zomrela na nesúvisiaci problém so srdcom (pozri „Pitevné nálezy“). Najdlhšie prežívajúce mačky v čase publikácie (OnlineFirst, február 2019) ukončili liečbu v auguste 2017 a najkratšie v máji 2018, všetky po ukončení pozorovacieho obdobia, v ktorom ešte mohlo dôjsť k relapsu (tj. 84 dní po ukončení liečby). 24 preživších mačiek bude starostlivo monitorovaných pre prípadný návrat príznakov ochorenia a budú sa pravidelne testovať na celkový pomer bielkovín, globulínu, albumínu a A:G počas prvého roka. Menej intenzívne monitorovanie sa bude vykonávať po zvyšok života mačiek. Majitelia boli upozornení, aby sa vyhli zbytočnému namáhaniu mačiek počas prvých 3 mesiacov, aj keď štyri mačky (CT52, CT58, CT65, CT79) a jeden kocúr (CT76) absolvovali bezproblémovú kastráciu.

Ukazovatele priaznivej reakcie na liečbu

Najjednoduchším dlhodobým meradlom účinnosti liečby bola telesná hmotnosť. K nárastu hmotnosti o 20–120% došlo počas a po liečbe, dokonca aj u mačiek, ktoré v čase diagnózy mali 1 rok alebo viac. Zdá, že výrazný rast sa prejavil aj u mladších mačiek, ako to nezávisle zaznamenali ich majitelia. Tieto výrazné zrýchlenia rastu po liečbe naznačili, že FIP bola u mnohých mačiek nejaký čas pred diagnózou subklinická a ovplyvnila ich rast. Pri sledovaní neskorších účinkov liečby a pri pozorovaní možných toxicít liekov sa osvedčili aj CBC (hematológia) a chemický profil (biochémia).

CBCs (Hematológia)

Mačky vykazovali zvýšený počet bielych krviniek, ktorý klesol na normálne hodnoty v priebehu prvých 2 týždňov liečby (obrázok 3a). Lymfopénia zaznamenaná v čase prijatia vymizla počas prvého týždňa liečby (obrázok 3b). Pri prijatí sa pozorovala mierna až stredne závažná anémia, čo sa prejavilo v hematokrite (PCV) (obrázok 4). Hematokrit sa vrátil na normálne hodnoty až po 6–8 týždňoch liečby. Absolútny celkový počet bielych krviniek a lymfocytov boli jedinými významnými hodnotami počas prvého týždňa liečby, zatiaľ čo PCV poskytol presnejší obraz postupu liečby počas prvých 8 týždňov.

Obrázok 3.
(a) Priemerný počet bielych krviniek so štandardnou odchýlkou u 26 mačiek, ktoré dokončili primárny liečebný režim 12 alebo viac týždňov. (b) Priemerný absolútny počet lymfocytov v krvi so štandardnou odchýlkou u 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby
Obrázok 4.
Hematokrit (PCV) so štandardnou odchýlkou pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby. Bodkovaná čiara naznačuje trend rastu PCV v priebehu času

Zmeny sérových bielkovín

Mačky s FIP často vykazovali vyššiu ako normálnu celkovú koncentráciu bielkovín v sére, vysokú hladinu sérového globulínu, nízku hladinu sérového albumínu a nízky pomer A:G (obrázky 5–7). Abnormálne hodnoty sérových bielkovín sa progresívne zlepšovali a dosiahli normálne hodnoty po 8–10 týždňoch liečby (obrázky 5–7). Hladina celkového proteínu bola najmenej informatívna, čo naznačuje nízka hodnota R2 (0,1883) trendovej spojnice (obrázok 5). Avšak 3 týždne po zahájení liečby došlo k dramatickému a prechodnému zvýšeniu celkových hladín proteínov (obrázok 5). Tento jav súvisel so zvýšením sérových globulínov (obrázok 6a) v čase rýchleho ústupu brušných výpotkov.

Obrázok 5.
Priemerné hladiny celkového proteínu v sére a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby
Obrázok 6.
(a) Priemerné hladiny sérového globulínu a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby. (b) Priemerné hladiny sérového albumínu a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby
Obrázok 7.
Priemerné pomery albumínu:globulínu (A/G) a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby

Plazmatické hladiny globulínu stúpali počas prvých 3 týždňov liečby, dosiahli vrchol a potom pomaly klesali na maximálnu referenčnú hodnotu 4,5 g/dl alebo nižšiu do 9. týždňa (obrázok 6a). Aj keď sa zdá, že hladiny globulínu v priebehu času reflektovali stav liečby, nízka hodnota R2 (0,3621) ukázala, že sa jedná o menej spoľahlivý ukazovateľ pokroku v liečbe.

Hladiny albumínu v sére 26 mačiek liečených najmenej 12 týždňov boli v čase zahájenia liečby zvyčajne nízke (⩽3,2 g/dl) (obrázok 6b). Hladiny albumínu sa potom pomaly zvyšovali a dosiahli normálnu úroveň po 8 týždňoch. Trendová čiara tohto nárastu albumínu mala vysokú hodnotu R2 (0,79), vďaka čomu boli hladiny sérového albumínu, ako aj PCV, dobrým indikátorom pokroku v liečbe. Ako sa očakávalo, pomer A:G vykazoval v priebehu času rovnako silnú trendovú líniu a okolo 8. týždňa liečby úroveň presiahla hodnotu 0,70 (obrázok 7).

Pokles hladiny vírusovej RNA v bunkách z ascitickej tekutiny v spojitosti s liečbou

Počas prvých 2–9 dní antivírusovej liečby sa odoberali od ôsmich mačiek sekvenčné vzorky ascitu a testovali sa na hladiny vírusovej RNA pomocou qRT-PCR (tabuľka 2). Najspoľahlivejším zdrojom FIPV RNA boli celé výpotky alebo ich bunkové frakcie. U 7/8 mačiek hladiny vírusovej RNA poklesli do 2-5 dní, často na nedetekovateľné hodnoty. U jednej mačky (CT54) sa neprejavil významný pokles hladín vírusovej RNA ani v priebehu 9 dní.

Tabuľka 2
Úrovne prepisov RNA vírusu mačacej infekčnej peritonitídy 7b v celých ascitoch alebo v bunkovej frakcii ascitickej tekutiny počas počiatočnej liečby GS-441524

ID vzorkyDni liečbyTyp vzorkyKópie vírusovej RNA/ml
CT520Ascites9.44 × 104
3AscitesNezistiteľné
CT540Ascites8.49 × 105
2Ascites6.97 × 104
4Ascites2.44 × 103
7Ascites2.07 × 103
9Ascites6.46 × 104
CT620Ascites5.96 × 103
2Ascites1.53 × 103
8AscitesNezistiteľné
CT740Bunky6.51 × 106
2Bunky3.39 × 105
CT750Bunky9.08 × 106
3Bunky4.75 × 105
4Bunky2.50 × 105
CT770Ascites5.47 × 104
2Ascites3.93 × 103
CT800Ascites4.10 × 103
2AscitesNezistiteľné
CT820Ascites1.13 × 104
5AscitesNezistiteľné

Vedľajšie účinky pozorované počas liečby a po liečbe

Ohraničené reakcie v mieste vpichu. Boli pozorované dva typy reakcií v mieste vpichu, a či boli spôsobené liekom, riedidlom alebo obomi, nebolo zistené. Okamžité reakcie na bolesť sa prejavovali vokalizáciou, občasným vrčaním a posturálnymi zmenami trvajúcimi 30–60 s. Tieto počiatočné reakcie sa časom zmierňovali, pretože majitelia sa stávali viac zručnými v podávaní injekcií a mačky sa tejto rutine postupne prispôsobovali. U šestnástich z 26 liečených mačiek sa prejavili reakcie v mieste vpichu (tabuľka 3). Reakcie boli zjavné najčastejšie počas prvých 4 týždňov a progredovali do otvorených rán iba u 7/16 mačiek. Ulcerácie sa zahojili do 2 týždňov zastrihnutím okolitých chlpov a jemným vyčistením rany vatovým tampónom namočeným v jednom diele peroxidu vodíka pre domácnosť a v dvoch dieloch vody dvakrát denne. Iba tri mačky mali znateľné jazvy v miestach vpichu.

Tabuľka 3
Reakcie v mieste vpichu u 16 z 26 mačiek liečených GS-441524 po dobu 12 týždňov alebo dlhšie

ID mačkyPovrchové lézieOtvorené ranyJazvy
CT53310
CT58100
CT60002
CT61500
CT63220
CT64101
CT65911
CT66320
CT68400
CT71510
CT73710
CT74310
CT761000
CT78700
CT79200
CT82200
Väčšina lézií bola povrchová a zahŕňala epidermis a nevyžadovala žiadnu liečbu, zatiaľ čo u niektorých došlo k progresii do otvorených rán, ktoré sa uzdravili do 2 týždňov topickou liečbou. Niektoré reakcie zanechali malé trvalé jazvy

Systémové liekové reakcie. Liečba GS-441524 v celkovom období 12–30 týždňov bola pozoruhodne bezpečná. V hodnotách CBC neboli pozorované žiadne dlhodobé abnormality (obrázky 3 a 4). Testy funkcie pečene a obličiek a hladiny amylázy/lipázy zostali počas liečby a po liečbe normálne (doplňujúce obrázky S1 – S3). Jedinou výnimkou bola mačka CT53, u ktorej došlo k progresívnemu zvýšeniu močoviny v krvi (BUN) na 35 mg/dl (referenčný interval [RI] 16–37 µg/dl) a k náhlemu zvýšeniu SDMA (20 µg/dl) (RI 0-14 µg/dl) po 8 týždňoch v treťom kole liečby v režime zvýšenej dávky 4 mg/kg. Aj keď mali tieto príznaky stále miernu povahu, bolo pre istotu rozhodnuté ukončiť liečbu. Tieto abnormality pri testovaní o 1 mesiac neskôr už neboli prítomné a mačka je momentálne v remisii choroby.

Pitevné nálezy

Štyri mačky (CT56, CT62, CT72, CT75) boli eutanizované alebo uhynuli do 2–5 dní od zaradenia do štúdie a pitvy boli vykonané u všetkých okrem mačky CT75. Piata mačka (mačka CT54) bola eutanizovaná po 26 dňoch liečby. Všetkých päť týchto mačiek malo závažné brušné efúzne ochorenie. U mačky CT54 a CT56 sa pri pitve našli dôkazy o rozšírenej pyogranulomatóznej vaskulitíde zahŕňajúcej brušné vnútornosti, centrálny nervový systém a oči. U mačky CT56 došlo aj kompromitácii ileálnej steny v oblasti hustého infiltrátu a sekundárnej bakteriálnej sepse. Mačka CT72 mala ťažkú ​​pyogranulomatóznu vaskulitídu obmedzenú na brucho so stredne ťažkým až ťažkým periférnym edémom a mineralizáciou kôry nadobličiek. Mačka CT62 trpela ťažkou pyogranulomatóznou a fibrinosuppuratívnou peritonitídou, ktorú komplikovala akútna perforácia žalúdka spojená s rastlinným materiálom a intralezionálnymi baktériami svedčiacimi o sepse. Mačka CT75 vykazovala chronickú formu FIP charakterizovanú silným spomalením rastu, masívne nízkym obsahom bielkovín / nízkym obsahom buniek vo výpotku, zrýchlenou činnosťou srdca svedčiacou o poškodení srdcovej funkcie a stredne závažným periférnym edémom. Echokardiogram ukázal bilaterálne zväčšenie predsiení, ale nijaký náznak primárneho srdcového ochorenia. Zdalo sa, že mačka reagovala na GS-441524 a bola prepustená. Mačka upadla o 2 dni neskôr do šoku a bola eutanizovaná bez pitvy.

V čase pitvy mačiek CT56, CT72 a CT75 pri použití qRT-PCR nebol vírus FIPV detekovaný, hoci vzorky ascitu pred liečbou boli pozitívne. Ascites z mačky CT54 vykazoval pozitívny výsledok qRT-PCR počas celej liečby (tabuľka 2) a tkanivá boli v čase pitvy stále imunohistochemicky pozitívne.

Po úspešnom absolvovaní jedného alebo viacerých kôl liečby boli eutanizované aj ďalšie dve mačky. Mačka CT57 bola po jednom kole liečby normálna, ale o 2 týždne neskôr došlo k relapsu so závažnými neurologickými príznakmi. Mačka nereagovala na opakovanú liečbu a bola usmrtená. Lézie typické pre FIP sa našli v mozgu a bruchu, ale boli negatívne na FIPV určený imunohistochémiou pre nukleokapsidový proteín alebo na 7b RNA pomocou qRT-PCR. Mačka CT80 bola úspešne liečená na efúznu brušnú FIP, ale o 4 týždne neskôr sa u nej objavili silné bolesti zadných nôh a krížov. Zistilo sa, že mačka mala výrazné zhrubnutie steny ľavej komory a septa, ktoré spôsobilo vážne zúženie komory (obrázok 8). Mikroskopický vzhľad steny ľavej srdcovej komory bol typický pre vrodenú mačaciu hypertrofickú kardiomyopatiu (HCM). V brušnej dutine, na hrudníku, v očiach, v mozgu alebo v chrbtici sa nezistili žiadne hrubé ani mikroskopické lézie FIP a qRT-PCR nedetekoval FIPV antigén a ani RNA FIPV.

Obrázok 8.
Prierez srdcom mačky CT80 vykazujúci extrémnu hypertrofiu steny ľavej komory a septa a extrémne zúženie komory

Diskusia

GS-441524 je za posledné 2-3 roky po GC376 druhým testovaným cieleným antivírusovým liekom pre liečbu FIP. Tieto dva lieky inhibujú vírusovú replikáciu dvoma veľmi odlišnými spôsobmi, buď ukončením vírusovej RNA transkripcie alebo blokovaním štiepenia vírusového polyproteínu. Oba procesy sú dobre známym cieľom pre liečbu niektorých ľudských vírusových ochorení. Kľúčovou otázkou je porovnanie liečby nukleozidovým analógom s liečbou inhibítorom vírusovej proteázy. Tieto dva lieky poskytli prakticky identické výsledky v štúdiách na tkanivových kultúrach a experimentálne infikovaných mačkách. Účinnosť proti prirodzene sa vyskytujúcej FIP sa však javila pri GS-441524 vyššia ako pri GC376. Šesť z 20 mačiek liečených GC376 zostáva dodnes v remisii (Pedersen NC, nepublikované údaje, 2018) v porovnaní s 25/31 mačkami liečenými GS-441524. Ochorenia, ktoré nereagovali na opakovanú liečbu, sa vyskytli u 14/20 mačiek s GC376 ale iba u jednej mačky liečenej GS-441524. 8 zo 14 relapsov spojených s GC376 malo neurologický charakter, v porovnaní s 2/8 relapsmi s GS-441524. Jeden z dvoch neurologických relapsov u mačiek liečených GS-441524 reagoval na opakovanú liečbu vyššou dávkou, zatiaľ čo neurologické relapsy s GC376, dokonca ani pri zvýšenej dávke, už neboli liečiteľné. Obidve liečby spôsobovali podobné reakcie v mieste vpichu. Obidva lieky sa javia ako pomerne bezpečné, hoci GC376 interferoval s vývojom trvalých zubov, keď sa podával mladším mačiatkam.

Aj keď sa zdá, že výsledky klinickej štúdie uprednostňujú GS-441524, niektoré rozdiely mohli byť ovplyvnené tým, ako boli tieto dva lieky podávané. Účinnosť GC376 sa mohla zlepšiť, ak by bolo všetkých 20 mačiek liečených bez prerušenia po dobu 12 týždňov, namiesto toho, aby boli liečené progresívne dlhšími obdobiami, začínajúcimi iba na 2 týždňoch. Päť zo šiestich mačiek vyliečených pomocou GC376 patrilo medzi sedem mačiek, ktoré boli liečené nepretržite po dobu 12 týždňov, zatiaľ čo bola vyliečená iba jedna z 13 mačiek liečených jedenkrát alebo viackrát po kratšiu dobu. Tieto kratšie doby trvania liečby boli nevyhnutné na stanovenie 12-týždňového obdobia použitého pre všetky mačky v tejto štúdii. Klinická štúdia GC376 okrem toho zahŕňala menej mačiek a bola limitovaná obmedzeným prísunom lieku, čo sťažilo testovanie ďalších dávkovacích režimov. Preto by sa mal GC376 pred akýmkoľvek konečným porovnaním ďalej študovať s použitím minimálne 12 týždňov s vyššou dávkou a väčším počtom mačiek. Bolo by tiež dôležité niekedy v budúcnosti vyhodnotiť obidva typy liekov v kombinácii, tak ako sa to robí pri HIV/AIDS a hepatitíde C.

V každej štúdii tohto typu treba počítať s predčasnými úmrtiami, ale ako by sa mali posudzovať pri analýze účinnosti? Päť predčasných úmrtí v tejto štúdii bolo zahrnutých do analýzy účinnosti GS-441524, ale boli vyradené v štúdii GC376. Pre zahrnutie úmrtí do štúdie je dôležité zistenie statusu vírusu v čase smrti. Vírusová RNA sa nezistila u troch pitvaných mačiek, ktoré uhynuli po 2–5 dňoch liečby s GS-441524, čo naznačuje, že liek bol účinný, ale choroba bola v príliš pokročilom štádiu. Nebolo to tak v prípade štvrtej pitvanej mačky, ktorá prežila 26 dní; hladiny vírusovej RNA počas celého obdobia liečby neklesli a príznaky choroby sa nezmiernili. Preto je možné, že táto mačka uhynula v dôsledku neúspešného zastavenia replikácie vírusu. Rezistencia na GS-5734 (Remdesivir), proliečivo GS-441524, bola spojená s mutáciami aminokyselín v RNA polymeráze a korekčnou exonukleázou v tkanivovými kultúrami propagovaných koronavírusoch. Či sa u tejto mačky vyskytla podobná rezistencia, bude ešte treba zistiť. Rezistencia na lieky bola pozorovaná u aj u jednej mačky v teste GC376. Našťastie žiadna z ďalších mačiek v súčasnej štúdii nevykazovala príznaky rezistencie na lieky. U budúcich mačiek, ktoré nereagujú vôbec alebo reagujú nedostatočne na primárnu alebo sekundárnu liečbu, je však potrebné túto možnosť vziať do úvahy.

Počiatočná dávka GS-441524 použitá v predloženej štúdii bola stanovená na základe predchádzajúcich farmakokinetických a experimentálnych infekčných štúdií s laboratórnymi mačkami. Tieto štúdie naznačili, že 2,0 a 5,0 mg/kg SC q24h po dobu 14 dní by boli rovnako účinné aj pri klinickej štúdii. Preto bola pre klinické testovanie zvolená dávka 2,0 mg/kg, pretože by to znížilo spotrebu lieku o 60%. Aj keď bolo toto rozhodnutie potvrdené u 18/26 mačiek, osem ďalších mačiek buď utrpelo relapsy choroby (dve dokonca dvarát), alebo si vyžiadali dlhšie trvanie liečby, aby sa kľúčové hodnoty krvi dostali späť do normálu. Preto bolo urobené rozhodnutie zvýšiť dávku GS-441524 z 2,0 mg/kg na 4,0 mg kg SC q24h u mačiek, u ktorých došlo k relapsu alebo vyžadovali predĺženú liečbu. Úspešnosť 4,0 mg/kg SC q24h u najmenej 12 takýchto mačiek, ako aj u jednej mačky s neurologickým ochorením, nás priviedla k záveru, že ide o účinnejšie dávkovanie a malo by sa stať základom pre budúcu liečbu.

Bolo dôležité sledovať jednoduché biologické ukazovatele pokroku v priebehu ⩾ 12 týždňovej liečby. Ako užitočné markery boli identifikované hladiny HCT (PCV), hladiny celkového proteínu v sére, globulínu a albumínu a pomer A:G. Na základe týchto parametrov sa ukázalo, že mačky sa po 6–10 týždňoch liečby ešte celkom nezotavili. Toto zistenie potvrdilo minimálne 12-týždňové trvanie liečby stanovené v predchádzajúcej klinickej štúdii GC376. Chronická anémia (anémia zápalu) postihuje 18–95% ľudí s akútnymi a chronickými infekciami a je normocytová/normochromická a nesúvisí s nedostatkom železa. Dobrým ukazovateľom aktivity ochorenia boli aj plazmatické hladiny albumínu, a je známe, že nízky albumín a nízky HCT (PCV) korešpondujú s výskytom chronického ochorenia. Hyperglobulinémia u mačiek s FIP bola klasifikovaná ako infekčná/zápalová a je spôsobená zvýšením vo všetkých triedach gama globulínov a variabilnými prírastkami vo frakcii alfa-2 globulínov. Výrazná tendencia mačiek s FIP k vysokej sérovej hladine globulínu a nízkej hladine albumínu robí z pomeru A:G obzvlášť dobrý indikátor aktivity ochorenia.

Očakávalo sa, že čistokrvné mačky nebudú rovnako dobre reagovať na liečbu z dôvodu geneticky oslabenej schopnosti imunologicky reagovať na FIPV, a že mladšie mačky s vlhkou FIP budú na liečbu reagovať najlepšie. V tejto štúdii však nakoniec čistokrvné mačky reagovali rovnako dobre ako obyčajné mačky, a plemená zastúpené mačkami v štúdii odrážali najpopulárnejšie súčasné plemená. Staršie mačky a mačky s čistou neefúznou FIP reagovali na liečbu GS-441524 rovnako dobre, ako mladé mačky a mačky s vlhkou FIP. Za predpokladu, že sa dá pomocou GS-441524 liečiť aj časť mačiek s očným a neurologickým ochorením, sa dá povedať, že by sa už žiadne prejavy FIP nemuseli považovať za neliečiteľné.

Bezpečnostný profil GS-441524 bol pôsobivý. Na základe CBC a sérových chemických hodnôt počas celkových liečebných období v trvaní od 12 do 30 týždňov sa až na jednu možnú výnimku nepozorovali žiadne významné systémové príznaky toxicity. Jedna mačka (CT53) mala mierny nárast BUN a SDMA v 8. týždni tretieho kola liečby a v rámci preventívnych opatrení si vynútila pozastavenie liečby. Na základe predchádzajúcich skúseností s GC376 boli obavy z účinku GS-441524 na vývoj trvalého chrupu. Tri mačky (CT52, CT74, CT77) v tejto štúdii boli vo veku 4 mesiacov alebo mladšie a stále mali juvenilný chrup a žiadna z nich nevykazovala žiadne následné zubnej abnormality. U GS-441524 sa pozorovali reakcie v mieste vpichu, ale ich počet bol pozoruhodne nízky a boli ľahko liečiteľné. Nezistilo sa, či je na vine liek, riedidlo alebo oboje. pH riedidla 1,5 bolo hlboko pod minimálnou hraničnou hodnotou 4,5 stanovenou FDA (Food and Drug Administration), avšak liečivá tohto typu sa ťažko rozpúštajú a stabilizujú pri fyziologicky priaznivejšom pH. Napriek tomu by sa malo vyhodnotiť viac fyziologických riedidiel.

Jedna mačka v štúdii (CT80) mala znepokojivé klinické príznaky. Aj keď mačka vykazovala efúznu brušnú FIP, mala aj dlhodobé príznaky nejasného zakrivenia zadnej končatiny, bolesti krížov, pravidelných epizód padania, neochoty skákať na vyššie miesta a nevysvetliteľných a prechodných zmien správania. Tieto príznaky viedli k liečbe mačky ešte dlho po zmiznutí brušného výpotku. Nakoniec sa prijalo rozhodnutie liečbu prerušiť a zistiť, či sa vrátia charakteristické príznaky FIP. Mačka bola nakoniec eutanizovaná a pri pitve bolo zistené, že má vrodený typ HCM a žiadne zvyškové lézie FIP alebo vírusovej RNA v akýchkoľvek tkanivách. Dilatačná kardiomyopatia bola hlásená u 17,6% ľudí infikovaných HIV pri chronickej antiretrovírusovej liečbe. Dospelo sa však k záveru, že príčinou srdcového ochorenia u tejto mačky nebol GS441524. Ochorenie srdca u tejto mačky bolo hypertrofické na rozdiel od dilatačnej formy pozorovanej u pacientov s HIV, a navyše je HCM u útulkových mačiek pomerne bežná.

Závery

Výsledky získané od 31 mačiek liečených GS-441524 prekonali všetky očakávania a naznačujú, že FIP, bez ohľadu na signalizáciu alebo formu ochorenia, je s použitím nukleozidových analógov liečiteľné ochorenie. Koncepcia štúdie a parametre liečby vyplývajúce z tohto obmedzeného klinického testovania budú dôležité pre ďalšie úsilie v komercializácii tohto alebo podobných liekov proti FIP.

Doplnkový materiál

Formulár súhlasu majiteľa

Obrázok S1. Priemerné hladiny pečeňových enzýmov (IU / L) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.
Obrázok S2. Priemerné hladiny lipázy a amylázy v sére (IU/L) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.
Obrázok S3. Priemerné hladiny BUN a kreatinínu u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Poďakovania

Ďakujeme pracovníkom Centra pre zdravie spoločenských zvierat za pomoc pri preprave liekov (Lyra Pineda-Nelson a Nancy Bei) a za prezentáciu údajov (Cynthia Echeverria). Sme vďační najmä mnohým majiteľom a 31 mačkám, ktoré sa zúčastnili emotívnej a náročnej cesty, ktorá predčila všetky očakávania. Sme vďační aj praktickým súkromným veterinárom, ktorí pomáhali s pravidelnými krvnými testami a boli tu pre nás a ich pacientov/majiteľov, keď to bolo potrebné.

Poznámky

Prijaté: 28. decembra 2018

Doplnkový materiál: K dispozícii sú nasledujúce súbory: Formulár súhlasu klienta.

Obrázok S1: Priemerné hladiny pečeňových enzýmov (IU / l) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Obrázok S2: Priemerné hladiny lipázy a amylázy v sére (IU / l) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Obrázok S3: Priemerné hladiny urey a kreatinínu v krvi u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Konflikt záujmov: MP a EM sú zamestnancami spoločnosti Gilead Sciences, Foster City, CA, USA a majú v spoločnosti podiely.

Finančné prostriedky: Finančnú podporu pre túto štúdiu poskytli Centrum pre spoločenské zdravie zvierat UC Davis, Fond Philipa Raskina v Kansas City a početní darcovia organizácii SOCK FIP podľa pokynov pani Carol Horace. GS-441524 použitý v tomto pokuse bol poskytnutý spoločnosťou Gilead Sciences, Foster City, CA.

Literatúra

1.De Clercq, E, Li, G. Approved antiviral drugs over the past 50 years. Clin Microbiol Rev 2016; 29: 695–747.
Google Scholar | Crossref | Medline
2.Hartmann, K. Efficacy of antiviral chemotherapy for retrovirus-infected cats: what does the current literature tell us? J Feline Med Surg 2015; 17: 925–939.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
3.Thomasy, SM, Shull, O, Outerbridge, CA. Oral administration of famciclovir for treatment of spontaneous ocular, respiratory, or dermatologic disease attributed to feline herpesvirus type 1: 59 cases (2006–2013). J Am Vet Med Assoc 2016; 249: 526–538.
Google Scholar | Crossref | Medline
4.Pedersen, NC, Elliott, JB, Glasgow, A. An isolated epizootic of hemorrhagic-like fever in cats caused by a novel and highly virulent strain of feline calicivirus. Vet Microbiol 2000; 73: 281–300.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
5.Kim, Y, Shivanna, V, Narayanan, S. Broad-spectrum inhibitors against 3C-like proteases of feline coronaviruses and feline caliciviruses. J Virol 2015; 89: 4942–4950.
Google Scholar | Crossref | Medline
6.Pedersen, NC, Kim, Y, Liu, H. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2018; 20: 378–392.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
7.Pesteanu-Somogyi, LD, Radzai, C, Pressler, BM. Prevalence of feline infectious peritonitis in specific cat breeds. J Feline Med Surg 2006; 8: 1–5.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
8.Riemer, F, Kuehner, KA, Ritz, S. Clinical and laboratory features of cats with feline infectious peritonitis – a retrospective study of 231 confirmed cases (2000–2010). J Feline Med Surg 2016; 18: 348–356.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
9.Rohrbach, BW, Legendre, AM, Baldwin, CA. Epidemiology of feline infectious peritonitis among cats examined at veterinary medical teaching hospitals. J Am Vet Med Assoc 2001; 218: 1111–1115.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
10.Warren, TK, Jordan, R, Lo, MK. Therapeutic efficacy of the small molecule GS-5734 against Ebola virus in rhesus monkeys. Nature 2016; 531: 381–385.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
11.Sheahan, TP, Sims, AC, Graham, RL. Broad-spectrum antiviral GS-5734 inhibits both epidemic and zoonotic coronaviruses. Sci Transl Med 2017; 9. DOI: 10.1126/scitranslmed.aal3653.
Google Scholar | Crossref
12.Murphy, BG, Perron, M, Murakami, E. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol 2018; 219: 226–233.
Google Scholar | Crossref | Medline
13.Takano, T, Endoh, M, Fukatsu, H. The cholesterol transport inhibitor U18666A inhibits type I feline coronavirus infection. Antiviral Res 2017; 145: 96–102.
Google Scholar | Crossref | Medline
14.Takano, T, Nakano, K, Doki, T. Differential effects of viroporin inhibitors against feline infectious peritonitis virus serotypes I and II. Arch Virol 2015; 160: 1163–1170.
Google Scholar | Crossref | Medline
15.Kim, Y, Liu, H, Galasiti Kankanamalage, AC. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad- spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog 2016; 12: DOI: 10.1371/journal.ppat.1005531.
Google Scholar | Crossref
16.Gut, M, Leutenegger, CM, Huder, JB. One-tube fluorogenic reverse transcription-polymerase chain reaction for the quantitation of feline coronaviruses. J Virol Methods 1999; 77: 37–46.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
17.Agostini, ML, Andres, EL, Sims, AC. Coronavirus susceptibility to the antiviral remdesivir (GS-5734) is mediated by the viral polymerase and the proofreading exoribonuclease. MBio 2018; 9. DOI: 10.1128/mBio.00221-18.
Google Scholar
18.Weiss, G, Goodnough, LT. Anemia of chronic disease. N Engl J Med 2005; 352: 1011–1023.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
19.Kurnick, JE, Ward, HP, Pickett, JC. Mechanism of the anemia of chronic disorders: correlation of hematocrit value with albumin, vitamin B12, transferrin, and iron stores. Arch Intern Med 1972; 130: 323–326.
Google Scholar | Crossref | Medline
20.Taylor, SS, Tappin, SW, Dodkin, SJ. Serum protein electrophoresis in 155 cats. J Feline Med Surg 2010; 12: 643–653.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
21.Hirschberger, J, Hartmann, K, Wilhelm, N. Clinical symptoms and diagnosis of feline infectious peritonitis. Tierarztl Prax 1995; 23: 92–99.
Google Scholar | Medline
22.Pedersen, NC, Liu, H, Gandolfi, B. The influence of age and genetics on natural resistance to experimentally induced feline infectious peritonitis. Vet Immunol Immunopathol 2014; 28: 152–154.
Google Scholar
23.Jain, N, Reddy, DH, Verma, SP. Cardiac abnormalities in HIV-positive patients: results from an observational study in India. J Int Assoc Provid AIDS Care 2014; 13: 40–46.
Google Scholar | SAGE Journals
24.Payne, JR, Brodbelt, DC, Luis Fuentes, V. Cardiomyopathy prevalence in 780 apparently healthy cats in rehoming centres (the CatScan study). J Vet Cardiol 2015; 17 Suppl 1: S244–S257.
Google Scholar | Crossref | Medline
Publikované

Účinnosť inhibítora 3C-Like proteázy pri liečbe rôznych foriem získanej mačacej infekčnej peritonitídy

Pôvodný článok: Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis
Publikovaný: 13.9.2017, SAGE – Journal of Feline Medicine and Surgery

Niels C Pedersen,1 Yunjeong Kim,2 Hongwei Liu,1 Anushka C Galasiti Kankanamalage,3 Chrissy Eckstrand,4 William C Groutas,3 Michael Bannasch,1 Juliana M Meadows,5 and Kyeong-Ok Chang2

Abstrakt

Cieľ

Bezpečnosť a účinnosť inhibítora 3C-Like proteázy GC376 bola testovaná na skupine klientmi vlastnených mačiek s rôznymi formami infekčnej peritonitídy (FIP).

Metódy

Do klinického testu bolo prijatých 20 mačiek vo veku od 3,3 do 82 mesiacov (priemerne 10,4 mesiaca) s rôznymi formami FIP. Štrnásť mačiek malo vlhkú alebo zmiešanú FIP a šesť mačiek malo suchú FIP. GC376 sa podával subkutánne každých 12 hodín v dávke 15 mg/kg. Mačky s neurologickými príznakmi boli zo štúdie vylúčené.

Výsledky

Devätnásť z 20 mačiek liečených GC376 sa uzdravilo do 2 týždňov od začiatku liečby. Príznaky choroby sa však po 1–7 týždňoch od primárnej liečby vrátili, a relapsy a nové prípady sa nakoniec liečili minimálne 12 týždňov. Relapsy, ktoré prestali reagovať na liečbu, sa vyskytli u 13 z týchto 19 mačiek v priebehu 1-7 týždňov od počiatočnej alebo opakovanej liečby. Závažné neurologické ochorenie sa vyskytlo u 8/13 mačiek, u ktorých zlyhala liečba, a u piatich mačiek sa opakovali brušné lézie. V čase písania tohto článku bolo sedem mačiek v remisii choroby. Päť mačiatok vo veku 3,3–4,4 mesiaca s vlhkou FIP bolo liečených 12 týždňov a po ukončení liečby a v čase písania článku boli v remisii ochorenia 5–14 mesiacov (priemerne 11,2 mesiaca). Šieste mačiatko bolo po 12 týždňoch liečby v remisii 10 týždňov, došlo však k relapsu a dobre reaguje na druhé kolo liečby s GC376. Siedma bola 6,8-ročná mačka s postihnutím mezenterických lymfatických uzlín, ktorej sa podarilo dosiahnuť remisiu po troch relapsoch, ktoré si vyžadovali postupne dlhšie opakované liečby počas 10 mesiacov. Vedľajšie účinky liečby zahŕňali pálenie pri aplikácii injekcie a občasné ložiská subkutánnej fibrózy a vypadávanie chlpov. U mačiek liečených pred 16.-18. týždňom došlo k spomalenému vývoju a abnormálnemu rastu trvalých zubov.

Závery a význam

GC376 sa ukázal byť sľubný pri liečbe mačiek s konkrétnymi formami FIP a otvoril tak dvere k cielenej antivírusovej liečbe.

Úvod

Lieky, ktoré priamo inhibujú replikáciu vírusov, sa stali kľúčovými oporami pri liečbe chronických vírusových infekcií, ako je HIV/AIDS, vírusu hepatitídy C (HCV), vírusu hepatitídy B, herpesvírusu a akútnych infekcií, ako je chrípka. RNA vírusy, ako sú HIV-1 a HCV, obsahujú ideálne ciele pre inhibíciu vírusov, ako sú RNA-závislá RNA polymeráza a proteáza. Proteázy sú obzvlášť dobrým cieľom, pretože sa podieľajú na dozrievaní vírusov (HIV) alebo na produkcii funkčných vírusových proteínov (HCV). Inhibítory proteázy sa tiež používajú v kombinácii s inhibítormi reverznej transkripcie pri celoživotnej liečbe HIV/AIDS. Kombinácie rôznych inhibítorov proteázy sú vysoko účinné pri liečbe infekcie HCV u ľudí. Preto nie je prekvapujúce, že vírusová proteáza by mala byť atraktívny cieľ aj pre výskum infekcií zvierat spôsobených RNA vírusom. Kim a kol. syntetizovali peptidylové zlúčeniny, ktoré sú zamerané na 3C-like (3CLpro) proteázy, a hodnotila ich účinnosť proti mačaciemu koronavírusu (FCoV) a mačaciemu kalicivírusu, ako aj proti dôležitým ľudským RNA vírusom, ktoré kódujú 3CLpro alebo príbuznú 3C proteázu. Identifikovali sériu zlúčenín, ktoré vykazovali silnú inhibičnú aktivitu proti rôznym koronavírusom, vrátane FCoV, s vysokým rozsahom bezpečnosti. Účinnosť ich inhibítorov 3CLpro bola predmetom pokusov u myší infikovaných vírusom hepatitídy A59, myšacím koronavírusom, a zistilo sa, že spôsobujú významné zníženie titrov vírusov a patologických lézií.

V súčasnosti neexistujú komerčne dostupné antivírusové lieky na koronavírusové infekcie u ľudí alebo zvierat a štúdie Kim a kol. dokázali, že inhibícia 3CLpro môže viesť k potlačeniu replikácie koronavírusu in vivo. Ukázali, že niektoré z ich inhibítorov 3CLpro sú vhodné ako terapeutické prostriedky proti týmto dôležitým vírusom u domácich a divokých mačiek. Potvrdila to štúdia s využitím experimentálnej infekcie vírusom mačacej infekčnej peritonitídy u laboratórnych mačiek. Aj keď je experimentálna infekcia FIPV vysoko smrteľná, akonáhle infekcia dosiahla definovateľné štádium, 14–20 dní trvajúca liečba pomocou GC376 viedla k rýchlej remisii ochorenia u šiestich mačiek, ktorá v čase publikácie článku trvala už viac ako 12 mesiacov.

Materiály a metódy

Oficiálne protokoly

Táto štúdia prebiehala podľa protokolu 18731 schváleného Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat a Výborom pre hodnotenie klinických skúšok Komisie pre klinické skúšky veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice na Kalifornskej univerzite v Davise. Tento protokol podrobne popisuje podmienky testovania nového inhibítora proteázy GC376 u mačiek vlastnených klientom. Každý vlastník bol povinný prečítať si podmienky štúdie a vyjadriť s nimi súhlas.

Organizácia klinickej štúdie

Predmetom štúdie bolo vyhodnotenie inhibítora 3CLpro GC376 u skupiny mačiek s prirodzene získanou FIP. Štúdia nezahŕňala skupinu s placebom, pretože, ako poznamenali Miller a Brody, „hlavnou etickou zásadou v placebom kontrolovaných klinických skúškach je, že pokiaľ pre daný stav existuje preukázaná účinná liečba, je testovanie proti placebu neetické“. GC376 sa už preukázal ako vysoko účinný pri liečbe mačiek s experimentálne indukovanou FIP pred touto štúdiou, čím vznikol predpoklad existujúcej účinnej liečby. Placebo kontrolu nahradila skupina s prirodzene prebiehajucou chorobou. Žiadna z 20 liečených mačiek nepreukázala pretrvávajúce priaznivé reakcie na liečbu, ktorú dostali pred liečbou GC376.

Inštitucionálne pravidlá vylúčili použitie mačiek získaných z útulkov alebo podobných zariadení na výskum tohto typu, a vyžadovali, aby všetky mačky boli v legálnom vlastníctve/adoptované, a aby sa s nimi zaobchádzalo s výslovným súhlasom majiteľa. Mačky s klinicky zjavným neurologickým ochorením boli vylúčené. Do štúdie bolo nakoniec zahrnutých 20 mačiek z rôznych oblastí USA, rôzneho veku a s rôznymi formami FIP. Táto relatívne malá skupina mačiek poskytla cenné poznatky o koncepcii pokusu, interakcii a súlade s vlastníkom, sledovaní bezpečnosti a účinnosti, stanovení minimálneho dávkovacieho režimu, hodnotení relapsov choroby počas liečby alebo po nej a stanovení klinických foriem FIP, ktoré sú pre liečbu najvhodnejšie. Tieto informácie, dúfajme, pomôžu pri ďalších testoch potrebných na udeľovanie licencií a prípadnú komercializáciu GC376 a na vykonávanie podobných testov budúcich antivírusových liekov na FIPV a iných chronických vírusových infekcií mačiek.

Popis testovacej skupiny

Do pokusu bolo zapojených 20 mačiek a ich majiteľov a príslušné informácie o každej mačke sú uvedené v tabuľke 1 a o celej pokusnej skupine na obrázku 1. Mačky boli do štúdie zaradené s rôznym stupňom predbežného testovania zo strany veterinárnych lekárov primárnej starostlivosti. Toto testovanie zvyčajne zahŕňalo kompletný krvný obraz (CBC) s celkovým plazmatickým proteínom, globulínom (G), albumínom (A), A:G; chemický profil séra a analýzu výpotkov vrátane celkového proteínu, skutočného alebo odhadovaného počtu buniek a typu zápalových buniek. U malého podielu mačiek sa uskutočnilo ďalšie testovanie, ktoré obsahovalo titre protilátok FIPV, ultrazvuk brušnej alebo hrudnej oblasti, biopsie postihnutého tkaniva a kvantitatívnu PCR v reálnom čase (qRT-PCR) z výpotkov.

Tabuľka 1
Základné údaje, pôvod, hlavné klinické príznaky a hlavné zistenia pri pitve po liečbe inhibítorom proteázy GC376

ID/MenoVek (mes.)Hmotnosť
(kg)		PohlaviePlemenoPôvodSymptómyStavPitva
CT01 (Echo)5.61.64FSDSHKRPeritonitída, zakrpatená–B, Int
CT02 (Cate)62.67FSDLHKRPeritonitída, zakrpatená–B, E, Int, L, MLN
CT03 (Pancake)7.863.18MCHimCTSuchá (Col) až vlhká+Int, L, MLN, S, Om, P
CT04 (Kratos)824.8MCDSHKRSuchá (MLN)Remisia
CT05 (Scooter)104.25MCDSHKRSuchá (E, MLN, K)–B, E, L, K, MLN
CT07 (Mac)6.62.6MCDSHKRSuchá (Col)+E, Int, L, MLN, S, K, A, Lu
CT08 (Phoebe)4.22.18FSDSHKRSuchá (E)–B, E, K, MLN, S
CT09 (Sammy)10.52.89MCDSHKRSuchá (MLN, K)?*B*
CT10 (Bandit)17.94.06MCHimCTSuchá (Col) až vlhká+B, E, Int, L, MLN, K, Om, P, Lu
CT12 (Daisy)7.52.5FSDSHKRPeritonitída, zakrpatená–B, Int, L, S
CT13 (Leo)7.41.97MCSphynxCTSuchá (E, K)+B, E, Int, L, MLN, S, K
CT14 (Muffin)82.94FSDSHKRSuchá (Col) až vlhká+E, Int, L, MLN, K, Om, P
CT15 (Flora)4.32.39FDSHFCPeritonitídaRemisia
CT16 (Bean)41.4FSDSHKRPeritonitída, zakrpatená+B,† E, Int, L, MLN, S, Om, P
CT17 (Peanut)4.42.3MDSHKRPeritonitídaRemisia
CT18 (Smokey)41.84MCDSHKRPeritonitídaRemisia
CT20 (Cloud)3.31.55MRMCTPleuritída (MLN)Remisia
CT21 (Phoebe)4.81.92FDSHKRPeritonitídaRemisia/relaps/opakovaná liečba
CT22 (Pepper)3.31.6FSibírskaCTPeritonitída+B, E, Om, MLN, Lu, Dia
CT23 (Oakely)3.93.1FSDSHKRPeritonitídaRemisia
Priemer10.282.59
SD17.220.94
FS = samica kastrovaná; F = samica nekastrovaná; DSH = domáca krátkosrstá; KR = záchranené mačiatko; B = mozog; Int = črevo; DLH = domáca dlhosrstá; E = oko; L = pečeň; MLN = mezenterické lymfatické uzliny; Him = himalájsky; Col = hrubé črevo; S = slezina; Om = omentum; P = pobrušnica; MC = kastrovaný samec; M = nekastrovaný samec; K = oblička; A = nadoblička; Lu = pľúca; FC = mačacia kolónia; RM = ragmuffin; Dia = bránica;SD = Štandardná odchýlka; CT = Chovná stanica

*Neuskutočnila sa žiadna pitva, ale boli prítomné terminálne neurologické príznaky
† Ťažký mozgový edém, neboli zaznamenané žiadne typické zápalové lézie

Obrázok 1.
Demografické údaje o mačkách zaradených do štúdie. (a–c) Koláčové grafy sumarizujúce percento pacientov: (a) vek v mesiacoch, (b) plemeno alebo (c) pôvod. (d) Stĺpcový graf zobrazujúci formy mačacej infekčnej peritonitídy (FIP) zaradených pacientov.
M = mesiace; DSH = domáca krátkosrstá; DLH = domáca dlhosrstá; MD = Maryland; OH = Ohio; Tx = Texas; FL = Florida; IL = Illinois; CT = Connecticut; CA = Kalifornia

Mačky s klinickými príznakmi svedčiacimi o neurologickom postihnutí boli zo štúdie vylúčené na základe skorších nepublikovaných experimentálnych štúdií s GC376. Jedna mačka, ktorá dlhodobo prežila predchádzajúcu štúdiu farmakokinetiky a účinnosti GC376, mala recidívu FIP prejavujúcu sa neurologickými príznakmi 6 mesiacov po tom, čo sa javila ako úspešná liečba akútnej infekcie.6 Táto mačka nereagovala na opakovanú procedúru s GC376, ktorá podnietila štúdiu schopnosti lieku preniknúť do mozgu. Úrovne GC376 v mozgu laboratórnych mačiek predstavovali iba 3% plazmatických koncentrácií liečiva.

Potvrdenie ochorenia

Diagnóza FIP bola potvrdená v čase vstupu do štúdie na základe základných údajov, klinickej anamnézy, vyšetrenia výsledkov predchádzajúcich laboratórnych testov, fyzikálneho vyšetrenia a opakovania základných analýz krvi a výpotku. Ručná palpácia brucha bola zvyčajne dostatočná na identifikáciu ascitu, zväčšených mezenterických lymfatických uzlín, zväčšenia slepého čreva a s nimi spojených ileo-cekálno-kolických lymfatických uzlín, tumorov v obličkách a infiltrácie hrubého čreva. Ručná palpácia sa v prípade potreby doplnila ultrazvukom. Oči sa spočiatku vyšetrovali priamym svetlom na akékoľvek abnormality v sietnici, na zrazeniny v prednej komore alebo na zadnej strane rohovky a záblesky v komorovej vode. Prítomnosť očného ochorenia sa potvrdila úplným oftalmoskopickým vyšetrením vykonaným oftalmologickou službou Veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice (VMTH), UC Davis. Prítomnosť FIPV sa ďalej potvrdila pomocou qRT-PCR, buď z brušných alebo hrudných výpotkov odobratých v čase prijatia, alebo v čase pitvy. Sekvenovanie génu FIPV proteázy sa uskutočňovalo na mačkách, u ktorých došlo k relapsu počas liečby, aby sa určilo, či došlo k potenciálnej mutácii spôsobujúcej rezistenciu na liečivo.

Diagnóza FIP sucho-vlhkej (zmiešanej) FIP u troch mačiek (CT03, CT10 a CT14) bola založená na difúznom zväčšení hrubého čreva a anamnéze riedkej stolice, krvi a hlienu v stolici, napínania na defekáciu a stolice malého kalibru pred výskytom brušných efúzií. FIP hrubého čreva bola opísaná ako špecifická variantná forma neefuzívnej FIP. Podozrenie na zmiešanú FIP bolo aj u mačiek CT01, CT02 a CT12 z dôvodu zastavenia rastu, ktorý o mnoho týždňov predchádzal výskyt brušných výpotkov.

Liečebný režim

GC376 bol syntetizovaný vo vysoko čistej forme a pripravený v koncentrácii 53 mg/ml v 10% etanole a 90% polyetylénglykole 400, ako bolo opísané vyššie. GC376 bol podávaný subkutánne (SC) v dávke 15 mg/kg každých 12 hodín SC, pokiaľ nie je uvedené inak. Účinná dávka pre mačky s experimentálne indukovanou FIP bola 10 mg/kg / q12 h SC, ale dávka sa zvýšila na 15 mg/kg potom, čo prvá mačka (CT01) nereagovala na nižšiu dávku 10 mg/kg stanovenú predchádzajúcimi farmakokinetickými štúdiami. Išlo o klinické rozhodnutie založené na reakcii tejto jednej mačky na liečbu.

Monitorovanie odpovede na liečbu
Mačky s FIP boli na základe predbežného testovania a počiatočného vyhodnotenia v čase prezentácie na UC Davis hospitalizované najmenej 5 dní a okamžite začali liečbu. Najmenej dvakrát denne boli podrobne vyšetrené na rektálnu teplotu, pulz, dýchanie, chuť do jedla a aktivitu. Použila sa hrudkujúca podstielka, ktorá umožňovala denné hodnotenie objemu a konzistencie stolice a močenia. Celá krv sa odoberala do EDTA alebo heparínu venepunkciou pred zahájením liečby, v dvojdňových intervaloch počas hospitalizácie, v čase prepustenia a v dvojtýždňových intervaloch počas prvého mesiaca a potom v mesačných alebo väčších intervaloch. Rutinné vyšetrenie krvi v každom časovom bode zahŕňalo minimálne hematokrit, celkový plazmatický proteín, ikterický index, celkový počet bielych krviniek, diferenciálny rozpočet bielych krviniek a absolútny počet neutrofilov, lymfocytov a monocytov a eozinofilov. Kvôli kontrole potenciálnej toxicity liekov sa pravidelne zaznamenávali hodnoty chemického zloženia krvného séra. Vzorky brušných výpotkov sa získavali paracentézou každý druhý deň, pokiaľ sa dali získať, čo bolo zvyčajne prvých 3–7 dní. Mačky s dýchavičnosťou boli vyšetrené hrudnou ultrasonografiou a vzorka tekutín bola získaná ultrazvukom vedenou paracentézou. Výpotky sa skúmali na prítomnosť fibrínových zrazenín, prímes neutrofilov a malých/veľkých mononukleárnych buniek, intenzitu žltého sfarbenia, viskozitu pôsobením vlákien a celkový obsah bielkovín. Bunkové pelety z peritoneálnych alebo hrudných výpotkov boli tiež skúmané pomocou qRT-PCR na hladinu vírusovej RNA, ako už bolo opísané.

Mačky boli vydané svojim majiteľom, keď bola zaznamenaná pozitívna reakcia na liečbu, zvyčajne do 5 dní. Majiteľ (majitelia) boli buď vedúcim veterinárnym lekárom, alebo veterinárnym lekárom primárnej starostlivosti poučení, ako podať liek dvakrát denne subkutánnou injekciou. Miesta vpichu sa menili tak, aby zahŕňali hornú líniu od zátylku po strednú časť chrbta a po stranách hrudníka a bokov. Dbalo sa na to, aby sa zabránilo ukladaniu liečiva do dermis alebo postupne na rovnakom podkožnom mieste. Majitelia boli vyzvaní, aby udržiavali denné záznamy o rektálnej teplote, aktivite, chuti do jedla, defekácii a močení a týždenné až dvojtýždňové telesné hmotnosti. Periodické vzorky krvi pre CBC a chemické hodnoty séra boli odoberané osobnými veterinárnymi lekármi majiteľov a zaslané do komerčných veterinárnych diagnostických laboratórií. Akékoľvek abnormálne príznaky alebo správanie bolo potrebné zaznamenať a okamžite hlásiť. Eutanázia sa v prípade potreby uskutočňovala buď na UC Davis, alebo veterinárnym lekárom primárnej starostlivosti. Telá mačiek usmrtené veterinárnymi lekármi primárnej starostlivosti boli okamžite schladené a odoslané v obaloch s ľadom expresnou poštou do UC Davis na pitvu. Požiadavky majiteľov o zaobchádzanie a konečnú dispozíciu tela boli rešpektované.

Výsledky

Stanovenie dĺžky liečby

Prvých päť mačiek v štúdii bolo spočiatku liečených 2 týždne (CT01, CT02, CT03, CT04 a CT05). U všetkých mačiek bolo pozorované rýchle zlepšenie zdravotného stavu a liečba bola ukončená. Napriek priaznivej počiatočnej odpovedi sa príznaky ochorenia opakovali 1 (CT01, CT05), 2 (CT03, CT04) alebo 7 (CT02) týždňov po ukončení 2-týždňovej liečby (obrázok 2). Mačky boli potom liečené znova, dôvodom bolo postupné predlžovanie primárnej a sekundárnej doby liečby, kým ich FIP ostávala citlivá na GC376 (pozri CT04, CT22, obrázok 2). Nové mačky, ktoré sa dostali do štúdie, sa ďalej liečili 3 (CT07) alebo 4 týždne (CT08, CT16). Mačky CT08 a CT16 spočiatku reagovali, ale ich príznaky choroby sa počas liečby objavili znova. U mačky CT08 sa vyvinula neurologická choroba, zatiaľ čo u mačky CT16 sa opakovane vyskytli brušné lézie (tabuľka 1). Primárne a sekundárne liečebné doby sa potom predĺžili na 9 týždňov (CT07, CT09, CT10, CT14) (obrázok 2). U mačky CT09 sa vyvinuli neurologické príznaky počas 9-týždňovej základnej liečby a nakoniec bola utratená, keď sa príznaky choroby stali závažnými. U mačky CT07 sa vyskytlo neurologické ochorenie 6 týždňov po začiatku druhej liečby. Od tohto bodu boli všetky nové mačky prijaté to štúdie a staršie mačky, ako napríklad CT10, liečené alebo znovu liečené najmenej 12 týždňov. Prínos 12-týždňovej liečby bol najzrejmejší u mačky CT04, ktorá bola predtým liečená už trikrát s kratšou dobou liečby nasledovanou relapsom (obrázok 2). Liečba bola ukončená u mačiek, ktoré nemali klinické ani laboratórne príznaky choroby po 12 týždňoch primárnej ani sekundárnej liečby. Zistilo sa, že minimálna doba liečby by mala byť okolo 12 týždňov. Mačka CT21 bola liečená 17 týždňov z dôvodu oneskoreného zlepšenia počtu celkových bielkovín a bielych krviniek (obrázok 2). U tejto mačky došlo k relapsu pleurálnej FIP o 13 týždňov neskôr a v čase písania tohto článku bola podrobená ďalšej liečbe.

Orázok 2.
Časová škála liečby a klinický výsledok 20 mačiek, ktoré vstúpili do klinickej štúdie s inhibítorom proteázy GC376. Obdobia, počas ktorých boli mačky liečené, sú označené plnými čiarami. Je uvedený dátum posledného dňa liečby pre šesť mačiek, ktoré dosiahli trvalú klinickú remisiu. Mačka 21 bola v čase písania tohto článku ešte v liečbe. Zvyšných 13 mačiek podľahlo neneurologickej FIP alebo neurologickej FIP po ukončení primárnej alebo sekundárnej liečby do 0-7 týždňov

Odpoveď na počiatočnú liečbu a ukazovatele priaznivej reakcie

Počas prvých 1–4 týždňov liečby sa u 19/20 mačiek prejavilo dramatické a progresívne zlepšovanie zdravotného stavu. Výnimkou bola mačka CT16, ktorá reagovala poklesom teploty v konečníku počas prvých 4 dní liečby. Horúčka sa však vrátila a zdravotný stav sa nasledujúcich 23 dní naďalej zhoršoval a mačka bola eutanizovaná. Horúčka (>38,9 °C) u ďalších 19 mačiek zmizla do 24–48 hodín, so súčasným zlepšením chuti do jedla, aktivity, rastu a prírastku hmotnosti. Brušné výpotky boli zvyčajne nezistiteľné do 2 týždňov. Zvyškový hrudný výpotok zostávajúci po počiatočnej terapeutickej drenáži po 3 dňoch u mačky CT20 takmer zmizol. Renálne tumory u mačiek CT02 a CT13 sa tiež rýchlo zmenšili a po 2 týždňoch už neboli hmatateľné. Zväčšené mezenterické lymfatické uzliny sa k normálnej veľkosti vracali pomalšie. Hmatateľné zhrubnutie hrubého čreva a s ním spojené ileo-cekálno-kolické útvary reagovali najpomalšie a u mačky CT03 pretrvávali aj napriek liečbe a návratu k inak normálnemu zdravotnému stavu. Žltačka, častý nález u mladších mačiek s efuzívnou FIP, pomaly ustupovala počas 2 alebo viac týždňov, súčasne so znižovaním hyperbilirubinémie. Príznaky očnej choroby začali miznút do 48 hodín a zmizli do 1 týždňa bez ohľadu na počiatočnú závažnosť (obrázok 3).

Obrázok 3.
Vzhľad očí mačky CT08 pred zahájením liečby (a) a o týždeň neskôr (b). U tejto mačky sa o 3 týždne po začiatku liečby rozvinuli závažné neurologické príznaky.

Prírastok hmotnosti bol jednoduchým a presným kritériom rastu a zlepšenia zdravia. Ako vzťažná hodnota pre tento parameter bola použitá hmotnosť mačky CT04, najstaršej mačky v teste (obrázok 4a). Mačka CT04 vykazovala signifikantný úbytok hmotnosti o 30%. Po každom kole liečby pribrala, krátko pred každým relapsom choroby začala chudnúť a po každej liečbe opäť pribrala. Po 9,3 mesiacoch bez liečby a po liečbe (4,8 kg až 7,19 kg) znovu získala všetku svoju stratenú váhu. Všetky mačiatka s trvalou remisiou počas a po antivírusovej liečbe ustavične priberali na váhe, čo naznačuje, že pri antivírusovej liečbe pokračoval normálny rast (obrázok 4b). Jedna mačka (CT15) a dvaja kocúri (CT17, 20) boli bez komplikácií kastrovaní počas remisie choroby.

Obrázok 4.
Antivírusová liečba a zmeny telesnej hmotnosti. (a) Mačka CT04, 6,8-ročný kastrovaný samec, ktorý mal suchú mačaciu infekčnú peritonitídu (FIP), absolvoval štyri cykly antivírusovej liečby s narastajúcim trvaním, ako je znázornené bodkovanými políčkami. Pred každou recidívou schudol a po následnej liečbe pribral. (b) Prírastky hmotnosti u štyroch mačiatok vo veku 3,5-4,4 mesiaca počas a po antivírusovej liečbe sú znázornené bodkami. Bodkovaný obdĺžnik označuje dĺžku antivírusovej liečby (12 týždňov)

Lymfopénia bola bežným klinickým príznakom mačiek s vlhkou FIP (obrázok 5) a mala tendenciu priamo korelovať so závažnosťou brušného zápalu, čo naznačovala viskozita, prítomnosť fibrínových vlákien, obsah bielkovín, počet buniek a stupeň žltej farby výpotku. Lymfopénia sa zlepšila pri liečbe všetkých mačiek s vlhkou FIP okrem CT16, ale nepomohla predpovedať relapsy choroby, ktoré sa vyskytli potom (obrázok 5a). U mačiek so suchou FIP lymfopénia nebola tak výrazná, a pre hodnotenie odpovede na liečbu nebola užitočná tak, ako iné parametre (obrázok 5b).

Obrázok 5.
Priemer a smerodajná odchýlka (SD) absolútneho počtu lymfocytov u liečených pacientov s (a) vlhkou alebo (b) suchou mačacou infekčnou peritonitídou (FIP). a) Dvanásť mačiek (prázdny krúžok), u ktorých sa prejavil brušný alebo hrudný výpotok, a ktoré boli liečené až 12 týždňov. Trinásta mačka (CT16, plný krúžok) s brušným výpotkom reagovala na liečbu zle. b) Sedem mačiek so suchou alebo vlhkou formou FIP a s následnou liečbou v trvaní 6 týždňov.

Celkové hladiny bielkovín v plazme ako nepriamy indikátor koncentrácie globulínu boli pri vyšetrení často zvýšené, ale hodnoty boli počas prvých 4 týždňov veľmi variabilné a často prechodne stúpali počas resorpcie výpotkov. Mačky, u ktorých nakoniec liečba nebola úspešná, mali tendenciu mať vyššie celkové koncentrácie plazmatických proteínov na začiatku liečby a mali tendenciu udržiavať si vyššie hladiny počas liečby ako mačky, ktoré úspešne dosiahli trvalú remisiu (obrázok 6).

Obrázok 6.
Priemer a SD celkových hladín bielkovín v plazme u 20 mačiek počas obdobia 12 týždňov. Trinásť mačiek utrpelo v rôznych týždňoch liečby (W) smrteľné relapsy a sedem mačiek dosiahlo trvalú remisiu po 12 týždňoch liečby (W-SV)

Zníženie hladiny vírusovej RNA v bunkách z ascitickej tekutiny v spojitosti s liečbou

Sekvenčné vzorky ascitu boli odobraté niekoľkým tým istým mačkám počas prvých 6–25 dní antivírusovej liečby a boli testované na hladiny vírusovej RNA pomocou qRT-PCR. Hladiny FIPV sú často nízke alebo negatívne v krvi mačiek s FIP a najvyššie sú v bunkách z výpotkov. Preto boli najspoľahlivejším zdrojom FIPV RNA bunky z ascitu alebo pleurálneho výpotku. Mačky CT15, CT16 a CT17 mali 955, 1699 a 2937-krát vyššie hladiny vírusovej RNA, v danom poradí, ako CT02, ktoré mali najnižšiu vírusovú záťaž v efúzii pred liečbou (obrázok 7). Hladiny vírusovej RNA sa v priebehu 2 týždňov znížili až 1567463-násobne v porovnaní s hodnotami pred liečbou, s výnimkou mačky CT16 (obrázok 8), ktorá mala druhú najvyššiu hladinu vírusovej RNA pred antivírusovou liečbou medzi 12 mačkami so vzorkami výpotkov dostupnými na testovanie ( Obrázok 7). Absencia rýchleho poklesu hladín vírusovej RNA u mačky CT16 spolu s ťažkou lymfopéniou môže vysvetľovať, prečo nereagovala na liečbu. CT10 tiež mala o niečo pomalší pokles hladiny vírusu a po antivírusovej liečbe dvakrát relapsovala. Je pozoruhodné, že hladiny vírusovej RNA v bunkách ascitu u mačiek CT15, CT17 a CT18 klesali najrýchlejšie a boli tiež medzi piatimi mačkami, u ktorých došlo k trvalej remisii ochorenia. Či príčinou bola vlastnosť jednotlivých izolátov FIPV, alebo forma a závažnosť choroby hostiteľa nebolo zistené.

Obrázok 7.
Relatívne počiatočné hladiny RNA vírusu infekčnej peritonitídy mačiek (FIPV) vo výpotkových vzorkách pacientov pred antivírusovou liečbou. Na vzorkách efúzií pacientov pred zahájením liečby sa uskutočnila kvantitatívna PCR v reálnom čase. Relatívne základné hladiny vírusovej RNA ako násobné rozdiely v porovnaní s úrovňou vírusu pred liečbou CT02, mačka s najnižšími hladinami RNA. Úroveň transkriptov RNA bola vypočítaná pre každého pacienta pomocou metódy ∆Ct s referenčným génom pre beta-aktín
Obrázok 8.
Zníženie RNA vírusu mačacej infekčnej peritonitídy zo sekvenčných vzoriek výpotku počas liečby GC376 u mačiek CT10, CT12, CT15, CT16, CT17, CT18 a CT23. Každý bod označuje násobné zníženie hladiny vírusovej RNA oproti hladine nameranej pred liečbou (deň 0). Hladiny vírusovej RNA sa stanovili pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase metódou ∆Ct a beta-aktín referenčným génom

Zlyhanie liečby v dôsledku recidívy brušnej FIP alebo výskytu neurologického ochorenia

Trinásť z 20 mačiek v teste nakoniec podľahlo recidíve choroby. Jedna mačka (CT16) nevykázala významné zlepšenie a bola eutanizovaná 3 týždne po začiatku 4-týždňového liečebného režimu (obrázky 2 a 8), 8), zatiaľ čo u ostatných 12 došlo k variabilnému obdobiu remisie ochorenia po primárnej alebo sekundárnej liečbe trvajúcej 3–17 týždňov (priemerne 7,8 týždňa) (obrázok 2). Všetky z týchto 13 mačiek okrem jednej (CT09) boli pitvané (tabuľka 1). Osem z týchto mačiek bolo eutanizovaných kvôli závažným neurologickým príznakom a päť z dôvodu recidívy brušnej choroby (obrázok 2). Pri vyšetrení boli sekundárne detekované tri mačky, ktoré podľahli neurologickému ochoreniu (CT05, CT08, CT13) v dôsledku okulárnej FIP (tabuľka 1). Medzi najskoršie príznaky neurologického ochorenia patrili horúčka, ktorá pretrvávala aj napriek pokračujúcej liečbe, apatia, občasné svalové zášklby uší a svalov, neobvyklé pohyby pri prehĺtaní, nutkavé naťahovanie končatín a strata normálnej mentality, ktorá sa prejavila krátkymi epizódami strnulých pohľadov alebo chradnutím. Tieto príznaky pretrvávali pri liečbe niekoľko dní alebo týždňov, ale nakoniec došlo k nekoordinácii a tonickým/klonickým záchvatom. Výskyt a rýchla progresia neurologických príznakov po prerušení liečby boli výraznejšie, ako počas liečby (obrázok 2).

Päť mačiek (CT03, CT07, CT10, CT14 a CT16) malo recidívu typických intraabdominálnych lézií pri absencii neurologických príznakov počas alebo po liečbe (tabuľka 1). U štyroch z nich sa vyskytli ileocekálne útvary (CT03, CT07 a CT14) alebo zväčšená lymfatická uzlina hrubého čreva (CT10), ktorá sa po primárnej liečbe zmenšila (CT03, CT10 a CT14) alebo už nebola hmatateľná (CT07). Avšak CT03 naďalej trpela ťažkou zápchou, napínaním a stolicou podobajúcou sa zubnej paste. Závažnosť obštrukcie hrubého čreva si vyžiadala resekciu hrubého čreva, ktorá zmiernila klinické príznaky, ale nezabránila prípadnému opätovnému výskytu brušných choroby. Všetky tri mačky, u ktorých sa vyskytli silné ileo-cekálno-kolické infiltráty, stále vykazovali dôkazy o tejto forme FIP pri pitve a imunohistochémia preukázala antigén FIPV v makrofágoch v granulomatóznom zápale (obrázok 9).

Obrázok 9.
Rez zo silne zhrubnutej steny resekovaného hrubého čreva z mačky CT03. Imunoperoxidáza (hnedá farba) sfarbená na mačací antigén vírusu infekčnej peritonitídy je pozorovaná v makrofágoch okolo periférie granulomatóznej lézie. K perzistencii vírusu v hrubom čreve došlo počas liečby a ústupu ďalších príznakov ochorenia (napr. efuzívnej peritonitídy)

Pokusy o liečbu neurologickej choroby zvýšením dávky lieku a predĺžením trvania liečby

Pre zmiernenie neurologických príznakov sme sa pokúsili zvýšiť dávku GC376, čím sa zvýšila jeho hladina v krvi a množstvo liečiva, ktoré prešlo cez hematoencefalickú bariéru. Mačka CT01 vykazovala efúznu FIP a bola pôvodne liečená GC376 (10 mg/kg q12h SC po dobu 9 dní). Mačka reagovala dobre, ale v 9. deň sa horúčka sa vrátila a dávka sa zvýšila na 15mg/kg každých 12 hodín po dobu 5 dní. Horúčka zmizla a liečba bola ukončená v deň 14. O 3 dni neskôr sa horúčka vrátila spolu s neurčitými neurologickými príznakmi pozostávajúcimi zo zášklbu svalov, abnormálneho naťahovania končatín a abnormálnych hltacích pohybov. Mačke bola okamžite znovu nasadená dávka 15 mg/kg každých 12h SC a jej stav sa zlepšil, ale krátko potom sa zhoršil s návratom horúčky a rovnakými neurčitými neurologickými príznakmi s miernou nekoordináciou. Dávka sa potom zvýšila na 50 mg/kg každých 12 hodín SC po dobu 14 dní a jej stav sa zlepšil na takmer normálny stav. Liečba bola zastavená, ale okamžite sa vrátili neurologické príznaky. Mačka bola potom liečená ďalšie štyri dni dávkou 50 mg/kg q12 h SC, počas ktorých sa neurologické príznaky opäť zlepšili. Padlo však rozhodnutie ukončiť liečbu úplne. Stav mačky zostal stabilný 1 týždeň a potom sa u nej rozvinula extrémna nekoordinácia, demencia a tonické/klonické záchvaty. Bola vykonaná eutanázia a pitva preukázala lézie iba v mozgu.

Mačka CT12 dobre reagovala na liečbu dávkou 15 mg/kg q12 h SC; rektálna teplota sa vrátila k normálu do 48 hodín a brušný výpotok zmizol do 2 týždňov. Mačka sa po druhom týždni liečby javila ako normálna, potom však mala pretrvávajúcu horúčku 38,9–40°C. Majitelia cítili, že mačka má inak normálnu aktivitu a chuť k jedlu, takže liečba pokračovala v rovnakom dávkovaní. Horúčka však pretrvávala, boli zaznamenané jemné príznaky zmeny správania a mačka nerástla podľa očakávania. Mačka pokračovala v liečbe ďalších 15 týždňov, počas ktorých sa dávka liečiva prechodne dvakrát znižovala (tj. na 10 mg/kg každých 12 hodín a 15 mg/kg každých 24 hodín) počas niekoľkých dní, horúčka sa však zvýšila a zakaždým sa znížila aktivita. Obnovilo sa dávkovanie 15mg/kg každých 12 hodín. Mačka naďalej vykazovala príznaky premenlivej horúčky a nejasné príznaky správania, ale majitelia boli optimistickí, pokiaľ ide o apetít a úroveň aktivity mačky. Liečba mačky bola potom zastavená, pretože ďalšie použitie lieku na tento účel nebolo možné odôvodniť. Stav mačky zostal nezmenený s pretrvávajúcou horúčkou, samotárskym správaním a zastavením rastu ďalších 5 týždňov. V 22. týždni sa objavili závažné neurologické príznaky pozostávajúce z nekoordinácie, demencie a záchvatov a mačka bola eutanizovaná. Makroskopické i mikroskopické lézie boli obmedzené na mozog.

Testovanie na vznik vírusovej rezistencie

O vzniku vírusu rezistentného na liečivo sa uvažovalo u mačky CT03, u ktorej došlo k relapsu s brušnými léziami po počiatočnej priaznivej reakcii na liečbu granulomatóznej kolitídy a zmiešanej FIP. V čase pitvy boli v brušnej dutine stále prítomné granulomatózne lézie a v mozgu sa nenašli žiadne makroskopické ani mikroskopické lézie (tabuľka 1). Preto recidíva ochorenia nesúvisela s neurologickým ochorením a perzistentný antigén FIPV bol identifikovaný v makrofágoch v granulomatóznych léziách. Uskutočnilo sa sekvenčné porovnanie medzi 3CLpro z efúzie pred liečbou a z omenta odobratým pri pitve o 95 dní neskôr. V 3CLpro sa však nenašla žiadna substitúcia aminokyselín, čo naznačuje, že výskyt vírusu rezistentného na liečivá nebol príčinou opakovaného ochorenia mačky.

Porovnávali sa tiež 3CLpro sekvencie vírusovej RNA pred liečbou s tými, ktoré boli získané o 25 dní (CT16), 139 dní (CT02), 149 dní (CT12) a 231 dní (CT10) neskôr v čase pitvy. V tomto období neboli pozorované žiadne rozdiely v 3CLpro. Sekvencie tiež zostali nezmenené u CT02, CT16 a CT12 od času prijatia až po pitvu. Vírusová 3CLpro z pľúc a sleziny mačky CT10, ktorá relapsovala dvakrát počas 8 mesiacov a bola znovu liečená, vykazovala substitúciu Asp-to-Ser v polohe 25 a substitúciu Lys-to-Asp v polohe 260 v porovnaní s vírusom z abdominálnej kvapaliny získanej pred liečbou. Presné účinky týchto mutácií na funkciu proteázy sa v súčasnosti skúmajú. Uvádza sa, že genetická evolúcia kvázi druhov vírusových proteínov nastáva v priebehu času u pacientov chronicky infikovaných RNA vírusom (HCV) a môže viesť k sporadickým zmenám aminokyselín.

Výskyt trvalých klinických remisií

Sedem z 20 mačiek v štúdii liečby GC376, z ktorých všetky absolvovali najmenej 12 týždňov nepretržitej liečby, bolo kategorizovaných ako potenciálne liečebné úspechy na základe viac ako 12 týždňov trvajúcej remisie choroby po ukončení liečby (Obrázok 2). Šesť z týchto mačiatok malo vo veku 3,3–4,4 mesiaca akútnu efúznu brušnú (CT15, CT17, CT18, CT21, CT23) alebo pleurálnu (CT20) formu ochorenia a boli liečené nepretržite 12 alebo 17 (mačka CT21) týždňov (tabuľka 1, obrázok 2). Siedma mačka (CT04), 6,8-ročný krížený kastrovaný kocúr so suchou FIP obmedzenou na mezenterickú lymfatickú uzlinu, tiež dosiahol dlhodobú remisiu, ale až po štyroch cykloch liečby so zvyšujúcim sa trvaním (Tabuľka 1, Obrázok 2).

Šesť z týchto dlhodobo preživších mačiek malo na začiatku liečby abnormality v CBC, hematokrite a celkových proteínoch, ale v čase ukončenia liečby mali úplne normálne hodnoty v krvi. Avšak mačka CT21 mala aj po 12 týždňoch zvýšené hladiny bielkovín v plazme a zvýšený počet bielych krviniek a v liečbe pokračovala ďalších 5 týždňov. Počty plazmatických bielkovín a bielych krviniek sa zlepšili po ďalších 5 týždňoch liečby, stále však neboli v referenčnom rozsahu. Trinásť týždňov po ukončení liečby sa u mačky vyvinul typický FIP výpotok v hrudnej dutine s horúčkou. Tekutina z hrudníka bola odsatá, aby sa zlepšilo dýchanie, a mačka začala s druhým kolom GC376 a v čase písania článku bola afebrilná, aktívna a po 8 týždňoch liečby jedla normálne. Liečba bude trvať 12 týždňov, ak sa znova neobjavia žiadne známky ochorenia.

Vedľajšie účinky pozorované počas liečby a po liečbe

Počas a po liečbe GC376 boli pozorované dva vedľajšie účinky. Liek pri injekčnej aplikácii často spôsoboval štípanie/pálenie. Subkutánne opuchy sa vyskytli, keď sa v rovnakom mieste aplikovalo príliš veľa injekcií, ale tie rýchlo ustúpili. U jednej mačky (CT12) sa približne v 14. týždni 18-týždňového obdobia liečby vyskytla hlboko lokalizovaná ulcerácia medzi lopatkami. Pri pitve však nebol pozorovaný žiadny dôkaz dermálnej FIP a išlo pravdepodobne o reakciu na nepretržité injekcie v rovnakom mieste. Prieskum siedmich dlhodobo preživších mačiek preukázal citeľné ohniskové podkožné zhrubnutie. U jednej mačky sa na röntgenových snímkach objavili štyri zvápenatené hrčky veľkosti hrášku. Tieto hrčky boli chirurgicky odstránené spolu s okolitým fibrotickým tkanivom. Traja ďalší dlhodobo preživší majú 1–3 malé ohniskové oblasti s trvalou stratou chlpov v miestach vpichu, ktoré sú zakryté okolitým srsťou (obrázok 10). Majitelia a ich veterinári boli požiadaní, aby tieto lézie pravidelne kontrolovali kvôli prípadným zmenám, či výskytu nových lézií.

Obrázok 10.
Ohnisková oblasť permanentného vypadávania chlpov spôsobená nechceným ukladaním GC376 do epidermy mačky CT21. Tieto oblasti boli zvyčajne prekryté chlpmi a neboli zvonka viditeľné

Najvýznamnejším vedľajším účinkom spojeným s dlhodobou liečbou bol juvenilný chrup. Normálna tvorba, rast a prerezanie trvalých zubov sa oneskorili u všetkých štyroch liečených mačiatok vo veku 3,3–4,4 mesiaca. Očné zuby, rezáky, štvrtý premolár a molár boli postihnuté najmenej, zatiaľ čo druhý a tretí premolár boli postihnuté najviac (obrázok 11). Dospelé zuby sa javili menšie ako normlingválne a to spolu s oneskoreným prerezaním viedlo buď k ponechaniu mliečnych špičákov, nevypadnutiu mliečnych zubov alebo k čiastočnému prerezaniu abnormálnych trvalých zubov k súčasne ponechaným mliečnym zubom. U žiadneho z dlhodobo preživších neboli pozorované žiadne iné anatomické alebo fyziologické defekty a neboli zaznamenané ani u pitvaných mačiek.

Obázok 11.
Dospelý chrup mačky CT17, ktorá bola liečená 12 týždňov GC376, počnúc vekom 4,4 mesiaca. Je viditeľný ponechaný horný ľavý mliečny špičák. Zdá sa, že horný druhý a tretí premolár sú mliečne. Malé trvalé tretie premoláre sa čiastočne prerezali lingválne k mliečnym tretím horným premolárom. Gingiva obklopujúca ponechaný špičák a premoláre je zapálená. Dospelé špičáky sa javia tiež menšie ako zvyčajne. Zdá sa, že trvalý pravý špičák a štvrtý horný premolár sa prerezali normálne

Pitevné nálezy

Telá 12/13 mačiek, u ktorých liečba nebola úspešná, boli podrobené pitve vrátane hrubého a histologického vyšetrenia a imunohistochémie postihnutých tkanív pre FIPV antigén. Odobrané a vyšetrené tkanivá zahŕňali reprezentatívne rezy všetkých hlavných brušných a hrudných orgánov, mozgu a očí. Hrubé vyšetrenie identifikovalo tri odlišné prezentácie. Päť mačiek nejavilo výrazné známky aktívnej FIP (CT01, CT02, CT05, CT08, C12), tri mali lézie zodpovedajúce neefúznej FIP (CT07, CT10, CT13) a štyri mali efúznu peritonitídu s multiorgánovým postihnutím (CT03, CT14, CT16, CT22). Histológia piatich mačiek, ktoré nevykazovali dostatočné dôkazy o chorobe, preukázala väčšinou mierne mononukleárne infiltráty, zvyčajne perivaskulárny zápal v oku, pečeni, črevnej stene a obličkách. Tri mačky s neefúznou FIP mali mierny až závažný zápal v mnohých orgánoch s najťažšími léziami v oku, mezenterických lymfatických uzlinách, obličkách a pľúcach. Tri mačky s efúznou FIP mali závažný pyogranulomatózny zápal vo viacerých brušných orgánoch vrátane omenta, pobrušnice, črevnej steny, mezenterických lymfatických uzlín, pečene a sleziny.

Závažný zápal typický pre cerebrálnu FIP bol prítomný v mozgu všetkých okrem jednej (CT07) z ôsmich mačiek, ktoré sa podrobili pitve bez výrazných hrubých známok FIP alebo s neefúznou FIP. Jedna mačka bez charakteristických mozgových lézií mala ťažký mozgový edém. Naproti tomu typické FIP lézie chýbali v mozgu všetkých troch pitvaných mačiek s efúznou FIP. Stereotypné FIP lézie mozgu boli charakterizované stredne ťažkou až ťažkou chronickou meningoencefalitídou a ventrikulitídou spojenou s periventrikulárnou nekrózou parenchýmu (obrázok 12a). Štvrtá komora bola postihnutá najťažšie a meningitída bola najčastejšie pozorovaná ventrálne do malého mozgu a mozgového kmeňa. Často sa pozorovali silné perivaskulárne manžety spojené s vaskulitídou. FIP antigén sa demonštroval imunoperoxidázovým zafarbením v mozgu 6/7 prípadov stereotypnej cerebrálnej FIP (obrázok 12b). Tkanivá z 11 pitvaných mačiek, sa testovali na prítomnosť FIPV RNA pomocou qRT-PCR. Všetky vykázali pozitívny výsledok, čím sa stanovila perzistencia vírusu u mačiek, u ktorých liečba nebola úspešná.

Obrázok 12.
Fotomikrografy lézie v mozgu mačky CT08. U tejto mačky sa počas počiatočnej liečby GC376 vyskytlo závažné neurologické ochorenie. (a) Štvrtá komora obsahuje bielkovinovú tekutinu zmiešanú s početnými neutrofilmi a makrofágmi, ktoré multifokálne zasahujú do okolitého zriedeného neuropilu. Veľké manžety lymfocytov a plazmatických buniek obklopujú krvné cievy (*) (farbenie hematoxylínom, zväčšenie 20x). (b) Viaceré bunky pripomínajúce peritoneálne makrofágy (vyznačená malá oblasť na obrázku 12a) vykazujú pozitívnu imunoreaktivitu pre mačací infekčný antigén peritonitídy (kontrastné farbivo hematoxylín, zväčšenie 600x).

Diskusia

Úspech v liečbe GC376 pri experimentálnej infekcii FIPV nás motivoval k preskúmaniu účinnosti GC376 pri prirodzene vyvinutej FIP. Medzi experimentálnou efúznou brušnou FIP a prirodzene sa vyskytujúcou chorobou existujú významné rozdiely. Experimentálna choroba obchádza kritické počiatočné štádium, ktoré začína u mačiatok vystavením neškodnému mačaciemu enterickému koronavírusu (FECV). Prirodzene sa vyskytujúca FIP je výsledkom špecifických mutantov, ktoré vznikajú po infekcii FECV, a FIP sa vyskytuje za prítomnosti imunity voči FECV. Experimentálna FIP je naopak indukovaná u mačiek, ktoré sa nestretli s koronavírusom intraperitoneálnou injekciou veľkej dávky purifikovaného FIPV získaného od laboratórnej mačky. Prirodzene sa vyskytujúca choroba je často subklinická po mnoho týždňov alebo mesiacov pred pozorovaním vonkajších príznakov choroby, zatiaľ čo experimentálne príznaky choroby sa objavia do 2–4 týždňov a rýchlo progredujú. Prirodzene sa vyskytujúca FIP má rôzne klinické formy, zatiaľ čo experimentálna infekcia má takmer vždy abdominálnu efúznu podobu. FIP v prírode je tiež ovplyvnená prostredím chorobu zvyšujúcich kofaktorov, zatiaľ čo experimentálne ochorenie sa vyskytuje u mačiek bez vonkajších vplyvov. Rozdiely môžu vysvetľovať, prečo sa choroba vyvinie len u malej časti mačiek prirodzene vystavených FIPV, zatiaľ čo 80–100% experimentálne infikovaných mačiek zomiera. Naše predpovede sa ukázali ako správne a prirodzene sa vyskytujúca FIP sa liečila oveľa ťažšie ako experimentálna choroba. Je však potrebné zdôrazniť, že tento pokus by nebol schválený bez informácií získaných z farmakokinetických štúdií, štúdií akútnej a chronickej toxicity a účinnosti uskutočňovaných na laboratórnych mačkách.

Bol to prvý pokus o použitie cieleného antivírusového lieku proti systémovému a vysoko smrteľnému veterinárne významnému ochoreniu. Aj keď zatiaľ nie sú k dispozícii žiadne špecifické antivírusové lieky na koronavírusové infekcie u ľudí alebo zvierat, na liečbu boli vyvinuté antivírusové lieky na iné vírusové infekcie ľudí, ako sú HCV a HIV-1, a použitie týchto liekov poskytlo solídny základ pre ich aplikáciu na choroby zvierat, ako je FIP. HCV infikuje hlavne pečeňové bunky a u väčšiny ľudí spôsobuje pretrvávajúcu vírusovú infekciu. Avšak len asi u 20–30% z nich sa rozvinú ochorenia pečene v časovom horizonte 20–30 rokov. Infekciu HCV je možné eliminovať nešpecifickou antivírusovou liečbou (interferón a ribavirín) po dobu 6–12 mesiacov u približne polovice pacientov a nedávnym zavedením priamo pôsobiacich antivírusových liekov v trvaní 3–6 mesiacov sa počas liečby podstatne zvýšila miera vyliečenia na viac ako 90% . HIV infekcia u ľudí vedie k predĺženému asymptomatickému stavu a nakoniec k pokročilému ochoreniu na HIV. HIV-1 infikuje T lymfocyty a makrofágy a prežíva v latentnom stave. Viac ako 30 antiretrovírusových liekov, z ktorých väčšina sa používa v kombinácii dvoch alebo viacerých liekov, sa úspešne použilo na zníženie vírusovej záťaže na nedetegovateľnú hladinu v krvi pacientov s HIV/AIDS. Vírus sa však po prerušení antivírusovej liečby vracia a vyžaduje tak celoživotnú antivírusovú liečbu. Šírenie vírusu do mozgu, ktoré je sprostredkované hlavne vírusom infikovanými makrofágmi, a následný vývoj neurologického ochorenia sa vyskytuje u viac ako 50% infekcií HIV. Neurologické zhoršenie preto stále zostáva dôležitým problémom aj v tejto dobe antivírusovej liečby. Tieto precedensy antivírusovej liečby infekcií HCV a HIV-1 ukazujú, že výsledok liečby (vírusový klírens vs perzistencia vírusu), trvanie liečby (konečná vs kontinuálna) a prítomnosť neurologických následkov sú výrazne ovplyvnené vírusovou patogenézou.

Táto štúdia bola obmedzená na 20 mačiek s FIP, ktoré predstavovali spektrum veku a foriem choroby. Aj keď bol počet liečených mačiek malý, zhromaždilo sa prekvapivé množstvo informácií, napríklad o tom, ako dlho sa má liečiť, o možných vedľajších účinkoch, o tom, ako identifikovať klinickú formu FIP, ktorá bude s najväčšou pravdepodobnosťou reagovať na liečbu, a potenciálnych ukazovateľoch zlyhania liečby a jej úspešnosti. Klinická štúdia bola založená na skúsenostiach získaných z farmakokinetických štúdií a štúdií účinnosti vykonaných na laboratórnych mačkách. Počiatočné obdobie liečby bolo na základe experimentálnych štúdií stanovené na 2 týždne, nakoniec sa však predĺžilo na 12 týždňov a viac na základe skúseností získaných v priebehu testovania. Toto konečné liečebné obdobie sa blížilo k 3–6 mesiacom používaným na liečbu infekcie HCV u ľudí s priamo pôsobiacimi antivírusovými liekmi. Na základe experimentálnych štúdií boli očakávané ťažkosti s liečením neurologických foriem choroby. Vedľajšie účinky boli prijateľné a zahŕňali pálenie pri aplikácii injekcie a dermálny a podkožný zápal, keď sa na rovnaké miesta podalo príliš veľa liečiva. Tento jav bol už predtým pozorovaný aj u laboratórnych mačiek. Závažnejší vedľajší účinok, ktorý sa predtým u laboratórnych mačiek nepozoroval, sa obmedzil na mačiatka a zahŕňal spomalený vývoj dospelých zubov a retenciu alebo oneskorenú stratu mliečnych zubov.

Liečba GC376 bola úspešná v indukcii významnej remisie príznakov ochorenia a regresie lézií u 19/20 mačiek. Tento výsledok potvrdzuje naše zistenia rýchleho zvratu klinických príznakov u laboratórnych mačiek s experimentálnou FIP liečených GC376, a rozšíril naše znalosti o účinkoch lieku na široké spektrum foriem prirodzene sa vyskytujúcej FIP. Mačky pochádzali z rôznych častí USA a dokonca aj z Peru, čo potvrdzuje, že geograficky rozmanité kmene FIPV boli voči tomuto inhibítoru rovnako citlivé. K výraznému zníženiu transkriptov vírusovej RNA vo výpotkoch došlo v priebehu niekoľkých dní liečby spolu s rýchlym zlepšením zdravotného stavu. Remisia ochorenia však pretrvávala 3 mesiace a dlhšie iba u 7/20 týchto mačiek. Neschopnosť dosiahnuť dlhodobú remisiu ochorenia bola nakoniec spojená s výskytom neurologického ochorenia pri absencii rozsiahlych brušných lézií alebo s opakovaním/pretrvávaním rozsiahlych brušných lézií za prítomnosti histologických lézií v mozgu a/alebo v očiach. Tieto objavy naznačujú, že FIPV má väčšiu tendenciu šíriť sa z telesných dutín do mozgu, ako sa pôvodne predpokladalo, najmä ak sa mu poskytne dostatok času. Toto rozšírenie s najväčšou pravdepodobnosťou zahŕňa infikované makrofágy, ktoré vstupujú do mozgu malými krvnými cievami v mozgových blanách a ependyme.

U mačky, u ktorých sa vyskytlo neurologické ochorenie, sa tak stalo buď počas liečby (CT05, CT08, CT22), alebo 2 (CT01, CT02, CT09), 3 (CT13) alebo 6 (CT10) týždňov po ukončení liečby. Najpravdepodobnejším vysvetlením tohto oneskorenia, ako aj určitej terapeutickej výhody vyšších dávok, bolo to, že časť GC376 bola stále schopná preniknúť do mozgu. Hladiny GC376 v mozgovomiechovom moku predstavovali iba 3% plazmy v mozgu 2 hodiny po subkutánnej injekcii v dávke 10 mg/kg (nezverejnené údaje). Aj keď boli relatívne koncentrácie liečiva v mozgu u týchto mačiek nízke, stále boli 21,4-krát vyššie ako hladiny potrebné na inhibíciu replikácie vírusu v tkanivovej kultúre. Na základe tohto zistenia sa predpokladalo, že vyššie dávky umožňujú prienik vyššieho množstva liečiva do mozgu. Tento predpoklad bol podporený skúsenosťami s dvoma mačkami, ktoré vykazovali neurologické príznaky. Zvýšenie dávky GC376 na 50 mg/kg každých 12 hodín u jednej mačky (CT01) viedlo k znateľnému zlepšeniu, ale neeliminovalo príznaky ochorenia mozgu. Zdá sa, že predĺženie liečby o takmer 3 mesiace v dávke 15mg/kg každých 12 h oddialilo progresiu neurologických príznakov u druhej mačky (CT12), zatiaľ čo pokusy znížiť celkovú dennú dávku u tejto mačky na 10mg/kg každých 12 hodín alebo 15mg/kg každých 24 hodín spôsobili zhoršenie neurologických príznakov. To naznačuje, že dávky 15 mg/kg každých 12 hodín alebo vyššie umožnili dostatočnému množstvu GC376 prekonať hematoencefalickú bariéru, aby spomalil, ale neeliminoval neurologické príznaky.

Vysoký výskyt ochorení centrálneho nervového systému (CNS) v tejto štúdii bol vyšší, ako sa uvádzalo predtým, a bol neočakávaný, pretože mačky so známkami postihnutia mozgu alebo miechy boli zo štúdie vylúčené. Choroby CNS sa ukázala omnoho pravdepodobnejšia u starších mačiek so suchou alebo zmiešanou formou FIP ako u mladých mačiek s vlhkou FIP. To naznačuje, že FIPV môže u mnohých mačiek preniknúť do mozgu, ak je mu poskytnutý dostatok času. Zdá sa, že pri infekcii CNS zohrávajú úlohu makrofágy peritoneálneho typu, pretože FIPV infikované bunky v mozgu mačiek s neurologickou FIP sa viac podobajú skôr peritoneálnym makrofágom ako rezidentným mozgovým makrofágom. To by nemalo byť prekvapujúce, pretože makrofágy migrujú do rôznych tkanív, vrátane mozgu, na vykonávanie imunitného dohľadu a sú tiež cieľmi pre celý rad infekčných agensov, ako sú FIPV a HIV-1. Infikované makrofágy hrajú hlavnú úlohu pri šírení vírusu do mozgu u pacientov s HIV a detekcia vírusu v mozgu je možná v priebehu niekoľkých týždňov po infikovaní. K neurologickému poškodeniu však zvyčajne dôjde v neskoršom štádiu. Lieky proti HIV tiež znižujú frekvenciu závažných neurologických porúch, podobne, ako sa pozorovalo v tejto štúdii o FIPV a GC376. Existujú aj alternatívne vysvetlenia. Je možné, že extra-CNS účasť môže inhibovať rozvoj mozgových ochorení a naopak. Je bežné, že sa ochorenie CNS vyskytuje pri neprítomnosti viscerálneho ochorenia a naopak. Potlačenie replikácie vírusu v neneuronálnych tkanivách môže tiež zvýšiť pozitívnu selekciu mutantov, ktoré sú neurotropnejšie alebo neurovirulentnejšie. Dôkaz druhej možnosti by si však vyžadoval veľké štúdie s použitím laboratórnych mačiek.

Zdalo sa, že určité formy FIP ovplyvňovali úspešnosť liečby. Chovanie GC376 pri liečbe okulárnej FIP bolo paradoxné, pretože táto forma mimoriadne dobre reagovala na GC376. Aj keď očné lézie reagovali na liečbu, všetky tri mačky s postihnutím očí nakoniec podľahli mozgovým ochoreniam, čo podporilo blízky anatomický vzťah oka a CNS. Chronické ileocekálne postihnutie a postihnutie hrubého čreva a spomalený rast u starších mačiek v tejto štúdii taktiež predstavovali zlú prognózu. U mnohých z týchto mačiek sa objavil brušný výpotok iba ako terminálny prejav ich choroby. Hostiteľské faktory tiež spojené so zníženou odpoveďou na antivírusovú liečbu pri iných vírusových infekciách, ako je HCV, zahŕňajú vek, pohlavie, cirhózu alebo fibrózu pečene, rasu alebo telesnú hmotnosť.

Vznik rezistencie je hlavným problémom každého antivírusového lieku, ale FIPV sa zriedka prenáša z mačky na mačku, a rezistencia na liečivo, ak by sa vyskytla, by predstavovala problém iba pre jednotlivé liečené mačky, a nie pre celú populáciu. Aj keď vírusová rezistencia na GC376 nebola pozorovaná až do 20 pasáží in vitro, čo naznačuje, že rezistencia sa nedá získať ľahko, dlhodobá a opakovaná liečba in vivo môže predstavovať silnejší selekčný faktor. Zdá sa však, že vírusová rezistencia nebola zodpovedná za relapsy brušných chorôb u piatich liečených mačiek. Tieto mačky mali granulomatózne útvary, často v hrubom čreve a ileo-cekálno-kolických lymfatických uzlinách, ktoré mohli poskytovať chránené miesto na pretrvanie vírusov. Ochrana patogénov v granulómoch je pre mykobaktérie dobre zdokumentovaným javom a vzťahuje sa na ďalšie patogény, ako sú vírusy. Stav ochorenia pečene (cirhóza) pri infekcii HCV tiež zvyšuje riziko relapsu a vyžaduje dlhšiu liečbu, čo tiež naznačuje, že vírusy môžu byť chránené pred liekmi, keď sa nachádzajú na určitých chránených miestach. Formácia „ochranných granulómov“ zahŕňa veľké množstvo chemokínov a cytokínov a zvyšovanie regulácie chemokínových receptorov, adresínov, selektínov a integrínov. Perzistencia patogénov na týchto chránených miestach môže vyžadovať vyššiu dávka lieku a dlhšiu dobu trvania liečby.

Zlyhania liečby môžu tiež byť výsledkom neschopnosti hostiteľa dosiahnuť ochrannú imunitnú reakciu počas obdobia, keď je potlačená replikácia vírusu. Takéto zlyhanie sa pozorovalo pri infekcii HCV u ľudí. Imunita sprostredkovaná T-lymfocytmi hrá dôležitú úlohu v ochrannej imunite, ktorá sa vyskytuje asi u 20% akútnej infekcie HCV, a pri rovnakom alebo väčšom podiele infekcie FIPV. Je ešte potrebné preskúmať možnú synergiu vírusového klírensu sprostredkovaného T-lymfocytmi a antivírusovej terapie u mačiek s FIP. Prínosom by mohla byť aj kombinácia antivírusových liekov a stimulantov imunity T-lymfocytov pri liečbe FIP, ako je kombinácia interferónov a ribavirínu pri liečbe infekcie HCV.

Trvalá remisia u 6/7 mačiek liečených 12 týždňov alebo dlhšie bola do istej miery predvídateľná. Tieto mačky boli vo veku 3,3–4,4 mesiaca, keď sa u nich prejavili akútne príznaky brušnej (C15, C17, C18, CT21, CT23) alebo hrudnej efúznej FIP (CT20). To ich urobilo mladšími ako všetky ostatné mačky v štúdii okrem troch (CT8, CT16, CT21) a viac sa podobali 16-týždňovým laboratórnym mačkám s akútnym nástupom efúznej FIP, ktoré dobre reagovali na GC376. Choroba, ak je akútna, dáva vírusu na prienik do mozgu alebo očí málo času. Akútnosť ich ochorenia mohla tiež umožniť kratšiu dobu, aby infekcia natrvalo narušila akúkoľvek ochrannú imunitnú odpoveď. Siedma mačka, CT04, bola oproti týmto šiestim mladším mačkám extrémom. CT04 bola so svojimi 6,8 rokmi najstaršou mačkou v štúdii, u ktorej došlo k výraznému úbytku hmotnosti (30%) a ochoreniu obmedzenému na mezenterické lymfatické uzliny. CT04 utrpela relapsy choroby vyžadujúce obnovenie liečby, ale všetky relapsy boli identické so vstupým stavom a nezahŕňali CNS. Je známe, že mačky s touto formou FIP prechádzajú spontánnou remisiou, čo naznačuje, že existuje bod zlomu medzi imunitou a chorobou. Mačky CT04 a CT21 demonštrovali múdre rozhodnutie znovuzahájenia liečby pri relapse, za predpokladu, že relapsy nezahŕňajú oči alebo nervový systém a stále reagujú na lieky.

Stanovenie minimálnej doby trvania liečby bolo založené na postupnom predlžovaní trvania liečby na základe priaznivej reakcie na liečbu. Na základe experimentálnych štúdií sa očakávalo, že môžu byť postačujúce 2 týždne liečby; to sa teda použilo ako východiskový bod. Táto štúdia však naznačila, že minimálna doba liečby sa blížila k 12 týždňom, čo sa prekvapivo blížilo k zvyčajnému 12-týždňovému obdobiu, ktoré je potrebné na liečbu ľudí s HCV pomocou inhibítorov proteázy. Avšak doba liečby HCV sa môže pohybovať od 8 do 24 týždňov u rôznych ľudí. Mačka CT21 bola navonok zdravá, aktívna a po 12 týždňoch liečby rástla, ale celkový počet bielkovín a bielych krviniek sa stále nevrátil do normálu, ako tomu bolo u ostatných šiestich mačiek. Napriek tomu sa rozhodlo o ukončení liečby po 17 týždňoch z dôvodu dlhého obdobia navonok normálneho zdravia. To, či by dlhodobejšia liečba mohla zabrániť relapsu choroby 13 týždňov po ukončení liečby, si môžeme len domýšľať, ale zvyšuje to pochybnosť o tom, aká dlhá má vôbec byť potrebná doba liečby u niektorých mačiek. Nastoľuje sa tiež otázka, ako dlhé musí byť obdobie remisie, aby sme mohli prehlásiť že došlo k uzdraveniu, a nielen k dlhodobej remisii. Najdlhšie obdobie bez choroby bolo v čase písania tohto článku viac ako 11 mesiacov, pričom päť ďalších mačiek bolo bez známok infekcie po dobu 5–9 mesiacov. Na základe klinických a histologických dôkazov neurologického ochorenia v čase smrteľných relapsov sa zdá, že sa vírus nakoniec dostane do mozgu a že to môže byť najdôležitejším obmedzujúcim faktorom pri antivírusovej liečbe FIP.

Aj keď dlhodobo prežila iba jedna tretina mačiek, 20 mačiek v tejto štúdii poskytuje základ pre budúce štúdie s GC376 a ďalšími antivírusovými liekmi, ktoré budú nasledovať. Nie všetky mačky budú liečiteľné, ale to by nemalo zastaviť úsilie. V tejto obmedzenej štúdii sa takmer všetkým liečeným mačkám vrátil normálny zdravotný stav, aj keď iba na niekoľko týždňov alebo mesiacov. Je dôležité si uvedomiť univerzálnosť vírusových patogénov a využiť priekopnícky vývoj liekov, ktoré sa klinicky uplatňujú pri liečbe ľudských chorôb, ako je HIV/AIDS, hepatitída C, MERS, SARS, Ebola a chrípka.

Závery

Inhibícia FIPV 3CLpro s pomocou GC376 sa za podmienok štúdie ukázala ako účinná a viedla k zníženiu replikácie vírusu a k remisii príznakov choroby u mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou FIP mimo CNS. K trvalej remisii v tejto štúdii však dochádzalo skôr u mačiatok vo veku nižšom ako 18 týždňov s akútnou vlhkou FIP alebo u mačiek so suchou FIP obmedzenou na mezenterickú lymfatickú uzlinu a je menej pravdepodobné, že sa vyskytne u mačiek starších ako 18 týždňov so suchou, zmiešanou alebo okulárnou formou FIP. Neschopnosť dosiahnuť trvalú remisiu bola spojená buď s vysokým výskytom neurologických ochorení počas alebo po ukončení liečby alebo s recidívou brušných lézií. Zdá sa, že antivírusová liečba spomalila progresiu neurologického ochorenia, ale nedokázala ju zvrátiť pri dávke použitej v tejto štúdii. Príčina recidívy extra-neurologického ochorenia pri liečbe nebola stanovená, ale nesúvisela s mutáciami v oblasti viažucej proteázu.

Poznámky pod čiarou

Prijaté: 3.8.2017

Doplňujúci materiál: Formulár informovaného súhlasu majiteľa.

Konflikt záujmov: YK, KOC a WCG majú v rukopise patentové nároky na inhibítory proteázy. Ostatní autori neprehlasujú žiadne potenciálne konflikty záujmov v súvislosti s výskumom, autorstvom alebo publikovaním tohto článku.

Financovanie: Hlavná podpora tejto štúdie bola umožnená vďaka grantu od Morris Animal Foundation, Denver, CO, USA. Ďalšie prostriedky na technickú podporu a starostlivosť o zvieratá poskytli Fond Philipa Raskina, Kansas City, SOCK FIP, grant National Institutes of Health R01AI109039 a Centrum pre zdravie spoločenských zvierat, Kalifornská univerzita, Davis, CA, USA.

Literatúra

1.Prokofjeva, MM, Kochetkov, SN, Prassolov, VS. Therapy of HIV infection: current approaches and prospects. Acta Naturae 2016; 8: 23–32.
Google Scholar | Crossref | Medline
2.Carter, W, Connelly, S, Struble, K. Reinventing HCV treatment: past and future perspectives. J Clin Pharmacol 2017; 57: 287–296.
Google Scholar | Crossref | Medline
3.Kim, Y, Lovell, S, Tiew, KC. Broad-spectrum antivirals against 3C or 3C-like proteases of picornaviruses, noroviruses, and coronaviruses. J Virol 2012; 86: 11754–11762.
Google Scholar | Crossref | Medline
4.Kim, Y, Mandadapu, SR, Groutas, WC. Potent inhibition of feline coronaviruses with peptidyl compounds targeting coronavirus 3C-like protease. Antiviral Res 2013; 97: 161–168.
Google Scholar | Crossref | Medline
5.Kim, Y, Shivanna, V, Narayanan, S. Broad-spectrum inhibitors against 3C-like proteases of feline coronaviruses and feline caliciviruses. J Virol 2015; 89: 4942–4950.
Google Scholar | Crossref | Medline
6.Kim, Y, Liu, H, Galasiti Kankanamalage, AC. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog 2016; 12: e1005531.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
7.Miller, FG, Brody, H. What makes placebo-controlled trials unethical? Am J Bioethics 2002; 2: 3–9.
Google Scholar | Crossref | Medline
8.Chiodo, GT, Tolle, SW, Bevan, L. Placebo-controlled trials good science or medical neglect? West J Med 2000; 172: 271–273.
Google Scholar | Crossref | Medline
9.Van Kruiningen, HJ, Ryan, MJ, Shindel, NM. The classification of feline colitis. J Comp Pathol 1983: 93: 275–294.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
10.Pedersen, NC, Eckstrand, C, Liu, H. Levels of feline infectious peritonitis virus in blood, effusions, and various tissues and the role of lymphopenia in disease outcome following experimental infection. Vet Microbiol 2015; 175: 157–166.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
11.Pellerin, M, Lopez-Aquirre, Y, Penin, F. Hepatitis C virus quasispecies variability modulates nonstructural protein 5A transcriptional activation, pointing to cellular compartmentalization of virus-host interactions. J Virol 2004; 78: 4617–4627.
Google Scholar | Crossref | Medline
12.Pedersen, NC, Allen, CE, Lyons, LA. Pathogenesis of feline enteric coronavirus infection. J Feline Med Surg 2008; 10: 529–541.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
13.Pedersen, NC . A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963–2008. J Feline Med Surg 2009; 11: 225–258.
Google Scholar
14.Pedersen, NC . An update on feline infectious peritonitis: virology and immunopathogenesis. Vet J 2014; 201: 123–132.
Google Scholar | Crossref | Medline
15.Pedersen, NC, Liu, H, Durden, M. Natural resistance to experimental feline infectious peritonitis virus infection is decreased rather than increased by positive genetic selection. Vet Immunol Immunopathol 2016; 171: 17–20.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
16.Pedersen, NC, Liu, H, Gandolfi, B. The influence of age and genetics on natural resistance to experimentally induced feline infectious peritonitis. Vet Immunol Immunopathol 2014; 162: 33–40.
Google Scholar | Crossref | Medline
17.Clifford, DB . HIV-associated neurocognitive disease continues in the antiretroviral era. Top HIV Med 2008; 16: 94–98.
Google Scholar | Medline
18.Foley, JE, Lapointe, JM, Koblik, P. Diagnostic features of clinical neurologic feline infectious peritonitis. J Vet Intern Med 1998; 12: 415–423.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
19.Mesquita, LP, Hora, AS, de Siqueira, A. Glial response in the central nervous system of cats with feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2016; 18: 1023–1030.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
20.Pedersen, NC . Feline infectious peritonitis: something old, something new. Feline Pract 1976; 6: 42–51.
Google Scholar
21.Valcour, V, Sithinamsuwan, P, Letendre, S. Pathogenesis of HIV in the central nervous system. Curr HIV/AIDS Rep 2011; 8: 54–61.
Google Scholar | Crossref | Medline
22.Joseph, SB, Arrildt, KT, Sturdevant, CB. HIV-1 target cells in the CNS. J Neurovirol 2015; 21: 276–289.
Google Scholar | Crossref | Medline
23.Spudich, S, Gonzalez-Scarano, F. HIV-1-related central nervous system disase: current issues in pathogenesis, diagnosis and treatment. Cold Spring Harb Perspect Med 2012; 2: a007120
Google Scholar | Crossref | Medline
24.Cavalcante, LN, Lyra, AC. Predictive factors associated with hepatitis C antiviral therapy response. World J Hepatology 2015; 7: 1617–1631.
Google Scholar | Crossref | Medline
25.Saunders, BM, Cooper, AM. Restraining mycobacteria: role of granulomas in mycobacterial infections. Immunol Cell Biol 2000; 78: 334–334.
Google Scholar | Crossref | Medline
26.Smyk-Pearson, S, Tester, IA, Klarquist, J. Spontaneous recovery in acute human hepatitis C virus infection: functional T-cell thresholds and relative importance of CD4 help. J Virol 2008; 82: 1827–1837.
Google Scholar | Crossref | Medline
27.Legendre, AM, Bartges, JW. Effect of polyprenyl immunostimulant on the survival times of three cats with the dry form of feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2009; 11: 624–626.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
28.Legendre, AM, Kuritz, T, Galyon, G. Polyprenyl immunostimulant treatment of cats with presumptive non-effusive feline infectious peritonitis in a field study. Front Vet Sci 2017; 4: 7.
Google Scholar | Crossref | Medline
Publikované

FIP a Polyprenyl Imunostimulant (PI)

Pôvodný článok: FIP and Polyprenyl immunostimulant (PI) publikovaný na webe UC Davis.

Na základe doteraz predložených výsledkov nemôže CCAH odporúčať PI ako prostriedok na predĺženie života mačiek pri akejkoľvek forme FIP.

Polyprenyl Imunostimulant

Polyprenyl imunostimulant (PI) je podľa USDA klasifikovaný ako biofarmaceutikum a vyrába ho spoločnosť Sass and Sass v Tennessee. PI dostal podmienenú licenciu od USDA ako terapeutikum na liečbu „príznakov“ infekcie mačacím herpesvírusom. Podľa webových stránok Sass a Sass uskutočňujú výskum jeho použitia pri liečbe FIP a iných chorôb spoločenských zvierat. Aj keď nemá schválenie USDA pre liečbu FIP, v súčasnosti sa bežne používa na predĺženie života mačiek s ľahšími formami FIP. Nepreukázal žiadny prínos pri liečbe alebo predĺžení života mačiek s vlhkou FIP alebo mačiek so známkami závažného ochorenia na začiatku liečby. Aj keď podľa webu a podľa tvrdení istých jednotlivcov poskytuje možnosť predĺženia života mačiek s FIP, najmä miernejších suchých foriem, je dôležité preskúmať, čo je známe o účinnosti PI, ak sa používa na tento účel. Pre mačku priemernej veľkosti a pri štandardnom dávkovaní PI môže stáť viac ako 400 dolárov mesačne, a tieto náklady sa môžu navýšiť o súvisiace veterinárne výdaje.

Prvou správou o použití PI pre liečbu FIP bol článok Effect of Polyprenyl Immunostimulant on the survival times of three cats with the dry form of feline infectious peritonitis, ktorý publikoval Dr. Al Legendre a kolegovia v roku 2009. V tejto štúdii boli zaradené tri mačky so suchou formou FIP liečené polyprenyl imunostimulantom. Dve z troch mačiek boli stále na liečbe a živé a zdravé 2 roky po diagnóze. Tretia mačka prežila 14 mesiacov, ale liečila sa iba 4,5 mesiaca. Je však dôležité vedieť, že tieto tri mačky trpeli ochorením obmedzeným na črevné lymfatické uzliny a že dve z mačiek v čase diagnózy nejavili žiadne príznaky choroby (u jednej bola choroba odhalená počas kastrácie a u druhej pri rutinnom palpačnom vyšetrení kvôli darcovstvu krvi). Tretia mačka bola trochu zanedbaná a mala hmatateľnú črevnú lymfatickú uzlinu. Krvné testy a biopsie lymfatických uzlín boli kompatibilné s diagnózou FIP. Všetky tri mačky boli liečené pomocou PI. Jedna mačka liečená 27 mesiacov zotrvávala klinicky normálna, hoci mala stále krvné zmeny naznačujúce subklinické ochorenie. Druhá mačka bola liečená 10 mesiacov a vyzerala normálne so zväčšením lymfatických uzlín. Tretia mačka bola liečená prvé 3 mesiace, pokračovala v chudnutí a liečba bola prerušená. Táto mačka zomrela o 11 mesiacov neskôr na FIP. Autori verili, že tieto výsledky preukázali určitý terapeutický prínos liečby PI za predpokladu, že všetky mačky s FIP zvyčajne umierajú do 200 dní alebo menej. Dôležitosť liečby u týchto troch mačiek je otázna. Nielenže ich počet bol malý, ale niektoré mačky bez alebo s minimálnymi známkami ochorenia a lézií lokalizovaných v brušnej lymfatickej uzline sa časom spontánne zotavia. Navyše sa zdá, že iba jedna z troch mačiek sa zotavila úplne; jedna na FIP uhynula a jedna mala na konci liečby príznaky subklinickej infekcie. Autori dospeli k záveru, že „na posúdenie potenciálu polyprenyl imunostimulantu sú potrebné ďalšie štúdie“ a pre zaradenie do nasledujúcej štúdie sa budú zvažovať iba mačky s dobre zdokumentovanou suchou formou FIP.

Následnú štúdiu 102 mačiek s diagnostikovanou suchou FIP Dr. Legende predstavil v roku 2012 na fóre ACVIM. Výsledky tejto štúdie boli nasledovné: „Dáta mačiek s podozrením na FIP boli dôkladne overené a do štúdie boli prijaté mačky, ktoré spĺňali inklúzne kritériá. Podľa predchádzajúcich skúseností sme nevideli žiadny prínos PI u mačiek s vlhkou formou FIP a tieto boli zo štúdie vylúčené. Do štúdie bolo zahrnutých celkovo 58 mačiek s diagnózou „suchej“ formy FIP liečených polyprenyl imunostimulantom. Začali sme s celkovo 102 mačkami, ale mačky, ktoré uhynuli pred začatím liečby PI, mačky, ktoré uhynuli pred uplynutím týždňa liečby PI, a mačky, u ktorých sme nemali k dispozícii následné hodnotenie, boli vylúčené. V štúdii sa nachádzala široká škála čistokrvných a domácich krátkosrstých mačiek. Mačky mali očnú, neurologickú a brušnú formu suchej FIP, pričom najbežnejšia bola brušná forma. 9% mačiek malo nejasné príznaky bez postihnutia konkrétneho orgánu. Tri mačky žili dlhšie ako 365 dní (5%), 22% mačiek bolo nažive najmenej 165 dní. Zdá sa, že PI zlepšuje pohodu liečených mačiek. “

Je pozoruhodné, že 44 z celkového počtu mačiek zaradených do štúdie bolo vyradených, pretože buď uhynuli pred zahájením liečby, uhynuli po podaní lieku menej ako jeden týždeň, alebo neboli opakovane dostupné/vyšetrené kvôli následnému hodnoteniu. Dve zo skupín, ktoré boli zo štúdie vylúčené, mali zjavne závažné ochorenie a je vysoko pravdepodobné, že väčšina mačiek nedostupných pre ďalšie sledovanie buď uhynula, alebo nereagovala na liečbu a mala tiež závažné ochorenie. Z 58 mačiek s miernejšou suchou FIP, ktoré zostali v štúdii, malo 9% (5/58) neurčité príznaky bez postihnutia špecifických orgánov, t.j. choroba nebola potvrdená. Aj vrátane týchto mačiek iba 22% (12/58) bolo nažive po 165 dňoch a iba 5% (3/58) týchto mačiek bolo nažive po 365 dňoch.

Majitelia, ktorí uvažujú o použití terapie PI u svojej mačky s FIP, by mali starostlivo zvážiť tieto predchádzajúce zistenia, ako aj náklady na liečbu. Mačky s vlhkou FIP alebo ťažkou suchou FIP na túto liečbu nereagujú. Z mačiek s ľahšou formou suchej FIP bude o rok neskôr stále nažive iba 5%. Jediné tvrdenie vedcov alebo výrobcu je, že liečba PI môže predĺžiť život u podskupiny mačiek s miernejšou suchou FIP. Pretože táto štúdia nezahŕňala žiadne placebo kontroly, a vzhľadom na skutočnosť, že malé percento mačiek so suchou FIP môže žiť bez liečby PI mnoho mesiacov a dokonca rokov, je aj toto tvrdenie potrebné brať s určitou skepsou. Na základe doteraz predložených výsledkov nemôže CCAH odporúčať PI ako prostriedok na liečbu alebo dokonca predĺženie života mačiek s akoukoľvek formou FIP.

Phosprenyl

Polyprenyl imunostimulant ako potenciálna liečba pre mačky s FIP má zaujímavú históriu, ktorá siaha z Ruska až do Spojených štátov. Výskum a chemická štruktúra PI je založená na biologickom „rastlinnom extrakte“ zvanom Phosprenyl, ktorý sa v Rusku používa na liečbu širokej škály vírusových infekcií u mnohých druhov zvierat. PI tak môže mať ruský pôvod.

Poznámka prekladateľa: S ohľadom na cenu PI a jeho veľmi sporný účinok a nutnosť nekonečnej „liečby“, je otázne, či vôbec má zmysel investovať peniaze do tejto zjavne len podpornej terapie, alebo radšej ísť to reálnej liečby s GS441524, na konci ktorej je skutočne zdravá mačka. Za mňa je voľba jasná.

Zdroje:

Publikované

Liečba FIP remdesivirom

Pôvodný článok: Treatment of FIP in cats with Remdesivir
Richard Malik DVSc PhD FACVSc FASM

Až donedávna bola diagnóza FIP pre mačacieho pacienta rozsudkom smrti. Aj keď omega-interferón a polyprenyl imunostimulant vykazovali v niektorých prípadoch isté účinky, väčšina mačiek a mačiatok s diagnostikovanou FIP uhynula, alebo z dôvodu zlého stavu bola nutná eutanázia.

Obrázok 1. (A) BOVA Remdesivir rekonštituovaný a pripravený na liečbu. (B) Cesta, ktorú Remdesivir absolvuje intracelulárne, aby sa aktivoval ako GS-441524

To všetko sa zmenilo pred niekoľkými rokmi, keď vyvrcholil celoživotný výskum FIP profesora Nielsa C. Pedersena z UC Davis. Niels najprv dokázal pomocou inhibítora proteázy GC-376 zachrániť životy niekoľkých mačiek s FIP, a čoskoro potom ukázal, že nukleozidový analóg GS-441524 je pri liečbe FIP ešte účinnejší, aj keď požadovaná dávka závisela na tom, či došlo k očnému postihnutiu alebo postihnutiu CNS. GS-441524 bol liek vyvinutý americkou spoločnosťou Gilead, ktorá však bohužiaľ neprejavila záujem o ďalší výskum molekuly pre veterinárne využitie pri liečbe FIP. Aby sa vyplnilo prázdne miesto pre účinnú terapiu FIP, začali rôzne spoločnosti vyrábať GS-441524 a predávať ho na čiernom trhu. Aj keď to bolo veľmi drahé, dostupnosť kvalitného GS-441524 poskytovala odhodlaným majiteľom mačiek spôsob, ako zachrániť mačky s vlhkou alebo suchou FIP, hoci obstaranie tohto lieku bolo komplikované, zvyčajne spojené s pomocou facebookovej skupiny. Bohužiaľ pre milovníkov mačiek, APVMA a Australian Veterinary Practitioner Board sa nakoniec postarali o výrazné sťaženie importu GS-441524 a jeho použitia pre veterinárne účely, s represívnymi opatreniami pre veterinárnych lekárov, ktorí chceli pomáhať mačkám s FIP.

Je iróniou, že riešenie tohto problému priniesla pandémia COVID 19. Spoločnosť Gilead vyvinula remdesivir (GS-5734) pre liečbu ľudskej koronavírusovej choroby. Tento liek dostal dočasnú registráciu TGA v júni 2020 na liečbu infekcií SARS-Cov-2 u ľudských pacientov. Tento proces by za normálnych okolností trval niekoľko rokov, ale COVID ho urýchlil. Remdesivir je v podstate GS-441524 s pridaním niekoľkých ďalších fosfátových skupín na zlepšenie intracelulárnej penetrácie (obrázok 1B). Pretože remdesivir je schváleným humánnym liekom, je možné ho použiť off-label aj vo veterinárnej praxi, ako je napríklad liečba FIP u mačiek. Tým sa obišli problémy s používaním nelicencovaného lieku zakúpeného na čiernom trhu a súvisiace problémy s nepreukázanou účinnosťou, čistotou a konzistenciou.

Obrázok 2. Suchá FIP s pyogranulomatóznym zápalom intraabdominálnych lymfatických uzlín. Namiesto vykonania prieskumnej laparotómie, biopsie lymfatických uzlín, histológie a imunohistológie by mohlo byť nákladovo efektívnejšie vyskúšať 3-dennú intravenóznu liečbu Remdesivirom.

Spoločnosti BOVA Aus sa podarilo zabezpečiť spoľahlivý zdroj remdesiviru. Štúdie v Austrálii určili dobu trvanlivosti a in vitro potvrdili účinnosť proti koronavírusom. Posledných 6 týždňov ho používame v klinickej praxi pre liečbu FIP. Niektoré z týchto prípadov boli novodiagnostikované mačky, zatiaľ čo iné boli mačky, ktoré sa už zlepšili pomocou produktu GS-441524 získaného z čierneho trhu, ktorý sa stal následne nedostupným. Liečilo sa niekoľko prípadov vlhkej a suchej FIP. Aj na základe malého počtu mačiek sa zdá, že remdesivir je veľmi účinný pri liečbe infekcií FIP. Jeho subkutánna aplikácia je o niečo ľahšia v porovnaní s GS-441524, a zdá sa, že je o niečo menej bolestivá. Dodáva sa v 100 mg vialke, ktorá sa riedi s 9 ml sterilnej vody pre injekčné roztoky, čím sa získa roztok s koncentráciou 10 mg/ml (10 ml vialka po rozriedení).

U novodiagnostikovaných mačiek so závažným priebehom ochorenia sme sa rozhodli počas prvých 3 dní liečby pre intravenóznu aplikáciu remdesiviru vo vysokej počiatočnej dávke (10mg/kg rozpustenej v 10ml fyziologického roztoku a podávanej počas 10 minút), čím sa dosiahol rýchly nástup antivírusového účinnku; Klinické príznaky mačiek sa počas úvodnej terapie výrazne zlepšili v priebehu 2 – 3 dní. Mačky potom prechádzajú na subkutánnu liečbu, zvyčajne pri nižšej dávke. Pre bežné prípady FIP sme používali 5-6 mg/kg raz denne (SIUD), pretože sa predpokladá, že remdesivir je približne rovnako účinný ako GS-441524 (Niels Pedersen, osobná komunikácia). V prípade zjavného postihnutia očí sa doporučuje dávkovanie 8mg/kg SID a mačkám s neurologickou FIP s príznakmi postihnutia CNS sa podáva 10mg/kg SID. Liečba potom pokračuje aplikáciou denných subkutánnych injekcií ďalšie 2-3 mesiace. U mačiek, pre ktoré boli SC injekcie bolestivé, sme na sedáciu/analgéziu použili gabapentín a/alebo buprenorfín, a v niektorých prípadoch sme každých 5 dní zaviedli nový cefalický katéter, ktorý umožnil majiteľom intravenóznu aplikáciu. V situáciách, keď si majitelia nemohli dovoliť celú liečbu, alebo keď injekcie boli príliš bolestivé, sme po úvodnej terapii Remdesivirom použili meflochín (62,5 mg 2-3 krát týždenne; získaný od BOVA alebo miestnej lekárne) pre jeho antivirotický účinok založený na práci Jacqui Norrisa a kolegov z University of Sydney.

Obrázok 3. Ktorá mačka má FIP a je liečená remdesivirom?

Hlavnou výhodou liečby FIP Remdesivirom je, že aktívna látka, ktorú používame, je prítomná v schválenom lieku pre humánne použitie. Ide len o vypísanie receptu s menom a adresou klienta, menom pacienta a dávkou, ktorá sa má podať. BOVA môže zvyčajne pripraviť a poskytnúť vialky ktorémukoľvek veterinárnemu lekárovi v Austrálii do 24-48 hodín. V súčasnosti sú náklady na 100mg vialku 250 dolárov plus GST a poštovné, aj keď je možné, že sa cena časom zníži z dôvodu väčsích odberov. Veríme, že väčšina majiteľov sa bude cítiť oveľa lepšie, ak získajú produkt od známej austrálskej spoločnosti, než aby posielali peniaze do zahraničia a dúfali, že sa lieky z čierneho trhu dostanú bezpečne z Číny do Austrálie.

Veterinári, ktorí sa chcú dozvedieť viac o tejto možnosti liečby, alebo majú všeobecné otázky týkajúce sa FIP, ma môžu kontaktovať e-mailom (richard.malik@sydney.edu.au). Diagnóza FIP presahuje rámec tohto informačného bulletinu, ale mačky s efúznou formou sa najľahšie diagnostikujú cytologickým vyšetrením a analýzou výpotku, a následnou imunohistochémiou na VPDS, University of Sydney (ľahko zariadiť prostredníctvom Vetnostics, QML, ASAP , VetPath, Gribbles alebo IDEXX). Suchá FIP je problematickejšia, pretože zvyčajne vyžaduje presnú aspiračnú biopsiu pyogranulomatóznych lézií v pečeni, obličkách alebo brušných lymfatických uzlinách. Zistili sme, že 3 dni intravenóznej terapie Remdesivirom môžu byť použité ako nákladovo efektívny terapeutický test u mačiek so suchou FIP ako alternatíva k biopsii intraabdominálnych štruktúr pri prieskumnej laparotómii, pretože v prípadoch FIP dochádza k rýchlemu zlepšeniu väčšiny klinických príznakov. Ak sa veterinári nechcú do liečby Remdesivirom pustiť sami, môžeme doporučiť veterinárnych lekárov so záujmom o liečbu FIP, ktorí by radi takéto prípady prijali.

Zdroje

Kim, Y.; Liu, H.; Galasiti Kankanamalage, A.C.; Weerasekara, S.; Hua, D.H.; Groutas, W.C.; Chang, K.O.; Pedersen, N.C. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog. 2016, 12, e1005531.

Pedersen, N.C.; Kim, Y.; Liu, H.; Galasiti Kankanamalage, A.C.; Eckstrand, C.; Groutas, W.C.; Bannasch, M.; Meadows, J.M.; Chang, K.O. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2018, 20, 378–392.

Murphy, B.G.; Perron, M.; Murakami, E.; Bauer, K.; Park, Y.; Eckstrand, C.; Liepnieks, M.; Pedersen, N.C. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet. Microbiol. 2018, 219, 226–233.

Pedersen, N.C.; Perron, M.; Bannasch, M.; Montgomery, E.; Murakami, E.; Liepnieks, M.; Liu, H. Efficacy, and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J. Feline Med. Surg. 2019, 21, 271–281

Dickinson PJ, Bannasch M, Thomasy SM, et al. Antiviral treatment using the adenosine nucleoside analogue GS-441524 in cats with clinically diagnosed neurological feline infectious peritonitis. Journal of Veterinary Internal Medicine. 2020. doi: 10.1111/jvim.15780.

McDonagh, P.; Sheehy, P.A.; Norris, J.M. Identification and characterisation of small molecule inhibitors of feline coronavirus replication. Vet. Microbiol. 2014, 174, 438–447.

sk_SKSK
en_GBEN sk_SKSK