Dlhá história Beta-d-N4-hydroxycytidínu a jeho moderná aplikácia na liečbu Covid-19 u ľudí a FIP u mačiek.

Niels C. Pedersen DVM, PhD
Originálny článok: The long history of Beta-d-N4-hydroxycytidine and its modern application to treatment of Covid-19 in people and FIP in cats.

Beta-d-N4-hydroxycytidín je malá molekula (nukleozid), ktorá bola študovaná koncom 70. rokov v bývalom Sovietskom zväze ako súčasť výskumu biologických zbraní [2]. Weaponizácia chorôb, ako sú kiahne, bola celosvetovým postrachom, ale nebezpečenstvo použitia vírusu kiahní na tento účel bolo príliš veľké. Pravé kiahne boli zo sveta vykorenené, prakticky všetky zásoby zničené a ďalší výskum zakázaný. To viedlo USA a Sovietsky zväz k výskumu ďalších RNA vírusov ako biologických zbraní a antivirotík na obranu proti nim. Vírus venezuelskej konskej encefalomyelitídy (VEEV) bol jedným z prvých vírusov, u ktorého sa seriózne zvažovalo jeho využitie ako biologickej zbrane [3]. VEEV sa na ľudí prenáša uštipnutím komárom a spôsobuje vysokú horúčku, bolesti hlavy a encefalitídu s opuchmi, ktoré môžu byť smrteľné. Zistilo sa, že beta-d-N4-hydroxycytidín nielenže inhibuje replikáciu VEEV, ale aj širokú škálu alfavírusov vrátane eboly, chikungunya, chrípkového vírusu, norovírusu, vírusu bovinnej diarey, vírusu hepatitídy C a respiračného syncyciálneho vírusu. [3-8]. Prvé správy o inhibičnom účinku beta-d-N4-hydroxycytidínu na ľudský koronavírus NL63 pochádzajú z roku 2006 [9]. Nedávne štúdie potvrdili jeho inhibičný účinok na široké spektrum ľudských a zvieracích koronavírusov [8].

Dôležitá časť novšej histórie beta-d-N4-hydroxycytidínu je spojená s Emory Institute for Drug Development (EIDD) [1], kde dostal experimentálne označenie EIDD-1931. Významnú finančnú podporu na štúdium antivirotík proti alfavírusom v inštitúciách, ako je Emory, poskytovala americká vláda už od roku 2004 [10]. Agentúra na zníženie obranných hrozieb poskytla v roku 2014 inštitucionálnu podporu s cieľom nájsť antivírusovú zlúčeninu proti VEEV a iným alfakoronavírusom. „N4-Hydroxycytidín a jeho deriváty a antivírusové použitia“ boli zahrnuté v patentovej prihláške USA 2016/106050 A1 z roku 2016 [11]. Ďalšie financovanie v roku 2019 poskytol Národný ústav pre alergie a infekcie na partnerský výskum esterifikovaného prekurzora beta-d-N4-hydroxycytidínu (EIDD-2801) na liečbu chrípky [10]. Uvedeným zámerom chemických zmien EIDD-2801 bolo zvýšenie jeho orálnej biologickej dostupnosti, čo by v konečnom dôsledku umožnilo podávať beta-d-N4-hydroxycytidín ako pilulky a nie ako injekcie. V roku 2019/2020 došlo k zmene zamerania výskumu z chrípky na SARS-CoV-2 [2]. Komercializáciou EIDD-2801 bola poverená pobočka Emory s názvom Ridgeway Biotherapeutics, ktorá následne spolupracovala so spoločnosťou Merck na zdĺhavom a nákladnom procese schvaľovania FDA. Aktuálna verzia EIDD-2081 na testovanie v teréne dostala názov Molnupiravir.

Beta-d-N4-hydroxycytidín, účinná látka Molnupiraviru, existuje v dvoch formách ako tautoméry. V jednej forme sa chová ako cytidín s jednoduchou väzbou medzi uhlíkom a skupinou N-OH. Vo svojej ďalšej forme, ktorá napodobňuje uridín, má oxim s dvojitou väzbou medzi uhlíkom a skupinou N-OH. Za prítomnosti beta-d-N4-hydroxycytidínu ho vírusová RNA-dependentná RNA polymeráza číta ako uridín namiesto cytidínu a namiesto guanozínu vkladá adenozín. Prepínanie medzi formami spôsobuje nezhody počas transkripcie, čo má za následok početné mutácie vírusového genómu a zastavenie replikácie vírusu [8].

Snaha spoločnosti Merck o podmienečné a úplné schválenie Molnupariviru FDA pokračuje. Spoločnosť Merck vo svojom vyhlásení uviedla: [12]„V očakávaní výsledkov z programu MOVe-OUT spoločnosť Merck vyrába Molnupiravir na vlastné riziko. Spoločnosť Merck očakáva, že do konca roku 2021 vyrobí 10 miliónov liečebných dávok, pričom v roku 2022 sa očakáva výroba ďalších dávok. Spoločnosť Merck sa zaväzuje poskytovať včasný prístup k lieku Molnupiravir na celom svete, ak bude autorizovaný alebo schválený, a plánuje zaviesť prístup k viacúrovňovým cenám na základe kritérií príjmu krajín Svetovej banky, ktoré budú odrážať relatívnu schopnosť krajín financovať svoju zdravotnú reakciu na pandémiu. V rámci svojho záväzku rozšíriť globálny prístup spoločnosť Merck už skôr oznámila, že uzavrela nevýhradné dobrovoľné licenčné zmluvy na Molnupiravir so zavedenými generickými výrobcami na urýchlenie dostupnosti Molnupiraviru vo viac ako 100 krajinách s nízkymi a strednými príjmami (LMIC) po schválení alebo núdzovom povolení miestnymi regulačnými agentúrami. “ Je nepravdepodobné, že by sa táto „veľkorysosť“ vzťahovala aj na použitie u zvierat.

Lieky na inhibíciu pôvodcu súčasnej pandémie Covid-19 boli v posledných dvoch rokoch predmetom urýchlených terénnych testov a jeden z nich, Remdesivir, bol schválený v rekordnom čase pre použitie u hospitalizovaných pacientov. V minulom roku bol Molnupiravir postúpený k podmienečnému schváleniu ako perorálny liek na domácu liečbu infekcie v počiatočnom štádiu [12]. Účinné zlúčeniny proti koronavírusu však boli vyvíjané už skôr pre inú bežnú a vážnu chorobu mačiek, mačaciu infekčnú peritonitídu (FIP). Tieto lieky zahŕňajú inhibítor proteázy (GC376) [13] a inhibítor RNA dependentnej RNA polymerázy (GS-441524), ktorý je aktívnou zložkou Remdesiviru [14]. Úspech antivírusových liekov pri liečbe FIP podnietil nedávnu štúdiu EIDD-1931 a EIDD-2801 pre ich schopnosti inhibovať FIPV v tkanivových kultúrach [15]. Účinná koncentrácia EC50 pre EIDD-1931 proti FIPV je 0,09 μM, EIDD-2801 0,4 μM a GS441524 0,66 μM [15]. Percento cytotoxicity pri 100 μM je 2.8, 3.8, respektíve 0. Preto sú EIDD-1931 a EIDD-2801 o niečo účinnejšie pri inhibícii vírusov, ale tiež cytotoxickejšie ako GS-441524. Tieto laboratórne štúdie naznačujú, že EIDD-1931 a EIDD-2801 sú vynikajúcimi kandidátmi na liečbu FIP.

Napriek tomu, že EIDD-1931 a EIDD-2801 sú veľkým prísľubom pre liečbu FIP, existuje niekoľko prekážok, kvôli ktorým v blízkej budúcnosti nebude legálne používanie týchto zlúčenín veľmi pravdepodobné. GS-441524, aktívna forma Remdesiviru a patentovaná spoločnosťou Gilead Sciences, bol skúmaný na použitie u mačiek s FIP krátko pred pandémiou Covid-19. Výskum FIP [14] preto podnietil potenciálne použitie Remdesiviru proti vírusu Ebola, a nie koronavírusom podobným SARS [14]. Aj keď boli tieto štúdie realizované v spolupráci s vedcami z Gilead Sciences, spoločnosť odmietla udeliť práva na GS-441524 na liečbu u zvierat, akonáhle bolo zrejmé, že existuje oveľa väčší trh s Covid-19 u ľudí [16]. Podobne moje pokusy za posledné 2-3 roky u Emory, Ridgeback Biotherapeutics a veterinárnej divízie spoločnosti Merck skúmať EIDD-1931 a EIDD2801 pre liečbu FIP u mačiek buď zostali bez odpovede, alebo boli zamietnuté, nepochybne z podobných dôvodov, prečo Gilead odmietol udeliť práva pre GS-441524. Veľká celosvetová potreba liečby FIP však rýchlo podporila neschválený trh s GS-441524 z Číny. Tá istá potreba liečiť FIP nedávno vyvolala záujem o Molnupiravir, tiež z Číny.

Situácia s EIDD-1931 vs. EIDD-2801/Molnupiravir a GS-441524 vs. Remdesivir vyvoláva otázku, prečo sa niektoré lieky pre účely marketingu prevádzajú na proliečivá [17]. Remdesivir bol údajne esterifikovaný, aby sa zvýšila antivírusová aktivita, aj keď štúdie na mačkách ukázali, že GS-441524 a Remdesivir mali podobnú vírusovú inhibičnú aktivitu v tkanivovej kultúre [18]. Zistilo sa však, že Remdesivir sa zle absorbuje orálnou cestou, a preto bol podmienenčne schválený iba pre injekčné použitie. EIDD-2801 bol vytvorený pre zvýšenie orálnej absorpcie EIDD-1931, aj keď predchádzajúci výskum ukázal, že EIDD-1931 je dobre absorbovaný orálne aj bez esterifikácie [6]. Motívy komercializácie Remdesiviru namiesto GS-441524 na humánne použitie boli vedecky spochybnené, pretože tento sa zdá byť v niekoľkých smeroch lepší bez ďalších úprav [17]. Prečo bol pre komercializáciu vybraný EIDD-2801, keď EIDD-1931 by bol lacnejší, 4-násobne účinnejší proti vírusom a o jednu tretinu menej toxický ako EIDD-2801 [15]? Sila patentových práv a dlhá životnosť patentov môžu v týchto rozhodnutiach predstavovať dôležitejšie faktory. [16,17,19].

Jedným z problémov pri liečbe FIP u mačiek sú hematookulárne a hematoencefalické bariéry, ktoré nadobúdajú veľký význam, keď choroba postihne oči a/alebo mozog [13, 14, 20]. Tento problém bol z veľkej časti prekonaný pri liečbe očných a neurologických foriem FIP pomocou GS-441524 postupným zvyšovaním dávkovania na zvýšenie hladín v krvi a tým aj koncentrácie liečiva v komorovom moku a/alebo v mozgu [20]. GC376, jedno z najúčinnejších antivirotík proti vírusu FIP v kultúre [17], nie je účinný proti okulárnej a neurologickej FIP kvôli neschopnosti dostať do týchto miest dostatok liečiva, aj keď sa dávka niekoľkonásobne zvyšuje[14]. Našťastie sa zdá, že EIDD-1931 môže dosiahnuť účinné hladiny v mozgu, ako to naznačujú štúdie na koňoch s infekciou VEEV [3]. Rezistencia na liečivá je ďalším problémom, ktorý sa teraz prejavuje u niektorých mačiek liečených GS-441524, najmä u jedincov s neurologickou formou FIP. Dlhé liečebné procedúry a ťažkosti s transportom dostatočného množstva liečiva do mozgu podporujú rozvoj liekovej rezistencie.

Zásadný význam má krátkodobý a dlhodobý toxický účinok kandidátskeho lieku na testovaného človeka alebo zviera. V bunkových kultúrach vykázal GS-441524 nižšiu toxicitu ako GC376, EIDD-1931 a EIDD-2801 [15]. Najdôležitejšia je však toxicita, ktorá sa prejavuje in vivo. GC376 patrí medzi lieky s najvyšším inhibičným účinkom na koronavírus [15], ale pri podávaní mladým mačiatkam spomaľuje vývoj dospelého chrupu [13]. Počas takmer troch rokov používania GS-441524 v teréne nebola pozorovaná žiadna vážna toxicita, čo odzrkadľuje úplnú absenciu cytotoxických účinkov in vitro pri koncentráciách až 400 µM [18]. EIDD-1931 a EIDD-2801 však vykazujú významnú cytoxicitu pri 100 µM [15]. Preto schopnosť EIDD-1931 vytvárať fatálne mutácie v RNA vyvoláva už nejaký čas množtvo otázok [8, 21, 22]. To bol hlavný dôvod, prečo sa aplikácia na liečbu chorôb stále odkladala. Súčasná odporúčaná doba liečby Covid-19 Molnupiravirom je však v počiatočnom štádiu liečby iba 5 dní [10]. Odporúčaná doba liečby FIP s GS-441524 je ale 12 týždňov [14], čo predstavuje oveľa dlhší čas pre manifestáciu toxicity. Preto bude dôležité dôkladné pozorovanie mačiek pri liečbe EIDD-1931 alebo EIDD-2801, či už ide o krátkodobé alebo dlhodobé účinky.

Všetky doterajšie antivírusové lieky viedli k rozvoju liekovej rezistencie prostredníctvom mutácií vo vírusovom genóme. Aj keď sa Remdesivir javí menej náchylný voči takýmto mutáciám v porovnaní s liekmi používaných pri vírusových ochoreniach, ako je HIV/AIDS, rezistencia je dobre zdokumentovaná [23–25]. Rezistencia voči GS-441524 u mačiek liečených na FIP bola pozorovaná s vyššou frekvenciou, najmä u mačiek s neurologickou FIP, kde je ťažšie dopraviť do mozgu dostatočné množstvo liečiva [13, 14, 20]. Rezistencia voči GS-441524 u mačiek bude tiež pravdepodobne väčším problémom, pretože mačky s FIP sa často liečia 12 týždňov alebo dlhšie, zatiaľ čo Remdesivir (a Molnupiravir) sa odporúčajú užívať iba päť dní počas počiatočného viremického štádia Covid-19 [16]. Problém rezistencie na liečivá je v liečbe HIV/AIDS efektívne zvládnutý použitím kokteilu rôznych liekov súčasne s rôznymi profilmi rezistencie. Mutanty rezistentné na jedno liečivo budú ostatné lieky okamžite inhibovať, čím sa zabráni ich pozitívnej selekcii pri liečbe. Inhibícia rezistencie je obzvlášť silná, ak tieto dva lieky útočia na rôzne proteíny zahrnuté v replikácii vírusu. Napríklad GC376 je inhibítor proteázy [13], zatiaľ čo GS-441524 pôsobí na RNA dependentnú RNA polymerázu [18]. GC376 však nie je tak dobre absorbovaný cez hematoencefalickú bariéru. Aj keď ešte neprebehol potrebný výskum, zdá sa, že medzi GS-441524 a Molnupiravirom nebude existovať žiadna skrížená rezistencia, a pri prechode hematoencefalickou bariérou je rovnako účinný ako GS-441524 [3]. To z Molnupiraviru (alebo 5-hyroxycytidínu) robí dôležitý príspevok pre budúcu liečbu FIP.

Ako sa dalo čakať, Molnupiravir bol nedávno testovaný na mačkách s FIP najmenej jedným čínskym predajcom GS-441524 a predbežné výsledky sú uvedené na webovej stránke FIP Warriors CZ/SK [26]. Terénne testy zahŕňali 286 mačiek s rôznymi formami prirodzene sa vyskytujúcej FIP pozorovaných na klinikách pre domáce zvieratá v USA, Veľkej Británii, Taliansku, Nemecku, Francúzsku, Japonsku, Rumunsku, Turecku a Číne. 286 mačiek, ktoré sa zúčastnili štúdie, vrátane siedmich mačiek s okulárnou (n=2) a neurologickou (n=5) FIP, nedošlo k žiadnemu úhynu. Dvadsať osem z týchto mačiek bolo vyliečených po 4-6 týždňoch liečby a 258 po 8 týždňoch. Všetky liečené mačky boli zdravé aj po 3-5 mesiacoch, čo je obdobie, počas ktorého by sa u neúspešne liečených mačiek očakávali relapsy. Tieto údaje poskytujú presvedčivé dôkazy o bezpečnosti a účinnosti Molnupiraviru pre mačky s rôznymi formami FIP. Dúfame však, že táto terénna štúdia bude napísaná v rukopisnej forme, predložená k recenznému konaniu a uverejnená. Tak či tak, Molnupiravir sa už teraz predáva majiteľom mačiek s FIP. Minimálne jeden ďalší veľký predajca GS-441524 má tiež záujem používať Molnupiravir na FIP, čo naznačuje dopyt po ďalších antivírusových liečivách pre mačky s FIP.

Bezpečné a účinné dávkovanie pre Molnupiravir u mačiek s FIP nebolo publikované. Minimálne jeden predajca z Číny však poskytol iste farmakokinetické dáta a dáta z terénnych testov Molnupariviru u mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou FIP v reklamnom letáku na výrobok s názvom Hero-2081 [26]. Tieto informácie však jasne neuvádzajú množstvo Molnupiraviru v jednej z ich „50 mg tabliet“ a skutočný dávkovací interval (q12h alebo q24h?). Našťastie odhadovanú počiatočnú dávku molnupiraviru pre mačky s FIP je možné získať z publikovaných štúdií o EIDD-1931 a EIDD-2801 in vitro na bunkových kultúrach [15] a laboratórnych a terénnych štúdií GS-441524 [14,18]. Molnupiravir (EIDD-2801) má EC50 0,4 uM/ul proti FIPV v bunkovej kultúre, zatiaľ čo EC50 GS-441524 je asi 1,0 uM/ul [18]. Oba majú podobnú perorálnu absorpciu okolo 40 – 50 %, takže účinná subkutánna (SC) dávka pre Molnupiravir by bola približne polovica odporúčanej 4 mg/kg SC každých 24 hodín začiatočnej dávky pre GS441524 [14] alebo 2 mg/kg SC q24h. Dávka per-os (PO) by sa zdvojnásobila, aby sa zohľadnila menej účinná perorálna absorpcia na dávku 4 mg/kg PO každých 24 hodín. Odhadovanú počiatočnú perorálnu dávku molnupiraviru pre mačky s FIP je možné tiež vypočítať z dostupných údajov o liečbe Covid-19. Pacientom liečeným na Covid-19 sa podáva 200 mg molnupiraviru PO q12h počas 5 dní. Táto dávka bola evidentne vypočítaná z farmakokinetickej štúdie vykonanej na ľuďoch a ak priemerný človek váži 60-80 kg (70 kg), účinná inhibičná dávka je ~ 3,0 mg/kg PO q12h. Mačka má bazálny metabolický pomer 1,5 -krát vyšší ako človek a za predpokladu rovnakej orálnej absorpcie u ľudí aj mačiek by minimálna dávka pre mačky podľa tohto výpočtu bola 4,5 mg/kg PO každých 12 hodín. Za predpokladu, že molnupiravir prechádza cez hematookulárnu bariéru a hematoencefalickú bariéru rovnako efektívne ako GS-441524 [3,18], dávka by sa zvýšila ~1,5 a ~2,0-krát, aby sa umožnila adekvátna penetrácia do komorovej vody a mozgovomiechový mok pre mačky s okulárnou (~ 8 mg/kg PO, q12 h) alebo neurologickou FIP (~ 10 mg/kg PO, q12h). Liečba bude trvať 10-12 týždňov a monitorovanie odpovede na liečbu bude identické s GS-441524 [14, 20]. Tieto odporúčania sú založené na predpokladoch zo zverejnených informácií a budú potrebné ďalšie skúsenosti s Molnupiravirom v tejto oblasti. Nie je pravdepodobné, že Molnupiravir bude na liečbu FIP bezpečnejší a účinnejší ako GS-441524, ale tretie antivírusové liečivo môže byť mimoriadne užitočné pri prevencii rezistencie voči GS-441524 (ako kokteil antivirotík s rôznymi profilmi rezistencie) alebo pri liečbe mačiek, ktoré už nereagujú dobre na GS-441524. Veľkou neznámou je, či bude Molnupiravir bez dlhodobých toxických účinkov, pretože účinná látka N4-hydroxycytidín je mimoriadne účinný mutagén [21] a doba liečby FIP je oveľa dlhšia ako pri Covid-19 a existuje pravdepodobnosť väčších vedľajších účinkov.

Je škoda, že EIDD-1931 (N4-hydroxycytidín), účinnej látke Molnupiraviru, nebola pri liečbe mačiek FIP venovaná väčšia pozornosť ako Molnupiraviru. EIDD-1931 má 4-krát väčší inhibičný účinok proti vírusu ako Molnupiravir (EC50 0,09 oproti 0,4 μM) a percento cytotoxicity je o niečo nižšie (2,3% vs. 3,8% pri 100 μM) [15]. N4-hydroxycytidín je tiež účinne absorbovaný orálnou cestou [3], čo bolo pri vývoji EIDD-2801 (Molnupiravir) bagatelizované. Tento scenár je identický so scenárom GS-441524 vs. Remdesivir, pričom pre komercializáciu bol vybraný druhý z nich – Remdesivir, aj keď súčasný výskum naznačuje, že najlepším kandidátom by bol GS-441524[17].

Referencie

  1. Painter GR, Natchus MG, Cohen O, Holman W, Painter WP. Developing a direct acting, orally available antiviral agent in a pandemic: the evolution of molnupiravir as a potential treatment for COVID-19 [published online ahead of print, 2021 Jun 18]. Curr Opin Virol. 2021;50:17-22. doi:10.1016/j.coviro.2021.06.003
  2. Halford B. An emerging antiviral takes aim at COVID-19. c&en topics. 2020. https://cen.acs.org/pharmaceuticals/drug-development/emerging-antiviral-takes-aim-COVID19/98/web/2020/05.
  3. Painter GR, Richard A. Bowend RA, Bluemling GR et al. The prophylactic and therapeutic activity of a broadly active ribonucleoside analog in a murine model of intranasal Venezuelan equine encephalitis virus infection. Antiviral Res. 2019, 171:104597
  4. Costantini, V.P., Whitaker, T., Barclay, L., Lee, D., McBrayer, T.R., Schinazi, R.F., Vinje,J., 2012. Antiviral activity of nucleoside analogues against norovirus. Antivir. Ther.17 (6), 981–991. https://doi.org/10.3851/imp2229.
  5. Ehteshami, M., Tao, S., Zandi, K., Hsiao, H.M., Jiang, Y., Hammond, E., Amblard, F., Russell, O.O., Merits, A., Schinazi, R.F., 2017. Characterization of beta-d-N(4)-hydroxycytidine as a novel inhibitor of chikungunya virus. Antimicrob. Agents Chemother. 61 (4) e02395-02316. https://doi.org/10.1128/aac.02395-16.
  6. Stuyver, L.J., Whitaker, T., McBrayer, T.R., Hernandez-Santiago, B.I., Lostia, S., Tharnish, P.M., Ramesh, M., Chu, C.K., Jordan, R., Shi, J., Rachakonda, S., Watanabe, K.A., Otto, M.J., Schinazi, R.F., 2003. Ribonucleoside analogue that blocks replication of bovine viral diarrhea and hepatitis C viruses in culture. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 244–254.
  7. Yoon J., Toots M, Lee S, Lee ME, et al., 2018. Orally efficacious broad-spectrum ribonucleoside analog inhibitor of influenza and respiratory syncytial viruses. Antimicrob. Agents Chemother. 2018, 62(8): https://doi.org/10.1128/aac.00766-18
  8. Urakova N, Kuznetsova V, Crossman DK, Sokratian A, Guthrie DB, Kolykhalov AA, et al. β-d-N4Hydroxycytidine is a potent anti-alphavirus compound that induces a high level of mutations in the viral genome. J Virol. 2018, 92:e01965–e01917. doi: 10.1128/JVI.01965-17.
  9. Pyrc, K., Bosch, B.J., Berkhout, B., Jebbink, M.F., Dijkman, R., Rottier, P., van der Hoek,L., 2006. Inhibition of human coronavirus NL63 infection at early stages of the replication cycle. Antimicrob. Agents Chemother. 2006, 50(6):2000–2008. https://doi.org/10.1128/aac.01598-05.
  10. Whitfill T. A likely new treatment for Covid-19 was made possible by government-funded innovation. STAT+. https://www.statnews.com/2021/10/05/government-funding-backed-molnupiravir-possible-newcovid-19-treatment/.
  11. Painter, G.R., Guthrie, D.B., Bluemling, G., Natchus, M.G. N4-Hydroxycytidine and Derivatives and Antiviral Uses Related Thereto. US Patent Application, 2016, 2016/106050 A1.
  12. Merck news release, October 1, 2021. https://www.merck.com/news/merck-and-ridgebacksinvestigational-oral-antiviral-molnupiravir-reduced-the-risk-of-hospitalization-or-death-by-approximately-50percent-compared-to-placebo-for-patients-with-mild-or-moderat/.
  13. Pedersen NC, Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC, Eckstrand C, Groutas WC, Bannasch M, Meadows JM, Chang KO. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2018, 20(4):378-392.
  14. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, Montgomery E, Murakami E, Liepnieks M, Liu H. efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2019, 21(4):271-281.
  15. Cook SE, Vogel H and D. Castillo D. A rational approach to identifying effective combined anticoronaviral therapies against feline coronavirus. 2021. bioRxiv 2020.07.09.195016; doi: https://doi.org/10.1101/2020.07.09.195016
  16. Zhang S. A Much-Hyped COVID-19 Drug Is Almost Identical to a Black-Market Cat Cure. May 8, 2020 Shutterstock / The Atlantic, https://www.theatlantic.com/science/archive/2020/05/remdesivir-cats/611341/.
  17. Yan VC, Muller FL. Advantages of the Parent Nucleoside GS-441524 over Remdesivir for Covid-19 Treatment. ACS Medicinal Chemistry Letters. 2020, 11 (7):1361-1366 DOI: 10.1021/acsmedchemlett.0c00316
  18. Murphy BG, Perron M, Murakami E, Bauer K, Park Y, Eckstrand C, Liepnieks M, Pedersen NC. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies.Vet Microbiol. 2018, 219:226-233.
  19. Common Dreams. Public citizen. Press release, August 4, 2020, https://www.commondreams.org/newswire/2020/08/04/public-citizen-scientists-gilead-and-federalscientists-have-neglected
  20. Dickinson PJ. Coronavirus Infection of the Central Nervous System: Animal Models in the Time of Covid-Front. Vet. Sci. 2020, 23: https://doi.org/10.3389/fvets.2020.584673
  21. Zhou S, Hill CS, Sarkar S, et al., β-d-N4-hydroxycytidine Inhibits SARS-CoV-2 through lethal mutagenesis but Is also mutagenic to mammalian cells. J Infect Dis. 2021, 224:415–419, https://doi.org/10.1093/infdis/jiab247.
  22. Cohen J, Piller C. Emails offer look into whistleblower charges of cronyism behind potential COVID-19 drug. ScienceInsider-Health. 2020, https://www.science.org/news/2020/05/emails-offer-look-whistleblowercharges-cronyism-behind-potential-covid-19-drug.
  23. Agostini ML, Andres EL, Sims AC, et al. Coronavirus susceptibility to the antiviral remdesivir (GS-5734) is mediated by the viral polymerase and the proofreading exoribonuclease. MBio 2018; 9. DOI:
    10.1128/mBio.00221-18.
  24. Szemiel AM, Merits A, Orton RJ, In vitro selection of Remdesivir resistance suggests evolutionary predictability of SARS-CoV-2. Plos Path, 2021,https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009929 .
  25. Martinot M, Jary A, Fafi-Kremer S, et al., Emerging RNA-Dependent RNA Polymerase Mutation in a Remdesivir-Treated B-cell Immunodeficient Patient With Protracted Coronavirus Disease 2019, Clinical Infectious Diseases, 2020;, ciaa1474, https://doi.org/10.1093/cid/ciaa1474
  26. FIP Warriors CZ/SK – EIDD-2801 (Molnupiravir) https://www.fipwarriors.eu/en/eidd-2801-molnupiravir/
Prečítať “Dlhá história Beta-d-N4-hydroxycytidínu a jeho moderná aplikácia na liečbu Covid-19 u ľudí a FIP u mačiek.”

ZHRNUTIE LIEČBY FIP POMOCOU GS-441524 (Dr. Pedersen)

Pôvodný článok: SUMMARY OF GS-441524 TREATMENT FOR FIP
Niels C. Pedersen, DVM PhD, emeritný profesor,
Stredisko pre zdravie spoločenských zvierat, škola veterinárneho lekárstva, UC Davis

Na monitorovanie liečby používame rovnaké kritériá, aké sú opísané v klinickej štúdii publikovanej v JFMS (Journal of Feline Medicine and Surgery). Majitelia by mali v denných alebo týždenných intervaloch sledovať teplotu, váhu, aktivitu, chuť do jedla a klinické príznaky pôvodného ochorenia. Krvné testy – hematológia a biochémia (vrátane hodnôt sérových bielkovín – celkový proteín, albumín, globulín, pomer A:G) na začiatku liečby a potom každé 4 týždne. Je vždy užitočné, keď sa tieto hodnoty spolu s hmotnosťou aktualizujú vo forme grafu. Cieľom je mať zdravú, čulú a aktívnu mačku na konci 12 týždňov liečby a s normálnymi hodnotami krvných testov, najmä pokiaľ ide o pomery hematokritu, celkového proteínu, globulínu, albumínu a A: G. Výrazné zvýšenie hmotnosti je tiež dobrým znamením, a niektoré mladé alebo obzvlášť vychudnuté mačky môžu počas liečby viac ako zdvojnásobiť svoju váhu. Jedná sa samozrejme o idealizovanú liečbu, a treba počítať s tým, že bude pravdepodobne potrebné upraviť dávkovanie smerom nahor, ak je odpoveď pomalá, alebo ak sa počas liečby prejavia komplikácie, ako napríklad okulárne alebo neurologické postihnutie.

Pre stabilizáciu mačiek, ktoré sú kriticky choré v čase diagnózy, alebo počas prvých dní liečby GS-441524 (GS), môže byť potrebná podporná (symptomatická) starostlivosť. Abdominálny výpotok by sa nemal odsávať, pokiaľ neutláča hrudník a nezasahuje do dýchania, pretože sa rýchlo nahradí na úkor zvyšku tela. Hrudné výpotky sú však zvyčajne spojené s rôznym stupňom dyspnoe a mali by sa odstrániť. Hrudné výpotky sa vracajú oveľa pomalšie. Symptomatická starostlivosť tiež často zahŕňa tekutiny a elektrolyty na potlačenie dehydratácie, antibiotiká pri podozrení na sekundárnu bakteriálnu infekciu a protizápalové lieky (zvyčajne systémové kortikosteroidy) a zriedkavo krvnú transfúziu. U niektorých mačiek s postihnutím oka môžu byť potrebné aj lokálne lieky na potlačenie závažného zápalu a zvýšeného vnútroočného tlaku (glaukóm).

Kortikosteroidy, ako je prednizolón, by sa mali používať len počas prvých dní liečby GS a mali by sa vysadiť, keď dôjde k rýchlemu zlepšeniu zdravotného stavu. Dlhodobé používanie kortikosteroidov s GS sa dôrazne neodporúča, pretože môže maskovať príznaky zlepšenia spôsobené GS, najmä u mačiek s neurologickou FIP, nemá žiadnu liečebnú moc a môže interferovať s vývojom ochrannej imunitnej odpovede na vírus FIP. Je možné, že táto imunitná odpoveď hrá hlavnú úlohu v konečnom vyliečení. Ak sú mačky na chronickej liečbe steroidmi, nie je potrebné znižovať dávku, pretože neexistuje dôkaz, že by sa u mačiek vyskytla závažná atrofia nadobličiek, ku ktorej dochádza u ľudí pri dlhodobej liečbe steroidmi. Mnohí majitelia, poradcovia pre liečbu GS a veterinári budú používať rôzne propagované doplnky na zlepšenie zdravia pečene, obličiek alebo imunitného systému, ako aj vitamíny ako B12. Tieto látky nemajú preukázanú účinnosť a považujem ich za vyhodené peniaze.

Liečba injekčnou formou GS, ktorá je najbežnejšia, sa môže tiež skomplikovať vredmi/léziami v mieste vpichu. Liečba je ťažká pre majiteľov aj pre mačky, pretože injekcie môžu byť bolestivé. U niektorých mačiek, najmä u tých s neurologickým postihnutím, nastáva problém s vývojom čiastočnej liekovej rezistencie, ktorá si vyžaduje zvyšovanie dávky. Reakcia na liečbu je zvyčajne do 24-72 hodín a väčšina mačiek sa vráti do normálu, alebo sa blíži k normálu v priebehu 2-4 týždňov, čo je dobré znamenie. Predpokladáme, že miera úspešnosti liečby FIP s GS-441424 je viac ako 80%, s ohľadom na zlyhanie liečby v dôsledku nesprávnej diagnózy FIP, neprimerané dávkovanie, komplikácie zdravotného stavu a rezistenciu na lieky. Mladé mačky sa liečia ľahšie a majú vyššiu mieru vyliečenia, ako mačky staršie 7 rokov. Mačky s vlhkou alebo suchou FIP, s nekomplikovanými neurologickými alebo očnými symptómami sa liečia ľahšie, ako mačky s neurologickou FIP.

Počiatočná dávka pre mačky s vlhkou alebo suchou FIP bez známok očného alebo neurologického ochorenia, je 4-6 mg/kg denne počas 12 týždňov, pričom u mladších mačiek a vlhkej FIP je tendencia smerovať k dolnej hranici a suché prípady k hornej hranici. Mačky s očnými léziami a bez neurologických príznakov začínajú s dávkou 8 mg/kg denne počas 12 týždňov. Mačky s neurologickými príznakmi začínajú na dennej dávke 10 mg/kg po dobu 12 týždňov. Ak sa u mačiek s vlhkou alebo suchou FIP na začiatku objavia očné alebo neurologické príznaky, prechádzajú na príslušné očné alebo neurologické dávky. Existuje orálna forma GS dostupná najmenej z dvoch zdrojov z Číny (Spark, Mutian), ale nepoužívam ju, takže nepoznám porovnateľné dávkovanie. Neodporúčam to však, pokiaľ injekčná dávka stúpne nad 10 mg/kg denne, pretože účinnosť orálnej absorpcie pri týchto vysokých dávkach klesá.

Odporúčam dávkovanie upraviť týždennou kontrolou hmotnosti. Prírastok hmotnosti môže byť u mnohých z týchto mačiek obrovský, a to buď preto, že sú na začiatku tak vychudnuté, alebo rastú, prípadne oboje. Ak dôjde k úbytku hmotnosti na začiatku liečby, zostávam na pôvodnom dávkovaní a neznižujem ho. Neschopnosť naberať váhu počas liečby sa považuje za zlé znamenie. Nezvyšujeme dávku, pokiaľ na to nie sú závažné dôvody, ako napríklad zhoršenie stavu, alebo sa nezlepšujú výsledky krvných testov, pomalé zlepšenie, slabá úroveň aktivity, obnovenie pôvodných klinických príznakov, alebo zmena formy ochorenia zahrňujúca aj očné alebo neurologické príznaky. Tu prichádza na rad zdravý úsudok, pretože sa nechcete zaseknúť na jednej hodnote krvi, ktorá nie je celkom bežná, ale nemá vplyv na celkový zdravotný stav mačky. Napríklad globulín môže byť stále trochu vysoký, ale ďalšie dôležité hodnoty krvných testov a zdravotný stav sú veľmi dobré. Ak existuje dobrý dôvod na zvýšenie dávky, malo by to byť vždy od +2 do +5 mg/kg denne a minimálne po dobu 4 týždňov. Ak tieto 4 týždne spôsobia predĺženie 12-týždňového trvania liečby, je to kvôli tejto úprave dávky. Dá sa očakávať pozitívna reakcia na akékoľvek zvýšenie dávky, a pokiaľ nevidíte zlepšenie, znamená to, že dávka stále nie je dostatočne vysoká, objavuje sa rezistencia na lieky, máte zlú značku GS, mačka nemá FIP , alebo existujú iné choroby, ktoré liečbu ovplyvňujú.

Jedným z najťažších rozhodnutí je určiť, kedy ukončiť liečbu. Hoci niektoré mačky, často mladšie s vlhkou FIP, môžu byť vyliečené už za 8 týždňov, a možno aj skôr, zvyčajná doba trvania liečby je 12 týždňov. Niektoré mačky môžu dokonca vyžadovať úpravu dávkovania a dlhšie obdobia liečby. Kritické krvné hodnoty, ako je hematokrit, hladina celkového proteínu, albumínu a globulínu a celkový počet bielych krviniek a absolútny počet lymfocytov sa zvyčajne u liečených mačiek normalizujú po 8-10 týždňoch, kedy často dochádza k neočakávanému zvýšeniu úrovne aktivity. Predpokladá sa, ale nie sú na to ešte dôkazy, že po 8-10 týždňov sa u mačky objaví vlastná imunita voči infekcii. Toto je situácia, ktorá sa vyskytuje pri liečbe hepatitídy C u ľudí, čo je tiež chronická infekcia spôsobená RNA vírusom, ktorá si často vyžaduje až 12 alebo viac týždňov antivírusovej liečby.

Nanešťastie neexistuje jednoduchý test, ktorý by určil, kedy došlo k vyliečeniu, a strach z relapsu často vedie majiteľov, liečebných poradcov a veterinárov k predĺženiu liečby nad hranicu 84 dní. Strach z relapsov tiež spôsobí, že ľudia zapojení do rozhodovacieho procesu budú príliš opatrní, pokiaľ ide o jednu hodnotu krvi, ktorá je trochu abnormálna (napr. mierne vysoký globulín alebo mierne nízky pomer A:G), alebo výsledky konečného ultrazvuku naznačujúce podozrivo zväčšené lymfatické uzliny, malé množstvo tekutiny v brušnej dutine, alebo nejasné nepravidelnosti v orgánoch, ako sú obličky, slezina, pankreas alebo črevá. Je potrebné pamätať na to, že do normálneho rozsahu krvných hodnôt síce spadá väčšina zvierat, ale inak sú to krivky v tvare zvona, a že sa nájde pár výnimočných pacientov, ktorí budú mať hodnoty na okraji týchto kriviek. Diagnóza podľa ultrazvuku musí vziať do úvahy stupeň patológie, ktorá sa môže vyskytnúť v brušnej dutine postihnutou FIP, ako napríklad jazvy alebo niektoré následky vo forme zmien orgánov u úspešne liečených mačiek. V situáciách, keď také otázky vyvstávajú, je lepšie pozrieť sa podrobnejšie na celkový obraz, a nielen na jednu malú časť. Najdôležitejším výsledkom liečby je návrat k normálnemu zdraviu, ktorý má dve zložky – vonkajšie príznaky zdravia a vnútorné príznaky zdravia. Medzi vonkajšie príznaky zdravia patrí návrat k normálnej úrovni aktivity, chuť k jedlu, primerané zvýšenie hmotnosti alebo rast a kvalita srsti. Posledne menované sú pre mačku často jednými z najlepších meradiel zdravia. Vnútorné príznaky zdravia sa prejavujú návratom určitých kritických hodnôt k normálu na základe periodického sledovania úplného krvného obrazu a biochémie. Najdôležitejšie hodnoty v krvnom obraze sú hematokrit a relatívny a absolútny celkový počet bielych krviniek, neutrofilov a lymfocytov. Najdôležitejšie hodnoty v biochémii (alebo sérovej elektroforéze) sú hladiny celkového proteínu, globulínu, albumínu a pomer A: G. Bilirubín je u mačiek často zvýšený pri efúznej FIP a môže byť užitočný pri monitorovaní závažnosti a trvania zápalu. V hematologických a biochemických paneloch existuje veľa ďalších hodnôt a nie je nič neobvyklé, že niektoré z nich sú o niečo vyššie alebo nižšie ako normálne, a je lepšie tieto hodnoty ignorovať, pokiaľ nie sú výrazne zvýšené a nie sú spojené s klinickými príznakmi – napríklad vysoká urea a kreatinín, ktoré sú tiež spojené so zvýšenou spotrebou vody, nadmerným močením a abnormalitami v analýze moči. Počet krvných doštičiek strojovo je u mačiek notoricky nízky v dôsledku traumy z odberu krvi a zhlukovania krvných doštičiek, a mal by sa vždy overiť manuálnym vyšetrením krvných náterov. Konečné rozhodnutie o ukončení alebo predĺžení liečby, keď sa stretnete s nejasnými pochybnosťami o rôznych testovacích postupoch, by malo vždy vychádzať z vonkajších prejavov zdravia viac, ako z ktoréhokoľvek jednotlivého výsledku testu.

Rôzne FIP skupiny prišli s rôznymi modifikáciami liečby FIP. Niektoré skupiny budú od začiatku liečiť mimoriadne vysokou dávkou GS namiesto toho, aby dávku zvyšovali iba vtedy, keď je to indikované, alebo v posledných dvoch týždňov navýšia dávkovanie GS, alebo o ďalšie dva týždne pretiahnu liečbu s vyššou dávkou GS v nádeji, že môžu skrátiť dobu trvania liečby, či znížiť pravdepodobnosť relapsu. Niektorí obhajujú použitie interferónu omega alebo nešpecifických imunostimulantov na ďalšiu stimuláciu imunitného systému, a niektorí používajú rôzne ďalšie modifikácie. Neexistuje žiadny dôkaz, že modifikácia liečby extra vysokou dávkou zlepší rýchlosť vyliečenia. Podobne interferón omega a nešpecifické imunostimulanty nemajú žiadne preukázané priaznivé účinky pri FIP, keď sa podávajú ako jediná liečba alebo ako doplnky ku GS. Objavuje sa aj prax pridávania ďalšieho antivírusového lieku, inhibítora vírusovej proteázy GC376, k liečbe GS u mačiek, u ktorých sa vyvíja rezistencia na GS, ale táto možnosť ešte vyžaduje výskum. Nakoniec je bežné, že majitelia, liečebné skupiny a veterinárni lekári pridávajú mnohé doplnky, toniká alebo injekcie (napr. B12) na zvýšenie hladín v krvi alebo na prevenciu ochorenia pečene alebo obličiek. Takéto doplnky sú zriedka potrebné u mačiek s čistou chorobou FIP.

Relapsy FIP počas 12-týždňového pozorovacieho obdobia po liečbe sa vyskytujú, a neexistuje jednoduchý krvný test na predpoveď, či došlo k vyliečeniu, alebo je možný relaps. Relapsy zvyčajne zahŕňajú infekcie, ktoré prenikli do centrálneho nervového systému (mozog, chrbtica, oči) počas liečby vlhkej alebo suchej FIP, ktorá nebola sprevádzaná neurologickými alebo okulárnymi príznakmi. Dávka GS-441524 používaná na liečbu týchto foriem FIP je často nedostatočná na účinné prekonanie hematoencefalickej alebo hematookulárnej beriéry. Hematoencefalická bariéra je nepriestupnejšia ako hematookulárna bariéra, čo vysvetľuje, prečo sa lézie očí dajú liečiť ľahšie ako infekcie mozgu alebo chrbtice. Relapsy, ktoré sa vyskytnú v období po liečbe, a ktoré zahŕňajú oči, mozog alebo chrbticu sa zvyčajne liečia najmenej 8 týždňov pri začiatočnej dennej dávke najmenej o 5 mg / kg vyššej, ako je dávka použitá počas primárnej liečby (napr. 10, 12, 15 mg/kg denne). Odporúča sa nepoužívať perorálne formy GS, ak dávka presahuje 10 mg/kg injekčnej formy denne, pretože pri vysokých perorálnych koncentráciách je znížená účinnosť absorpcie v čreve. U mačiek, ktoré sa nedajú vyliečiť z infekcie pri dávkach až 15 mg/kg denne, sa pravdepodobne vyvinula rôzna miera rezistenice voči GS-441524. Čiastočná rezistencia môže umožniť udržanie príznakov ochorenia pod kontrolou, ale nie vyliečenie, zatiaľ čo celková rezistencia sa prejavuje rôznou závažnosťou klinických príznakov počas liečby.

V čase diagnostiky môže existovať rezistencia na GS-441524, čo je však neobvyklé. Skôr sa objavuje počas liečby, a na začiatku je často čiastočná a vedie k potrebe vyššieho dávkovania. U niektorých mačiek sa môže stať úplnou. Rezistencia je najväčším problémom u mačiek s neurologickým ochorením, najmä u tých, ktoré majú neurologické príznaky, alebo sa u nich vyvine mozgová infekcia počas liečby, alebo počas relapsu po tom, čo sa liečba javila ako úspešná. Mnoho mačiek s čiastočnou rezistenciou na lieky môže byť liečené na príznaky choroby, ale relaps sa objaví hneď po ukončení liečby. Mačky sa „liečili“ na FIP už viac ako rok bez vyliečenia, ale nakoniec sa rezistencia zhoršuje, alebo majiteľovi dôjdu peniaze.

Liečba GS-441524 vykazuje žiadne, alebo len minimálne systémové vedľajšie účinky. Môže spôsobiť mierne poškodenie obličiek u niektorých mačiek, ale nemala by viesť k zlyhaniu obličiek. Systémové liekové reakcie typu vaskulitídy sa pozorovali u niekoľkých mačiek a možno ich zameniť s reakciami v mieste vpichu. Tieto liekové reakcie sú však v miestach, kde sa nepodávajú injekcie, a často sa stratia samé, alebo dobre reagujú na krátkodobú nízku dávku steroidov. Hlavným vedľajším účinkom liečby GS je bolesť v miestach vpichu, ktorá sa líši od mačky k mačke a podľa schopností osoby, ktorá injekcie aplikuje (zvyčajne majiteľ). Vredy/lézie v mieste vpichu sú u niektorých mačiek problém, a zvyčajne k nim dôjde, keď sa miesto vpichu nestrieda (nezdržujte sa medzi ramenami) a nepodáva sa do svalových a nervových vrstiev pod podkožím. Odporúčam zvoliť miesta začínajúce jeden palec za lopatkami, dole od chrbta po 1 až 2 palce pred chvostovou časťou a jednu tretinu až polovicu cesty dole k hrudníku a bruchu. Mnoho ľudí používa gabapentín pred injekciami na zmiernenie bolesti. Vredy v mieste vpichu sa zbavia okolitých chlpov a jemne sa čistia 4 alebo viackrát denne sterilnými vatovými tyčinkami namočenými v zriedenom roztoku peroxidu vodíka pre domácnosť v pomere 1:5. Zvyčajne nevyžadujú žiadne zložitejšie ošetrenie a vyliečia sa asi za 2 týždne.

Dúfame, že čoskoro bude k dispozícii legálna forma GS-441524. Liečivo s názvom Remdesivir je najväčšou súčasnou nádejou, pretože Remdesivir sa pri intravenóznom podaní ľuďom, myšiam, primátom a mačkám okamžite rozkladá na GS. Remdesivir dostal plné schválenie americkej FDA, a podobné schválenie bude pravdepodobne nasledovať aj v ďalších krajinách. Ak to tak bude, môže ho predpisovať akýkoľvek humánny lekár s licenciou a veterinári. Použitie Remdesiviru v USA sa však stále obmedzuje na konkrétnu podskupinu pacientov s Covid-19 a len za kontrolovaných podmienok a s pokračujúcim zberom údajov. Kým nebudú zrušené všetky obmedzenia, nebude ľahko dostupný ani pre ľudské použitie. Nemám skúsenosti s liečbou mačiek Remdesivirom namiesto GS-441524. Skupiny v Austrálii a niektorých ázijských krajinách však začínajú Remdesivir používať a hlásia rovnaké výsledky ako s GS-441524. Dávkovanie Remdesiviru na molárnom základe je teoreticky rovnaké ako GS-441524. Voľná ​​báza GS-441524 má molekulovú hmotnosť 291,3 g/M, zatiaľ čo Remdesivir má 602,6 g/M. Preto na získanie 1 mg GS-441524 by bolo potrebné dvakrát viac Remdesiviru (602,6/291,3=2,07). Rozpúšťadlo pre Remdesivir sa výrazne líši od rozpúšťadla používaného pre GS-441524 a je určené na IV použitie u ľudí. Nie je známe, ako sa bude zriedený Remdesivir správať pri subkutánnej aplikácii počas 12 alebo viac týždňov dlhej liečbe. U ľudí sa pri Remdesivire pozorovali mierne príznaky hepatotoxicity a nefrotoxicity. GS-441524 spôsobuje miernu a neprogresívnu renálnu toxicitu u mačiek, ale bez zjavnej pečeňovej toxicity. Nie je isté, či renálna toxicita pozorovaná u ľudí, ktorým bol podávaný Remdesivir, je spôsobená jeho aktívnou zložkou (t.j. GS-441524) alebo chemickými prísadami určenými na zvýšenie antivírusovej aktivity. O schválenie GC376 pre mačky (a ľudí) sa snaží spoločnosť Anivive, ale bude to trvať ešte dva alebo viac rokov. GC376 je inhibítor vírusovej proteázy a pôsobí odlišne ako GS-441524, ktorý inhibuje rané štádium replikácie vírusovej RNA. Preto je nepravdepodobné, že bude mať významný synergický vírusový inhibičný účinok, bude ale oveľa dôležitejší pri inhibícii liekovej rezistencie, keď sa použije v kombinovanej terapii (ako napríklad kombinovaná antivírusová terapia pre HIV/AIDS).

Prečítať “ZHRNUTIE LIEČBY FIP POMOCOU GS-441524 (Dr. Pedersen)”

Liečba orálnymi formami GS-441524

Pôvodný článok: Treatment with oral formulations of GS-441524
Nicole Jacque, Niels C. Pedersen, 24.9.2021

Úvod

Počiatočné klinické testy GS-441524 pri liečbe FIP zahŕňali iba subkutánnu injekčnú aplikáciu. Tento spôsob podávania bol založený na predchádzajúcich farmakokinetických (PK) štúdiách vykonaných na laboratórnych mačkách. Intravenózne a subkutánne injekčné podanie priniesli podobne vysoké hladiny v krvi, ktoré sa udržali pri vírusových inhibičných koncentráciách viac ako 24 hodín. Zistilo sa tiež, že orálne podanie lieku vykazuje v krvi s istým oneskorením iba 40% hladinu v porovnaní so subkutánnou alebo intravenóznou aplikáciou (Pedersen NC, nepublikované dáta, 2018) . Psy, ktoré majú dlhší črevný trakt vyvinutý pre stravu všežravcov, však môžu absorbovať až 85% GS441524 orálnou cestou [1,5]. Psy sa často používali ako náhrada za ľudí v štúdiách orálnej absorpcie, takže orálna absorpcia u ľudí je tiež pravdepodobne vyššia ako u mačiek. Preto bol na terénne testovanie u mačiek zvolený subkutánny spôsob kvôli jednoduchej aplikácii a výsledným hladinám v krvi.

Čínski dodávatelia GS-441524 okopírovali zloženie riedidla, koncentráciu liečiva a subkutánny spôsob aplikácie tak, ako sa použili aj v klinických testoch. Prvou spoločnosťou, ktorá ponúkla GS-441524 na neschválenom trhu, bola spoločnosť Mutian. Mutian bol tiež prvým, kto skúmal a priniesol orálnu formu lieku. Vedci z Mutianu zistili, že účinné hladiny GS-441524 v krvi je možné dosiahnuť jednoduchým zvýšením koncentrácie liečiva v ich perorálnych prípravkoch. Ostatné spoločnosti (napr. Aura, Lucky) následne ponúkli svoje vlastné verzie perorálne podávaného GS-441524. V súčasnosti sú najbežnejšie používané orálne formy GS-441524 v USA značky Mutian, Aura a Lucky.

Súčasné značky kapsúl/tabliet sa predávajú ako doplnky a na ich štítkoch je uvedených niekoľko bežných neškodných chemických zlúčenín a liečivých bylín a GS-441524 sa v nich ako jedna zo zložiek vôbec neuvádza. Je to pravdepodobne preto, aby sa zabránilo problémom pri potenciálnej colnej kontrole. Bez ohľadu na zoznam zložiek je aktívnou zložkou všetkých perorálnych produktov GS-441524. Presnú koncentráciu GS-441524 v rôznych perorálnych produktoch predajcovia taja, je však zjavne niekoľkonásobne vyššia, ako by bola potrebná, keby sa liek podával subkutánne.

Spočiatku sme boli k orálnej forme liečby skeptickí z dvoch dôvodov. Po prvé, orálne formy viac plytvali tým, čo bolo spočiatku vzácnym a nákladným zdrojom. Po druhé, publikovaný výskum orálnej absorpcie nukleozidov (GS-441524 je nukleozid) dokumentuje koncentračný limit alebo strop pre orálnu absorpciu [2-5]. Toto obmedzenie by teoreticky sťažilo dosiahnutie extrémne vysokých koncentrácií v krvi potrebných na liečenie určitých foriem FIP (napr. neurologických) a/alebo prekonanie problému získanej rezistencie na lieky. Novšie informácie získané na základe užívania orálnych foriem GS-441524 značiek Mutian a Aura naznačujú, že tento problém nemusí byť taký závažný, ako sa pôvodne myslelo, pretože väčšina foriem FIP reaguje na liečbu rovnako dobre, či už sú podávané tablety alebo injekcie.

Zdá sa, že stále viac majiteľov a veterinárnych lekárov používa orálnu formu GS-441524 na čiastočnú alebo úplnú liečbu. Náklady na perorálne prípravky GS-441524 za posledné dva roky neustále klesali a kvalita sa zvyšovala. Problém reakcií v mieste vpichu v porovnaní s účinnejšími perorálnymi prípravkami GS-441524 viedol k širšiemu použitiu orálnej liečby. Stále viac mačiek je liečených perorálnym liečivom buď počas časti alebo celej liečby.

Formy a dávkovanie

Dodávatelia perorálnej formy GS-441524 neuvádzajú množstvo účinnej látky v tabletách alebo kapsulách. Namiesto toho sa zvyčajne odporúča 1 tableta/kapsula na kg telesnej hmotnosti pre vlhkú/suchú FIP a 2 tablety/kg pre okulárnu/neurologickú formu. To je porovnateľné s odporúčaniami pre dávkovanie pre injekčnú formu, to znamená, že vlhká a iné ako neurologické/okulárne formy FIP vyžadujú asi polovičnú dávku oproti neurologickým alebo okulárnym formám. Niektorí dodávatelia tiež poskytujú tablety s vyššou koncentráciou GS-441524 pre mačky s očnou a neurologickou FIP, aby sa obmedzili množstvá tabliet, ktoré sa musia podať naraz. Jeden dodávateľ (Aura/Spark) má navyše tablety určené pre podávanie každých 12 hodín a iné každých 24 hodín. 1 tableta/kg každých 12 hodín obsahuje polovičnú dávku GS-441524 ako 1 tableta/kg každých 24 hodín – dôvodom je to, že dávkovanie každých 12 hodín zabráni poklesu koncentrácie v krvi pred uplynutím 24 hodín. Toto nie je v súlade s pôvodnými farmakokinetickými údajmi, ktoré ukazujú, že hladiny v krvi udržiavajú na účinných úrovniach najmenej 24 hodín. Bez ohľadu na to sa tablety Aura q12h a q24h zdajú byť rovnako účinné, ak sa podávajú podľa pokynov, aj keď väčšina majiteľov uprednostňuje dávkovanie raz denne.

Všetky perorálne prípravky, s výnimkou Mutianu, sú tablety. Všetky tablety sú pomerne malé, zatiaľ čo kapsula Mutian je podstatne väčšia. Vďaka tomu sa tablety ľahšie podávajú. Kapsuly Mutian sú tiež skôr tekuté než plnené práškom, a ak ich mačky prehryznú, časť obsahu môže uniknúť. Navyše u niektorých mačiek, ktoré narušili kapsulu, boli hlásené nežiadúce účinky. Novšie prípravky, ako napríklad Sweeper, ponúkajú rozpustnú filmovú formu GS-441524, aby sa predišlo problémom s podávaním tabliet u niektorých mačiek.

Aplikácia

Všetky perorálne značky uvádzajú pre podávanie kapsúl alebo tabliet podobné pokyny. Všeobecne sa odporúča pôst pol hodiny pred a po podaní lieku. Malé množstvo jedla môže povzbudiť mačky, aby si ich vzali a veľa mačiek ich ľahšie skonzumuje spolu s pochúťkou (napr. Churu).

Cena

Cena orálnych foriem GS sa za posledný rok výrazne znížila. Relatívne náklady na perorálne frmy GS-441524 sú napriek tomu o 20 – 40% vyššie (v závislosti od dodávateľa) ako ich injekčná verzia.

Faktory ovplyvňujúce perorálne vs. injekčné podávanie liekov

Mačky, ktoré často alebo opakovane zvracajú alebo majú hnačky, sa všeobecne považujú za nevhodných kandidátov na perorálne podávanie GS-441524. Preto sa mačkám so závažným gastrointestinálnym ochorením často podávajú injekcie, a to minimálne do vyriešenia problémov. Väčšina ľudí, najmä v minulosti, začala s injekčným podávaním GS-441524. Injekčná forma je lacnejšia a dávkovanie je presnejšie. Navyše absorpcia GS-441524 subkutánnou cestou je oproti orálnej ceste spoľahlivejšia, čo je často kritickým faktorom pri počiatočnej liečbe ťažko chorých a nestabilizovaných mačiek. To, či mačka pokračuje v injekciách GS-441524 alebo nie, je často podmienené schopnosťou majiteľa aplikovať injekcie efektívnym spôsobom, ochotou mačky znášať bolesť pri aplikácie injekcie a výskytom lézií v mieste vpichu. Orálna medikácia je v takýchto situáciách často vítaným oddychom pre majiteľa, ako aj pre mačacieho pacienta.

Porovnanie úspešnosti liečby injekčnou a perorálnou formou GS-441524

Za predpokladu správne vypočítaného dávkovania a spoľahlivého podania lieku, miera úspešnosti perorálnej formy GS-441524 je v súčasnosti porovnateľná s úspešnosťou injekčných formulácií. Napriek tomu boli zaznamenané rozdiely v reakciách medzi perorálnou a injekčnou formou GS-441524. Malé množstvo mačiek na orálne podanie GS-441524 na začiatku liečby nereagovalo podľa očakávania alebo boli zaznamenané relapsy, ak orálna forma nasledovala po podávaní injekcií. Podobne ale prechodom na orálnu aplikáciu GS-441524 v ekvivalentnom dávkovaní došlo k vyriešeniu problémov u mačiek, ktorá nereagovali dobre na injekcie. Je ťažké prisúdiť tieto dramatické rozdiely v odpovedi konkrétnej liekovej forme, pretože GS-441524 podaný či už subkutánne alebo orálne, končí v krvi a nakoniec v tkanivách. Je pravdepodobnejšie, že značky injekčných alebo perorálnych foriem GS-441524 neboli ešte dostatočne kvalitné. Skutočne sa vyskytlo veľa prípadov, keď prechod na inú perorálnu alebo injekčnú značku okamžite zlepšil reakciu na liečbu.

Predpokladalo sa, že iba injekčná forma GS-441524 môže dosiahnuť extrémne vysoké hladiny v krvi a mozgomiechovom moku potrebné na účinnú liečbu neurologických ochorení, najmä v situáciách, keď sa u vírusu vyvinul rôzny stupeň rezistencie na liečivo. Značky Aura/Lucky vo svojej orálnej forme vykázali u mačiek s neurologickou FIP pomerne vysokú účinnosť. Stalo sa tak aj u niektorých mačiek, ktoré nereagovali na extrémne vysokú dávku injekčného GS-441524. Čoraz viac mačiek s neurologickou FIP sa lieči kompletne orálne. Je to buď kvôli čoraz väčším skúsenostiam s perorálnou liečbou zložitých prípadov FIP, alebo pravdepodobne kvôli zvýšenej kvalite perorálnych prípravkov.

Prehľad momentálne dostupných značiek orálnej formy GS-441524

Informácie o výsledkoch liečby perorálnymi formami GS-441524 sú zatiaľ obmedzené, ale existuje stále viac dostupných značiek, ktoré potvrdzujú popularitu tejto formy liečby. Informácie o týchto značkách sú aktualizované na webovej stránke FIP Warriors CZ/SK [7]. Tento web tiež obsahuje vynikajúce informácie o FIP a liečbe pomocou GS-441524.

Odporúčané dávkovania sa líšia od značky k značke a nie vždy zodpovedajú ekvivalentnému dávkovaniu pre injekčné GS-441524. GS-441424 sa absorbuje z čreva s asi 50% účinnosťou v porovnaní so subkutánnou alebo intravenóznou aplikáciou. Existuje tiež teoretický vzostupný limit absorpcie cez črevo, ktorý by tiež obmedzil dsahnuteľné hladiny v krvi. Vzhľadom na absorpčné obmedzenia orálneho GS-441524 by sa dalo očakávať, že orálna dávka bude približne dvojnásobná ako pri injekciách. Väčšina perorálnych značiek sa však odporúča v ekvivalentnej dávke ako injekcie. To naznačuje, že skutočná koncentrácia GS-441524 v perorálnych prípravkoch môže byť vyššia ako v prípade injekčných foriem GS-441524, ako je uvedené v nižšie uvedených tabuľkách a ako je uvedené na webovej stránke FIP Warriors CZ/SK.

Kapsule Mutian – Toto je pôvodná a najznámejšia značka perorálnych liekov GS-441524 a predáva sa v kapsulách obsahujúcich 2.5, 5 a 10 mg GS-441524. Hlavnou výhradou proti kapsulám Mutian je variabilita reakcií na terapiu. Používatelia kapsúl Mutian tiež hlásia nepriaznivejšie vedľajšie účinky ako užívatelia iných perorálnych značiek. Vzhľadom na ich väčšiu veľkosť môže byť ich podávanie zložitejšie ako u iných značiek tabliet. Kapsuly Mutian sú najdrahšou orálnou formou s približne dvojnásobne vyššími nákladmi oproti ostatným značkám.

Forma FIPDoporučené dávkovanieTablety q24h (10 mg tablety)
Vlhká FIP6 mg/kg0.6 tbl/kg
Suchá FIP8 mg/kg0.8 tbl/kg
Okulárna FIP10 mg/kg1 tbl/kg
Neurologická FIP12 mg/kg1.2 tbl/kg

Aura/Spark – tablety Aura sa v USA používajú takmer tak dlho ako Mutian a ukázalo sa, že sú vysoko účinné proti všetkým formám FIP, vrátane okulárnej a neurologickej FIP. Predávajú sa vo verziách q12h a q24h. Skutočné množstvo GS-441524 v tablete nie je uvedené, ale zdá sa, že 1 tableta/kg každých 12 hodín zodpovedá 2,5 -3mg injekčnej formy GS-441524, 1 tableta/kg každých 24 hodín zodpovedá 5-6mg, 1 tableta/3 kg každých 12 hodín zodpovedá 7,5-9mg a 1 tableta/2kg každých 24 hodín zodpovedá 10-12mg.

Forma FIPDoporučené dávkovanieTablety q24h (2.5-3 mg tablety)
Vlhká FIP6 mg/kg2 tbl/kg
Suchá FIP8 mg/kg3.25 tbl/kg
Okulárna FIP10 mg/kg4 tbl/kg
Neurologická FIP12 mg/kg5 tbl/kg

Lucky – tablety Lucky sa predávajú ako 1 tableta/kg každých 24 hodín a uvádza sa, že majú rovnaké zloženie ako porovnateľná tableta Aura, aj keď má iný tvar.

Forma FIPDoporučené dávkovanieTablety q24h (12 mg tablety)
Vlhká FIP6 mg/kg0.5 tbl/kg
Suchá FIP8 mg/kg0.67 tbl/kg
Okulárna FIP10 mg/kg0.83 tbl/kg
Neurologická FIP12 mg/kg1 tbl/kg

Capella – Spoločnosť Capella tiež prišla s orálnou verziu GS-441524. Keďže injekčný produkt tejto značky má dobrú povesť, orálna forma sa tiež stáva čoraz populárnejšou.

Kitty Care – Toto je ďalšia nízkonakladová značka, ktorá ponúka injekčné aj perorálne formulácie GS-44524. Každá tableta obsahuje 6 mg GS-441524.

Forma FIPDoporučené dávkovanieTablety q24h
Vlhká FIP6 mg/kg1 tbl/kg
Suchá FIP8 mg/kg1.33 tbl/kg
Okulárna FIP10 mg/kg1.67 tbl/kg
Neurologická FIP12 mg/kg2 tbl/kg

Hero 16 – Toto je uznávaná značka, ktorá sa dodáva s ľahko použiteľnými a ryhovanými tabletami obsahujúcimi 16 mg GS-441524. Perorálna dávka s ekvivalentnou injekčnou dávkou je nasledovná:

Forma FIPDoporučené dávkovanieTablety q24h
Vlhká FIP6 mg/kg0.38 tbl/kg
Suchá FIP8 mg/kg0.5 tbl/kg
Okulárna FIP10 mg/kg0.63 tbl/kg
Neurologická FIP12 mg/kg0.75 tbl/kg

Rainman – Táto značka je populárna v Číne a zdá sa, že má dobrú povesť v krajinách, kde sa používa. Predáva sa v tabletách obsahujúcich 10 mg GS-441524.

Forma FIPDoporučené dávkovanieTablety q24h
Vlhká FIP6 mg/kg0.6 tbl/kg
Suchá FIP8 mg/kg0.8 tbl/kg
Okulárna FIP10 mg/kg1 tbl/kg
Neurologická FIP12 mg/kg1.2 tbl/kg

Mary – Mary sa predáva v kapsulách obsahujúcich 6 mg GS-441524

Forma FIPDoporučené dávkovanieTablety q24h
Vlhká FIP6 mg/kg1 tbl/kg
Suchá FIP8 mg/kg1.33 tbl/kg
Okulárna FIP10 mg/kg1.67 tbl/kg
Neurologická FIP12 mg/kg2 tbl/kg

Ďalšie značky– Panda 6 mg, Pany 5 mg, Sweeper 6 mg, Sweeper film 6mg

Referenčné štúdie o GI absorpcii nukleozidov podobných GS-441524 a GS-441524

  1. Thomas L. A precursor to remdesivir shows therapeutic potential for COVID-19. https://www.news-medical.net/news/20210209/A-precursor-to-remdesivir-showstherapeuticpotential-for-COVID-19.aspx.
  2. Painter GR, Bowen RA, Bluemling GR, et al. The prophylactic and therapeutic activity of a broadly active ribonucleoside analog in a murine model of intranasal venezuelan equine encephalitis virus infection. Antiviral Res. 2019;171:104597. doi:10.1016/j.antiviral.2019.104597
    After oral administration EIDD-1931 is quickly absorbed as evidenced by plasma T-max-values ranging between 0.5 and 1.0 h.Exposures are high (C-ma-xvalues range between 30 and 40μM) and are dose dependent, but significantly less than dose proportional. The observation of decreasing bioavailability with increasing dose may indicate capacity limited absorption, a phenomenon that has been reported for other nucleosides (de Miranda et al., 1981). EIDD-1931, like most endogenous nucleosides and xenobiotic nucleoside analogs, is a highly polar, hydrophilic molecule (cLog P =−2.2) and therefore likely to require functional transporters to cross cell membranes. This dependence would explain the capacity limited uptake seen in the pharmacokinetic studies done using the CD-1 mice. Earlier reports also indicated that nucleoside uptake into mouse intestinal epithelial cells is primarily mediated by sodium dependent concentrative nucleoside transporters (Cass et al., 1999; Vijayalakshmi and Belt, 1988).
  3. Cass, C.E., Young, J.D., Baldwin, S.A., Cabrita, M.A., Graham, K.A., Griffiths, M.,Jennings, L.L., Mackey, J.R., Ng, A.M., Ritzel, M.W., Vickers, M.F., Yao, S.Y., 1999.Nucleoside transporters of mammalian cells. Pharm. Biotechnol. 12313–12352
  4. de Miranda, P., Krasny, H.C., Page, D.A., Elion, G.B., 1981. The disposition of acyclovir indifferent species. J. Pharmacol. Exp. Ther. 219 (2), 309–315
  5. Vijayalakshmi, D., Belt, J.A., 1988. Sodium-dependent nucleoside transport in mouse intestinal epithelial cells. Two transport systems with differing substrate specificities. Biol. Chem. 263 (36), 19419–19423.
  6. Yan VC, Khadka S, Arthur K, Ackroyd JJ, Georgiou DK, Muller FL. Pharmacokinetics of Orally Administered GS-441524 in Dogs. bioRxiv, doi: https://doi.org/10.1101/2021.02.04.429674
  7. FIP Warriors CZ/SK, https://www.fipwarriors.eu/, https://www.facebook.com/groups/fipczsk
Prečítať “Liečba orálnymi formami GS-441524”

Racionálny prístup k identifikácii účinných kombinovaných antikoronavírusových terapií proti mačaciemu koronavírusu

9.7.2020
S.E. Cook, H. Vogel, D. Castillo, M. Olsen, N. Pedersen, B. G. Murphy
Pôvodný článok: A rational approach to identifying effective combined anticoronaviral therapies against feline coronavirus

Abstrakt

Mačací infekčný zápal pobrušnice (FIP), spôsobený genetickým mutantom mačacieho enterického koronavírusu známym ako FIPV, je smrteľným ochorením mačiek, pre ktoré v súčasnosti nie je k dispozícii žiadna vakcína alebo liečba schválená FDA. Šírenie FIPV u postihnutých mačiek vedie k radu klinických príznakov vrátane kavitárnych výpotkov, anorexie, horúčky a lézií pyogranulomatóznej vaskulitídy a perivaskulitídy s alebo bez postihnutia centrálneho nervového systému a/alebo oka. Vznikla kritická potreba účinných a schválených antivírusových terapií proti koronavírusom vrátane FIPV a zoonotických koronavírusov, ako je SARS-CoV-2, pôvodcu COVID-19. Pokiaľ ide o SARS-CoV-2, predbežné dôkazy naznačujú, že môžu existovať potenciálne klinické a patologické spoločné znaky s mačacím koronavírusovým ochorením, vrátane enterického a neurologického postihnutia. Skúmali sme 89 vytipovaných antivírusových zlúčenín a identifikovali sme 25 zlúčenín s antivírusovou aktivitou proti FIPV, ktoré predstavujú rôzne triedy liekov a mechanizmov antivírusového pôsobenia. Na základe úspešných stratégií kombinovanej liečby u ľudských pacientov s infekciou HIV alebo vírusom hepatitídy C sme identifikovali kombinácie liekov zameraných na rôzne fázy životného cyklu FIPV, ktoré vedú k synergickému antivírusovému účinku. Podobne navrhujeme, aby sa kombinovaná antikoravírusová terapia (cACT) s viacerými mechanizmami účinku a penetrácie do všetkých potenciálnych anatomických miest vírusovej infekcie aplikovala na liečbu ďalších koronavírusov, ako je SARS-CoV-2.

Zhrnutie autora

In vitro sme testovali antivírusovú aktivitu proti FIPV u 89 zlúčenín. Antivírusová aktivita týchto zlúčenín spočivala buď v priamom účinku na vírusové proteíny zapojených do replikácie vírusu, alebo v nepriamom inhibičnom účinku na normálne bunkové procesy uzurpované FIPV na podporu replikácie vírusu. Dvadsaťpäť z týchto zlúčenín vykázalo významnú antivírusovú aktivitu. Zistili sme aj to, že určité kombinácie týchto zlúčenín sú účinnejšie ako samotná monoterapia.

Slovník

SkratkaAnglický výrazSlovenský preklad
PIprotease inhibitorinhibítor proteázy
NPInucleoside polymerase inhibitornukleozidový inhibítor polymerázy
NNPInon-nucleoside polymerase inhibitornenukleozidový inhibítor polymerázy
CPEcytopathic effect cytopatický efekt
cACTcombined anti-coronaviral therapykombinovaná antikoronavírusová terapia
cARTcombined anti-retroviral therapykombinovaná antiretrovírusová terapia
CRFK cellsCrandell-Rees Feline Kidney cellsCrandell-Rees mačacie obličkové bunky

Úvod

Mačacia infekčná peritonotída (FIP) je vysoko smrteľné ochorenie bez účinnej vakcíny alebo liečby schválenej FDA. Aj keď patogenéza nie je úplne objasnená, všeobecne sa predpokladá, že FIP je výsledkom špecifických mutácií vo vírusovom genóme minimálne patogénneho a všadeprítomného mačacieho enterického koronavírusu (FECV), ktoré vedú k vzniku virulentného vírusu FIP (FIPV) [1–3]. Tieto mutácie FECV vedú k zmene tropizmu vírusom napadnutej hostiteľskej bunky z intestinálnych enterocytov na makrofágy peritoneálneho typu. Produktívna infekcia makrofágov vírusom FIPV, cielená rozsiahla anatomická diseminácia a imunitne sprostredkovaná perivaskulitída vedú k vysoko smrteľnému systémovému zápalovému ochoreniu FIP [4]. V dôsledku vírusovej diseminácie sa FIP môže prejavovať klinickými príznakmi odrážajúcimi zápal na rôznych anatomických miestach, ktoré môžu potenciálne zahŕňať brušnú dutinu a vnútornosti, hrudnú dutinu, centrálny nervový systém a/alebo oči [5–8]. Kvôli vysokej úmrtnosti FIP zostáva devastujúcim vírusovým ochorením mačiek a výzvou pri stanovení presnej etiologickej diagnózy za súčasného nedostatku dostupných a efektívnych možností liečby [7, 9]. Vývoj účinnej vakcíny proti FIP bol komplikovaný úlohou na protilátkách závislého zosilnenia (ADE) v patogenéze choroby FIP, kde sa ukázalo, že prítomnosť neneutralizujúcich antikoronavírusových protilátok zhoršuje ochorenie FIP [10–12] .

Koronavírusy u cicavcov infikujú a spravidla spôsobujú ochorenie črevného traktu alebo dýchacieho systému infikovaných hostiteľov [13]. FIP sa však často prejavuje ako syndróm multisystémového zápalového ochorenia v dôsledku rozsiahleho šírenia makrofágov infikovaných FIPV. Nedávny pandemický výskyt SARS-CoV-2 má u infikovaných ľudských pacientov za následok rôzne syndrómy choroby, súhrnne označovanej ako COVID-19. Aj keď má SARS-CoV-2 zjavný tropizmus pre respiračný epitel, ktorý vedie k intersticiálnej pneumónii, nedávne dôkazy naznačujú, že COVID-19 sa môže prejavovať aj ako zažívacie ochorenie a klinicky sa prejavovať ako hnačka [14, 15]. Tropizmus pre tieto tkanivá odráža membránovú expresiu proteínu ACE2, bunkového cieľa SARS-CoV-2 [16]. Ďalej sa ukazuje, že SARS-CoV-2 je schopný infikovať a spôsobiť zápalové ochorenie v tkanivách mimo črevného traktu a dýchacích ciest, vrátane mozgu, očí, reprodukčných orgánov a srdcového myokardu [17–21]. Neuroinvazia mozgového kmeňa a následná encefalitída spôsobená SARS CoV-2 môžu prispieť k respiračnému zlyhaniu u pacientov s COVID-19 [20,22]. Experimentálne je SARS CoV-2 schopný vytvoriť produktívnu infekciu u mačiek [23]. Infekcia FIPV mačiek a infekcia SARS CoV-2 u ľudských pacientov sa preto podobajú viac, ako sa pôvodne zdalo.

Vznikla okamžitá a kritická potreba dostupných a účinných antivírusových terapií na liečenie týchto koronavírusových chorôb. Mačky infikované FIPV by mohli slúžiť ako translačný model a poskytnúť užitočné poznatky použiteľné pre pacientov infikovaných SARS-CoV-2 s COVID-19. Posledné antivírusové klinické štúdie u mačiek experimentálne aj prirodzene infikovaných FIPV priniesli nádej pre liečbu a vyliečenie FIP pomocou GS-441524, nukleozidového analógu a metabolitu proliečiva Remdesivir (Gilead Sciences) alebo GC-376, 3C-like inhibítora proteázy FIPV (Anivive) [24–26]. Remdesivir, prodrug GS-441524, sa nedávno ukázal byť sľubným pri liečbe ľudských pacientov infikovaných SARS-CoV-2 [27,28]. Napriek týmto nedávnym klinickým úspechom musia byť tieto antivírusové zlúčeniny ešte schválené a v súčasnosti nie sú k dispozícii na klinické veterinárne použitie u mačiek s FIP.

Identifikácia a vývoj účinných antivírusových terapií môžu byť nákladné aj časovo náročné. Cielený skríning a opakované použitie liekov už schválených FDA alebo schválených na výskumné použitie, môžu hrať efektívnu úlohu pri objavovaní liekov. Použitím predpokladaných antivírusových zlúčenín vybraných na základe ich preukázanej účinnosti pri liečbe iných RNA-vírusov sme identifikovali podskupinu zlúčenín so silnou anti-FIPV aktivitou a charakterizovali ich profily bezpečnosti a účinnosti in vitro. Na základe veľkého úspechu kombinovanej antiretrovírusovej terapie (cART) proti HIV-1 a kombinovanej liečby vírusu hepatitídy C [29] sme vyvinuli metódy na identifikáciu účinných kombinačných terapií proti FIPV. Počiatočné monoterapie proti HIV-1, ako je azidotymidín (AZT), často viedli k vírusovým únikovým mutáciám. Zdá sa, že súčasné použitie viacerých antivírusových zlúčenín blokuje tento adaptívny vírusový evolučný mechanizmus, pretože vývoj HIV-1 je modernými cART účinne zastavený [30]. Úspešnosť cART je výsledkom farmakologického zamerania na viac stupňov životného cyklu vírusu súčasne, pričom sa spoločne dosahuje synergický antivírusový účinok [31].

Vzhľadom na pôsobivý úspech cART by sa mohlo javiť, že súčasné zacielenie na FIPV v rôznych fázach životného cyklu vírusu kombinovanou antikoronavírusovou terapiou (cACT) môže ponúknuť vyššiu úroveň trvalého a úplnejšieho úspechu, v porovaní s monoterapiami samotnými. Zahrnutie antivírusového agenta do cACT schopného preniknúť hematoencefalickou (BBB) ​​a hematookulárnou bariérou, a dosiahnuť farmakologicky relevantné tkanivové koncentrácie môže uľahčiť eradikáciu FIPV v celom systéme. Popisujeme tu súbor in vitro testov uľahčujúcich rýchly skríning a identifikáciu účinných antikoronavírusových zlúčenín. Účinné antivírusové látky s rôznymi mechanizmami účinku a predpokladanou distribúciou v tele boli kombinované do cACT a testované na synergiu zlúčenín. Predpokladali sme, že kombinované použitie dvoch alebo viacerých účinných antivírusových monoterapií s rôznymi mechanizmami účinku uľahčí identifikáciu synergických kombinácií poskytujúcich vynikajúcu antikoronavírusovú účinnosť v porovnaní s ich samostatným použitím. Identifikácia úspešnej cACT môže tiež poskytnúť vodítka k liečbe ďalších objavujúcich sa vírusových ochorení, ako je SARS-CoV-2.

Výsledky

Testovanie zlúčenín

Na identifikáciu zlúčenín s anti-FIPV aktivitou bola in vitro testovaná skupina 89 zlúčenín (doplnková tabuľka 1) z rôznych tried liečiv a s rôznymi predpokladanými mechanizmami účinku. Testované zlúčeniny zahŕňali inhibítory nukleozidovej polymerázy (NPI), nenukleozidové polymerázové inhibítory (NNPI), inhibítory proteázy (PI), NS5A inhibítory, súbor nových anti-helikázových chemických „fragmentov“ a súbor zlúčenín s neurčenými mechanizmami účinku . Z tejto skupiny 89 zlúčenín sa ukázalo, že celkovo 25 rôznych zlúčenín vykazuje antivírusovú aktivitu proti FIPV vrátane NPI, PI, inhibítorov NS5A a dvoch zlúčenín s neurčenými mechanizmami účinku (označovaných ako „iné“, obr. 1). Medzi tieto úspešné antivírusové látky patrili toremiféncitrát, daklatasvir, elbasvir, lopinavir, ritonavir, nelfinavirmesilát, K777 / K11777, grazoprevir, amodiaquín, EIDD 1931, EIDD 2801 a GS-441524 pochádzajúce od troch rôznych čínskych výrobcov (tabuľka 1, obr. 2). Testovali sme niekoľko nukleozidových analógových zlúčenín poskytnutých spoločnosťou Gilead Sciences štrukturálne príbuzných nukleozidovým analógom GS-441524 a Remdesivir na ich antivírusové vlastnosti a našli sme niekoľko s potenciálom (obsiahnutých vo vyššie uvedených 25 identifikovaných zlúčeninách), ale tieto látky sme ďalej nesledovali. Pre ďalšie analýzy bolo vybraných 13 antivírusových látok. Tento celkový počet zahrňuje už pretým identifikovaný 3-C inhibítor proteázy, GC-376 (Anivive).

Názov zlúčeninyKategória liekuEC50 (µM)
GC376PI0.04
EIDD 1931NPI0.09
ElbasvirNS5A Inhibitor0.16
EIDD 2801NPI0.4
GS-441524+NPI0.66
K777/K11777PI0.67
Toremifene citrateIné*5
AmodiaquineIné**6.5
LopinavirPI8.08
RitonavirPI8.7
GrazoprevirPI12.13
Nelfinavir mesylatePI13.47
Tabuľka 1.
EC50 zlúčenín s anti-FIPV aktivitou.
PI = Inhibítor proteázy; NPI = Nukleozidový inhibítor polymerázy
+ MedChem Express, HY-103586
* Selektívny modulátor estrogénových receptorov
** 4-Aminoquinoline
Obrázok 1
Testované zlúčeniny podľa mechanizmu účinku
(A) Všetky testované zlúčeniny
(B) Zlúčeniny, u ktorých bola pri testoch in vitro zistená anti-FIPV aktivita
Obrázok 2
Príklad testovacej matrice využívajúcej farbenie kryštálovou violeťou na identifikáciu anti-FIPV aktivity pri 10μM.
Horný ľavý riadok sú kontrolné jamky iba s CRFK bunkami a bez liečiva alebo FIPV. Pravý horný riadok je pozitívna kontrola využívajúca GS-441524 so známou úplnou ochranou CRFK buniek pred FIPV-indukovanou bunkovou smrťou. Celý spodný rad jamiek predstavuje CRFK bunky infikované FIPV a bez liečby. Zvyšné riadky sú testovacie jamky, pričom ľavá polovica hodnotí cytotoxicitu pri 10μM (bez infekcie FIPV) a pravá polovica hodnotí anti-FIPV aktivitu pri 10μM pre ktorúkoľvek danú zlúčeninu. Strata zafarbenia naznačuje stratu buniek. Daklatasvir a velpatasvir demonštrovali anti-FIPV aktivitu, o čom svedčí zvýšené farbenie kryštálovou violeťou (relatívne intaktné bunkové monovrstvy) v porovnaní s kontrolnými jamkami obsahujúcimi iba FIPV (spodný rad doštičky). Lieky 32, 33 a 34 vykazovali neprítomný až minimálny antivírusový účinok, zatiaľ čo liečivo 34 (Ravidasvir) tiež vykazovalo cytotoxicitu pri koncentrácii 10μM na základe dramatického vyčistenia jamiek pozorovaného v ľavej polovici matrice bez FIPV.

Stanovenie antivírusovej účinnosti

Antivírusová účinnosť (EC50) sa stanovila pre 10 antivírusových zlúčenín. Pre tieto zlúčeniny bola EC50 v rozmedzí od 0,04μM do 13,47μM (tabuľka 1, obr. 3). Jedna z antivírusových látok, Daclatasvir, preukázal neprijateľnú cytotoxicitu pri 20μM a bol vyradený z ďalšieho testovania. Ukázalo sa, že GS-441524 pochádzajúci z Číny (MedChemExpress, HY-103586) má porovnateľnú EC50 v porovnaní s predtým publikovanými hodnotami pre GS-441524 pochádzajúci z Gilead Sciences [25].

Obrázok 3
Reprezentatívne príklady nelineárnych regresných analýz EC50 pre zlúčeniny s anti-FIPV aktivitou.

Na identifikáciu polovičnej maximálnej efektívnej koncentrácie (EC50) sa uskutočnili sériové riedenia každej zlúčeniny s anti-FIPV aktivitou. Tu uvedené výsledky GS-441524 predstavujú zlúčeninu pochádzajúcu z MedChemExpress.

Bezpečnostné profily cytotoxicity

Profily bezpečnosti na cytotoxicitu (CSP) sa stanovili pre desať rôznych antivírusových zlúčenín v bunkách CRFK. Pri 5μM sedem testovaných zlúčenín nevykazovalo v podstate žiadnu cytotoxicitu, zatiaľ čo dve z antivirotík, amodiaquine a toremifene, mali 11, respektíve 12% cytotoxicitu (obr. 4; tabuľka 2). 50% cytotoxická koncentrácia (CC50) pre GC376 sa uvádza ako >150μM [32]. Je zaujímavé, že na základe testu Promega CellTox ™ Green Cytotoxicity bola cytotoxicita obidvoch EIDD zlúčenín v podstate nedetegovateľná až do 100μM. Vizuálna kontrola jamiek s EIDD tesne pred aplikáciou fluorescenčného farbiva a odčítaním z matrice však odhalila rozdiely v morfológii buniek (cytopatický účinok) medzi neliečenými CRFK bunkami a liečenými bunkami. Neliečené CRFK bunky sa vyznačovali adherentnou vretenovou morfológiou v jednej monovrstve, zatiaľ čo jamky s EIDD preukázali zreteľný pokles konfluencie v porovnaní s variabilnou morfológiou buniek vrátane zaokrúhľovania buniek (cytopatický účinok). Rozpor medzi subjektívnym vizuálnym hodnotením jamiek s EIDD a fluorescenčným testom je záhadou. Je možné, že celkové zníženie počtu buniek v jamkách s EIDD viedlo k strate a degradácii nukleovej kyseliny nevyhnutnej na fluorescenčné viazanie a detekciu v teste CellTox.

ZlúčeninaKategória lieku5μM10μM25μM50μM100μM
ElbasvirNS5A Inhibítor0.670.461.424.9
K777/K11777PI0.610.292.3916
Toremifene citrateIná*1222233539
AmodiaquineIná**1112192326
LopinavirPI0.6715131618
RitonavirPI0.490.8423326
GrazoprevirPI0.5500.813.919
EIDD1931NPI1.20.940.60.782.8
EIDD2801NPI00.950.631.70.8
GS-441524+NPI0.210000
Tabuľka 2
Percento cytotoxicity podľa zlúčeniny a koncentrácie.
PI = Inhibítor proteázy; NPI = Nukleozidový inhibítor polymerázy
* Selektívny modulátor estrogénových receptorov
** 4-Aminoquinoline
+ NMPharmTech
Obrázok 4
Reprezentatívne profily cytotoxicity.
Stĺpcové grafy percenta cytotoxicity +/- štandardná odchýlka (SD) pre štyri zlúčeniny s anti-FIPV aktivitou. Percentuálne hodnoty cytotoxicity sa stanovili normalizáciou cytotoxicity pre kontrolné jamky s pozitívnou toxicitou (nastavená na 100% cytotoxicitu) a neliečené bunky CRFK (nastavené na 0% východiskovej cytotoxicity).

Kvantifikácia inhibície produkcie vírusovej RNA pri monoterapii

Na meranie schopnosti každej antivírusovej látky inhibovať koronavírusovú replikáciu pri monoterapii (Vírusový RNA knock-down test) sa použil test RT PCR v reálnom čase. Zlúčeninami demonštrujúcimi najväčšiu inhibíciu produkcie FIPV RNA boli GC376, 3C-like inhibítor koronavírusovej proteázy, GS-441524, EIDD-1931 a EIDD-2801, pričom posledné tri boli nukleozidové analógy (obr. 5, tabuľka 3). Medzi látky s najmenším inhibičným účinkom na produkciu vírusovej RNA patria elbasvir, nelfinavir a ritonavir. Ritonavir, inhibítor proteázy, sa používa v kombinácii s lopinavirom na liečbu infekcie HIV-1 (Kaletra, AbbVie). Monoterapia lopinavirom má u ľudí neuspokojivú orálnu biologickú dostupnosť, avšak pri použití v kombinácii sa ukázalo, že ritonavir výrazne zlepšuje plazmatickú koncentráciu lopinaviru [33]. Preto aj napriek relatívne minimálnej inhibícii FIPV identifikovanej s ritonavirom ako monoterapiou, bola táto zlúčenina predmetom ďalšieho testovania vrátane kombinovaného antikoravírusového hodnotenia.

ZlúčeninaNásobok redukcie titra vírusu
GC376 (20μM)25000
GC3767300
GS-441524 (NMPharmTech)5280
EIDD-19313700
GS-441524 (MedChemExpress)3500
EIDD-28012110
Lopinavir309
Toremifene10
K7777
Grazoprevir5
Amodiaquine4
Elbasvir2
Nelfinavirmesylate1
Ritonavir1
Tabuľka 3
Násobné zníženie počtu kópií vírusovej RNA pre anti-FIPV zlúčeniny pri monoterapii
*Pokiaľ nie je uvedené inak, všetky zlúčeniny sa použili pri 10 μM.
Obrázok 5
Násobné zníženie počtu kópií FIPV RNA s použitím antivírusových zlúčenín pri monoterapii.

FIPV-infikované CRFK bunky sa inkubovali 24 hodín so zlúčeninami so zistenou anti-FIPV aktivitou. Počet vírusových kópií sa následne stanovil pomocou RT-qPCR a normalizoval sa na počet mačacích GAPDH kópií, aby sa určil účinok násobného zníženia pre každú zlúčeninu. Všetky zlúčeniny sa testovali pri 10μM, pokiaľ nie je uvedené inak. Všetky experimentálne ošetrenia sa uskutočňovali v triplikátových jamkách a násobný pokles sa vypočítal vydelením priemerného experimentálneho normalizovaného počtu kópií FIPV priemerným normalizovaným počtom kópií FIPV stanoveným pre neošetrené jamky infikované FIPV.
1GS-441524 – NMPharmTech (Čína).
2GS-441524 – MedChemExpress (Čína).

Kvantifikácia inhibície produkcie vírusovej RNA pri cACT

Na identifikáciu kombinácií liekov so synergickým antivírusovým účinkom oproti monoterapii sa vybrali kombinácie dvoch alebo viacerých zlúčenín na základe (i) zavedených kombinácií používaných pri iných vírusových infekciách, ako je HIV-1 a HCV, (ii) liekov s rôznymi mechanizmami účinku , (iii) potenciálnych zmien v systémovej distribúcii zlúčeniny (napr. schopnosti preniknúť cez hematoencefalickú alebo hematookulárnu bariéru podľa chemickej klasifikácie) a (iv) minimálnej cytotoxicity (na základe CSP). Pre každú cACT bolo akékoľvek výsledné zníženie počtu kópií FIPV prevyšujúce vypočítaný aditívny účinok pre každé liečivo použité v režime monoterapie považované za synergické (tabuľka 4). Najväčší synergický účinok s najvyšším celkovým násobným znížením vírusovej RNA, dosiahla kombinácia GC376 a amodiaquinu so 76-násobným znížením vírusovej RNA v porovnaní s aditívnym účinkom (obr. 6). Táto konkrétna synergická kombinácia bola jedným z prekvapujúcich výsledkov vzhľadom na to, že samotný amodiaquín preukázal iba obmedzenú inhibíciu kópií vírusovej RNA FIPV stanovenú pomocou qRT-PCR.

Zlúčenina 1Zlúčenina 2Zlúčenina 3Redukcia titra vírusuAddcACT/add
GC376 (20 uM)Amodiaquine18970002500476
GC376 (20 uM)AmodiaquineToremifene2560002501410
GC376 (20 uM)K7772480002500710
GC376 (20 uM)Toremifene128000250105.1
GC376 (20 uM)Nelfinavir mesylate91100250013.6
Elbasvir (5 uM)Lopinavir1400031145
Elbasvir (5 uM)GC376 (20 uM)12600250020.50
GC376 (10 uM)Amodiaquine1170073041.6
GC376 (10 uM)Grazoprevir829073051.1
GC376 (20 uM)GS-441524 (NMPharmTech)8260302800.27
GC376 (10 uM)AmodiaquineElbasvir (5 uM)757073061.0
GC376 (10 uM)GS-441524 (MedChem)6910108000.64
GC376 (20 uM)Ritonavir6560250010.26
K777Lopinavir553031618
GC376 (10 uM)GS-441524 (NMPharmTech)4340125800.34
GC376 (20 uM)Lopinavir3400253090.13
LopinavirRitonavir313031010
LopinavirRitonavirToremifene17403205.4
GC376 (10 uM)EIDD-280125594100.03
K777Toremifene25171.5
Tabuľka 4
Násobné zníženie počtu kópií FIPV vírusovej RNA pri kombinovanej terapii (cACT).
Očakávaný aditívny účinok reflektuje súčet násobného zníženia vírusovej RNA každej zlúčeniny použitej pri monoterapii (Tabuľka 3)
* Pokiaľ nie je uvedené inak, všetky zlúčeniny boli použité pri 10μM.
cACT/add – pomer redukcie titra FIPV pri kombinovanej terapii oproti súčtu násobkov redukcie titra pri monoterapii
Add – súčet násobkov redukcie titra pri monoterapii
Obrázok 6
Vybrané príklady násobného zníženia počtu kópií FIPV RNA pomocou kombinovanej terapie (cACT).
Stĺpce predstavujú priemerný násobný pokles troch jamiek liečených buniek CRFK v porovnaní so stredným násobným poklesom troch neliečených jamiek infikovaných FIPV. Všetky zlúčeniny boli testované pri 10μM, pokiaľ nie je uvedené inak.

Vzhľadom na výraznú anti-FIPV aktivitu GC-376, ako aj na jeho potenciálnu dostupnosť pre pokrok vo farmakokinetických štúdiách in vivo, klinických testoch a nádejnom použití v aplikácii cACT bola táto zlúčenina vybraná na sériu “vírusových RNA knock-down” testov pri mono a kombinovanej terapii (obr. 7). Celkovo GC376 preukázal vynikajúcu anti-FIPV aktivitu pri 20μM tak pri monoterapii, ako aj pri kombinovanej terapii in vitro. K najvýraznejšiemu zníženiu FIPV RNA došlo v kombinácii GC376 pri 20μM s amodiaquinom pri 10μM. Pokus kombinujúci GC376 s amodiaquinom sa opakoval a oba výsledky sú uvedené pre porovnanie na obr. 7C.

Obrázok 7
GC376 antivírusová aktivita pri monoterapii a v kombinovanej terapii pri 10 a 20 μM

(A) Redukcia FIPV RNA kvantifikovaná pomocou RT-qPCR s použitím GC376 ako monoterapii pri 10 a 20 μM. Medzi týmito dvoma koncentráciami je významný rozdiel, pričom 20μM je lepšia ako 10μM. (nepárový t-test; p <0,0001).
(B) Kombinovaná in vitro terapia s použitím GC376 pri 10 μM.
(C) Kombinovaná in vitro terapia proti FIPV s použitím GC376 pri 20 μM.

Diskusia

Pretože v súčasnosti neexistuje účinná vakcína proti FIP, existuje silná klinická a celosvetová potreba účinných možností antivírusovej liečby pre mačky infikované FIPV. Testovali sme 89 zlúčenín, ktorých výsledkom je identifikácia 25 antivírusových látok s antivírusovou účinnosťou a silnými bezpečnostnými profilmi proti mačaciemu koronavírusu, FIPV. Identifikovali sme tiež kombinácie antivírusových látok (cACT), ktoré viedli k vyššej účinnosti alebo synergizmu oproti samotnej monoterapii. Obzvlášť zaujímavé bolo zistenie týkajúce sa použitia elbasviru, ktorý opakovane demonštroval vynikajúcu ochranu CRFK pred FIPV vyvolanom CPE pri koncentrácii nižšej ako 1 μM na základe viacerých testov (EC50 0,16 μM). V zásade sa však nezistil žiadny rozdiel v počte kópií vírusovej RNA medzi infikovanými bunkami liečenými elbasvirom alebo bez neho. Ďalšia vizuálna analýza buniek CRFK infikovaných FIPV, ktoré boli liečené elbasvirom, odhalila atypickú morfológiu buniek vo vzťahu k neinfikovaným bunkám, ktorá sa vyznačovala premenlivým zväčšením, zaoblením buniek a čiastočným odlúčením buniek (cytopatický účinok). Tieto „atypické bunky“ sa zriedka oddelili od kultivačnej doštičky a vo výsledku boli hodnoty absorbancie porovnateľné s neinfikovanými kontrolnými jamkami. Tento dichotomický výsledok medzi analýzou doštičky a vírusovým RNA knock-down testom naznačuje, že k antivírusovému účinku elbasviru dochádza po vírusovej replikácii a vo výsledku nemusí elbasvir chrániť bunky pred akumuláciou vírusovej RNA. Elbasvir sa používa na liečbu pacientov infikovaných vírusom hepatitídy C (HCV) a predpokladá sa, že je cielený na HCV NS5A proteín zabraňujúci replikácii a tiež na kompletizáciu viriónov [34]. Aj keď nie je pre FIPV identifikovaný homológ NS5A, je možné, že elbasvir vykazuje podobný antivírusový účinok tým, že zabraňuje kompletizácii viriónov FIPV bez blokovania syntézy vírusovej RNA v CRFK bunkách. Dodatočné vyhodnotenie liečených buniek CRFK infikovaných FIPV pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie môže objasniť účinok elbasviru na ochranu CRFK pred poškodením a smrťou spojenou s FIPV.

Ukázalo sa, že súčasné podávanie ritonaviru s lopinavirom významne zvyšuje plazmatické koncentrácie lopinaviru u potkanov, psov a ľudí [33]. Ritonavir je silný inhibítor CYP3A, ktorý je primárnym enzýmom zodpovedným za metabolizmus inhibítorov proteázy, a preto jeho súbežné podávanie s inými inhibítormi proteázy vedie k zvýšeným systémovým koncentráciám súčasne podávaného inhibítora proteázy, ako je lopinavir [38, 39]. Zvýšenie antivírusového účinku lopinaviru spojené s ritonavirom bolo v testoch eliminácie vírusovej RNA relatívne minimálne s iba 10-násobnou inhibíciou FIPV oproti aditívnemu účinku. Môže to byť výsledkom in vitro artefaktu testovania na mačacej obličkovej bunkovej línii (tj. CRFK bunkách), v ktorej chýba enzým CYP3, čo je enzým, ktorý sa typicky vyskytuje v miestach s vysokým metabolizmom inhibítora proteázy pri efekte prvého priechodu (tj. v enterocytoch a hepatocytoch) [39]. Tieto výsledky naznačujú, že samotné testy in vitro nemusia úplne predpovedať účinok antivírusových látok u mačiek infikovaných FIPV in vivo.

Grazoprevir, inhibítor serínovej proteázy NS3/4, sa používal v kombinácii s elbasvirom, inhibítorom NS5A, na liečbu pacientov infikovaných HCV (Zepatier, Merck) [40]. Tu sme preukázali, že grazoprevir má anti-FIPV aktivitu, keď sa používa ako monoterapia. Inhibítor cysteínovej proteázy K777/K11777 bol skúmaný kvôli svojej schopnosti blokovať vstup koronavírusu (MERS-CoV a SARS-CoV-1) a ebolavírusu a bolo zistené, že úplne inhibuje koronavírusovú infekciu, ale iba v cieľových bunkových líniách bez vírus aktivujúcich serínových proteáz. [41]. V prípade iných bunkových línií K777 inhiboval vstup koronavírusových buniek v kombinácii s inhibítorom serínovej proteázy [41]. Je možné, že obmedzená inhibícia produkcie FIPV RNA K777 by sa mohla zvýšiť, ak by sa kombinovala s inhibítorom serínovej proteázy.

Amodiaquine je antimalarické liečivo a patrí do triedy 4-aminochinolínových liečiv. Amodiaquine spolu s príbuznými 4-aminochinolínmi, ako sú chlorochin a hydroxychlorochin, bol pôvodne vyvinuý pre liečbu malárie [42], a podobne ako chlorochín a hydroxychlorochín oplýva rozsiahlym anatomickým distribučným objemom vrátane očí a mozgu [43–49]. Prenikanie antivírusových látok do CNS a/alebo očných kompartmentov je obzvlášť dôležité v prípade mačiek infikovaných FIPV s neurologickým a/alebo očným postihnutím. Zatiaľ čo niekoľko výskumov definovalo antivírusové vlastnosti chlorochínu a hydroxychlorochínu [28, 50, 51], antivírusová aktivita amodiaquinu sa skúmala aj s identifikáciou antivírusovej aktivity proti vírusu dengue, vírusu Ebola a ťažkej horúčke s vírusovým trombocytopénnym syndrómom (SFTS) [52–55]. Mechanizmus účinku amodiaquinu môže zahŕňať zvýšenie cytoplazmatického lyzozomálneho a/alebo endozomálneho pH, ktoré zabráni uvoľneniu životaschopných viriónov do cytoplazmy [56]. Vzhľadom na svoj jedinečný status triedy liečív a predpokladanú schopnosť prekonať hematoencefalickú bariéru [57] je amodiaquine sľubným kandidátom pre kombinovanú liečbu neurologických a/alebo okulárnych foriem FIP.

Toremiféncitrát, selektívny modulátor estrogénových receptorov (SERM), sa používa na liečbu metastatického karcinómu prsníka u ľudských pacientov. V poslednej dobe bol toremifén hodnotený z hľadiska jeho antivírusových vlastností a preukázal antikoravírusovú aktivitu proti zoonotickým koronavírusom, koronavírusom blízkovýchodného respiračného syndrómu (MERS-CoV) a SARS-CoV-1 [58]. Toremifén tiež preukázal aktivitu proti vírusu Ebola (EBOV) [59, 60]. Aj keď presný mechanizmus antivírusového pôsobenia nie je definovaný, zdá sa, že antivírusový účinok toremifénu proti EBOV spočíva v destabilizácii glykoproteínu EBOV [59].

Je zaujímavé, že GC376 preukázal pri kombinovanej terapii mätúce rozdiely medzi dávkovaním 10 μM a 20 μM . Pri kombinovanom použití pri 10 μM s inými zlúčeninami absentoval synergizmus a v niektorých prípadoch pokles antivírusového účinku v porovnaní s adititívnymi hodnotami v rozmedzí od 0,03 do 1,6 (tabuľka 4). Ak sa použil pri 20 μM, stále existovali prípady, keď kombinácia s inou zlúčeninou viedla k zníženému antivírusovému účinku v porovnaní s GC376 použitým ako monoterapia pri 20 μM. Oveľa viac variácií však pri kombináciách pri 20 μM vykazovalo násobok účinku oproti aditívnym hodnotám v rozmedzí od 0,13 do 76 (tabuľka 4). Konkrétnym príkladom je kontrast medzi GC376 pri 20 μM v porovnaní s GC376 pri 10 μM kombinovanom s amodiaquinom pri 10 μM. Prvý spôsobil najväčšiu inhibíciu vírusovej RNA, ako aj najväčší násobok aditívneho (synergického) účinku, zatiaľ čo druhý spôsobil takmer stratu synergizmu s hodnotou násobku aditívnej hodnoty 1,6.

Identifikácia účinných antivírusových stratégií pre liečbu mačiek infikovaných FIPV má translačné dôsledky pre prebiehajúcu pandémiu SARS-CoV-2. Infekcia FIPV u mačiek pripomína infekciu koronavírusmi u fretiek [61, 62] a porovnáva sa s patogenézou iných chronických chorôb závislých od makrofágov, ako je tuberkulóza [63]. Pretože sa klinické a patogénne podrobnosti infekcie SARS-CoV-2 u ľudí stále objavujú, zdá sa, že existuje určité prekrytie s FIPV v anatomickej distribúcii, klinických prejavoch a pravdepodobnej reakcii na určité antivírusové terapie. U mačiek je mačací enterický koronavírusový biotyp (FECV) obmedzený na zažívací trakt v dôsledku tropizmu enterocytov. Klinické príznaky u mačiek infikovaných FECV siahajú od mierneho gastrointestinálneho ochorenia (hnačka) až po absenciu príznakov. Mutovaný mačací biotyp koronavírusu FIPV získava makrofágový tropizmus a prednostne sa zameriava na serózne povrchy brušnej a hrudnej dutiny s podskupinou mačiek, ktoré demonštrujú postihnutie CNS alebo očí [7]. Podobne u pacientov s COVID-19 existujú správy o hnačkách a podskupine pacientov s postihnutím CNS [14]. Aj keď bol bunkový receptor pre SARS-CoV-2 identifikovaný ako ACE2 [64], bunkový receptor pre FIPV sérotypu I sa ešte musí určiť. Bunkový receptor pre menej klinicky relevantný FIPV sérotypu II bol identifikovaný ako mačacia aminopeptidázová peptidáza (fAPN) [4]. Štúdia využívajúca RNAseq na hodnotenie profilov génovej expresie buniek ascitu získaných z mačiek s FIP neidentifikovala expresiu ACE2, čo naznačuje, že ACE2 pravdepodobne nebude receptorom FIPV sérotypu I [63]. Je potrebné podrobnejšie preskúmanie identity receptora FIPV sérotypu I.

Doterajšie klinické úspechy s použitím GS-441524 alebo GC-376 u mačiek s experimentálnymi a prirodzene sa vyskytujúcimi FIP ukazujú, že je možné účinne liečiť FIP, avšak liečba suchých (granulomatóznych), neurologických a okulárnych FIP stále predstavuje výzvu. Inhibítor proteázy 3C-like proteázy, GC-376, sa javí ako relatívne účinný pri liečbe efúznej infekcie FIPV obmedzenej na telesné dutiny, ale môže byť menej účinný pri liečbe neurologických alebo okulárnych foriem ochorenia [24]. Tieto odlišné výsledky môžu byť výsledkom neúčinnej penetrácie hematoencefalickej a hematookulárnej bariéry, čo robí z GC-376 nádejného kandidáta na kombinovanú terapiu s antivírusovým liekom prenikajúcim do CNS.

Materiály a metódy

Inokulácia FIPV pre in vitro experimenty

Mačacie obličkové bunky Crandell-Reese (CRFK, ATCC) sa kultivovali v bankách T150 (Corning), naočkovali sa FIPV sérotypu II (WSU-79-1146, GenBank DQ010921) a množili sa v 50 ml Dulbeccovho modifikovaného Eagle média (DMEM) s 4,5 g/l glukózy (Corning) a 10% fetálneho hovädzieho séra (Gemini Biotec). Po 72 hodinách inkubácie pri 37°C bol zaznamenaný rozsiahly cytopatický účinok (CPE) a veľké plochy clearingu/oddeľovania buniek. Banky sa následne bleskovo zmrazili na -70°C počas 8 minút, krátko sa rozmrazili pri izbovej teplote a bunky a supernatant sa potom centrifugovali pri 1500 g počas 5 minút, po ktorých nasledoval druhý krok centrifugácie pri 4000 g počas 5 minút, aby sa izolovali bezbunkové vírusové objemy. Supernatant obsahujúci vírusový základ sa rozdelil na 0,5 a 1,0 ml alikvotné časti v 1,5 ml kryotubusoch (Nalgene) a archivoval sa pri -70°C. Po zmrazení sa jedna skúmavka nechala rozmrznúť a titer vírusu sa stanovil pomocou biologických testov (TCID50) a RT PCR metód v reálnom čase (nižšie).

Infekčná dávka dose-50 pre tkanivovú kultúru (TCID50) sa stanovila pomocou vírusového plaque testu. CRFK bunky sa pestovali na 96-jamkovej doštičke pre tkanivové kultúry (Genesee Scientific), kým bunky CRFK nedosahovali približne 75-85% konfluenciu. Sériové 10-násobné riedenia sa pripravili z FIPV zásobného roztoku a 200 μl vzoriek z každého riedenia sa pridalo do 10-jamkových replikátov. 72 hodín po infekcii sa bunky fixovali metanolom a zafarbili sa kryštálovou violeťou (Sigma-Aldrich). Jednotlivé jamky sa vizuálne hodnotili na vírusom indukovaný CPE, hodnotili sa ako CPE pozitívne alebo negatívne a TCID50 sa stanovila na základe rovnice log10TCID50 = [celkový počet # jamiek CPE pozitívny / # replikátov] + 0.5, aby reflektovali infekčné virióny na mililiter supernatantu [68].

Kvantifikácia FIPV pomocou qRT-PCR

Bezbunková vírusová RNA bola izolovaná z východiskového vírusu pomocou QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) podľa pokynov výrobcu. Izolovaná RNA bola ošetrená DNázou (Turbo DNáza, Invitrogen) a následne reverzne transkribovaná pomocou súpravy High-Capacity RNA-to-CDNA (Applied Biosystems) podľa protokolov výrobcov. Počet kópií FIPV a mačacej GAPDH cDNA sa stanovil s použitím Real-Time PCR systému Applied Biosystems ‘QuantStudio 3 a PowerUp SYBR Green Master Mix podľa protokolu výrobcu pre 10 μL reakciu. Každá PCR reakcia sa uskutočňovala trikrát s vodným templátom ako negatívnou kontrolou a plazmidovou DNA ako pozitívnou kontrolou. Kontrolná reakcia vylučujúca reverznú transkriptázu bola zahrnutá do každej sady testov PCR v reálnom čase. Templáty cDNA sa amplifikovali pomocou FIPV forward primeru, 5’-GGAAGTTTAGATTTGATTTGGCAATGCTAG a FIP reverzného primeru, 5’-AACAATCACTAGATCCAGACGTTAGCT (terminálna časť génu FIPV 7b) [25]. PCR v reálnom čase pre mačací domáci gén GAPDH sa uskutočňovala súčasne s použitím primérov, 5 GAPDH, 5’-AAATTCCACGGCACAGTCAAG a 3 GAPDH, 5’-TGATGGGCTTTCCATTGATGA. Podmienky cyklovania pre FIPV aj GAPDH amplikóny boli nasledujúce: 50°C počas 2 minút, 95°C počas 2 minút, potom nasledovalo 40 cyklov pri teplote 95°C počas 15s, 58°C počas 30s, 72°C počas 1 minúty. Posledný krok obsahoval disociačnú krivku na vyhodnotenie špecifičnosti väzby priméru. Počet kópií FIPV a GAPDH bol vypočítaný na základe štandardných kriviek generovaných v našom laboratóriu. Kópie cIPNA FIPV stanovené pomocou RT PCR v reálnom čase sa normalizovali na 106 kópií mačacej GAPDH cDNA.

Vývoj anti-helikázových chemických fragmentov

Lieky skúmané a opísané v tejto štúdii boli už známe antivírusové látky. Naproti tomu bol helikázový enzým FIPV klonovaný, exprimovaný a použitý ako cieľ pre koronavírus a enzýmovo špecifickým vírusovým objavom. Cieľová sekvencia DNA AviTag-FIP Helicase-HisTag bola optimalizovaná a syntetizovaná. Syntetizovaná sekvencia bola klonovaná (Adeyemi Adedeji) do vektora pET30a s tagom Avi-His na expresiu proteínu v E. coli. Kmeň E. coli BL21 (DE3) sa transformoval rekombinantným plazmidom. Jedna kolónia sa naočkovala do 1 litra auto-indukovaného média obsahujúceho antibiotikum a kultúra sa inkubovala pri 37°C pri 200 ot./min.

Keď OD600 dosiahol asi 3, teplota bunkovej kultúry bola na 16 hodín zmenená na 15°C. Bunky sa zozbierali centrifugáciou. Bunkové pelety sa resuspendovali v lyzačnom pufri s následnou sonifikáciou. Zrazenina po centrifugácii sa rozpustila pomocou denaturačného činidla. Cieľový proteín sa získal jednostupňovým čistením na Ni kolóne. Cieľový proteín sa sterilizoval 0,22 um filtrom. Výťažok bol 7,2 mg pri 0,90 mg/ml a bol uložený v PBS, 10% glycerole, 0,5 mM L-arginíne, pH 7,4. Koncentrácia bola stanovená Bradfordovým proteínovým testom s BSA ako štandardom. Čistota proteínu a molekulová hmotnosť sa stanovili pomocou SDS-PAGE s potvrdením Western blot.

Skríning fragmentov povrchovej plazmónovej rezonancie (SPR) sa uskutočňoval na platforme ForteBio Pioneer FE SPR. Použil sa senzorový čip HisCap, ktorý obsahuje povrchovú matricu NTA. Kanály 1 a 3 boli naplnené 100uM NiCI2, nasledovalo injekčné podanie 50ug/ml FIP proteínu. Kanál 2 bol ponechaný bez bielkovín, rovnako ako NiCl2, ako referencia. Kanál 1 bol imobilizovaný na hustotu ~8000 RU, zatiaľ čo kanál 3 obsahoval približne 12000 RU. Bol použitý kanál 1. Pufrom použitým na imobilizáciu bol 10 mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCI a 0,1% Tween-20. Pre tento test sa pridal DMSO do konečnej koncentrácie 4%. Proprietárna knižnica zlúčenín sa zriedila v rovnakom tlmivom roztoku bez DMSO na konečnú koncentráciu DMSO 4% DMSO. Zlúčeniny z knižnice sa testovali pri koncentrácii 100 uM s použitím gradientovej injekčnej metódy OneStep. Nálezy boli vybrané na základe RU a kinetiky a použité pre bunkový skríning.

Vírusový plaque (doštičkový) test

Na skríning antivírusovej aktivity zlúčenín boli infikované bunky CRFK ošetrené zlúčeninami v šiestich jamkových replikátoch a porovnávané s jamkami pozitívnej kontroly (infikované bunky), negatívnymi kontrolami (neinfikované bunky) a kontrolami liečby (infikované bunky ošetrené známou účinnou antivírusovou zlúčeninou) súčasne na každej platni pre tkanivové kultúry. CRFK bunky sa pestovali na 96-jamkových platniach pre tkanivové kultúry (Genesee Scientific) obsahujúcich 200 ul kultivačného média. Pri ~75-85% konfluencii buniek bolo médium v ​​neinfikovaných kontrolných jamkách odsaté a nahradené 200 ul čerstvého média. Médium v ​​infikovaných jamkách bolo odsaté a nahradené médiom inokulovaným FIPV pri multiplicite infekcie (MOI) 0,004 infekčného viriónu na bunku. Doštička pre tkanivovú kultúru sa inkubovala 1 hodinu s periodickým jemným miešaním (manipulácie typu „číslo osem“) uskutočňovaným každých 15 minút, aby sa uľahčila interakcia vírus-bunka. Po 1 hodine po infekcii sa každá predpokladaná antivírusová zlúčenina pridala do šiestich jamiek infikovaných FIPV (na stanovenie antivírusovej účinnosti zlúčeniny) a šiestich neinfikovaných kontrolných jamiek (na skríning cytotoxicity zlúčeniny v bunkách CRFK). Všetky zlúčeniny boli pôvodne skrínované pri 10 μM, s výnimkou zlúčenín „chemického fragmentu“ dodávaných M. Olsenom (Midwestern University), ktoré boli hodnotené pri 50 μM. Doštičky s tkanivovými kultúrami sa inkubovali 72 hodín pri 37°C a potom sa zafixovali metanolom a zafarbili sa kryštálovou fialovou farbou. Doštičky sa skenovali na absorbanciu pri 620 nm pomocou čítačky doštičiek ELISA (FilterMax F3, Molecular Devices; Softmax Pro, Molecular Devices). Pre každú liečebnú podmienku sa zaznamenali jednotlivé hodnoty absorbancie jamky spolu s priemernou hodnotou absorbancie a strednou chybou priemeru pre 6 jamkové experimentálne replikáty.

Pre látky, ktoré preukázali antivírusovú účinnosť pri počiatočnom skríningu pri 10 alebo 50μM (chránené pred vírusom asociovaným CPE), sa EC50 stanovila vykonaním série progresívnych 2-násobných riedení zlúčenín vo vírusovom plaque teste. Na stanovenie EC50 sa bunky CRFK pestovali na 96-jamkových doštičkách pre tkanivové kultúry podobne ako v prípade antivírusového skríningového testu. Okrem neinfikovaných kontrolných jamiek boli všetky zostávajúce jamky infikované FIPV, ako je opísané vyššie. Séria dvojnásobného riedenia sa pohybovala od 20μM do 0μM a každá koncentrácia sa uskutočňovala v šiestich jamkových replikátoch. Počet krokov riedenia bol v rozmedzí od 6 do 14 a bol závislé od zlúčeniny. Šesť jamkových replikátov neinfikovaných buniek CRFK slúžilo ako kontrola pre normálne bunky CRFK; šesť replikátov CRFK buniek infikovaných FIPV slúžilo ako neošetrené kontrolné jamky infikované FIPV; a šesť jamkových replikátov FIPV infikovaných CRFK buniek ošetrených GS-441524 slúžilo ako kontrolné jamky na ochranu pred vírusom indukovanou bunkovou smrťou na základe publikovaných údajov týkajúcich sa účinnosti použitia GS-441524 in vitro v CRFK bunkách [26].

Platne s tkanivovými kultúrami sa inkubovali 72 hodín a potom sa zafixovali metanolom, zafarbili sa kryštálovou violeťou a pomocou čítačky doštičiek ELISA sa skenovala absorbancia pri 620 nm. Jednotlivé hodnoty absorbancie spolu s priemernou hodnotou absorbancie a štandardnou odchýlkou pre 6 jamkové experimentálne replikáty boli zaznamenané pre každú podmienku liečby. EC50 bola vypočítaná vynesením nelineárnej regresnej rovnice (krivka dávka-odpoveď) pomocou programu Prism 8 (GraphPad).

Vírusový RNA knock-down test

Na kvantifikáciu inhibície produkcie vírusovej RNA zlúčeninou sa použili testy v reálnom čase RT-PCR. CRFK bunky sa kultivovali na 6-jamkovej doštičke pre tkanivové kultúry (Genesee Biotek). Pri približne 75-85% splývaní buniek bolo kultivačné médium nahradené čerstvým médiom a bunky boli infikované FIPV sérotypu II pri MOI 0,2 (MOI na základe TCID50 biotestu/pfu). Doštičky sa inkubovali jednu hodinu s periodickým jemným trepaním každých 15 minút. Jamky infikované FIPV boli ošetrené jednou (monoterapia), dvoma alebo tromi (kombinovaná antikoravírusová terapia) antivírusovými zlúčeninami; každé experimentálne ošetrenie sa uskutočňovalo trikrát. Dávka zlúčeniny bola založená na EC50 zlúčenín a pohybovala sa od 0,001 do 20 μM. Pre každú experimentálnu sadu slúžili tri kultivačné jamky s FIPV-infikovanými a neošetrenými CRFK bunkami ako vírusom infikované kontroly. Infikované bunkové kultúry boli následne inkubované po dobu 24 hodín a celková RNA spojená s bunkami bola izolovaná pomocou mini súpravy PureLink ™ RNA (Invitrogen). RNA bola ošetrená DNAsou (TurboDNAse, Ambion), reverzne transkribovaná na cDNA pomocou súpravy High-Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems) a cIPNA FIPV a mačacie GAPDH cDNA boli merané pomocou qRT-PCR v reálnom čase, ako je opísané vyššie . Násobné zníženie vírusového titra sa stanovilo delením normalizovaného priemerného počtu kópií FIPV RNA pre neošetrené bunky CRFK infikované FIPV na normalizovaný priemerný počet kópií FIPV RNA pre liečené bunky CRFK požadovanou zlúčeninou (zlúčeninami). Očakávaný aditívny účinok sa stanovil pridaním násobnej redukcie pre každú monoterapiu použitú v kombinácii. Zložený aditívny účinok sa určil vydelením predikovaného aditívneho účinku na hodnotu kombinovanej redukcie násobku pre konkrétnu kombinovanú liečbu.

Stanovenie bezpečnostných profilov cytotoxicity (CSP).

Cytotoxicita zlúčeniny v mačacích bunkách sa hodnotila pomocou komerčne dostupnej súpravy (CellTox Green Cytotoxicity Assay, Promega) podľa pokynov výrobcu. Neošetrené bunky CRFK sa použili ako negatívne kontroly a bunky sa ošetrili cytotoxickým roztokom poskytnutým výrobcom ako pozitívne kontroly toxicity. Stručne, okrem kontrolných jamiek boli bunky CRFK nanesené na 96-jamkové doštičky pre tkanivové kultúry (Genesee Scientific) v štyroch jamkových replikátoch s 5, 10, 25, 50 alebo 100 μM koncentráciami požadovanej zlúčeniny a boli inkubované po dobu 72 hodín. Po 72 hodinách sa na všetky jamky nanieslo farbivo viažuce sa na súpravu DNA, inkubované pri 37°C chránené pred svetlom po dobu 15 minút a intenzite fluorescencie pri 485-500 nm Ex/520-530 nm EM bola následne stanovená pomocou čítačky doštičiek (FilterMax F3, Molekulárne zariadenia; Softmax Pro, Molekulárne zariadenia). Predpokladalo sa, že cytotoxicita zlúčeniny v konkrétnej koncentrácii je úmerná intenzite fluorescencie na základe selektívnej penetrácie a väzby farbiva na DNA degenerovaných, apoptotických alebo nekrotických buniek. Rozsah cytotoxicity sa stanovil nastavením hodnoty fluorescencie pre bunky ošetrené reagentom pre pozitívnu kontrolu na 100% a neošetrené mačacie bunky ako 0% cytotoxicity. Priemerná hodnota fluorescencie pre štyri jamky obsahujúce každú koncentráciu zlúčeniny sa potom interpolovala ako percento (percento cytotoxicity) v rozmedzí od 0 do 100%.

Konflikt záujmov

Autori prehlasujú, že nedošlo k žiadnemu konfliktu záujmov.

Oceňujeme financovanie poskytované Winn Feline Foundation (MTW 17-020; MTW 19-026) a Kalifornskou univerzitou v Davise, Centre for Companion Animal Health (CCAH; 2018-92-F; 2018-94-FE) prostredníctvom darov určených pre výskum FIP viacerými individuálnymi darcami a organizáciami (SOCK FIP, Davis, CA) a nadáciami (fond Philip Raskin, Kansas City, KS).

Doplnkové informácie

Kompletný zoznam zlúčenín testovaných in vitro na aktivitu proti FIPV

Inhibítory nukleozidovej polymerázy

12x GS Nuc AnalogsNucleoside analogNPI
GS-441524 (China-sourced)Nucleoside analog AdenosineNPI
3-Deazaneplanocin A HydrochlorideNucleoside analog AdenosineNPI
AdefovirNucleoside analog AdenosineNPI
GalidesivirNucleoside analog AdenosineNPI
GS-441524 (Manufactured in China)Nucleoside analog AdenosineNPI
MK-0608Nucleoside analog AdenosineNPI
NITD008Nucleoside analog AdenosineNPI
DidanosineNucleoside analog AdenosineNPI
Tenofovir alafenamideNucleoside analog AdenosineNPI
Tenofovir disoproxil fumarateNucleoside analog AdenosineNPI
EIDD 1931Nucleoside analog Cytidine 
EIDD 2801Nucleoside analog Cytidine 
2′-C-methylcytidineNucleoside analog CytidineNPI
Gemcitabine HydrochlorideNucleoside analog CytidineNPI
2-C-methylguanosineNucleoside analog GuanosineNPI
7-methylguanosineNucleoside analog GuanosineNPI
EntecavirNucleoside analog GuanosineNPI
MizoribineNucleoside analog GuanosineNPI
RibavirinNucleoside analog GuanosineNPI
PSI-6206Nucleoside analog UridineNPI
6-AzauridineNucleoside analog UridineNPI
BalapiravirNucleoside analog CytidineNPI
SofosbuvirNucleoside analog UridineNPI
FavipiravirNucleoside analog PurineNPI
Celkom 36

Inhibítory proteázy

GrazoprevirNS3/4A protease inhibitorPI
RupintrivirRhinoviral 3CP inhibPI
LopinavirAntiretroviral PIPI
RitonavirAntiretroviral PIPI
NelfinavirAntiretroviral PIPI
Disulfiram (tetraethyliuram disulfide)Papain-like protease inhibPI
K777/K11777Cysteine protease inhibitorPI
TelaprevirNS3/4A protease inhibitorPI
Camostat mesylateSerine protease inhibitorPI
ParitaprevirSerine protease inhibitorPI
GC376Coronavirus protease inhibitorPI
Celkom 11

NS5A inhibítory

VelpatasvirNS5A InhibitorNS5A Inhibitor
Ravidasvir/PPI-668NS5A InhibitorNS5A Inhibitor
LedipasvirNS5A InhibitorNS5A Inhibitor
OmbitasvirNS5A InhibitorNS5A Inhibitor
PibrentasvirNS5A InhibitorNS5A Inhibitor
DaclatasvirNS5A InhibitorNS5A Inhibitor
ElbasvirNS5A InhibitorNS5A Inhibitor
Celkom 7

NNPI

DasabuvirNon-nucleoside polymerase inhibitorNNPI
Celkom 1

Iné

MonensinIonophoreIné
Phenazopyridine hydrochlorideCrystalline solidIné
Pyrvinium pamoate hydrateAndrogen receptor inhibitorIné
Toremifene citrateSelective estrogen receptor modulator Iné
AM580Retinobenzoic derivativeIné
HomoharringtonineTranslation elongation inhibIné
Amodiaquine4-aminoquinoloneIné
Celkom 7

Midwestern Chemical Fragments

F0472-0017Midwestern
F6190-0257Midwestern
F6279-0675Midwestern
F2167-1080Midwestern
F6190-0740Midwestern
F6438-2155Midwestern
F3411-5663Midwestern
F6233-0011Midwestern
F9995-2543Midwestern
F2124-0890Midwestern
F2711-2577Midwestern
F2130-0055Midwestern
F2493-3358Midwestern
F2459-0974Midwestern
F2124-0465Midwestern
F1899-2269Midwestern
F2185-1982Midwestern
F2189-0717Midwestern
F2147-0158Midwestern
F1371-0192Midwestern
F2156-0057Midwestern
F9995-2431Midwestern
F3349-0218Midwestern
F2156-0059Midwestern
F2156-0070Midwestern
F5856-0194Midwestern
F2147-0975Midwestern
Celkom 27

Referencie

  1. Chang HW, de Groot RJ, Egberink HF, et al. Feline infectious peritonitis: Insights into feline coronavirus pathobiogenesis and epidemiology based on genetic analysis of the viral 3c gene. J Gen Virol 2010; 91: 415–420.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  2. Pedersen NC, Liu H, Dodd KA, et al. Significance of coronavirus mutants in feces and diseased tissues of cats suffering from feline infectious peritonitis. Viruses 2009; 1: 166–184.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  3. Vennema H, Poland A, Foley J, et al. Feline infectious peritonitis viruses arise by mutation from endemic feline enteric coronaviruses. Virology 1998; 243: 150–157.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  4. Rottier PJM, Nakamura K, Schellen P, et al. Acquisition of Macrophage Tropism during the Pathogenesis of Feline Infectious Peritonitis Is Determined by Mutations in the Feline Coronavirus Spike Protein. J Virol 2005; 79: 14122–14130.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  5. Diaz JV., Poma R. Diagnosis and clinical signs of feline infectious peritonitis in the central nervous system. Can Vet J 2009; 50: 1091–1093.PubMedGoogle Scholar
  6. Foley JE, Lapointe JM, Koblik P, et al. Diagnostic features of clinical neurologic feline infectious peritonitis. J Vet Intern Med 1998; 12: 415–423.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  7. Pedersen NC. An update on feline infectious peritonitis: Diagnostics and therapeutics. Vet J 2014; 201: 133–141.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  8. Stiles J. Ocular manifestations of feline viral diseases. Vet J 2014; 201: 166–173.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  9. Pedersen NC. A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963-2008. J Feline Med Surg 2009; 11: 225–258.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  10. Hohdatsu T, Yamada M, Tominaga R, et al. Antibody-Dependent Enhancement of Feline Infectious Peritonitis Virus Infection in Feline Alveolar Macrophages and Human Monocyte Cell Line U937 by Serum of Cats Experimentally or Naturally Infected with Feline Coronavirus. J Vet Med Sci 1998; 60: 49–55.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  11. Takano T, Yamada S, Doki T, et al. Pathogenesis of oral type I feline infectious peritonitis virus (FIPV) infection: Antibodydependent enhancement infection of cats with type I FIPV via the oral route. J Vet Med Sci 2019; 81: 911–915.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  12. Vennema H, de Groot RJ, Harbour DA, et al. Early death after feline infectious peritonitis virus challenge due to recombinant vaccinia virus immunization. J Virol 1990; 64: 1407–1409.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  13. Fenner’s Veterinary Virology. 2017. Epub ahead of print 2017. DOI: 10.1016/c2013-0-06921-6.CrossRefGoogle Scholar
  14. Wei X, Wang X, Peng W, et al. The Lancet Respiratory Medicine Clinical characteristics of SARS-CoV-2 infected pneumonia with diarrhea. 4.Google Scholar
  15. Hosoda T, Sakamoto M, Shimizu H, et al. SARS-CoV-2 enterocolitis with persisting to excrete the virus for about two weeks after recovering from diarrhea: A case report. Infect Control Hosp Epidemiol 2020; 1–4.Google Scholar
  16. Hamming I, Timens W, Bulthuis MLC, et al. Tissue distribution of ACE2 protein, the functional receptor for SARS coronavirus. A first step in understanding SARS pathogenesis. 2004; 631–637.Google Scholar
  17. Zhang J, Wu Y, Wang R, et al. Bioinformatic analysis of reproductive system Bioinformatic analysis reveals that the reproductive system is potentially at risk from SARS-CoV-2. 2020; 1–15.Google Scholar
  18. Zheng YY, Ma YT, Zhang JY, et al. COVID-19 and the cardiovascular system. Nat Rev Cardiol. Epub ahead of print 2020. DOI: 10.1038/s41569-020-0360-5.CrossRefGoogle Scholar
  19. Chen L, Deng C, Chen X, et al. Ocular manifestations and clinical characteristics of 534 cases of COVID-19 in China: A cross-sectional study. medRxiv 2020; 2020.03.12.20034678.Google Scholar
  20. Mao L, Wang M, Chen S, et al. Neurological Manifestations of Hospitalized Patients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective case series study. medRxiv 2020; 2020.02.22.20026500.Google Scholar
  21. Chen C, Zhou Y, Wang DW. SARS-CoV-2: a potential novel etiology of fulminant myocarditis. Herz 2020; 10–12.Google Scholar
  22. Li Y-C, Bai W-Z, Hashikawa T. The neuroinvasive potential of SARS-CoV2 may be at least partially responsible for the respiratory failure of COVID-19 patients. J Med Virol 2020; 24–27.Google Scholar
  23. Shi J, Wen Z, Zhong G, et al. Susceptibility of ferrets, cats, dogs, and other domesticated animals to SARS-coronavirus 2. Science. Epub ahead of print 2020. DOI: 10.1126/science.abb7015.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  24. Pedersen NC, Kim Y, Liu H, et al. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2018; 20: 378–392.CrossRefGoogle Scholar
  25. Murphy BG, Perron M, Murakami E, et al. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol 2018; 219: 226–233.Google Scholar
  26. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, et al. Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2019; 21: 271–281.Google Scholar
  27. Holshue ML, DeBolt C, Lindquist S, et al. First case of 2019 novel coronavirus in the United States. N Engl J Med 2020; 382: 929–936.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  28. Wang M, Cao R, Zhang L, et al. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro. Cell Res 2020; 30: 269–271.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  29. Nakagawa F, May M, Phillips A. Life expectancy living with HIV: Recent estimates and future implications. Curr Opin Infect Dis 2013; 26: 17–25.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  30. Simonetti FR, Kearney MF. Review: Influence of ART on HIV genetics. Current Opinion in HIV and AIDS. Epub ahead of print 2015. DOI: 10.1097/COH.0000000000000120.CrossRefGoogle Scholar
  31. Arts EJ, Hazuda DJ. HIV-1 antiretroviral drug therapy. Cold Spring Harb Perspect Med; 2. Epub ahead of print 2012. DOI: 10.1101/cshperspect.a007161.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  32. Kim Y, Liu H, Kankanamalage ACG. Reversal of the Progression of Fatal Coronavirus Infection in Cats by a Broad-Spectrum Coronavirus Protease Inhibitor. 2016; 1–18.Google Scholar
  33. Kumar GN, Jayanti VK, Johnson MK, et al. Metabolism and disposition of the HIV-1 protease inhibitor lopinavir (ABT-378) given in combination with ritonavir in rats, dogs, and humans. Pharm Res 2004; 21: 1622–1630.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  34. Sulejmani N, Jafri SM, Gordon SC. Pharmacodynamics and pharmacokinetics of elbasvir and grazoprevir in the treatment of hepatitis C. Expert Opin Drug Metab Toxicol 2016; 12: 353–361.Google Scholar
  35. Combination Antiretroviral Therapy for HIV Infection – American Family Physicianhttps://www.aafp.org/afp/1998/0601/p2789.html (accessed 6 April 2020).Google Scholar
  36. Julg B. Atripla™ – HIV therapy in one pill. 2008; 4: 573–577.Google Scholar
  37. Clay PG, Taylor TAH, Glaros AG, et al. “One pill, once daily”: what clinicians need to know about Atripla™. 2008; 4: 291–302.Google Scholar
  38. Hill A, Van Der Lugt J, Sawyer W, et al. How much ritonavir is needed to boost protease inhibitors? Systematic review of 17 dose-ranging pharmacokinetic trials. Aids 2009; 23: 2237–2245.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  39. A. H, G.R. G, R.J. B. Ritonavir: Clinical pharmacokinetics and interactions with other anti-HIV agents. Clin Pharmacokinet 1998; 35: 275–291.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  40. Kwo P, Gane EJ, Peng C, et al. Effectiveness of Elbasvir and Grazoprevir Combination, With or Without Ribavirin, for Treatment-Experienced Patients With Chronic Hepatitis C Infection. Gastroenterology 2017; 152: 164–175.e4.Google Scholar
  41. Zhou Y, Vedantham P, Lu K, et al. Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Res 2015; 116: 76–84.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  42. Alessandro SD, Scaccabarozzi D, Signorini L, et al. The Use of Antimalarial Drugs against Viral Infection. 2020; 1–26.Google Scholar
  43. Rynes RI, Bernstein HN. Ophthalmologic safety profile of antimalarial drugs. In: Lupus. 1993. Epub ahead of print 1993. DOI: 10.1177/0961203393002001051.CrossRefGoogle Scholar
  44. Briceño E, Reyes S, Sotelo J. Therapy of glioblastoma multiforme improved by the antimutagenic chloroquine. Neurosurg Focus. Epub ahead of print 2003. DOI: 10.3171/foc.2003.14.2.4.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  45. Ekong M, Igiri A, Ekanem T, et al. The effect of amodiaquine on some brain macromolecules of Wistar rats. Int J Biol Chem Sci. Epub ahead of print 2009. DOI: 10.4314/ijbcs.v2i4.39762.CrossRefGoogle Scholar
  46. Mackenzie AH. Pharmacologic actions of 4-aminoquinoline compounds. Am J Med. Epub ahead of print 1983. DOI: 10.1016/0002-9343(83)91264-0.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  47. Kuroda K. Detection and distribution of chloroquine metabolites in human tissues. J Pharmacol Exp Ther.Google Scholar
  48. Maguire A, Kolb H. THE EFFECT OF A SYNTHETIC ANTIMALARIAL (AMODIAQUINE) ON THE RETINA. Br J Dermatol. Epub ahead of print 1964. DOI: 10.1111/j.1365-2133.1964.tb15487.x.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  49. McAnally D, Siddiquee K, Gomaa A, et al. Repurposing antimalarial aminoquinolines and related compounds for treatment of retinal neovascularization. PLoS One. Epub ahead of print 2018. DOI: 10.1371/journal.pone.0202436.CrossRefGoogle Scholar
  50. Keyaerts E, Li S, Vijgen L, et al. Antiviral activity of chloroquine against human coronavirus OC43 infection in newborn mice. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53: 3416–3421.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  51. Savarino A, Boelaert JR, Cassone A, et al. Effects of chloroquine on viral infections: An old drug against today’s diseases? Lancet Infect Dis 2003; 3: 722–727.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  52. Azuma P, Massaquoi M, Job D, et al. Effect of Artesunate–Amodiaquine on Mortality Related to Ebola Virus Disease. 2016; 23–32.Google Scholar
  53. Boonyasuppayakorn S, Reichert ED, Manzano M, et al. HHS Public Access. 2015; 125–134.Google Scholar
  54. Baba M, Toyama M, Sakakibara N. Establishment of an antiviral assay system and identification of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus inhibitors. 2017; 25: 83–89.Google Scholar
  55. Savarino A, Lucia MB, Rastrelli E, et al. Anti-HIV Effects of Chloroquine. JAIDS J Acquir Immune Defic Syndr. Epub ahead of print 2004. DOI: 10.1097/00126334-200403010-00002.CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
  56. Al-bari AA. Targeting endosomal acidification by chloroquine analogs as a promising strategy for the treatment of emerging viral diseases. 2017; 5: 1–13.Google Scholar
  57. Terauchi M. Pharmacokinetics of selective estrogen receptor modulators(SERMs). Clin Calcium 2016; 26: 1571–1581.Google Scholar
  58. Agents A, Dyall J, Diseases I, et al. Repurposing of Clinically Developed Drugs for Treatment of Middle. Epub ahead of print 2014. DOI: 10.1128/AAC.03036-14.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  59. Zhao Y, Ren J, Harlos K, et al. virus glycoprotein. Nature 2016; 535: 169–172.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  60. Dyall J, Nelson EA, Dewald LE, et al. Identification of Combinations of Approved Drugs With Synergistic Activity Against Ebola Virus in Cell Cultures. 2018; 22908: 672–678.Google Scholar
  61. Michimae Y, Mikami S, Okimoto K, et al. The First Case of Feline Infectious Peritonitis-like Pyogranuloma in a Ferret Infected by Coronavirus in Japan. 2010; 99–101.Google Scholar
  62. Ramis A, Amarilla SP. Coronavirus Infection in Ferrets : Antigen Distribution and Inflammatory Response. 2016; 53: 1180–1186.Google Scholar
  63. Watanabe R, Eckstrand C, Liu H, et al. Characterization of peritoneal cells from cats with experimentally ‑ induced feline infectious peritonitis (FIP) using RNA ‑ seq. Vet Res 2018; 1–15.Google Scholar
  64. Inhibitor P, Hoffmann M, Kleine-weber H, et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Article SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. 2020; 1–10.Google Scholar
  65. Zhang B, Zhou X, Zhu C, et al. Immune phenotyping based on neutrophil-to-lymphocyte ratio and IgG predicts disease severity and outcome for patients with COVID-19. medRxiv. Epub ahead of print 2020. DOI: 10.1101/2020.03.12.20035048.Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
  66. Zhao J, Yuan Q, Wang H, et al. Antibody Responses to SARS-CoV-2 in Patients of Novel Coronavirus Disease 2019. SSRN Electron J. Epub ahead of print 2020. DOI: 10.2139/ssrn.3546052.CrossRefGoogle Scholar
  67. Cao X. COVID-19: immunopathology and its implications for therapy. Nat Rev Immunol; 2019. Epub ahead of print 2020. DOI: 10.1038/s41577-020-0308-3.CrossRefPubMedGoogle Scholar
  68. Ramakrishnan MA. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World J Virol 2016; 5: 85.CrossRefPubMedGoogle Scholar
Prečítať “Racionálny prístup k identifikácii účinných kombinovaných antikoronavírusových terapií proti mačaciemu koronavírusu”

Neurologická forma mačacej infekčnej peritonitídy a liečba pomocou GS-441524

1.6.2021
Niels C. Pedersen, DVM PhD
Pôvodný článok: The Neurological Form of Feline Infectious Peritonitis and GS-441524 treatment

Úvod

Neurologické postihnutie sa vyskytuje asi u 5–10% prípadov FIP. To sa môže v jednotlivých regiónoch líšiť, pretože na základe skúseností autora sa zdá, že turecké pouličné mačky vykazujú väčšiu prevalenciu. Vek nástupu je podobný ako u iných foriem FIP, pričom väčšina prípadov sa vyskytuje do 3 rokov.

Neurologická FIP sa považuje za formu suchej FIP a typické lézie suchej FIP v oblasti brucha, hrudníka alebo očí sa vyskytujú približne v polovici neurologických prípadov FIP. Neurologické príznaky sú viditeľné iba u asi 5% mačiek s prejavmi vlhkej FIP.1 Každopádne u mačiek došlo k významnému zvýšeniu výskytu neurologickej FIP buď počas liečby s GS-441524, alebo vo forme relapsov v období pozorovania po liečbe u mačiek, ktoré boli pôvodne liečené na neneurologickú FIP.

Klinické príznaky

Neurologická FIP sa vyskytuje v dvoch formách, primárnej a sekundárnej. Abnormálne neurologické príznaky sú prítomné u mačiek s primárnym ochorením. Bežné sú však aj všeobecné príznaky zlého zdravotného stavu, ako napríklad neprospievanie, chudnutie, letargia a nechutenstvo. Horúčka môže byť zjavná alebo skrytá. Asi polovica mačiek s primárnou neurologickou FIP bude mať tiež identifikovateľné lézie mimo CNS a typickými výsledkami krvných testov. Avšak mačky bez zjavných znakov poškodenia CNS budú mať často na paneli CBC a v sére normálne, alebo normálu sa blížiace hladiny.

Skoré neurologické príznaky, rozpoznateľné prospektívne alebo retrospektívne, zahŕňajú lízanie podlahy alebo stien, sporadické zášklby svalov a neurčité správanie a kognitívne abnormality. Anizokória je ďalším skorým znamením. Podozrenie na neurologickú FIP rastie, keď sú klinické príznaky funkčnejšie. Najskorším znakom je zvyčajne postupná strata koordinácie a rovnováhy (ataxia). Nechuť skákať hore alebo dole z vysokých miest je jedným z prvých prejavov nekoordinácie. Inkoordinácia je spočiatku najnápadnejšia u zadných nôh, ale rýchlo sa stáva všeobecnou. V niektorých prípadoch sa môžu vyskytnúť aj záchvaty typu grand mal alebo psychomotorického typu. Záchvaty typu grand mal sa prejavujú krátkou stratou vedomia, silnými rytmickými svalovými kŕčmi postihujúcimi celé telo. Psychomotorická epilepsia je spojená s rôznym stupňom vedomia a nekontrolovanými alebo čiastočne kontrolovanými pohybmi tela.

Mačky so sekundárnou neurologickou FIP sa vyznačujú príznakmi extra-intestinálneho ochorenia a postihnutie CNS sa objaví v neskoršej fáze choroby. Vyskytuje sa často počas antivírusovej liečby iných foriem FIP a je častou príčinou relapsu u mačiek liečených na iné formy FIP. Tieto relapsy sa zvyčajne vyskytujú v priebehu prvých 1-4 týždňov po úspešnej liečbe.

Postihnutie miechy je pri neurologickej FIP často prehliadané, hoci viac ako 50% mačiek so zápalovým ochorením miechy má FIP.2 Postihnutie miechy vedie k fekálnej a/alebo močovej inkontinencii rôznej závažnosti. Paralýza chvosta alebo zadných končatín sú tiež príznakmi ochorenia miechy. Postihnutie miechy pravdepodobne vedie k trvalým neurologickým deficitom a potom k ochoreniu mozgu.

Diagnostika

Náhly výskyt neurologických abnormalít u mačiek mladších ako 5-7 rokov je silným dôkazom FIP už iba ​​na základe samotnej pravdepodobnosti, pretože len málo ďalších chorôb bude mať v tejto vekovej skupine podobné príznaky. Avšak medzi veterinármi existuje tendencia zaradiť systémovú toxoplazmózu na svoj diagnostický zoznam vyššie, najmä keď sa pozorujú očné príznaky alebo príznaky postihnutia CNS. Systémová toxoplazmóza u mačiek je v porovnaní s FIP zriedkavým ochorením a často sa vyskytuje u imunokompromitovaných hostiteľov, vrátane hostiteľov s FIP. 15-17 Je to pochopiteľné, pretože mačky sú v prírode definitívnym hostiteľom Toxoplasma gondii a vyvinul sa u nich stav fakultatívnej symbiózy. Okrem toho je hlavným klinickým prejavom systémovej toxoplazmózy charakteristická pneumónia, niekedy spojená s hepatitídou, nekrózou pankreasu, myozitídou, myokarditídou a dermatitídou.3-8 Uveitída podobná FIP sa vyskytuje u približne 10% mačiek so systémovou toxoplazmózou, 4 a encefalitída je ešte menej častá.7,17 Diagnostický test na systémovú toxoplazmózu je založený na porovnaní titrov protilátok IgG a IgM pomocou postupu nepriamej fluorescenčnej protilátky (IFA). 3 Vysoké titre IgG pri absencii protilátok IgM naznačujú predchádzajúcu expozíciu na toxoplazmu, ktorá môže v populácií divých mačiek dosahovať až 50% .4 Prítomnosť vysokých titrov protilátok IgM je indikáciou systémového rozšírenia organizmu z čreva do iných tkanív a je jednou z požiadaviek na diagnostiku systémového ochorenia. Mnoho mačiek s očnými a neurologickými známkami je však nevhodne liečených na systémovú toxoplazmózu iba na základe vysokých titrov IgG.

Diagnóza typických foriem FIP sa zvyčajne určí spojením informácií o veku a pôvode mačky, historických a fyzických znakov (napr. zlý zdravotný stav, horúčka, brušné alebo hrudné výpotky, hmatateľné hmoty v brušných orgánoch) s určitými laboratórnymi abnormalitami v kompletnom krvnom obraze (anémia; vysoký počet bielych krviniek, nízky počet lymfocytov a vysoký počet neutrofilov), sérovom biochemickom paneli (vysoká celková bielkovina, vysoký globulín, nízky albumín a nízky pomer A:G), vyšetrenia výpotkov, ak sú prítomné (exsudát alebo modifikovaný exsudát, žltý odtieň) a určením pravdepodobnosti, že tieto zistenia možno najlepšie vysvetliť FIP. Definitívnu diagnózu je možné získať identifikáciou koronavírusových proteínov alebo RNA vo výpotkoch alebo vzorkách tkanív pomocou PCR alebo imunohistochémie. Je ale možné, že u mačiek, u ktorých sa vyvinie neurologická FIP počas liečby alebo po liečbe neneurologickej formy, budú mnohé alebo všetky tieto klinické znaky chýbať.

Diagnostika neurologickej FIP, najmä v primárnej forme, sa zvyčajne robí tromi spôsobmi: 1) zvážte všetky historické, klinické a laboratórne nálezy a odhadnite pravdepodobnosť, že sa jedná o FIP, 2) vyšetrite mozog pre charakteristické znaky FIP pomocou magnetickej rezonancie (MRI) a/alebo analýzou mozgovomiechového moku (CSF), 8,9 a 3) liečte na základe predpokladu, že ide o neurologickú FIP, a dúfajte v pozitívnu reakciu na antivírusovú liečbu.

Pri diagnostike neurologickej FIP sa stále viac uplatňuje magnetická rezonancia s vylepšením kontrastu. Dilatácia (hydrocefalus) jednej alebo viacerých mozgových komôr je častou léziou v mozgu.8,9 Podobné rozšírenia vo forme syringomyélie sa dajú pozorovať aj v mieche. Dilatácie sú sekundárne pri zápale okolitého ependymu. Ependyma zabezpečuje vylučovanie, cirkuláciu a udržiavanie homeostázy CSF. Preto je závažnosť sekundárneho obštrukčného hydrocefalu FIP úmerná stupňu ependymálneho zápalu a súvisiaceho zvýšenia kontrastu. Diskrétne lézie parenchýmu nie sú identifikované. MRI výrazne zvyšuje náklady na diagnostiku, anestézia zvyšuje riziko úmrtia u ťažko chorých mačiek a odborné znalosti a vybavenie nie sú vždy k dispozícii. Preto konečná diagnóza často spadá do reakcie na špecifickú antivírusovú liečbu. Liekom voľby pre neurologické prípady FIP je GS-441524.9,12

Analýza CSF je alternatívnym spôsobom kvantifikácie povahy a závažnosti zápalu v ependyme a mozgových blanách. Hladiny proteínu v CSF a počet buniek sú u mačiek s FIP zvýšené a často je možné získať vhodné vzorky pre detekciu infikovaných makrofágov pomocou IHC alebo PCR.10,11 Analýza CSF je spojená s malým rizikom z anestézie a punkcie ihly do cisterny magna.

Liečba

Neurologická FIP sa dá vyliečiť, ak sa cez hematoencefalickú bariéru prejde dostatočné množstvo antivivirotika a vírus nezískal rezistenciu voči lieku.9,12 Terénne testy s inhibítorom vírusovej proteázy GS376 boli prvými, ktoré preukázali, že neurologické príznaky možno významne potlačiť, ale infekcia sa nedá vyliečiť. Za dôvod sa považovala neschopnosť dosiahnuť dostatočne vysoké hladiny GC376 v CNS. Väčší úspech pri liečbe mačiek s neurologickou FIP sa dosiahol pomocou nukleozidového analógu a inhibítora transkripcie vírusovej RNA GS-441524.9,12 Ukázalo sa, že GS-441524 vstupuje do cerebrospinálnej tekutiny (CSF) v koncentráciách od 7-21% krvi, v závislosti od testovanej mačky. 13 Tieto rozdiely hematoencefalickej bariéry medzi mačkami sú pravdepodobným vysvetlením variabilných dávok GS-441524 od 4 do 10 mg/kg denne potrebných pre liečbu prirodzene sa vyskytujúcich prípadov neurologickej FIP.9,12

Súčasné počiatočné dávkovanie pre GS-441524 bolo na základe nedávnych zistení7 stanovené na 10 mg/kg denne subkutánnou cestou. Aj keď je možné liečiť niektoré mačky pri nižšom dávkovaní, 9,12 neexistuje jednoduchý spôsob, ako zmerať silu hematoencefalickej bariéry, takže sa používa najnižšie dávkovanie, ktoré bude mať liečivý efekt pre väčšinu mačiek. Úspešnosť liečby sa meria tak zlepšením klinických príznakov, ako aj zlepšením kritických abnormálnych hodnôt krvných testov. Prírastok hmotnosti a kvalita srsti sú taktiež dôležité kvalitatívne znaky, ktoré je potrebné pozorovať. Sekvenčné analýzy MRI a CSF poskytnú priamejšie dôkazy o reakcii na liečbu,9 ale vo väčšine prípadov sú nepraktické.

Zlepšenie celkového zdravotného stavu a neurologických príznakov sa zvyčajne prejavia do 24-48 hodín a väčšina mačiek predurčených k úplnému zotaveniu sa vráti do normálneho stavu za 4-6 týždňov. Významná časť mačiek však bude reagovať pomalšie a vyžaduje si prehodnocovanie ich klinického stavu a stavu krvných testov každé 4 týždne. Spomalenie priebehu liečby, buď klinicky, alebo vo forme zvratu v počiatočných abnormalitách krvného testu, si bude vyžadovať zvýšenie dávky lieku od +2 do +5 mg/kg denne.9,12

Ukončenie liečby, ktoré je zvyčajne po 84 dňoch, nie je vždy ľahké potvrdiť. Typické abnormality v krvných testoch, ktoré sa používajú pri väčšine ostatných foriem FIP, sa buď nevyskytujú v čase diagnózy, alebo sa vrátia do normálu pred ukončením liečby. Trvalé neurologické abnormality môžu pretrvávať aj po vyliečení infekcie a sťažujú tak klinické vyhodnotenie. Bez analýzy pomocou magnetickej rezonancie a/alebo mozgovomiechového moku, ktoré by potvrdili, či choroba už pominula, zostáva jedinou možnosťou ukončiť liečbu a dúfať, že k relapsu nedôjde.

Komplikácie neurologickej FIP

Relapsy u mačiek liečených na neurologickú FIP sa zvyčajne vyskytujú v priebehu niekoľkých dní po ukončení liečby a sú spôsobené buď neprimeraným dávkovaním a/alebo získaním liekovej rezistencie. Výskyt relapsov sa javí o niečo vyšší ako po liečbe foriem FIP bez postihnutia CNS. Poddávkovanie môže byť výsledkom silnejšej hematoencefalickej bariéry u niektorých mačiek v porovnaní s inými, nekvalitného antivírusového lieku alebo nesprávneho výpočtu dávky. Je však bežné, že sa mačky pri opakovanej liečbe vyliečia, pokiaľ nedošlo k liekovej rezistencii.

Získanie liekovej rezistencie je dobre známe u antivírusových liekov používaných u ľudí na choroby ako HIV/AIDS. Bola zaznamenaná aj u GC37611,14 aj GS-441524 u mačiek.12 Rezistencia na liečivo sa môže vyskytnúť mutáciami buď v pôvodnom FECV, alebo v jeho mutantnom biotype FIP v prírode14, a prejavovať sa nedostatočnou počiatočnou reakciou na liečbu, ale nie je to bežný jav.12 Rezistencia sa pravdepodobnejšie vyskytne počas liečby a dochádza k nej jednak chronickým vystaveniu liečivu, jednak nižšími sub-inhibičnými hladinami liečiva. Rezistencia na liek je zvyčajne čiastočná a dá sa často prekonať zvýšením dávky. Lieková rezistencia sa môže časom časom zhoršiť, a ďalšie zvyšovanie dávkovania už neprinesie žiadny efekt.

Mačky s neurologickou FIP môžu po ukončení liečby vykazovať zvyškové poškodenie mozgu a/alebo miechy a trvalé následky. Medzi postihnutia patrí rôzny stupeň nekoordinácie, zmeny správania a demencia. Najproblematickejšie následky sú spojené s postihnutím miechy. Miecha je uzavretá v kostnej trubici, ktorá neumožňuje veľkú expanziu v prípade zápalu alebo nejakej formy syringomyélie. Postihnutie miechy pri FIP sa často prejavuje rôznymi stupňami fekálnej a/alebo močovej inkontinencie. Pozoruje sa tiež ochrnutie zadných končatín a chvosta, ale je to menej časté. Bohužiaľ, tieto klinické abnormality sú často trvalé, najmä ak sa neurologické ochorenie nelieči dlhší čas.

Jedným z najbežnejších negatívnych výsledkov antivírusovej liečby u mačiek s neurologickou FIP je nedosiahnutie vyliečenia, aj keď pokračovanie v liečbe vysokými dávkami stále umožňuje udržateľnú kvalitu života (t.j. riadenie príznakov ochorenia bez vyliečenia). Táto situácia naznačuje, že inhibícia replikácie vírusu antivírusovými liekmi nemusí byť dostatočná pre vyliečenie infekcie, a že je tiež potrebná účinná imunitná odpoveď. Tento fenomén „liečby bez vyliečenia“ viedol v mnohých prípadoch mnohých majiteľov k tomu, aby v liečbe za každú cenu pokračovali aj po dobu viac ako jedného roka. Tiež to viedlo k mnohým experimentom s ultravysokými dávkami GS441524 (>15 mg/kg denne), rozdelenými dávkami, prechodom z injekcií na perorálnu liečbu, súčasnou perorálnou a injekčnou liečbou, kombinovanou antivírusovou liečbou (napr. GS-441424 plus GC376) a podporou antivírusovej liečby vysokými dávkami kortikosteroidov a iných imunosupresív. Príležitostne sa vyžaduje liečba takýmito spôsobmi liečby, ale výsledok bol pre väčšinu týchto mačiek nepriaznivý.

Existujú nepriame dôkazy o tom, že imunita hostiteľa voči FIP je rozdelená medzi CNS a ostatné časti tela. Výskyt postihnutia CNS sa zdá byť zvýšený, keď vďaka GS-441524 dôjde k inhibícii infekcie mimo CNS. Zdá sa preto, že aktívne ochorenie mimo CNS má inhibičný účinok na ochorenie v CNS. Mačky s čistým neurologickým ochorením často nevykazujú abnormálne hodnoty krvných testov na paneli CBC ani v sére, a to ani pri významných zápalových zmenách v mozgovomiechovom moku.8 Mačky s neurologickou FIP majú v porovnaní s inými formami FIP často najvyššie sérum, teda najvyššie hodnoty titra protilátok v CSF.8 To všetko sú dôkazy o „kompartmentalizácii“ infekcie na jednej alebo druhej strane hematoencefalickej bariéry.

Referencie

  1. Pedersen NC. 2009. A review of feline infectious peritonitis virus infection: 1963-2008. J Feline Med Surg 11:225-58.
  2. Marioni-Henry K. Feline spinal cord diseases. Vet Clin No Am Small Anim Pract. 2010;40:1011–1028.
  3. Pedersen NC. Toxoplasmosis. In: Feline Infectious Diseases. American Veterinary Publications, Inc., Goleta, CA, USA, 1988, pp 372-380.
  4. Petrak M, Carpenter J. Feline toxoplasmosis. J Am Vet Assoc. 1965; 146:728734. 
  5. Jokelainen P, Simola O, Rantanen E, Nareaho A, Lohi H, Sukura A. Feline toxoplasmosis in Finland: Cross-sectional epidemiological study and case series study. J Vet Diagn Invest. 2012; 24:1115–1124.
  6. Henriksen P, Dietz HH, Henriksen SA. Fatal toxoplasmosis in five cats. Vet Parasitol. 1994;55:15-20.
  7. Holzworth J. Encephalitic toxoplasmosis in a cat. J Am Vet Assoc. 1954; 124:313-316.
  8. Foley JE, Lapointe JM, Koblik P, Poland A, Pedersen NC Diagnostic features of clinical neurologic feline infectious peritonitis. J Vet Intern Med. 1998;12:415-423.
  9. Dickinson PJ, Bannasch M, Thomasy SM, Murthy VD, Vernau KM, Liepnieks M, Montgomery E, Knickelbein KE, Murphy B, Pedersen NC. Antiviral treatment using the adenosine nucleoside analogue GS‐441524 in cats with clinically diagnosed neurological feline infectious peritonitis. J Vet Intern Med. 2020; 34:1587–1593.
  10. Ives EJ, Vanhaesebrouck AE, Cian F. 2013. Immunocytochemical demonstration of feline infectious peritonitis virus within cerebrospinal fluid macrophages. J Feline Med Surg. 2013;15:1149–1153. 
  11. Pedersen NC, Kim Y, Liu H, Galasiti Kankanamalage AC, Eckstrand C, Groutas WC, Bannasch M, Meadows JM, Chang KO. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2018;20:378-392.
  12. Pedersen NC, Perron M, Bannasch M, et al. Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg. 2019;21:271-281. 
  13. Murphy BG, Perron M, Murakami E, et al. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol. 2018;219:226-233. 
  14. Perera KD, Rathnayake AD, Liu H, Pedersen NC, Groutas WC, Chang KO, Kim Y. Characterization of amino acid substitutions in feline coronavirus 3C-like protease from a cat with feline infectious peritonitis treated with a protease inhibitor. Vet Microbiol. 2019;237:108398. 
  15. Ward, B.C. and Pedersen, N.C.:  Infectious Peritonitis in Cats.  J Am Vet Med.  1969;154:26-35.  
  16. Toomey JM, Carlisle-Nowak MM, Barr SC, Lopez JW, French TW, Scott FW, Hoose W, Pizano S, Dubey JP. Concurrent toxoplasmosis and feline infectious peritonitis in a cat. J Am Anim Hosp Assoc. 1995;31:425-428.
  17. Zandonà L, Brunetta R, Zanardello C, Vascellari M, Persico L, Mazzolini E. Cerebral toxoplasmosis in a cat with feline leukemia and feline infectious peritonitis viral infections. Can Vet J. 2018;59:860-862
Prečítať “Neurologická forma mačacej infekčnej peritonitídy a liečba pomocou GS-441524”

FIP u gravidných mačiek

24.5.2021
Niels C. Pedersen, DVM. PhD
Pôvodný článok: Feline Infectious Peritonitis in Pregnant Cats

Úvod – Gravidita je zaujímavý imunologický paradox. Aj keď sú orgány a tkanivá od jedincov rovnakého (aloštep) alebo iného druhu (xenoimplantát) považované za cudzie a zničené, pre plod, ktorý je aloštepom, to neplatí. Prevencia odmietnutia plodu je sprevádzaná udalosťami súvisiacimi s nastávajúcimi komplexnými hormonálnymi zmenami. 1-4 Účinky gravidity ovplyvňujú mnoho funkcií imunitného systému. 1-4 Hlavný vplyv však gravidita má na imunitu T lymfocytov. T-lymfocytová imunita je sprostredkovaná triedou týmusom (brzlíkom) ovplyvnených lymfocytov, ktoré sú aktívne pri identifikácii infikovaných hostiteľských buniek vyhodnotených ako cudzorodé kvôli ich interakcii s patogénmi. Imunita T-lymfocytov hrá dôležitú úlohu aj pri autoimunitných ochoreniach.

Modulácia imunity, ktorá sa vyskytuje počas gravidity, môže rôzne ovplyvňovať imunokompetenciu matky. Je známe, že gravidita zlepšuje alebo zhoršuje autoimunitné ochorenia, zvyšuje popôrodný výskyt autoimunitných ochorení a zvyšuje náchylnosť na mnoho bežných bakteriálnych, plesňových a vírusových ochorení. 4-7 Výskyt týchto chorôb je najväčší v treťom trimestri, keď sú najvyššie hladiny estradiolu a progesterónu v krvi.4

Aj keď matky môžu byť počas gravidity náchylnejšie na určité infekcie, plod zostáva chránený pred infekciami matky prostredníctvom placentárnej bariéry, ktorá oddeľuje krvný obeh matky a plodu. Aj keď je táto bariéra vysoko účinná pri zadržiavaní infekčných agens, je priepustná pre väčšinu liekov. Preto sa placentárna bariéra svojou úlohou odolávať hlavne patogénom líši od hematoencefalickej bariéry, ktorá je prekážkou tak pre lieky, ako aj patogény.

FIP a gravidita – O FIP u gravidných samíc bolo publikované iba obmedzené množsto informácií. 8-10 Na základe ďalších skúseností autora s malým počtom prípadov pozorovaných počas liečby FIP pomocou GS-441524 sa zdá, že postihnuté samice sú v čase otehotnenia v subklinickom alebo predklinickom štádiu FIP. Imunosupresívny účinok gravidity potom umožňuje infekcii prejsť do klinického štádia, zvyčajne v poslednom trimestri. Najbežnejšia klinická forma FIP u gravidných mačiek je brušná a vlhká, a klinické príznaky sa zvyčajne objavujú v neskorom štádiu gravidity, v čase pôrodu alebo krátko po ňom.

FIP u samice ovplyvňuje aj mačiatka, v závislosti od závažnosti infekcie a jej načasovania. Mačiatka buď zomierajú na začiatku gravidity, keď sú resorbované, v neskoršom štádiu gravidity potratené, alebo sa môžu narodiť choré a uhynúť skoro po narodení. 8-10 Niektoré môžu dokonca prežiť niekoľko týždňov, kým podľahnú FIP. Niektoré vrhy sa však rodia živé a pri pestúnskej starostlivosti alebo prikrmovaní z fľaše zostanú zdravé. Nie je jasné, akú úlohu pri tejto úmrtnosti zohráva infekcia. Sú skoré resorpcie a potraty plodu dôsledkom infekcie plodu od materských monocytov/makrofágov? Sú úmrtia plodu spôsobené nešpecifickým účinkom ochorenia a s ním spojenou cytokínovou búrkou? Je pravdepodobné, že pôjde o kombináciu oboch. Nie je však pochýb o tom, že niektoré mačiatka môžu byť infikované v neskorom štádiu gravidity, narodiť sa relatívne zdravé a v prvých týždňoch života sa u nich môže rozvinúť potvrdená FIP.

Príchod liečby FIP pomocou GS-441524 výrazne ovplyvnil FIP počas gravidity, osud plodov i novonarodených mačiatok. Samice, ktoré sa liečia v počiatočnom štádiu choroby, často porodia zdravé mačiatka, a ak je ich reakcia na liečbu rýchla, môžu sa o ne starať bežným spôsobom. Neuskutočnili sa žiadne štúdie, ktoré by určili, koľko GS-441524 sa dostane k plodu z krvného obehu matky, ale je to malá molekula a mala by ľahko prechádzať placentárnou bariérou. Ukazuje sa, že GS-441524 nemá žiadne negatívne účinky na vývoj plodu alebo mačiatkok, keď sa podáva samici počas druhého alebo tretieho trimestra a/alebo počas novorodeneckého obdobia. Predpokladá sa, že GS-441524 ľahko prechádza zo samíc na mačiatka v mledzive (colostre) a mlieku.

Aktuálnym odporúčaním je zaobchádzať s gravidnými samicami tak, akoby neboli gravidné, a pokiaľ to nie je nevyhnutné, nezasahovať do gravidity alebo neonatálnej starostlivosti. Postupné ultrazvukové vyšetrenia poskytnú presný obraz o tom, čo sa deje s plodmi. Niektoré budú mŕtve a vstrebávajú sa in utero, iné sú slabé a potratené, iné majú normálny vzhľad a po narodení sú zdravé. Samice zvyčajne reagujú rýchlo na liečbu GS-441524 a väčšina z nich je natoľko zdravých, aby mohli svoje mačiatka ošetrovať a starať sa o ne. Okrem samotnej liečby by samiciam mali byť umožnené normálne interakcie s ich mačiatkami. Mačiatka nepotrebujú individuálnu liečbu, pretože dostatočné množstvo GS-441524 je pravdepodobne poskytované materským mliekom. Mačiatka, ktoré sa narodia zdravé a nie sú kojené, je možné umelo prikrmovať a každodenne monitorovať ich váhu. Liečba GS-441524 by sa mala použiť iba vtedy, ak nedostatok prírastku hmotnosti a a aktivity naznačujú, že môže byť potrebná.

Referencie

  1. Robinson DP, Klein SL. Pregnancy and pregnancy-associated hormones alter immune responses and disease pathogenesis. Horm Behav. 2012;62:263-271.
  2. Aghaeepour N, Ganio EA, Mcilwain D, et al. An immune clock of human pregnancy. Science Immunology 2017; 2 (15):eaan2946
  3. Pazos M, Sperling RS, Moran TM, Kraus TA. The influence of pregnancy on systemic immunity. Immunol Res. 2012;54:254-261.
  4. Kourtis AP, Read JS, Jamieson DJ. Pregnancy and Infection. N Engl J Med. 2014;370(23):2211-2218.
  5. Ledan S Infectious Diseases in Pregnancy. US Pharm. 2020;45(9):22-26.
  6. Arora N, Sadovsky Y, Dermody TS, Coyne CB. Microbial Vertical Transmission during Human Pregnancy. Cell Host Microbe. 2017;21(5):561-567. 
  7. Racicot K, Mor G. Risks associated with viral infections during pregnancy. J Clin Invest. 2017;127(15):1591-1599.
  8. Pastoret PP, Henroteaux M. Epigenetic transmission of feline infectious peritonitis. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 1978;1:67-70.
  9. Addie DD, Jarrett O. A study of naturally occurring feline coronavirus infection in kittens. Vet Rec, 1992;130:133–137.
  10. Addie D.D., Jarrett O. Feline coronavirus infections. In: Greene C.E., editor. Infectious diseases of the dog and cat. WB Saunders; Philadelphia: 1990. pp. 300– 312. 
Prečítať “FIP u gravidných mačiek”

Infekcia FeLV a jej vzťah k FIP

21.5.2021
Niels C. Pedersen, DVM, PhD
Pôvodný článok: Synopsis of Feline leukemia virus infection and its relationship to feline infectious peritonitis

Základné fakty – Vírus mačacej leukémie (FeLV) je retrovírus príbuzný s vírusom myšej leukémie, ktorý existoval medzi divými mačkami už desaťtisíce rokov pred jeho objavením v roku 1964 (Jarrett a kol., 1964). Infekcia FeLV sa vyskytuje hlavne u mačiek mladších ako 3-8 rokov (Pedersen, 1998, 1991). Hlavným zdrojom infekcie sú mačky v asymptomatickom štádiu infekcie. Vírus sa vylučuje vo všetkých výlučkoch a telesných sekrétoch a šíri sa blízkym kontaktom (Pedersen a kol., 1977). Infekcia FeLV sa v prírode zvyčajne vyskytuje potom, čo sú mačky dostatočne staré na to, aby sa mohli socializovať, a primárna fáza infekcie je buď bezpríznaková, alebo prechodná a končí dlhotrvajúcou imunitnou reakciou u 95% alebo viac mačiek. Iba malá časť infekcií v prírode vedie k chronickej virémii. Ochorenia spojené s FeLV sa vyskytujú prevažne u malej skupiny mačiek s pretrvávajúcou infekciou.
Ochorenie FeLV u divých mačiek nevyvolalo pred jeho objavením zvýšený záujem a akákoľvek súvisiaca úmrtnosť zostala medzi spektrom chorôb, ktoré postihujú divé mačky, nepovšimnutá. To, čo vieme o patogenéze infekcie FeLV u divokých mačiek, preto pôvodne pochádzalo zo štúdií uskutočnených v 70. a 80. rokoch na skupinách domácich mačiek a laboratórnych infekciách (prehľad Pedersen, 1998, 1991).

Epizootiológia – zdá sa, že FeLV nepozorovane prestúpila z prírody do populácie domácich mačiek niekedy pred 60. rokmi 20. storočia a odvtedy došlo k rapídnemu nárastu incidencie. Prvé náznaky, že by za touto chorobou mohol stáť vírus, prišli v roku 1964 s identifikáciou intracelulárnych častíc pripomínajúcich vírus myšej leukémie v domácnosti mačiek s viacerými prípadmi lymfosarkómu (Jarrett a kol., 1964). Naše chápanie závažnosti infekcie FeLV a jej vzťahu k chorobám iným ako lymfosarkóm sa začalo v roku 1969 vo výskumných laboratóriách (Hardy a kol., 1969). Hlavné spektrum chorôb súvisiacich s FeLV vzišlo z komerčnej aplikácie nepriameho fluorescenčného testu protilátok (IFA) na detekciu viremických mačiek, počnúc rokom 1972 (Hardy, 1973; Hardy a Zuckerman, 1991). Nasledovali rýchle domáce testy FeLV založené na ELISA (Lutz a kol., 1979).

FeLV bola retrospektíne identifikovaná ako hlavná príčina ochorení domácich mačiek v 60. rokoch a prospektívne v 70. a 80. rokoch. Čo spôsobilo panzootiu infekcie FeLV a chorôb u domácich mačiek? Ako sa neskôr zistilo, človekom riadené prostredie s početnou populáciou mačiek, najmä kde boli mladé mačiatka v kontakte so staršími infikovanými mačiatkami a mačkami, sa ukázalo ako ideálne pre prenos z mačky na mačku. Závažnosť týchto expozícií spolu s mladým vekom (Hoover et al., 1976) a inými stresovými faktormi prostredia výrazne zvýšil výskyt pretrvávajúcich infekcií oproti prechodným infekciám (Pedersen a kol., 1977). Zatiaľ čo iba malé percento mačiek v prírode sa stáva trvale viremických, u tretiny alebo viac mačiek exponovaných v kontrolovanom laboratórnom prostredí sa vyvinula perzistentná virémia.

Koniec panzootie FeLV nastal s rozsiahlym „testovaním a oddeľovaním“ viremických mačiek, ako dokumentujú Weijer a kolegovia (1986). Testovanie a oddeľovanie boli neskôr doplnené účinnými vakcínami. Je pozoruhodné, že infekcia FeLV už nie je hlavnou príčinou ochorení v domácnostiach s mnohopočetným výskytom mačiek. Opäť existuje ako prírodná infekcia, s pozitivitou iba u 1-5% divokých mačiek. Niekoľko viremických mačiek, najmä mladších, sa však naďalej objavuje medzi mačkami premiestnenými z prírody do prostredia útulkov a dočasných domovov.

Patogenéza – primárna infekcia FeLV je svojou povahou do značnej miery nevýrazná a ukončená silnou imunitnou odpoveďou a celoživotnou imunitou (prehľad Pedersen, 1991). Ak je však rozsah expozície dostatočne veľký a/alebo je nejakým spôsobom znížená imunita mačky, môže dôjsť k primárnemu a prechodnému ochoreniu. Táto fáza sa môže prejaviť horúčkou, generalizovanou lymfadenopatiou, nízkym počtom krvných doštičiek a WBC a miernou anémiou. Po tomto štádiu často nasleduje dlhotrvajúca a do značnej miery bezpríznaková virémia trvajúca mesiace a roky. U mačiek s pretrvávajúcou infekciou FeLV sa nakoniec vyvinie niekoľko primárnych a sekundárnych chorôb, ktoré sú zvyčajne smrteľné. Zvyčajný odhad úmrtnosti u viremických mačiek je okolo 50% ročne (Pedersen, 1988), čo znamená, že po troch rokoch zostane nažive iba 12,5% z nich. Pretože infekcia v prírode sa vyskytuje hlavne u mladších mačiek a väčšina z nich uhynie do 3 rokov, v prírode sa u mačiek starších ako 5-8 rokov pozoruje len málo prípadov infekcie FeLV.

Primárne choroby FeLV sú spojené s rôznymi mutantami infikujúceho kmeňa a zahŕňajú aplastickú anémiu, rôzne myeloproliferatívne poruchy a lymfóm, ktorý je zvyčajne generalizovaný, očný alebo neurologický (zhrnutie Pedersen 1988, 1991). Sekundárne ochorenie spojené s FeLV je spôsobené niekoľkými bežnými infekčnými agensmi mačiek, ktoré zvyčajne nie sú veľmi patogénne, ale ktoré sa zosilňujú potlačením imunity T-lymfocytov spojenej s FeLV.

Súvislosť infekcie FeLV a FIP – Zistilo sa, že jedna tretina až polovica mačiek s FIP počas 70. a 80. rokov bola infikovaná FeLV (Cotter a kol., 1973; Pedersen a kol., 1977). Spojenie medzi týmito dvoma infekciami sa ukázalo, keď boli mladé laboratórne mačky s infekciou enzootickým mačacím enterickým koronavírusom (FECV) chované spolu s nosičmi FeLV (Pedersen a kol., 1977). Keď sa tieto mladé mačky trvale infikovali FeLV, začali sa zvyšovať ich titre koronavírusových protilátok a behom niekoľkých týždňov alebo mesiacov sa objavili klinické príznaky FIP. FIP sa vyskytla iba u jednej tretiny mačiek s virémiou FeLV, a u dvoch tretín mačiek, ktoré sa stali imunnými voči FeLV, sa nezistili žiadne prípady FIP. V neskoršej štúdii boli mačky chronicky infikované laboratórnym kmeňom vírusu mačacej imunodeficiencie (FIV) experimentálne infikované FECV (Poland a kol., 1996). U dvoch z 19 mačiek v chronickom imunosupresívnom štádiu infekcie FIV sa vyvinula FIP, zatiaľ čo žiadna z 20 FIV neinfikovaných “spolubývajúcich” neochorela. Štúdie podobné tejto s imunosupresiou FeLV a FIV boli dôležité pre záver, že vírus FIP (FIPV) bol bežne sa vyskytujúcim mutantom FECV a minimálnym patogénom u zdravých imunokompetentných mačiek.

Čo znamená infekcia FeLV pre liečbu FIP? Priznávam sa, že nie som zástancom liečby FIP u mačiek pozitívnych na FeLV. Vieme, že infekcia FeLV indukuje typ imunosupresie, ktorý vedie k rozvoju FIP. Mám tiež podozrenie, že úspešná liečba FIP antivirotikami, ako je GS-441524, spočíva v obnovení ochrannej imunitnej odpovede na FIPV. Ak je to pravda, FeLV indukovaná imunosupresia môže interferovať s imunitou FIPV a znižovať mieru vyliečenia pri liečbe GS alebo interferovať s akoukoľvek dlhodobou ochrannou imunitou vyvolanou úspešnou antivírusovou liečbou. Je potrebné vziať do úvahy ďalšie dva problémy s liečením takýchto mačiek. Chov mačiek infikovaných FeLV spôsobuje finančné a fyzické ťažkosti, pokiaľ ide o rutinnú veterinárnu starostlivosť a karanténu náchylných mačiek. Je tiež známe, že iba 10% mačiek infikovaných FeLV prežije dlhšie ako tri roky. Tieto fakty vyvolávajú otázky ohľadne najlepšieho využívania prostriedkov dočasných/záchranných skupín a jednotlivcov – na mačky iba s FIP, mačky s iným liečiteľným ochorením alebo na zdravé mačky čakajúce na domov?

Záver – Je nepravdepodobné, že by sa pestúni/záchranári rozhodli neliečiť FIP u FeLV pozitívnych mačiek. Rozhodnutie liečiť FIP u takýchto mačiek však musí v prvom rade vychádzať z presnosti počiatočného testu FeLV. Asi 5 zo 100 pozitívnych in-house testov FeLV ELISA u zdravej populácie mačiek bude falošne pozitívnych. Ak je výskyt FeLV v populácii mačiek pochádzajúcich z ulice 1%, falošne pozitívne výsledky budú päťkrát častejšie ako skutočné pozitivity. Preto je dôležité, aby boli pozitívne testy ELISA potvrdené ďalším testom, ako je PCR. Majitelia by sa mali vždy, keď je to možné, uistiť, že tieto mačky nemajú iné choroby spojené s FeLV, ako je aplastická anémia, lymfóm alebo myeloproliferatívne poruchy. Majitelia mačiek, ktorí sa rozhodnú pre liečbu GS, by sa tiež mali podeliť o krátkodobé a dlhodobé výsledky svojho úsilia, aby bolo možné v tejto skupine FIP získať lepšiu prognózu.

Referencie

  • Cotter SM, Gillmore CE, Rollins C. 1973. Multiple cases of feline leukemia and feline infectious peritonitis in a household. J Am Vet Med Assoc 162:1054-1058.
  • Hardy WD Jr., et al. Feline leukemia virus: occurrences of viral antigen in the tissues of cats with lymphosarcoma and other diseases. Science 1969, 166:1019-1021. 
  • Hardy WD Jr. Horizontal transmission of feline leukemia virus in cats. Nature 1973, 244:266269. 
  • Hardy WD Jr, Zuckerman EE. Ten-year study comparing enzyme-linked immunosorbent assay with the immunofluorescent antibody test for detection of feline leukemia virus infection in cats. J Am Vet Med Assoc. 1991, 199:1365-73.
  • Hoover EA, et al. Feline leukemia virus infection: Age-related variation in response of cats to experimental infection. J Natl Cancer Inst. 1976, 57:365-369. 
  • Jarrett WFH, et al., Leukemia in the cat. A virus-like particle associated with leukemia (lymphosarcoma). Nature 1964, 202:567-56.
  • Lutz H, et al. The Demonstration of Antibody Specificity by a New Technique. The Gel
  • Electrophoresis-Derived Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (GEDELISA) and its Application to Antibodies Specific for Feline Leukemia Virus.  J Histochem Cytochem. 1979, 27:1216-1218.
  • Pedersen NC. Feline Infectious Diseases. American Veterinary Publications, Inc., Goleta, CA, USA, 1988.  
  • Pedersen NC. Feline leukemia virus infection. In: Feline Husbandry. Disease and management in the multiple-cat environments. American Veterinary Publications, Inc., Goleta, CA, USA, 1991, pp210-228. 
  • Pedersen NC, Theilen G, Keane MA, Fairbanks L, Mason T, Orser B, Che CH, Allison C. 1977. Studies of naturally transmitted feline leukemia virus infection. Am J Vet Res 38:1523-31.
  • Poland AM, Vennema H, Foley JE, Pedersen NC. 1996. Two related strains of feline infectious peritonitis virus isolated from immunocompromised cats infected with feline enteric coronavirus. J Clin Micro 34:3180-3184. Weijer K, de Haag U, Osterhaus A. 1986. Control of feline leukemia virus infection by a removal programme. Vet Rec, 119, 555-556.
Prečítať “Infekcia FeLV a jej vzťah k FIP”

Príbeh o doplnkoch pre domácich miláčikov

6. Apríl 2021
Niels C. Pedersen, DVM PhD
Pôvodný článok: The Story About Supplements for Pets like Cats

Používanie doplnkov pre psy a mačky je čoraz bežnejšie, čo odzrkadľuje trend využívania doplnkov pre ľudí. Všimol som si tiež, že mnoho majiteľov mačiek používa početné doplnky na podporu liečby FIP pomocou GS-441524. Silne cítim, že tieto doplnky nemajú žiadny účinok a majiteľov stoja obrovské množstvo peňazí. Niektorí majitelia sa pre užívanie doplnkov rozhodnú sami, v niektorých prípadoch ich však používajú na odporúčanie svojich veterinárnych lekárov. Na doplnky sa ľudia spoliehajú aj v tých častiach sveta, kde je nedostatok veterinárnej starostlivosti. V mnohých prípadoch sú „predpísané“ na prevenciu, spomalenie alebo zvrátenie konkrétnych zdravotných stavov. V skutočnosti sa ale často používajú len kvôli potrebe niečo urobiť, a aj keď nefungujú, tak aspoň neublížia. V niektorých prípadoch stačí len náznak, že konkrétny orgán „potrebuje určitú formu pomoci“. Značná časť testovacích panelov vykonaných dokonca u zdravých zvieratách bude vykazovať jednu alebo viac podozrivých hodnôt, najmä u krvi, pečene alebo obličiek. Takéto hodnoty by sa nemali používať ako dôvod na predpisovanie alebo predaj doplnkov. Ako človek, ktorý verí vo vedecké metódy a klinické skúšky zamerané na zaistenie bezpečnosti a účinnosti, nemôžem s čistým svedomím odporučiť majiteľom používať nevyskúšané doplnky bez lekárskeho predpisu, ktoré tvrdia, že majú predchádzať, zmierňovať alebo liečiť choroby.

Som si vedomý mnohých svedectiev, ktoré existujú na webe, a ktoré dokazujú účinnosť širokej škály výrobkov. Existuje však aj veľa článkov z renomovaných zdrojov, ktoré podporujú moje presvedčenie. Nižšie citujem úryvky z takýchto článkov.


McKenzie B. Desať najlepších doplnkov pre domáce zvieratá: Fungujú? Science Based Medicine, 19. mája 2011. https://sciencebasedmedicine.org/the-top-ten-pet-supplements-do-they-work/.

Trápenie bohatých

„Napísalo sa už mnoho o podnikaní s výživovými doplnkami, priemysle za miliardy dolárov so silnými politickými väzbami, a o žalostnej neadekvátnosti regulácie, ktorá umožňuje rozsiahly marketing doplnkov bez solídneho vedeckého základu alebo vedeckých dôkazoch. …………. . Marketing použitý na propagáciu týchto doplnkov samozrejme ide nad rámec čohokoľvek odôvodneného skutočnými vedeckými dôkazmi a je takmer všeobecne nedôveryhodný. Rovnako aj svedectvá a anekdoty o ich účinkoch, či už od pacientov, majiteľov domácich miláčikov, veterinárnych lekárov alebo laureátov Nobelovej ceny, sú iba príbehmi, ktoré nemajú takmer žiadnu dôkaznú hodnotu. A keďže väčšina dobrých nápadov v medicíne sa nakoniec nestane skutočnou a účinnou klinickou terapiou, je pravdepodobné, že sa ukáže, že i mnohé z týchto ešte atraktívnejších produktov sa ukážu ako neúčinné alebo budú ukrývať neznáme riziká. Bez adekvátnych podporných dôkazov a bez účinnej kontroly kvality, regulácie a dohľadu po uvedení na trh si nikdy nemôžeme byť istí, že ich používaním pomáhame a neubližujeme našim pacientom. “


Finno CJ. Veterinárne doplnky pre zvieratá a nutraceutiká. Nutr. dnes. 2020; 55 (2): 97-101. doi: 10,1097/nt,0000000000000399. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7802882/.

„Tvrdenia o účinnosti mnohých doplnkov a nutraceutík pre domáce zvieratá sú často založené na subjektívnych metódach hodnotenia vrátane posudkov vlastníkov, keď neboli dôsledne testované v dobre navrhnutých klinických štúdiách a publikované v odborných časopisoch, a preto by sa na ne malo nazerať skepticky . Aj keď sú výsledky extrapolované zo štúdií uskutočňovaných na ľuďoch alebo na modeloch hlodavcov cenné pre medzidruhové porovnania, nezohľadňujú rozdielnu farmakokinetiku a farmakodynamiku jednotlivých druhov. Ďalej sa veľa doplnkov a nutraceutík pre domáce zvieratá konzumuje perorálne, a biologická dostupnosť orálne užívaných liekov sa medzi jednotlivými druhmi veľmi líši. Spotrebiteľom by sa tiež malo odporučiť, aby boli skeptickí k marketingovým tvrdeniam založených na testoch in vitro. Napríklad veľa deklarovaných benefitov doplnkov na kĺby pre domácich miláčikov je založených na testoch in vitro, ktoré sa často spoliehajú na veľmi vysoké dávky priamo aplikované na explantáty chrupavky alebo kultivované chondrocyty. “


Aliancia pre výživu domácich miláčikov. Ako sú regulované výživové doplnky pre zvieratá? https://petnutritionalliance.org/site/pnatool/how-are-dietary-supplements-for-animals-regulated/.

Odpovede:

  • Pokiaľ ide o zvieratá, Úrad pre kontrolu potravín a liečiv (FDA), Centrum pre veterinárnu medicínu (CVM) v USA reguluje dve triedy výrobkov: potraviny a lieky. V závislosti na zamýšľanom použití sa výživový doplnok pre zvieratá považuje za potravinu alebo liek. Pre „doplnky“ pre zvieratá neexistuje samostatná kategória.
  • V zákone o zdravotných výživových doplnkoch (DSHEA) z roku 1994 bol definovaný pojem „výživový doplnok“, ktorý však nešpecifikoval, či sa definícia vzťahuje na ľudí, zvieratá alebo na obidve. Hlavným prínosom DSHEA bolo preklasifikovanie určitých regulovaných potravinových zložiek na potravinové prísady, ktoré pred uvedením na trh vyžadujú schválenie.
  • V roku 1996 CVM zverejnilo oznámenie vo federálnom registri, v ktorom vysvetlilo, že DSHEA sa nevzťahuje na živočíšne produkty.
  • Federálne zákony a nariadenia jednoducho nepoznajú kategóriu výrobkov pre zvieratá, ktorá sa nazýva „výživové doplnky“. V závislosti na uvedenom zamýšľanom použití je produktom buď potravina, alebo liek, regulovaný FDA.
  • Mnoho majiteľov kupuje pre svoje domáce zvieratá výrobky určené pre humánne použitie. Je dôležité vedieť, že výrobcovia výživových doplnkov pre ľudí nemusia poskytovať FDA dôkazy o tom, že ich doplnky sú účinné alebo bezpečné. Nie je im však dovolené (vedome) uvádzať na trh nebezpečné alebo neúčinné výrobky.
  • Len čo je výživový doplnok pre ľudí uvedený na trh, musí FDA pre jeho obmedzenie alebo stiahnutie z trhu dokázať, že výrobok nie je bezpečný.
  • Naopak, predtým, ako výrobcovia dostanú povolenie uviesť liek na trh, musia získať súhlas FDA poskytnutím presvedčivých dôkazov o tom, že je bezpečný a učinný.
  • Niektoré doplnky, ktoré sú bezpečné pre ľudí, môžu byť toxické pre psy alebo mačky. Preto je nevyhnutné, aby sa majitelia domácich zvierat pred podaním výživového doplnku svojmu domácemu miláčikovi poradili so svojimi veterinárnymi lekármi.
Prečítať “Príbeh o doplnkoch pre domácich miláčikov”

FIP u starých mačiek

Pôvodný článok: 2021 – FIP IN AGED CATS
Niels C. Pedersen, DVM, PhD, Emeritný profesor, Škola veterinárneho lekárstva University of California, Davis; 11.2.2021

Fakty: Vzťah veku a incidencie FIP už bol v literatúre diskutovaný a dokonca bol aj predmetom výskumu [1]. 29% prípadov FIP sa vyskytuje u mačiatok do 0,5 roka, 50% do 1 roka, 80% do veku 3 roky a 96% do 8 rokov (tabuľka 1). Výskyt FIP medzi 7. a 11. rokom života je extrémne nízky. Prinajmenšom dve štúdie, jedna z USA v roku 1976 [2] a druhá z Európy v roku 2021 [3][tabuľka 1], potvrdzujú skutočný, ale menej dramatický nárast výskytu na 3% u starších mačiek. Zámerom tohto článku je rozobrať príčiny tohto nárastu a jeho dôsledky pre diagnostiku a úspešnú liečbu FIP u starých mačiek.

Tabuľka 1. Vek mačiek v čase diagnózy FIP na základe údajov získaných o mačkách liečených pomocou GS-441524 z Európy 2019-2021.

Zdroj expozície FIP: FIP je výsledkom expozície FECV [4] a to isté platí aj pre staršie mačky. Existuje však niekoľko jedinečných situácií, ktoré sú s takouto expozíciou spojené. Prvý scenár je analogický s tým, ktorý sa vyskytuje u mladších mačiek, t. j. hromadná expozícia mladších mačiek. Je však bežné, že staršie mačky sa spárujú ako mačiatka a žijú svoj život spoločne v relatívnej izolácii. To vedie k ďalšiemu zaujímavému scenáru, pri ktorom je pravdepodobné, že jedna mačka z páru zomrie skôr ako druhá, čo ju ponechá bez spoločníka. Nového spoločníka, najčastejšie mačiatko, potom získate od záchranárskej organizácie, útulku alebo chovateľskej stanice. Šanca, že mačiatko z týchto zdrojov vylučuje FECV, je vysoké. Existuje tiež druhý zdroj expozície FECV, ktorý nevyžaduje kontakt mačky s mačkou. Je známe, že FECV sa môže preniesť z jednej mačky na druhú prostredníctvom ľudského oblečenia. FECV je prítomný vo vysokých koncentráciách v prachu podstielky, najmä u mladých mačiek a mačiatok, a v prostredí môže prežiť mnoho dní. Preto je kontakt majiteľa s mladšími mačkami mimo domova ďalším zdrojom infekcie FECV.

Jedinečné aspekty FIP u starých mačiek: Skúsenosti s liečbou starých mačiek GS-441524 vedú k trom možným faktorom, ktoré by nás mali zaujímať: 1) chybne diagnostikovaná FIP, 2) existencia FIP v spojení s jednou alebo viacerými ďalšími poruchami bežnými u starnúcej mačky a 3) liečba FIP v súvislosti s oslabeným imunitným systémom.

Chybná diagnóza FIP: Pozorovania uskutočnené u mačiek liečených GS-441524 naznačujú, že FIP u starších mačiek je náchylnejšia na nesprávnu diagnózu a je ťažšie ju liečiť. Chybná diagnóza FIP u starých mačiek sa dá najlepšie vysvetliť jednoduchou pravdepodobnosťou. Napríklad v jednej štúdii sa zistilo, že FIP je najbežnejšou príčinou ochorenia chrbtice u mačiek mladších ako dva roky, zatiaľ čo rakovina bola najbežnejšou samostatnou poruchou vo vekovom rozmedzí 2 – 8 rokov [5]. Preto by prvou úvahou o poruche chrbtice u mladej mačky mala byť FIP, zatiaľ čo prvou úvahou u starej mačky by mala byť rakovina. Výskyt mnohých typov rakoviny, ktorá nie je vyvolaná retrovírusom, tiež stúpa, počnúc vekom okolo 7-9 rokov, a predstavuje asi jednu tretinu úmrtí starých mačiek. Chronické ochorenie obličiek sa tiež začína klinicky prejavovať približne v rovnakom veku a predstavuje asi jednu tretinu úmrtí starých mačiek. Medzi zostávajúce úmrtia starých mačiek patrí cukrovka a hypertyreóza a početné muskuloskeletálne, kardiovaskulárne, neurologické a gastrointestinálne poruchy. Staré mačky, rovnako ako starí ľudia, majú sklon k zníženiu imunitnej funkcie, čo sa často prejavuje zvýšením hladín sérového imunoglobulínu a chorobami spojenými s relatívnou imunodeficienciou a autoimunitou. Klinické a laboratórne príznaky týchto porúch starnutia často napodobňujú príznaky FIP, ale pravdepodobnosť, že starnúce mačky budú mať FIP, je oveľa nižšia ako u týchto iných stavov. Naopak, pravdepodobnosť výskytu mladej mačky s klinickými a laboratórnymi znakmi kompatibilnými s FIP, ktorá má FIP, je oveľa vyššia ako u starej mačky s podobnými nálezmi.

FIP ako sekundárne ochorenie: Druhý scenár je bežnejší u mnohých starých mačiek s FIP trpiacich inými vážnymi chorobnými stavmi. Chronické zlyhanie obličiek je najbežnejším z týchto základných stavov, pričom rakoviny ako lymfóm sú menej časté. Staršie mačky tiež trpia starnutím imunitného systému, čo vedie k stavu relatívnej imunodeficiencie, čo je ďalším predisponujúcim faktorom pre FIP.

FIP a imunodeficiencia v dôsledku starnutia: Imunitný systém je citlivý na nepriaznivé účinky starnutia u všetkých druhov zvierat, vrátane mačiek [6, 7]. Pokles imunitnej funkcie u starnúcich mačiek je spojený so zmenami v populáciách B a T lymfocytov a zvýšenými hladinami nešpecifického imunoglobulínu. Preto majú staré mačky často vyššiu hladinu sérových bielkovín a globulínu, ako je bežné. Zvýšenie celkových hladín sérových bielkovín a globulínov u mladších mačiek sa často považuje za príznaky FIP, zatiaľ čo ich diagnostická hodnota u starších mačiek je menej významná.

Relatívna imunodeficiencia spôsobená starnutím sťažuje boj s novými infekciami a staršími infekciami, ktoré zostávajú v tele skryté alebo latentné po celé desaťročia. Najlepšie študované príklady vplyvu starnutia na odolnosť voči novým a latentným infekciám pochádzajú od ľudí. Úmrtia na COVID-19 u starých ľudí s komplikujúcimi chorobami, ako je cukrovka a chronické ochorenie pľúc, sú najlepším príkladom vplyvu starnutia a chronických degeneratívnych chorôb na odolnosť voči infekčným činiteľom. Je dobre známe, že tuberkulóza zostáva latentne v pľúcnych lymfatických uzlinách po celé desaťročia pred opätovnou aktiváciou. Preto je TBC osobitným problémom u ľudí v zariadeniach pre seniorov a u jedincov liečených na autoimunitné poruchy pomocou inhibítorov cytokínov. Existujú tiež náznaky, že FIP môže u niektorých mačiek existovať v subklinickom stave mesiace až roky, kým sa klinicky prejaví. Existujú aj prípady mačiek, ktoré žijú celý život v bytovej izolácii, kým sa u nich v starobe vyvinie FIP.

Záver: FIP u starých mačiek je našťastie neobvyklá, ale má jedinečné vlastnosti, ktoré ovplyvňujú diagnostiku a liečbu. Je potrebné venovať osobitnú pozornosť verifikácii diagnózy FIP a identifikácii ďalších zdravotných faktorov, ktoré buď predisponujú k FIP, alebo komplikujú jej úspešnú liečbu. U starších mačiek je to veľká diagnostická výzva a liečbu sťažujú ďalšie degeneratívne poruchy bežné pre túto vekovú skupinu. Miera vyliečenia FIP, ktorá je u mladých mačiek vyššia ako 80%, nie je u starých mačiek taká vysoká.

Referencie

  1. Pedersen NC, Liu H, Gandolfi B, Lyons LA. The influence of age and genetics on natural
    resistance to experimentally induced feline infectious peritonitis. Vet Immunol Immunopathol.
    2014, 162(1-2):33-40.
  2. Pedersen NC. Feline infectious peritonitis. Something old, something new. Feline
    Practice. 1976, 6:42-51.
  3. FIP Warriors CZ/SK. 2021. Statistics on FIP treatment in the Czech & Slovak Republics.
    https://www.fipwarriors.eu/en/stats/.
  4. Pedersen NC. Virologic and immunologic aspects of feline infectious peritonitis virus infection.
    Adv Exp Med Biol. 1987, 218:529-50.
  5. Marioni-Henry K, Vite CH, Newton AL, Van Winkle TJ. Prevalence of diseases of
    the spinal cord of cats. Journal Veterinary Internal Medicine, 2004, 18, 851-58.
  6. Day MJ. Ageing, immunosenescence and inflammageing in the dog and cat. J Comp
    Pathol. 2010, 142 Suppl 1:S60-9.
  7. Cornell Feline Health Center. The Special Needs of the Senior Cat. 2016.
    https://www.vet.cornell.edu/departments-centers-and-institutes/cornell-feline-healthcenter/health-information/feline-health-topics/special-needs-senior-cat
Prečítať “FIP u starých mačiek”

Účinnosť a bezpečnosť nukleozidového analógu GS-441524 pri liečbe mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou mačacou infekčnou peritonitídou

13.2.2019, Journal of Feline Medicine and Surgery; Preklad 10.2.2021
Pôvodný článok: Efficacy and safety of the nucleoside analog GS-441524 for treatment of cats with naturally occurring feline infectious peritonitis
Niels C PedersenMichel PerronMichael BannaschElizabeth MontgomeryEisuke MurakamiMolly Liepnieks, and Hongwei Liu

Abstrakt

Ciele

Cieľom tejto štúdie bolo zistiť bezpečnosť a účinnosť nukleozidového analógu GS-441524 pre mačky trpiace rôznymi formami prirodzene získanej infekčnej peritonitídy mačiek (FIP).

Metódy

Mačky boli vo veku od 3,4 do 73 mesiacov (priemerne 13,6 mesiaca); 26 mačiek malo vlhkú alebo zmiešanú FIP, 5 suchú formu FIP. Mačky so závažnou neurologickou a okulárnou FIP neboli do štúdie prijaté. Skupina začala s GS-441524 v dávke 2,0 mg/kg SC q24h po dobu najmenej 12 týždňov, ktorá sa zvyšovala, keď to bolo indikované, na 4,0 mg/kg SC q24h.

Výsledky

Štyri z 31 mačiek, ktoré mali ťažkú formu ochorenia, uhynuli alebo boli eutanizované do 2-5 dní a piata mačka po 26 dňoch. Zvyšných 26 mačiek dokončilo plánovaných 12 alebo viac týždňov liečby. Osemnásť z týchto 26 mačiek zostáva zdravých v čase publikácie (OnlineFirst, február 2019) po jednom kole liečby, zatiaľ čo osem ďalších utrpelo relapsy choroby v priebehu 3–84 dní. Šesť z relapsov bolo neneurologických a dva neurologické. Tri z ôsmich ralapsujuúcich mačiek boli liečené opäť rovnakou dávkou, zatiaľ čo piatim mačkám bola dávka zvýšená z 2,0 na 4,0 mg/kg každých 24 hodín. Päť mačiek liečených druhýkrát vyššou dávkou, vrátane jednej s neurologickým ochorením, reagovalo dobre a v čase publikácie boli zdravé. Jedna z troch mačiek znovu liečených pôvodnou nižšou dávkou však mala relaps s neurologickým ochorením a bola eutanizovaná, zatiaľ čo dve zostávajúce mačky reagovali priaznivo, ale došlo k druhému relapsu. Tieto dve mačky boli úspešne liečené tretíkrát pri vyššej dávke, čo vo výsledku viedlo k 25 dlhodobo preživším mačkám. Jedna z 25 úspešne liečených mačiek bola následne eutanizovaná z dôvodu pravdepodobného nesúvisiaceho ochorenia srdca, zatiaľ čo 24 zostalo zdravých.

Záver a význam

GS-441524 sa ukázal ako bezpečný a efektívny pri liečbe FIP. Bola stanovená optimálna dávka 4,0 mg/kg SC q24h po dobu najmenej 12 týždňov.

Kľúčové slová: Nukleozidový analóg, GS-441524, infekčná peritonitída mačiek, FIP, klinická štúdia

Úvod

Lieky, ktoré inhibujú replikáciu vírusov, sa stali ústredným bodom zaujmu pri liečbe ľudských akútnych a chronických RNA a DNA infekcií. Vývoj záujmu o antivírusové lieky pre infekcie zvierat bol však oveľa pomalší. To platí najmä pre mačky, ktoré trpia niekoľkými chronickými vírusovými infekciami podobnými tým ľudským. Medzi infekčné činitele patrí vírus mačacej leukémie a imunodeficiencie (FeLV a FIV), mačací herpesvírus (FHV), virulentný systémový kalicivírus a koronavírus spôsobujúci mačaciu infekčnú peritonitídu (FIPV). Infekcie FeLV a FIV sa darí udržiavať pod kontrolou pomocou testovania, izolácie a/alebo očkovania. Ochorenie spojené s FHV bolo prvou mačacou vírusovou infekciou, kde bolo pre liečbu použité antivirotikum. Vysoko smrteľný systémový kalicivírus postihuje iba malý počet mačiek. Infekcia FIPV je najlepším kandidátom pre vývoj antivírusových liekov, pretože vakcíny sú neúčinné, prostredie s mnohými mačkami veľmi komplikuje prevenciu a zabíja 0,3–1,4% mačiek na celom svete.

Výskyt exotických chorôb, ako je ebola, stredovýchodný respiračný syndróm (MERS) a ťažký akútny respiračný syndróm (SARS) u ľudí, podnietil intenzívny výskum liekov, ktoré inhibujú replikáciu vírusu RNA. Jedným z najsľubnejších antivírusových liekov proti vznikajúcim RNA vírusom je proliečivo (prodrug) adenozínový nukleozidový monofosfát GS-5734 (Remdesivir; Gilead Sciences). GS-5734 preukázal účinnosť pri experimentálnej ebole u opíc rhesus a inhiboval epidemické aj zoonotické koronavírusy v tkanivových kultúrach a v myšacích infekčných modeloch. Tieto sľubné zistenia iniciovali výskum GS-5734 a jeho pôvodného nukleozidu GS-441524 proti FIPV infekcii mačiek. GS-441524 a GS-5734 majú porovnateľné hodnoty EC50 (1,0 uM) a CC50 (> 100 uM) proti FIPV v mačacích bunkách. Preto sa rozhodlo pre účely dalších testov s laboratórnymi mačkami zamerať na chemicky menej komplexný GS-441524. Farmakokinetická štúdia na dvoch laboratórnych mačkách preukázala trvalé a účinné plazmatické hladiny GS-441524 vyše 24 hodín po dávke podanej subkutánne (SC) alebo intravenózne (IV). Tieto výsledky sa rozšírili na 10 laboratórnych mačiek s experimentálne indukovanou brušnou efúznou mačacou infekčnou peritonitídou (FIP). Táto štúdia preukázala, že GS-441524 je vysoko účinný proti experimentálnej FIP, a otvorila tak cestu pre túto klinickú štúdiu.

Cieľom tejto štúdie bolo demonštrovať bezpečnosť a účinnosť GS-441524 pri liečbe mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou FIP. Malomolekulárne lieky, ako je GS-441524, majú hmotnosť <900 daltonov a veľkosť približne 1 nm a môžu ľahko prenikať do buniek a interagovať s kľúčovými cieľovými molekulami. Na rozdiel od už publikovaných látok alebo liekov, ktoré inhibujú FIPV brzdením bunkových procesov vírusmi využívaných pre ich replikáciu, malé molekuly, ako je GS-441524, interferujú priamo s vírusom kódovanými replikačnými procesmi.

Materiály a metódy

Príprava lieku

GS-441524 poskytla spoločnosť Gilead Sciences ako čistý a vysoko stabilný prášok, ktorý bol zriedený na koncentráciu 10 alebo 15 mg/ml v 5% etanole, 30% propylénglykole, 45% PEG 400, 20% vode (pH 1,5 s HCI ). Roztok bol umiestnený do sterilných 50 ml sklenených injekčných fľaštičiek, v ktorých sa pretrepal až do rozpustenia a potom sa podrobil sonickej vodnej kúpeli na 5 až 20 minút, kým nebol číry. Zriedený liek bol uložený do chladu a bol použitý v priebehu 3–4 týždňov.

Koncepcia štúdie

Táto štúdia prebiehala podľa protokolov 19336 a 19863 schválených Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat a Výborom pre hodnotenie klinických skúšok Komisie pre klinické skúšky veterinárnej lekárskej fakultnej nemocnice na Kalifornskej univerzite v Davise. Inštitucionálne pravidlá vylučujú použitie chorých mačiek z útulkov alebo z podobných zariadení, kvôli požiadavke legálneho vlastníctva/adopcie a zaobchádzania za špecifických podmienok so súhlasom majiteľa (doplňujúci materiál). Štúdia nezahŕňala kontrolnú skupinu, pretože neexistuje účinná zrovnávacia liečba. Nebola zahrnutá ani placebo skupina, pretože prípravné štúdie in vitro a in vivo naznačovali, že GS-441524 bude bezpečný a účinnejší ako žiadna liečba.

Výber prípadov a potvrdenie diagnózy

Mačky s FIP boli prijaté od majiteľov alebo ich veterinárnych lekárov, ktorí hľadali súčasné možnosti liečby alebo prístup k predchádzajúcej štúdii antivírusových liekov. Počiatočná diagnóza FIP bola založená predovšetkým na charakteristických základných informáciách, klinických anamnézach a príznakoch choroby, výsledkoch bežných laboratórnych testov a vyšetrení brušných alebo hrudných výpotkov. Definitívnejšia diagnóza založená na RT-PCR alebo imunohistochémii bola síce žiaduca, ale nebola nevyhnutnou podmienkou pre zaradenie. Mačky so zjavným očným alebo neurologickým ochorením boli vyradené kvôli pochybnostiam ohľadne schopnosti antivírusových liekov, vrátane GS-441524, preniknúť cez hematoencefalickú alebo hematookulárnu bariéru.

Do štúdie bolo prijatých 31 mačiek a ich majiteľov (tabuľka 1). Majitelia alebo zástupcovia 26 mačiek prišli na úvodnú liečbu priamo do UC Davis a päť majiteľov a ich mačky (CT59, CT73, CT76, CT78, CT80) boli v ošetrení miestneho veterinára. Mačky prítomné na UC Davis boli znovu prehodnotené, ich diagnóza FIP bola znovu potvrdená na základe dát, klinickej anamnézy, fyzikálneho vyšetrenia, výsledkov predchádzajúcich laboratórnych testov a opakovania kompletného krvného obrazu (CBC), sérových bielkovín a analýz výpotkov. Hrudný alebo brušný výpotok u mačiek s vlhkou FIP bol potvrdený ako pozitívny na FIPV 7b RNA pomocou RT-PCR. Mačky so známkami neefúznej FIP boli ďalej testované brušnou a hrudnou ultrasonografiou na primárne lézie. Očné ochorenie bolo potvrdené oftalmologickou službou VMTH, UC Davis. Neurologický stav v prípadoch s možnými príznakmi ochorenia centrálneho nervového systému bol vyhodnocovaný neurologickou službou VMTH.

Tabuľka 1
Zoznam 31 mačiek zaradených do testovania vrátane laboratórneho označenia, mena mačky, plemena, klinickej formy infekčnej peritonitídy (FIP) a dátumu diagnózy

IDMenoDátum narodeniaPlemenoPohlaviePôvodDátum diagnózyForma FIP
CT52Luna9.1.2017SavannahFChovateľ24.4.2017Brušná efúzna
CT53Ice Bear2.8.2016DLHMCZáchranná skupina5.5.2017Brušná efúzna
CT54Charolett11.7.2016SiberianFChovateľ15.4.2017Brušná efúzna
CT55Dempsey26.6.2016DSHMCZáchranná skupina15.4.2017Brušná efúzna
CT56Mudsa1.7.2016DSHMCÚtulok12.5.2017Brušná efúzna
CT57Boone31.10.2016DSHFSZáchranná skupina8.5.2017Brušná efúzna
CT58Justyna17.4.2016RagdollFChovateľ25.5.2017Brušná efúzna
CT59Bubba11.4.2011DLHMCTúlavá10.4.2017Brušná neefúzna
CT60Joey25.7.2016DSHMCZáchranná skupina20.5.2017Brušná efúzna
CT61Hudson1.7.2016DSHMCZáchranná skupina29.5.2017Hrudná efúzna
CT62Luca10.3.2016DSHMCZáchranná skupina30.5.2017Brušná efúzna
CT63Bao Bao6.11.2016DSHMCZáchranná skupina3.6.2017Brušná efúzna
CT64Cedrick27.6.2016DSHMCZáchranná skupina22.5.2017Brušná neefúzna
CT65Mona14.3.2016Exotic SH/PersianFChovateľ11.6.2017Hrudná efúzna
CT66Squeekers7.6.2016DSHFSÚtulok14.6.2017Brušná efúzna
CT67Double2.3.2016RagdollFSChovateľ20.6.2017Brušná efúzna
CT68Tuckerman8.5.2016Maine CoonMCZáchranná skupina22.6.2017Brušná efúzna
CT69Danny16.6.2015SnowshoeMCÚtulok22.6.2017Hrudná efúzna
CT70Tolstoy1.8.2014DSHMCZáchranná skupina25.6.2017Brušná efúzna
CT71Amadeus29.6.2016DSHMCTúlavá20.6.2017Hrudná efúzna
CT72Bella25.2.2017British SHFChovateľ20.6.2017Brušná efúzna
CT73Siersha8.8.2015DSHFSÚtulok21.6.2017Brušná neefúzna
CT74Maive4.3.2017SiberianFSChovateľ7.7.2017Brušná efúzna
CT75Lucy31.3.2017DSHFZáchranná skupina10.7.2017Brušná efúzna
CT76Pie20.7.2016Exotic SHMChovateľ28.6.2017Brušná efúzna
CT77Mila15.3.2017SiberianFSChovateľ3.7.2017Brušná efúzna
CT78Polly1.3.2016DSHMCZáchranná skupina22.7.2017Brušná neefúzna
CT79Oona21.9.2016HimalayanFChovateľ18.7.2017Hrudná neefúzna
CT80Fezzik17.10.2016DLHMCTúlavá25.7.2017Brušná efúzna
CT81Jewelkat8.9.2016PersianFSChovateľ1.8.2017Hrudná efúzna
CT82Tiko8.4.2016DSHMCZáchranná skupina6.8.2017Brušná efúzna
F = samica nekastrovaná; FS = samica kastrovaná; M = samec nekastrovaný; MC = samec kastrovaný; DLH = domáca dlhosrstá; DSH = domáca krátkosrstá; SH = krátkosrstá;

Liečebný režim

Na základe predchádzajúcich experimentov s tkanivovými kultúrami a farmakokinetických štúdií na laboratórnych mačkách bol počiatočný dávkovací režim pre GS-441524 stanovený na 2,0 mg/kg SC q24h. Na základe skúseností s inhibítorom 3CL proteázy GC376 proti prirodzene sa vyskytujúcej FIP bola určená minimálna doba liečby 12 týždňov. Liečba sa predĺžila o jeden alebo viac týždňov u mačiek, ktoré stále mali abnormálne hodnoty sérových bielkovín. V neskorších štádiách štúdie sa dávka zvýšila z 2,0 na 4,0 mg/kg v prípadoch, keď sa liečba musela predĺžiť, alebo keď došlo k relapsu choroby. Majiteľom bola každé 4 týždne zasielaná nová dávka lieku vo forme vopred natiahnutých injekčných striekačiek Luer lock s objemom 1 alebo 3 ml s 1 palcovými ihlami Luer veľkosti 22G (0,7x25mm). Injekčné striekačky sa uložili do chladničky a pred aplikáciou sa zahriali na izbovú teplotu. Injekcie boli aplikované pozdĺž chrbtice od 2 cm za lopatkami do polovice bedrovej oblasti a do polovice vzdialenosti nadol na susedný hrudník a boky.

Monitorovanie počas počiatočného obdobia liečby

V čase vstupu do testovania bola u mačiek vysadená všetka liečba, ktorá nebola nevyhnutná – antibiotiká, kortikosteroidy, interferóny, pentoxifylín, nesteroidné protizápalové lieky, alebo lieky na tlmenie bolesti. Počas pobytu na UC Davis boli mačky každých 12 hodín monitorované z hľadiska teploty, chuti do jedla, aktivity, močenia a defekácie. Krv bola odoberaná v 1–3 denných intervaloch na vyhodnotenie hematokritu, celkového proteínu, bilirubínu, počtu bielych krviniek a diferenciálneho počtu bielych krviniek.

Vzorky ascitu sa odobrali na začiatku a potom sa odoberali v jedno alebo niekoľko denných intervaloch čo najdlhšie, ako to bolo možné, a testovali sa na úrovne prepisov FIPV 7b RNA kvantitatívnou (q) RT-PCR (IDEXX molekulárna diagnostika). Rezy tkaniva fixovaného formalínom od piatich pitvaných mačiek, boli podrobené imunohistochémii na proteín nukleokapsidy FIPV.

Monitorovanie počiatočnej a dlhodobej reakcie na liečbu

Mačky boli prepustené do domáceho ošetrenia, keď bola zaznamenaná významná priaznivá odpoveď na liečbu, zvyčajne do 3–5 dní. Počas tohto obdobia boli majitelia poučení, ako správne podávať subkutánne injekcie, a boli vyzvaní, aby pokračovali v denných záznamoch o telesnej teplote, aktivite, chuti do jedla, defekácii a močení a týždenných meraniach telesnej hmotnosti. CBC a sérový chemický panel boli robené v mesačných intervaloch miestnymi veterinármi alebo počas návštev VMTH. Bolo potrebné zaznamenávať a okamžite hlásiť akékoľvek abnormálne príznaky alebo správanie. Odôvodnená eutanázia bola zvyčajne vykonaná veterinárnym lekárom majiteľa alebo, ak to bolo možné, v UC Davis. Telá boli okamžite ochladené a zapečatené v plastových vreciach, a odoslané do 2 alebo menej dní v kontajneroch chladených ľadom na UC Davis expresnou poštou. Pitvy boli vykonané jedným z autorov (ML) v Anatomic Pathology Service, School of Veterinary Medicine, UC Davis. Bola rešpektovaná žiadosť majiteľa o konečnú dispozíciu tela.

Výsledky

Základné údaje a prezentácia choroby

Do štúdie bolo zaradených 31 mačiek vo veku od 3,4 do 73 mesiacov (priemerne 13,6 mesiacov) (tabuľka 1). Osemnásť mačiek boli domáce krátkosrsté a dlhosrsté , 13 mačiek predstavovalo zástupcov 10 rôznych plemien (tabuľka 1). Domáce mačky boli adoptované z organizácií na záchranu mačiek (n = 13), útulkov (n = 2) alebo to boli túlavé mačky z okolia (n = 3). Štúdia zahŕňala 14 samíc (7 nekastrovaných; 7 kastrovaných) a 17 samcov (1 nekastrovaný; 16 kastrovaných).

Dvadsaťšesť z 31 mačiek malo vlhkú FIP (6 hrudná, 20 brušná). Päť mačiek malo neefúznu FIP; štyri z nich (CT59, CT64, CT73, CT78) s ochorením lokalizovaným do brucha (mezenterické a ileo/cekálne/kolické lymfatické uzliny) a jedna (CT79) do hrudníka (pľúca, hilárne lymfatické uzliny) (tabuľka 1). Štyri ďalšie mačky vykazovali znaky skoršej suchej FIP, ktorá prešla do efúznej formy (CT57, CT65, CT67, CT71) (tabuľka 1). Hrubé príznaky očného ochorenia zodpovedajúce FIP sa potvrdili oftalmoskopickým vyšetrením u troch z 31 mačiek (CT56, CT65, CT71). Dve mačky (CT71, CT80) neochotne alebo už vôbec nedokázali skákať na vyvýšené miesta, čo naznačovalo neurologické postihnutie.

Výsledky liečby

Štyri mačky boli eutanizované (CT62, CT72, CT75) alebo uhynuli (CT56) počas prvých 2–5 dní kvôli závažnému ochoreniu a iným komplikáciám a piata mačka bola eutanizovaná (CT54) po 26 dňoch z dôvodu chýbajúcej reakcie na liečbu (obrázok 1). Liečba prebiehala bez prerušenia, s výnimkou troch mačiek, ktorým bol v 4. (mačka CT80) alebo 8. týždni (mačky CT53, CT71) poskytnutý dvojtýždňový oddych kvôli problémom s podávaním injekcií a kožným reakciám (obrázok 1). Mačka CT53 bola po druhom relapse liečená po dobu 8 a nie 12 týždňov z dôvodu zvýšenia močoviny v krvi a zvýšenia sérových hladín symetrického dimetylarginínu (SDMA).

Obrázok 1.
Časová škála liečby a klinický výsledok 31 mačiek, ktoré boli zaradené do klinickej štúdie GS-441524. Obdobie liečby je označené plnou čiarou (dávka 2 mg/kg) alebo prerušovanou čiarou (dávka 4 mg/kg). Hviezdičky označujú bod relapsu. Dátum ukončenia liečby pre mačky, ktoré dosiahli trvalú klinickú remisiu, je uvedený v zátvorkách. Časový bod a príčina smrti sú označené krížikom

Klinická reakcia 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby, bola dramatická. Horúčka zvyčajne ustúpila do 12–36 hodín (obrázok 2), súčasne s každodenným výrazným zvýšovaním chute do jedla, úrovne aktivity a prírastku hmotnosti. Brušné výpotky rýchlo vymizli počas 1-2 týždňov, počnúc asi 10.-14. dňom po zahájení liečby. Mačky s hrudným výpotkom zvyčajne vykazujúce dýchavičnosť, absolvovali u praktickych súkromných veterinárov odsatie pleurálnych výpotkov ešte pred príchodom na UC Davis. Zbytková dýchavičnosť a hrudný výpotok rýchlo reagovali na liečbu a po 7 dňoch už neboli vôbec viditeľné. Žltačka pomaly odznela v priebehu 2–4 týždňov, súčasne s poklesom hyperbilirubinémie. Známky očného ochorenia začali miznúť do 24-48 hodín a prestali byť zjavné navonok i pre oftalmoskopické vyšetrenie do 7–14 dní. V priebehu liečby začalo dochádzať k zmenšovaniu zväčšených mezenterických a ileo/cekálno/kolických lymfatických uzlín. Všetkých 26 mačiek vyzeralo podľa odhadov majiteľov navonok normálne alebo takmer normálne po 2 týždňoch liečby. Po 2 týždňoch liečby sa kládol dôraz na sledovanie niekoľkých parametrov krvných testov. Kľúčové hodnoty zahŕňali hematokrit, celkový počet bielych krviniek, absolútny počet lymfocytov, celkový sérový proteín, sérový globulín, sérový albumín a pomer albumín: globulín (A:G).

Obrázok 2.
Priemer (plná čiara) a 1 SD (smerodajná odchýlka) (čiarkovane) telesných teplôt počas prvých 5 dní liečby GS-441524. Normálny teplotný rozsah pre mačky je 37,7–39,1 °C (100–102,5 ° F). Teploty klesli do normálneho rozsahu do 12–36 hodín od začiatku liečby

Osemnásť z 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov neprerušenej primárnej liečby, nevyžadovalo žiadnu ďalšiu liečbu. Osem ďalších mačiek však utrpelo relapsy choroby v priebehu 3–84 dní (priemerne 23 dní) (obrázok 1). Táto skupina zahŕňala tri mačky, u ktorých došlo k dočasnému prerušeniu počiatočnej liečby (CT53, CT71, CT80), a päť mačiek (CT53, CT57, CT60, CT68, CT73), ktoré vyžadovali predĺženú primárnu liečbu (obrázok 1). Relapsy choroby u 2/8 mačiek (CT57, CT71) mali zjavne neurologický charakter s vysokou horúčkou a silnou zadnou ataxiou a nekoordináciou, zatiaľ čo relapsy choroby u zvyšných šiestich mačiek pozostávali hlavne z horúčky, anorexie a znízenej aktivity. Iba jedna mačka (CT60) mala pri relapse zjavný brušný výpotok. Jedna mačka (CT57) bola eutanizovaná 2 týždne po relapse s neurologickými príznakmi, ktoré nereagovali na druhé kolo liečby.

U ôsmich mačiek bolo rozhodnuté zvýšiť dávku GS-441524 z 2,0 na 4,0 mg/kg, buď z dôvodu predĺženia liečby (CT77, CT80), alebo z dôvodu jedného (CT60, CT68, CT71, CT73) alebo dvoch relapsov (CT53, CT63), alebo preto, že relaps mal neurologickú formu (CT71). Všetkých osem mačiek reagovalo pozitívne na režim zvýšeného dávkovania.

Celkovo 25/26 mačiek liečených 12 týždňov alebo dlhšie dosiahlo trvalú remisiu FIP, hoci jedna z nich následne zomrela na nesúvisiaci problém so srdcom (pozri „Pitevné nálezy“). Najdlhšie prežívajúce mačky v čase publikácie (OnlineFirst, február 2019) ukončili liečbu v auguste 2017 a najkratšie v máji 2018, všetky po ukončení pozorovacieho obdobia, v ktorom ešte mohlo dôjsť k relapsu (tj. 84 dní po ukončení liečby). 24 preživších mačiek bude starostlivo monitorovaných pre prípadný návrat príznakov ochorenia a budú sa pravidelne testovať na celkový pomer bielkovín, globulínu, albumínu a A:G počas prvého roka. Menej intenzívne monitorovanie sa bude vykonávať po zvyšok života mačiek. Majitelia boli upozornení, aby sa vyhli zbytočnému namáhaniu mačiek počas prvých 3 mesiacov, aj keď štyri mačky (CT52, CT58, CT65, CT79) a jeden kocúr (CT76) absolvovali bezproblémovú kastráciu.

Ukazovatele priaznivej reakcie na liečbu

Najjednoduchším dlhodobým meradlom účinnosti liečby bola telesná hmotnosť. K nárastu hmotnosti o 20–120% došlo počas a po liečbe, dokonca aj u mačiek, ktoré v čase diagnózy mali 1 rok alebo viac. Zdá, že výrazný rast sa prejavil aj u mladších mačiek, ako to nezávisle zaznamenali ich majitelia. Tieto výrazné zrýchlenia rastu po liečbe naznačili, že FIP bola u mnohých mačiek nejaký čas pred diagnózou subklinická a ovplyvnila ich rast. Pri sledovaní neskorších účinkov liečby a pri pozorovaní možných toxicít liekov sa osvedčili aj CBC (hematológia) a chemický profil (biochémia).

CBCs (Hematológia)

Mačky vykazovali zvýšený počet bielych krviniek, ktorý klesol na normálne hodnoty v priebehu prvých 2 týždňov liečby (obrázok 3a). Lymfopénia zaznamenaná v čase prijatia vymizla počas prvého týždňa liečby (obrázok 3b). Pri prijatí sa pozorovala mierna až stredne závažná anémia, čo sa prejavilo v hematokrite (PCV) (obrázok 4). Hematokrit sa vrátil na normálne hodnoty až po 6–8 týždňoch liečby. Absolútny celkový počet bielych krviniek a lymfocytov boli jedinými významnými hodnotami počas prvého týždňa liečby, zatiaľ čo PCV poskytol presnejší obraz postupu liečby počas prvých 8 týždňov.

Obrázok 3.
(a) Priemerný počet bielych krviniek so štandardnou odchýlkou u 26 mačiek, ktoré dokončili primárny liečebný režim 12 alebo viac týždňov. (b) Priemerný absolútny počet lymfocytov v krvi so štandardnou odchýlkou u 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby
Obrázok 4.
Hematokrit (PCV) so štandardnou odchýlkou pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby. Bodkovaná čiara naznačuje trend rastu PCV v priebehu času

Zmeny sérových bielkovín

Mačky s FIP často vykazovali vyššiu ako normálnu celkovú koncentráciu bielkovín v sére, vysokú hladinu sérového globulínu, nízku hladinu sérového albumínu a nízky pomer A:G (obrázky 5–7). Abnormálne hodnoty sérových bielkovín sa progresívne zlepšovali a dosiahli normálne hodnoty po 8–10 týždňoch liečby (obrázky 5–7). Hladina celkového proteínu bola najmenej informatívna, čo naznačuje nízka hodnota R2 (0,1883) trendovej spojnice (obrázok 5). Avšak 3 týždne po zahájení liečby došlo k dramatickému a prechodnému zvýšeniu celkových hladín proteínov (obrázok 5). Tento jav súvisel so zvýšením sérových globulínov (obrázok 6a) v čase rýchleho ústupu brušných výpotkov.

Obrázok 5.
Priemerné hladiny celkového proteínu v sére a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby
Obrázok 6.
(a) Priemerné hladiny sérového globulínu a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby. (b) Priemerné hladiny sérového albumínu a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby
Obrázok 7.
Priemerné pomery albumínu:globulínu (A/G) a štandardná odchýlka pre 26 mačiek, ktoré absolvovali najmenej 12 týždňov liečby

Plazmatické hladiny globulínu stúpali počas prvých 3 týždňov liečby, dosiahli vrchol a potom pomaly klesali na maximálnu referenčnú hodnotu 4,5 g/dl alebo nižšiu do 9. týždňa (obrázok 6a). Aj keď sa zdá, že hladiny globulínu v priebehu času reflektovali stav liečby, nízka hodnota R2 (0,3621) ukázala, že sa jedná o menej spoľahlivý ukazovateľ pokroku v liečbe.

Hladiny albumínu v sére 26 mačiek liečených najmenej 12 týždňov boli v čase zahájenia liečby zvyčajne nízke (⩽3,2 g/dl) (obrázok 6b). Hladiny albumínu sa potom pomaly zvyšovali a dosiahli normálnu úroveň po 8 týždňoch. Trendová čiara tohto nárastu albumínu mala vysokú hodnotu R2 (0,79), vďaka čomu boli hladiny sérového albumínu, ako aj PCV, dobrým indikátorom pokroku v liečbe. Ako sa očakávalo, pomer A:G vykazoval v priebehu času rovnako silnú trendovú líniu a okolo 8. týždňa liečby úroveň presiahla hodnotu 0,70 (obrázok 7).

Pokles hladiny vírusovej RNA v bunkách z ascitickej tekutiny v spojitosti s liečbou

Počas prvých 2–9 dní antivírusovej liečby sa odoberali od ôsmich mačiek sekvenčné vzorky ascitu a testovali sa na hladiny vírusovej RNA pomocou qRT-PCR (tabuľka 2). Najspoľahlivejším zdrojom FIPV RNA boli celé výpotky alebo ich bunkové frakcie. U 7/8 mačiek hladiny vírusovej RNA poklesli do 2-5 dní, často na nedetekovateľné hodnoty. U jednej mačky (CT54) sa neprejavil významný pokles hladín vírusovej RNA ani v priebehu 9 dní.

Tabuľka 2
Úrovne prepisov RNA vírusu mačacej infekčnej peritonitídy 7b v celých ascitoch alebo v bunkovej frakcii ascitickej tekutiny počas počiatočnej liečby GS-441524

ID vzorkyDni liečbyTyp vzorkyKópie vírusovej RNA/ml
CT520Ascites9.44 × 104
3AscitesNezistiteľné
CT540Ascites8.49 × 105
2Ascites6.97 × 104
4Ascites2.44 × 103
7Ascites2.07 × 103
9Ascites6.46 × 104
CT620Ascites5.96 × 103
2Ascites1.53 × 103
8AscitesNezistiteľné
CT740Bunky6.51 × 106
2Bunky3.39 × 105
CT750Bunky9.08 × 106
3Bunky4.75 × 105
4Bunky2.50 × 105
CT770Ascites5.47 × 104
2Ascites3.93 × 103
CT800Ascites4.10 × 103
2AscitesNezistiteľné
CT820Ascites1.13 × 104
5AscitesNezistiteľné

Vedľajšie účinky pozorované počas liečby a po liečbe

Ohraničené reakcie v mieste vpichu. Boli pozorované dva typy reakcií v mieste vpichu, a či boli spôsobené liekom, riedidlom alebo obomi, nebolo zistené. Okamžité reakcie na bolesť sa prejavovali vokalizáciou, občasným vrčaním a posturálnymi zmenami trvajúcimi 30–60 s. Tieto počiatočné reakcie sa časom zmierňovali, pretože majitelia sa stávali viac zručnými v podávaní injekcií a mačky sa tejto rutine postupne prispôsobovali. U šestnástich z 26 liečených mačiek sa prejavili reakcie v mieste vpichu (tabuľka 3). Reakcie boli zjavné najčastejšie počas prvých 4 týždňov a progredovali do otvorených rán iba u 7/16 mačiek. Ulcerácie sa zahojili do 2 týždňov zastrihnutím okolitých chlpov a jemným vyčistením rany vatovým tampónom namočeným v jednom diele peroxidu vodíka pre domácnosť a v dvoch dieloch vody dvakrát denne. Iba tri mačky mali znateľné jazvy v miestach vpichu.

Tabuľka 3
Reakcie v mieste vpichu u 16 z 26 mačiek liečených GS-441524 po dobu 12 týždňov alebo dlhšie

ID mačkyPovrchové lézieOtvorené ranyJazvy
CT53310
CT58100
CT60002
CT61500
CT63220
CT64101
CT65911
CT66320
CT68400
CT71510
CT73710
CT74310
CT761000
CT78700
CT79200
CT82200
Väčšina lézií bola povrchová a zahŕňala epidermis a nevyžadovala žiadnu liečbu, zatiaľ čo u niektorých došlo k progresii do otvorených rán, ktoré sa uzdravili do 2 týždňov topickou liečbou. Niektoré reakcie zanechali malé trvalé jazvy

Systémové liekové reakcie. Liečba GS-441524 v celkovom období 12–30 týždňov bola pozoruhodne bezpečná. V hodnotách CBC neboli pozorované žiadne dlhodobé abnormality (obrázky 3 a 4). Testy funkcie pečene a obličiek a hladiny amylázy/lipázy zostali počas liečby a po liečbe normálne (doplňujúce obrázky S1 – S3). Jedinou výnimkou bola mačka CT53, u ktorej došlo k progresívnemu zvýšeniu močoviny v krvi (BUN) na 35 mg/dl (referenčný interval [RI] 16–37 µg/dl) a k náhlemu zvýšeniu SDMA (20 µg/dl) (RI 0-14 µg/dl) po 8 týždňoch v treťom kole liečby v režime zvýšenej dávky 4 mg/kg. Aj keď mali tieto príznaky stále miernu povahu, bolo pre istotu rozhodnuté ukončiť liečbu. Tieto abnormality pri testovaní o 1 mesiac neskôr už neboli prítomné a mačka je momentálne v remisii choroby.

Pitevné nálezy

Štyri mačky (CT56, CT62, CT72, CT75) boli eutanizované alebo uhynuli do 2–5 dní od zaradenia do štúdie a pitvy boli vykonané u všetkých okrem mačky CT75. Piata mačka (mačka CT54) bola eutanizovaná po 26 dňoch liečby. Všetkých päť týchto mačiek malo závažné brušné efúzne ochorenie. U mačky CT54 a CT56 sa pri pitve našli dôkazy o rozšírenej pyogranulomatóznej vaskulitíde zahŕňajúcej brušné vnútornosti, centrálny nervový systém a oči. U mačky CT56 došlo aj kompromitácii ileálnej steny v oblasti hustého infiltrátu a sekundárnej bakteriálnej sepse. Mačka CT72 mala ťažkú ​​pyogranulomatóznu vaskulitídu obmedzenú na brucho so stredne ťažkým až ťažkým periférnym edémom a mineralizáciou kôry nadobličiek. Mačka CT62 trpela ťažkou pyogranulomatóznou a fibrinosuppuratívnou peritonitídou, ktorú komplikovala akútna perforácia žalúdka spojená s rastlinným materiálom a intralezionálnymi baktériami svedčiacimi o sepse. Mačka CT75 vykazovala chronickú formu FIP charakterizovanú silným spomalením rastu, masívne nízkym obsahom bielkovín / nízkym obsahom buniek vo výpotku, zrýchlenou činnosťou srdca svedčiacou o poškodení srdcovej funkcie a stredne závažným periférnym edémom. Echokardiogram ukázal bilaterálne zväčšenie predsiení, ale nijaký náznak primárneho srdcového ochorenia. Zdalo sa, že mačka reagovala na GS-441524 a bola prepustená. Mačka upadla o 2 dni neskôr do šoku a bola eutanizovaná bez pitvy.

V čase pitvy mačiek CT56, CT72 a CT75 pri použití qRT-PCR nebol vírus FIPV detekovaný, hoci vzorky ascitu pred liečbou boli pozitívne. Ascites z mačky CT54 vykazoval pozitívny výsledok qRT-PCR počas celej liečby (tabuľka 2) a tkanivá boli v čase pitvy stále imunohistochemicky pozitívne.

Po úspešnom absolvovaní jedného alebo viacerých kôl liečby boli eutanizované aj ďalšie dve mačky. Mačka CT57 bola po jednom kole liečby normálna, ale o 2 týždne neskôr došlo k relapsu so závažnými neurologickými príznakmi. Mačka nereagovala na opakovanú liečbu a bola usmrtená. Lézie typické pre FIP sa našli v mozgu a bruchu, ale boli negatívne na FIPV určený imunohistochémiou pre nukleokapsidový proteín alebo na 7b RNA pomocou qRT-PCR. Mačka CT80 bola úspešne liečená na efúznu brušnú FIP, ale o 4 týždne neskôr sa u nej objavili silné bolesti zadných nôh a krížov. Zistilo sa, že mačka mala výrazné zhrubnutie steny ľavej komory a septa, ktoré spôsobilo vážne zúženie komory (obrázok 8). Mikroskopický vzhľad steny ľavej srdcovej komory bol typický pre vrodenú mačaciu hypertrofickú kardiomyopatiu (HCM). V brušnej dutine, na hrudníku, v očiach, v mozgu alebo v chrbtici sa nezistili žiadne hrubé ani mikroskopické lézie FIP a qRT-PCR nedetekoval FIPV antigén a ani RNA FIPV.

Obrázok 8.
Prierez srdcom mačky CT80 vykazujúci extrémnu hypertrofiu steny ľavej komory a septa a extrémne zúženie komory

Diskusia

GS-441524 je za posledné 2-3 roky po GC376 druhým testovaným cieleným antivírusovým liekom pre liečbu FIP. Tieto dva lieky inhibujú vírusovú replikáciu dvoma veľmi odlišnými spôsobmi, buď ukončením vírusovej RNA transkripcie alebo blokovaním štiepenia vírusového polyproteínu. Oba procesy sú dobre známym cieľom pre liečbu niektorých ľudských vírusových ochorení. Kľúčovou otázkou je porovnanie liečby nukleozidovým analógom s liečbou inhibítorom vírusovej proteázy. Tieto dva lieky poskytli prakticky identické výsledky v štúdiách na tkanivových kultúrach a experimentálne infikovaných mačkách. Účinnosť proti prirodzene sa vyskytujúcej FIP sa však javila pri GS-441524 vyššia ako pri GC376. Šesť z 20 mačiek liečených GC376 zostáva dodnes v remisii (Pedersen NC, nepublikované údaje, 2018) v porovnaní s 25/31 mačkami liečenými GS-441524. Ochorenia, ktoré nereagovali na opakovanú liečbu, sa vyskytli u 14/20 mačiek s GC376 ale iba u jednej mačky liečenej GS-441524. 8 zo 14 relapsov spojených s GC376 malo neurologický charakter, v porovnaní s 2/8 relapsmi s GS-441524. Jeden z dvoch neurologických relapsov u mačiek liečených GS-441524 reagoval na opakovanú liečbu vyššou dávkou, zatiaľ čo neurologické relapsy s GC376, dokonca ani pri zvýšenej dávke, už neboli liečiteľné. Obidve liečby spôsobovali podobné reakcie v mieste vpichu. Obidva lieky sa javia ako pomerne bezpečné, hoci GC376 interferoval s vývojom trvalých zubov, keď sa podával mladším mačiatkam.

Aj keď sa zdá, že výsledky klinickej štúdie uprednostňujú GS-441524, niektoré rozdiely mohli byť ovplyvnené tým, ako boli tieto dva lieky podávané. Účinnosť GC376 sa mohla zlepšiť, ak by bolo všetkých 20 mačiek liečených bez prerušenia po dobu 12 týždňov, namiesto toho, aby boli liečené progresívne dlhšími obdobiami, začínajúcimi iba na 2 týždňoch. Päť zo šiestich mačiek vyliečených pomocou GC376 patrilo medzi sedem mačiek, ktoré boli liečené nepretržite po dobu 12 týždňov, zatiaľ čo bola vyliečená iba jedna z 13 mačiek liečených jedenkrát alebo viackrát po kratšiu dobu. Tieto kratšie doby trvania liečby boli nevyhnutné na stanovenie 12-týždňového obdobia použitého pre všetky mačky v tejto štúdii. Klinická štúdia GC376 okrem toho zahŕňala menej mačiek a bola limitovaná obmedzeným prísunom lieku, čo sťažilo testovanie ďalších dávkovacích režimov. Preto by sa mal GC376 pred akýmkoľvek konečným porovnaním ďalej študovať s použitím minimálne 12 týždňov s vyššou dávkou a väčším počtom mačiek. Bolo by tiež dôležité niekedy v budúcnosti vyhodnotiť obidva typy liekov v kombinácii, tak ako sa to robí pri HIV/AIDS a hepatitíde C.

V každej štúdii tohto typu treba počítať s predčasnými úmrtiami, ale ako by sa mali posudzovať pri analýze účinnosti? Päť predčasných úmrtí v tejto štúdii bolo zahrnutých do analýzy účinnosti GS-441524, ale boli vyradené v štúdii GC376. Pre zahrnutie úmrtí do štúdie je dôležité zistenie statusu vírusu v čase smrti. Vírusová RNA sa nezistila u troch pitvaných mačiek, ktoré uhynuli po 2–5 dňoch liečby s GS-441524, čo naznačuje, že liek bol účinný, ale choroba bola v príliš pokročilom štádiu. Nebolo to tak v prípade štvrtej pitvanej mačky, ktorá prežila 26 dní; hladiny vírusovej RNA počas celého obdobia liečby neklesli a príznaky choroby sa nezmiernili. Preto je možné, že táto mačka uhynula v dôsledku neúspešného zastavenia replikácie vírusu. Rezistencia na GS-5734 (Remdesivir), proliečivo GS-441524, bola spojená s mutáciami aminokyselín v RNA polymeráze a korekčnou exonukleázou v tkanivovými kultúrami propagovaných koronavírusoch. Či sa u tejto mačky vyskytla podobná rezistencia, bude ešte treba zistiť. Rezistencia na lieky bola pozorovaná u aj u jednej mačky v teste GC376. Našťastie žiadna z ďalších mačiek v súčasnej štúdii nevykazovala príznaky rezistencie na lieky. U budúcich mačiek, ktoré nereagujú vôbec alebo reagujú nedostatočne na primárnu alebo sekundárnu liečbu, je však potrebné túto možnosť vziať do úvahy.

Počiatočná dávka GS-441524 použitá v predloženej štúdii bola stanovená na základe predchádzajúcich farmakokinetických a experimentálnych infekčných štúdií s laboratórnymi mačkami. Tieto štúdie naznačili, že 2,0 a 5,0 mg/kg SC q24h po dobu 14 dní by boli rovnako účinné aj pri klinickej štúdii. Preto bola pre klinické testovanie zvolená dávka 2,0 mg/kg, pretože by to znížilo spotrebu lieku o 60%. Aj keď bolo toto rozhodnutie potvrdené u 18/26 mačiek, osem ďalších mačiek buď utrpelo relapsy choroby (dve dokonca dvarát), alebo si vyžiadali dlhšie trvanie liečby, aby sa kľúčové hodnoty krvi dostali späť do normálu. Preto bolo urobené rozhodnutie zvýšiť dávku GS-441524 z 2,0 mg/kg na 4,0 mg kg SC q24h u mačiek, u ktorých došlo k relapsu alebo vyžadovali predĺženú liečbu. Úspešnosť 4,0 mg/kg SC q24h u najmenej 12 takýchto mačiek, ako aj u jednej mačky s neurologickým ochorením, nás priviedla k záveru, že ide o účinnejšie dávkovanie a malo by sa stať základom pre budúcu liečbu.

Bolo dôležité sledovať jednoduché biologické ukazovatele pokroku v priebehu ⩾ 12 týždňovej liečby. Ako užitočné markery boli identifikované hladiny HCT (PCV), hladiny celkového proteínu v sére, globulínu a albumínu a pomer A:G. Na základe týchto parametrov sa ukázalo, že mačky sa po 6–10 týždňoch liečby ešte celkom nezotavili. Toto zistenie potvrdilo minimálne 12-týždňové trvanie liečby stanovené v predchádzajúcej klinickej štúdii GC376. Chronická anémia (anémia zápalu) postihuje 18–95% ľudí s akútnymi a chronickými infekciami a je normocytová/normochromická a nesúvisí s nedostatkom železa. Dobrým ukazovateľom aktivity ochorenia boli aj plazmatické hladiny albumínu, a je známe, že nízky albumín a nízky HCT (PCV) korešpondujú s výskytom chronického ochorenia. Hyperglobulinémia u mačiek s FIP bola klasifikovaná ako infekčná/zápalová a je spôsobená zvýšením vo všetkých triedach gama globulínov a variabilnými prírastkami vo frakcii alfa-2 globulínov. Výrazná tendencia mačiek s FIP k vysokej sérovej hladine globulínu a nízkej hladine albumínu robí z pomeru A:G obzvlášť dobrý indikátor aktivity ochorenia.

Očakávalo sa, že čistokrvné mačky nebudú rovnako dobre reagovať na liečbu z dôvodu geneticky oslabenej schopnosti imunologicky reagovať na FIPV, a že mladšie mačky s vlhkou FIP budú na liečbu reagovať najlepšie. V tejto štúdii však nakoniec čistokrvné mačky reagovali rovnako dobre ako obyčajné mačky, a plemená zastúpené mačkami v štúdii odrážali najpopulárnejšie súčasné plemená. Staršie mačky a mačky s čistou neefúznou FIP reagovali na liečbu GS-441524 rovnako dobre, ako mladé mačky a mačky s vlhkou FIP. Za predpokladu, že sa dá pomocou GS-441524 liečiť aj časť mačiek s očným a neurologickým ochorením, sa dá povedať, že by sa už žiadne prejavy FIP nemuseli považovať za neliečiteľné.

Bezpečnostný profil GS-441524 bol pôsobivý. Na základe CBC a sérových chemických hodnôt počas celkových liečebných období v trvaní od 12 do 30 týždňov sa až na jednu možnú výnimku nepozorovali žiadne významné systémové príznaky toxicity. Jedna mačka (CT53) mala mierny nárast BUN a SDMA v 8. týždni tretieho kola liečby a v rámci preventívnych opatrení si vynútila pozastavenie liečby. Na základe predchádzajúcich skúseností s GC376 boli obavy z účinku GS-441524 na vývoj trvalého chrupu. Tri mačky (CT52, CT74, CT77) v tejto štúdii boli vo veku 4 mesiacov alebo mladšie a stále mali juvenilný chrup a žiadna z nich nevykazovala žiadne následné zubnej abnormality. U GS-441524 sa pozorovali reakcie v mieste vpichu, ale ich počet bol pozoruhodne nízky a boli ľahko liečiteľné. Nezistilo sa, či je na vine liek, riedidlo alebo oboje. pH riedidla 1,5 bolo hlboko pod minimálnou hraničnou hodnotou 4,5 stanovenou FDA (Food and Drug Administration), avšak liečivá tohto typu sa ťažko rozpúštajú a stabilizujú pri fyziologicky priaznivejšom pH. Napriek tomu by sa malo vyhodnotiť viac fyziologických riedidiel.

Jedna mačka v štúdii (CT80) mala znepokojivé klinické príznaky. Aj keď mačka vykazovala efúznu brušnú FIP, mala aj dlhodobé príznaky nejasného zakrivenia zadnej končatiny, bolesti krížov, pravidelných epizód padania, neochoty skákať na vyššie miesta a nevysvetliteľných a prechodných zmien správania. Tieto príznaky viedli k liečbe mačky ešte dlho po zmiznutí brušného výpotku. Nakoniec sa prijalo rozhodnutie liečbu prerušiť a zistiť, či sa vrátia charakteristické príznaky FIP. Mačka bola nakoniec eutanizovaná a pri pitve bolo zistené, že má vrodený typ HCM a žiadne zvyškové lézie FIP alebo vírusovej RNA v akýchkoľvek tkanivách. Dilatačná kardiomyopatia bola hlásená u 17,6% ľudí infikovaných HIV pri chronickej antiretrovírusovej liečbe. Dospelo sa však k záveru, že príčinou srdcového ochorenia u tejto mačky nebol GS441524. Ochorenie srdca u tejto mačky bolo hypertrofické na rozdiel od dilatačnej formy pozorovanej u pacientov s HIV, a navyše je HCM u útulkových mačiek pomerne bežná.

Závery

Výsledky získané od 31 mačiek liečených GS-441524 prekonali všetky očakávania a naznačujú, že FIP, bez ohľadu na stav alebo formu ochorenia, je s použitím nukleozidových analógov liečiteľné ochorenie. Koncepcia štúdie a parametre liečby vyplyvajúce z tohto obmedzeného klinického testovania budú dôležité pre ďalšie úsilie v komercializácii tohto alebo podobných liekov proti FIP.

Doplnkový materiál

Formulár súhlasu majiteľa

Obrázok S1. Priemerné hladiny pečeňových enzýmov (IU / L) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.
Obrázok S2. Priemerné hladiny lipázy a amylázy v sére (IU/L) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.
Obrázok S3. Priemerné hladiny BUN a kreatinínu u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Poďakovania

Ďakujeme pracovníkom Centra pre zdravie spoločenských zvierat za pomoc pri preprave liekov (Lyra Pineda-Nelson a Nancy Bei) a za prezentáciu údajov (Cynthia Echeverria). Sme vďační najmä mnohým majiteľom a 31 mačkám, ktoré sa zúčastnili emotívnej a náročnej cesty, ktorá predčila všetky očakávania. Sme vďační aj praktickým súkromným veterinárom, ktorí pomáhali s pravidelnými krvnými testami a boli tu pre nás a ich pacientov/majiteľov, keď to bolo potrebné.

Poznámky

Prijaté: 28. decembra 2018

Doplnkový materiál: K dispozícii sú nasledujúce súbory: Formulár súhlasu klienta.

Obrázok S1: Priemerné hladiny pečeňových enzýmov (IU / l) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Obrázok S2: Priemerné hladiny lipázy a amylázy v sére (IU / l) u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Obrázok S3: Priemerné hladiny urey a kreatinínu v krvi u mačiek počas liečby GS-441524. Počas celých liečebných období sa nepozorovali žiadne významné zmeny.

Konflikt záujmov: MP a EM sú zamestnancami spoločnosti Gilead Sciences, Foster City, CA, USA a majú v spoločnosti podiely.

Finančné prostriedky: Finančnú podporu pre túto štúdiu poskytli Centrum pre spoločenské zdravie zvierat UC Davis, Fond Philipa Raskina v Kansas City a početní darcovia organizácii SOCK FIP podľa pokynov pani Carol Horace. GS-441524 použitý v tomto pokuse bol poskytnutý spoločnosťou Gilead Sciences, Foster City, CA.

Referencie

1.De Clercq, E, Li, G. Approved antiviral drugs over the past 50 years. Clin Microbiol Rev 2016; 29: 695–747.
Google Scholar | Crossref | Medline
2.Hartmann, K. Efficacy of antiviral chemotherapy for retrovirus-infected cats: what does the current literature tell us? J Feline Med Surg 2015; 17: 925–939.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
3.Thomasy, SM, Shull, O, Outerbridge, CA. Oral administration of famciclovir for treatment of spontaneous ocular, respiratory, or dermatologic disease attributed to feline herpesvirus type 1: 59 cases (2006–2013). J Am Vet Med Assoc 2016; 249: 526–538.
Google Scholar | Crossref | Medline
4.Pedersen, NC, Elliott, JB, Glasgow, A. An isolated epizootic of hemorrhagic-like fever in cats caused by a novel and highly virulent strain of feline calicivirus. Vet Microbiol 2000; 73: 281–300.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
5.Kim, Y, Shivanna, V, Narayanan, S. Broad-spectrum inhibitors against 3C-like proteases of feline coronaviruses and feline caliciviruses. J Virol 2015; 89: 4942–4950.
Google Scholar | Crossref | Medline
6.Pedersen, NC, Kim, Y, Liu, H. Efficacy of a 3C-like protease inhibitor in treating various forms of acquired feline infectious peritonitis. J Feline Med Surg 2018; 20: 378–392.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
7.Pesteanu-Somogyi, LD, Radzai, C, Pressler, BM. Prevalence of feline infectious peritonitis in specific cat breeds. J Feline Med Surg 2006; 8: 1–5.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
8.Riemer, F, Kuehner, KA, Ritz, S. Clinical and laboratory features of cats with feline infectious peritonitis – a retrospective study of 231 confirmed cases (2000–2010). J Feline Med Surg 2016; 18: 348–356.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
9.Rohrbach, BW, Legendre, AM, Baldwin, CA. Epidemiology of feline infectious peritonitis among cats examined at veterinary medical teaching hospitals. J Am Vet Med Assoc 2001; 218: 1111–1115.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
10.Warren, TK, Jordan, R, Lo, MK. Therapeutic efficacy of the small molecule GS-5734 against Ebola virus in rhesus monkeys. Nature 2016; 531: 381–385.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
11.Sheahan, TP, Sims, AC, Graham, RL. Broad-spectrum antiviral GS-5734 inhibits both epidemic and zoonotic coronaviruses. Sci Transl Med 2017; 9. DOI: 10.1126/scitranslmed.aal3653.
Google Scholar | Crossref
12.Murphy, BG, Perron, M, Murakami, E. The nucleoside analog GS-441524 strongly inhibits feline infectious peritonitis (FIP) virus in tissue culture and experimental cat infection studies. Vet Microbiol 2018; 219: 226–233.
Google Scholar | Crossref | Medline
13.Takano, T, Endoh, M, Fukatsu, H. The cholesterol transport inhibitor U18666A inhibits type I feline coronavirus infection. Antiviral Res 2017; 145: 96–102.
Google Scholar | Crossref | Medline
14.Takano, T, Nakano, K, Doki, T. Differential effects of viroporin inhibitors against feline infectious peritonitis virus serotypes I and II. Arch Virol 2015; 160: 1163–1170.
Google Scholar | Crossref | Medline
15.Kim, Y, Liu, H, Galasiti Kankanamalage, AC. Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad- spectrum coronavirus protease inhibitor. PLoS Pathog 2016; 12: DOI: 10.1371/journal.ppat.1005531.
Google Scholar | Crossref
16.Gut, M, Leutenegger, CM, Huder, JB. One-tube fluorogenic reverse transcription-polymerase chain reaction for the quantitation of feline coronaviruses. J Virol Methods 1999; 77: 37–46.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
17.Agostini, ML, Andres, EL, Sims, AC. Coronavirus susceptibility to the antiviral remdesivir (GS-5734) is mediated by the viral polymerase and the proofreading exoribonuclease. MBio 2018; 9. DOI: 10.1128/mBio.00221-18.
Google Scholar
18.Weiss, G, Goodnough, LT. Anemia of chronic disease. N Engl J Med 2005; 352: 1011–1023.
Google Scholar | Crossref | Medline | ISI
19.Kurnick, JE, Ward, HP, Pickett, JC. Mechanism of the anemia of chronic disorders: correlation of hematocrit value with albumin, vitamin B12, transferrin, and iron stores. Arch Intern Med 1972; 130: 323–326.
Google Scholar | Crossref | Medline
20.Taylor, SS, Tappin, SW, Dodkin, SJ. Serum protein electrophoresis in 155 cats. J Feline Med Surg 2010; 12: 643–653.
Google Scholar | SAGE Journals | ISI
21.Hirschberger, J, Hartmann, K, Wilhelm, N. Clinical symptoms and diagnosis of feline infectious peritonitis. Tierarztl Prax 1995; 23: 92–99.
Google Scholar | Medline
22.Pedersen, NC, Liu, H, Gandolfi, B. The influence of age and genetics on natural resistance to experimentally induced feline infectious peritonitis. Vet Immunol Immunopathol 2014; 28: 152–154.
Google Scholar
23.Jain, N, Reddy, DH, Verma, SP. Cardiac abnormalities in HIV-positive patients: results from an observational study in India. J Int Assoc Provid AIDS Care 2014; 13: 40–46.
Google Scholar | SAGE Journals
24.Payne, JR, Brodbelt, DC, Luis Fuentes, V. Cardiomyopathy prevalence in 780 apparently healthy cats in rehoming centres (the CatScan study). J Vet Cardiol 2015; 17 Suppl 1: S244–S257.
Google Scholar | Crossref | Medline
Prečítať “Účinnosť a bezpečnosť nukleozidového analógu GS-441524 pri liečbe mačiek s prirodzene sa vyskytujúcou mačacou infekčnou peritonitídou”